DE102011011040A1

DE102011011040A1 - (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on (Verbindung A) zur Therapie

Info

Publication number: DE102011011040A1
Application number: DE102011011040A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2011-02-08
Filing date: 2011-02-08
Publication date: 2012-08-09

Abstract

Die Erfindung betrifft (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zu therapeutischen Zwecken, Pharmazeutische Mittel und deren Verwendung in der Therapie, insbesondere zur Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on (= Verbindung A) zu therapeutischen Zwecken, Pharmazeutische Mittel enthaltend Verbindung A und deren Verwendung in der Therapie, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Acetyl-CoA Carboxylasen (ACCs) spielen eine Schlüsselrolle in der zellulären Fettsäure-Homöostase. ACCs sind Biotin-enthaltende Enzyme, die die Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA in einer ATPabhängigen Weise katalysieren (Kim, 1997; Harwood, 2005; Tong, 2005). Diese Reaktion, die als zwei halbe Reaktionen abläuft, eine Biotin-Carboxylase (BC) Reaktion und eine Carboxyltransferase (CT) Reaktion, ist der erste einleitende Schritt in der Fettsäurebiosynthese und ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für den Pathway. Es sind zwei humane ACC Isoformen bekannt, ACC1 und ACC2, die von zwei unterschiedlichen Genen codiert werden (LuTFI ABU-ELHEIGA et al, 1995, Jane WIDMER, et al. 1996). ACC1 ist in lipogenem Gewebe exprimiert (Leber, Fettgewebe), im Zytosol lokalisiert, und füllt den Malonyl-CoA Pool, der als C2-Einheiten Donor für die de novo Synthese von langkettigen Fettsäuren durch FASN und anschließende Kettenverlängerung dient. ACC2 ist vor allem in oxidativen Geweben exprimiert (Leber, Herz, Skelettmuskel) (Bianchi et al., 1990; Kim, 1997), mit den Mitochondrien assoziiert, und reguliert einen zweiten Pool von Malonyl-CoA. Dieser steuert die Fettsäureoxidation durch die Hemmung der Carnitinpalmitylransferase I, dem Enzym das den Eintritt langkettiger Fettsäuren in die Mitochondrien für die β-Oxidation erleichtert (Milgraum LZ, et al., 1997, Widmer J. et al., 1996). Beide Enzyme zeigen eine sehr große Sequenzhomologie und sind ähnlich reguliert durch eine Kombination von transkriptionellen, translationellen und prosttranslationellen Mechanismen. In Menschen als auch in Tieren ist die ACC Aktivität streng durch eine Reihe von diätätischen, hormonellen und anderen physiologischen Mechanismen kontrolliert wie beispielsweise über eine vorwärts allosterische Aktivierung durch Citrat, eine Feedback-Inhibition durch langkettige Fettsäuren, reversible Phosphorylierung und/oder Inaktivierung bzw. Modulation der Enzymproduktion durch veränderte Genexpression.
ACC1 Knockout-Mäuse sind embryonal letal (Swinnen, et al., 2006, Abu-Elheiga, et al. 2005). ACC2 Knockout-Mäuse zeigen reduzierte Malonyl-CoA-Spiegel in Skelett und Herzmuskel, erhöhte Fettsäureoxidation im Muskel, erniedrigte Leberfettlevel, erniedrigte Mengen an Gesamtkörperfett, erhöhte Level von UCP3 im Skelettmuskel (als Zeichen einer erhöhten Energieaufwendung), ein erniedrigtes Körpergewicht, erniedrigte Spiegel von freien Fettsäuren im Plasma, erniedrigte Plasma-Glucose-Spiegel, erniedrigte Mengen an Glycogen im Gewebe und sie sind geschützt vor Nahrungs-induziertem Diabetes und Fettleibigkeit (Abu-Elheiga et al., 2001, 2003; Oh et al., 2005).
Zusätzlich zur Beteiligung an der Fettsäuresynthese in lipogenen Geweben und der Fettsäureoxidation in oxidativen Geweben, wurde eine Hochregulation von ACC und gesteigerte Lipogenese in vielen Tumorzellen beobachtet (Swinnen, et al., 2004, Heemers, et al., 2000, Swinnen, et al., 2002, Rossi, et al., 2003, Milgraum, et al., 1997, Yahagi, et al., 2005). Dieser Phenotyp trägt sehr wahrscheinlich zur Entwicklung und Progression von Tumoren bei, die regulatorischen Mechanismen hierfür müssen jedoch noch geklärt werden.
EP0454782 und US5759837 schützen die Verwendung von Fettsäuresyntheseinhibitoren zur Inhibierung von Tumorzellwachstum. Zyklische Ketoenole sind nicht offenbart.
Es wurde eine Reihe von Substanzen entdeckt, die in der Lage sind, Pflanzen und/oder Insekten-ACC zu inhibieren.
Die PCT Patent Applikation PCT/EPP99/01787 , publiziert als WO 99/48869 , die dem europäischen Patent EP 1 066 258 B1 entspricht, bezieht sich auf neue Arylphenyl-substituierte zyklische Ketoenole, zu einer Mehrheit der Prozesse für ihre Herstellung und ihre Nutzung als Pestizide und Herbizide.
Von 3-Acyl-pyrrolidin-2,4-dionen sind pharmazeutische Eigenschaften vorbeschrieben (S. Suzuki et al. Chem. Pharm. Bull. 15 1120 (1967)). Weiterhin wurden N-Phenylpyrrolidin-2,4-dione von R. Schmierer und H. Mildenberger (Liebigs Ann. Chem. 1985, 1095) synthetisiert. Eine biologische Wirksamkeit dieser Verbindungen wurde nicht beschrieben.
In EP-A-0 262 399 und GB-A-2 266 888 werden ähnlich strukturierte Verbindungen (3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dione) offenbart, von denen jedoch keine herbizide, insektizide oder akarizide Wirkung bekannt geworden ist. Bekannt mit herbizider, insektizider oder akarizider Wirkung sind unsubstituierte, bicyclische 3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate ( EP-A-355 599 , EP-A-415 211 und JP-A-12-053 670 ) sowie substituierte monocyclische 3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate ( EP-A-377 893 und EP-A-442 077 ).
Weiterhin bekannt sind polycyclische 3-Arylpyrrolidin-2,4-dion-Derivate ( EP-A-442 073 ) sowie 1H-Arylpyrrolidin-dion-Derivate ( EP-A-456 063 , EP-A-521 334 , EP-A-596 298 , EP-A-613 884 , EP-A-613 885 , WO 95/01 971 , WO 95/26 954 , WO 95/20 572 , EP-A-0 668 267 , WO 96/25 395 , WO 96/35 664 , WO 97/01 535 , WO 97/02 243 , WO 97/36 868 , WO 97/43275 , WO 98/05638 , WO 98/06721 , WO 98/25928 , WO 99/24437 , WO 99/43649 , WO 99/48869 , WO 99/55673 , WO 01/17972 , WO 01/23354 , WO 01/74770 , WO 03/013249 , WO 03/062244 , WO 2004/007448 , WO 2004/024 688 , WO 04/065366 , WO 04/080962 , WO 04/111042 , WO 05/044791 , WO 05/044796 , WO 05/048710 , WO 05/049569 , WO 05/066125 , WO 05/092897 , WO 06/000355 , WO 06/029799 , WO 06/056281 , WO 06/056282 , WO 06/089633 , WO 07/048545 , DEA 10 2005 059 892 , WO 07/073856 , WO 07/096058 , WO 07/121868 , WO 07/140881 , WO 08/067873 , WO 08/067910 , WO 08/067911 , WO 08/138551 , WO 09/015801 , WO 09/039975 , WO 09/049851 , WO 09/115262 , WO10/052161 , WO 10/063378 , WO 10/063670 , WO10/063380 , WO10/066780 und WO10/102758 .
Außerdem sind ketalsubstituierte 1-H-Arylpyrrolidin-2,4-dione aus WO 99/16748 und (spiro)ketalsubstituierte N-Alkoxy-alkoxy-substituierte Aryl-pyrrolidindione aus JP-A-14 205 984 und Ito M. et al. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 67, 1230–1238, (2003) bekannt. Außerdem sind aus WO 06/024411 herbizide Mittel enthaltend Ketoenole bekannt.
Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte Δ³-Dihydrofuran-2-on-Derivate herbizide Eigenschaften besitzen (vgl. DE-A-4 014 420 ). Die Synthese der als Ausgangsverbindungen verwendeten Tetronsäurederivate (wie z. B. 3-(2-Methyl-phenyl)-4-hydroxy-5-(4-fluorphenyl)-Δ³-di-hydrofuranon-(2)) ist ebenfalls in DE-A-4 014 420 beschrieben. Ähnlich strukturierte Verbindungen ohne Angabe einer insektiziden und/oder akariziden Wirksamkeit sind aus der Publikation Campbell et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1985, (8) 1567–76 bekannt. Weiterhin sind 3-Aryl-Δ³-dihydrofuranon-Derivate mit herbiziden, akariziden und insektiziden Eigenschaften bekannt aus: EP-A-528 156 , EP-A-647 637 , WO 95/26 954 , WO 96/20 196 , WO 96/25 395 , WO 96/35 664 , WO 97/01 535 , WO 97/02 243 , WO 97/36 868 , WO 98/05 638 , WO 98/06 721 , WO 99/16 748 , WO 98/25 928 , WO 99/43 649 , WO 99/48 869 , WO 99/55 673 , WO 01/23354 , WO 01/74 770 , WO 01/17 972 , WO 04/024 688 , WO 04/080 962 , WO 04/111 042 , WO 05/092 897 , WO 06/000 355 , WO 06/029 799 , WO 07/048545 , WO 07/073856 , WO 07/096058 , WO 07/121868 , WO 07/140881 , WO 08/067911 , WO 08/083950 , WO 09/015801 , WO09/039975 und PCT/EP2010/003020 .
Auch 3-Aryl-Δ³-dihydrothiphen-on-Derivate sind bekannt aus ( WO 95/26 345 , 96/25 395 , WO 97/01 535 , WO 97/02 243 , WO 97/36 868 , WO 98/05638 , WO 98/25928 , WO 99/16748 , WO 99/43649 , WO 99/48869 , WO 99/55673 , WO 01/17972 , WO 01/23354 , WO 01/74770 , WO 03/013249 , WO 04/080 962 , WO 04/111 042 , WO 05/092897 , WO 06/029799 und WO 07/096058 .
Bestimmte, im Phenylring unsubstituierte Phenyl-pyron-Derivate sind bereits bekannt geworden (vgl. A. M. Chirazi, T. Kappe und E. Ziegler, Arch. Pharm. 309, 558 (1976) und K.-H. Boltze und K. Heidenbluth, Chem. Ber. 91, 2849). Im Phenylring substituierte Phenyl-pyron-Derivate mit herbiziden, akariziden und insektiziden Eigenschaften sind in EP-A-588 137 , WO 96/25 395 , WO 96/35 664 , WO 97/01 535 , WO 97/02 243 , WO 97/16 436 , WO 97/19 941 , WO 97/36 868 , WO 98/05638 , WO 99/43649 , WO 99/48869 , WO 99/55673 , WO 01/17972 , WO 01/74770 , WO 03/013249 , WO 04/080 962 , WO 04/111 042 , WO 05/092897 , WO 06/029799 und WO 07/096058 beschrieben.
Bestimmte, im Phenylring unsubstituierte 5-Phenyl-1,3-thiazin-Derivate sind bereits bekannt geworden (vgl. E. Ziegler und E. Steiner, Monatsh. 95, 147 (1964), R. Ketcham, T. Kappe und E. Ziegler, J. Heterocycl. Chem. 10, 223 (1973)). Im Phenylring substituierte 5-Phenyl-1,3-thiazin-Derivate mit herbizider, akarizider und insektizider Wirkung sind in WO94/14 785 , WO 96/25 395 , WO 96/35 664 , WO 97/01 535 , WO 97/02 243 , WO 97/02 243 , WO 97/36 868 , WO 99/43649 , WO 99/48869 , WO 99/55673 , WO 01/17972 , WO 01/74770 , WO 03/013249 , WO 04/080 962 , WO 04/111 042 , WO 05/092897 , WO 06/029799 und WO 07/096058 beschrieben.
Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte 2-Arylcyclopentandione, herbizide, insektizide und akarizide Eigenschaften besitzen (vgl. z. B. ( US-4 283 348 ; 4 338 122 ; 4 436 666 ; 4 526 723 ; 4 551 547 ; 4 632 698 ; WO 96/01 798 ; WO 96/03 366 , WO 97/14 667 sowie WO 98/39281 , WO 99/43649 , WO99/48869 , WO 99/55673 , WO 01/17972 , WO 01/74770 , WO 03/062244 , WO 04/080962 , WO04/111042 , WO05/092897 , WO06/029799 , WO07/080066 , WO07/096058 WO09/019005 , WO09/019015 , WO09/049851 , WO 10/069834 , WO10/000773 , WO10/057880 , WO10/081894 , WO10/089210 , WO10/102848 und WO10/133232 . Außerdem sind ähnlich substituierte Verbindungen bekannt; 3-Hydroxy-5,5-dimethyl-2-phenylcyclopent-2-en-1-on aus der Publikation Micklefield et al., Tetrahedron, (1992), 7519–26 sowie der Naturstoff Involutin (–)-cis-5-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-cyclopent-2-en-one aus der Publikation Edwards et al., J. Chem. Soc. S, (1967), 405–9. Eine insektizide oder akarizide Wirkung wird nicht beschrieben. Außerdem ist 2-(2,4,6-Trimethylphenyl)-1,3-indandion aus der Publikation J. Economic Entomology, 66, (1973), 584 und der Offenlegungsschrift DE-A 2 361 084 bekannt, mit Angabe von herbiziden und akariziden Wirkungen.
Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte 2-Arylcyclohexandione herbizide, insektizide und akarizide Eigenschaften besitzen ( US-4 175 135 , 4 256 657 , 4 256 658 , 4 256 659 , 4 257 858 , 4 283 348 , 4 303 669 , 4 351 666 , 4 409 153 , 4 436 666 , 4 526 723 , 4 613 617 , 4 659 372 , DE-A 2 813 341 , sowie Wheeler, T. N., J. Org. Chem. 44, 4906 (1979)), WO 99/43649 , WO 99/48869 , WO 99/55673 , WO 01/17972 , WO 01/74770 , WO 03/013249 , WO 04/080 962 , WO 04/111 042 , WO 05/092897 , WO 06/029799 , WO 07/096058 , WO 08/071405 , WO 08/110307 , WO 08/110308 , WO 09/074314 , WO 08/145336 , WO 09/015887 , WO09/074314 , WO10/046194 , WO10/081755 , und WO10/089211 .
Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte 4-Aryl-pyrazolidin-3,5-dione akarizide, insektizide und herbizide Eigenschaften besitzen (vgl. z. B. WO 92/16 510 , EP-A-508 126 , WO 96/11 574 , WO 96/21 652 , WO 99/47525 , WO 01/17 351 , WO 01/17 352 , WO 01/17 353 , WO 01/17 972 , WO 01/17 973 , WO 03/028 466 , WO 03/062 244 , WO 04/080 962 , WO 04/111 042 , WO 05/005428 , WO 05/016873 , WO 05/092897 , WO 06/029799 und WO 07/096058 .
Es ist bekannt, dass bestimmte Tetrahydropyridone herbizide Eigenschaften besitzen ( JP 0832530 ). Außerdem sind spezielle 4-Hydroxytetrahydropyridone mit akariziden, insektiziden und herbiziden Eigenschaften bekannt ( JP 11152273 ). Weiterhin bekannt wurden 4-Hydroxytetrahydropyridone als Schädlingsbekämpfungsmittel und Herbizide in WO 01/79204 und WO 07/096058 . 4-Hydroxy-chinolone sind offenbart in WO 03/01045 .
Es ist bekannt, dass bestimmte 5,6-Dihydropyron-Derivate als Proteaseinhibitoren antivirale Eigenschaften haben ( WO 95/14012 ). Weiterhin ist das 4-Phenyl-6-(2-phenethyl)-5,6-dihydropyron aus der Synthese von Kawalakton-Derivaten bekannt (Kappe et al., Arch. Pharm. 309, 558–564 (1976). Außerdem sind 5,6-Dihydropyron-Derivate als Zwischenprodukte bekannt (White, J. D., Brenner, J. B., Deinsdale, M. J., J. Amer. Chem. Soc. 93, 281–282 (1971). 3-Phenyl-5,6-dihydropyron-Derivate mit Anwendungen im Pflanzenschutz sind in WO 01/98288 und WO 07/09658 beschrieben.
4'-Biphenyl-substituierte Tetronsäurederivate werden in WO 2008/022725 für die Therapie viraler Erkrankungen offenbart.
WO 2005/089118 und WO2007/039286 offenbaren generisch stickstoffhaltige bizyklische Strukturen für die Therapie, wobei 5'-Biphenyl-substituierte zyklische Ketoenole nicht spezifisch genannt sind.
4-Phenylsubstituierte[1.2]-Oxazin-3,5-dione sind als Herbizide erstmalig in WO 01/17972 beschrieben. Weiterhin wurden 4-Acyl-substituierte[1.2]-Oxazin-3,5-dione als Pestizide vor allem aber als Herbizide und Wachstumsregulatoren beschrieben z. B. in EP-A-39 48 89 ; WO 92/07837 , US 5,728,831 sowie als Herbizide und Schädlingsbekämpfungsmittel in WO 03/048138 .
Die Verbindung A ist spezifisch offenbart in WO2008/067910 (Tabelle 1, Seite 26, Zeile 4). WO2008/067910 offenbart nicht die Eignung von Verbindung A zu therapeutischen Zwecken.
Die vorliegende Anmeldung begründet die Priorität für die therapeutische Verwendung von Verbindung A. Zeitgleich zur vorliegenden prioritätsbegründenden Anmeldung, deren Gegenstand die therapeutische Verwendung nur von Verbindung A ist, wurde u. a. eine PCT-Anmeldung eingereicht, die zum Gegenstand die therapeutische Verwendung zahlreicher zyklischer Ketoenole hat und die die Priorität einer deutschen Anmeldung mit der Anmeldenummer DE 10 2010 008 644.4 in Anspruch nimmt. Verbindung A ist Beispiel 1–118 in der PCT-Anmeldung, war aber in der DE 10 2010 008 644.4 noch nicht enthalten.
Den strukturell nächstliegenden Stand der Technik könnte das Beispiel I-1-a-16 der WO99/48869 bilden, das sich von der Verbindung A nur durch ein fehlendes Fluor-Atom am äußeren Phenylring des Biphenyls unterscheidet. Die therapeutische Verwendung von Beispiel I-1-a-16 der WO99/48869 ist auch ein Gegenstand in DE 10 2010 008 644.4 und der PCT-Anmeldung, die die Priorität von DE 10 2010 008 644.4 in Anspruch nimmt (Beispiel 1–2).
Den strukturell nächstliegenden Stand der Technik könnte aber auch das Beispiel I-1-a-31 der WO03/059065 bilden, das sich von der Verbindung A durch den Ersatz des Fluoratoms am äußeren Phenylring des Biphenyls durch ein Chloratom unterscheidet. Die therapeutische Verwendung von Beispiel I-1-a-31 der WO03/059065 ist auch ein Gegenstand in DE 10 2010 008 644.4 und der PCT-Anmeldung, die die Priorität von DE 10 2010 008 644.4 in Anspruch nimmt (Beispiel 1–81).
Ausgehend von diesem Stand der Technik, ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine besonders effektive Struktur für die Therapie von Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.
Insbesondere soll die erfindungsgemäße Struktur zur Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen geeignet sein und Vorteile gegenüber im Stand der Technik bekannten Strukturen aufweisen.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Verbindung A
besonders gut für die Therapie von Erkrankungen geeignet ist.
Dabei war nicht vorhersehbar, ob und welches der als Insektizide oder Herbizide bekannten Strukturen die erfindungsgemäße Aufgabe besonders gut löst, nämlich eine Struktur darstellt, die bei der Therapie von menschlichen Erkrankungen besonders gut eingesetzt werden können.
Die Verbindung A hat vergleichbare Enzyminhibitionsdaten wie das Beispiel I-1-a-16 der WO99/48869 , das als strukturell nächstliegender Stand der Technik angesehen werden könnte. Überraschenderweise zeichnet sich die Verbindung A aber durch ein breiteres therapeutisches Fenster im MCF7-Xenograft-Modell aus als dieser Stand der Technik, welcher keine Effektivität in diesem Modell bei tolerierten Dosen hat.
Die Verbindung A hat bessere Enzyminhibitionsdaten als das Beispiel I-1-a-31 der WO03/059065 , das ebenfalls als der strukturell nächstliegende Stand der Technik angesehen werden könnte.
Aus der großen Gruppe der als Insektizide, Fungizide oder Herbizide bekannten zyklischen Ketoenole hat sich die Verbindung A überraschenderweise durch bessere Enzyminhibition und/oder durch eine bessere in-vivo-Effektivität bei tolerierten Dosen hervorgehoben.
Ebenfalls als von der vorliegenden Erfindung als erfasst anzusehen ist die Verwendung der physiologisch verträglichen Salze der Verbindung A.
Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung A umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z. B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z. B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel enthaltend Verbindung A und mindestens einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Verbindung A kann systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z. B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege kann Verbindung A in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die Verbindung A abgebende Applikationsformen, die die Verbindung A in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z. B. Tabletten (nicht überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophilisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z. B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z. B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u. a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z. B. Inhalationsarzneiformen (u. a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Die Verbindung A kann in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u. a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z. B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z. B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z. B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die die Verbindung A, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die Formulierung der Verbindung A zu pharmazeutischen Präparaten erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man den oder die Wirkstoffe mit den in der Galenik gebräuchlichen Hilfsstoffen in die gewünschte Applikationsform überführt.
Als Hilfsstoffe können dabei beispielsweise Trägersubstanzen, Füllstoffe, Sprengmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Gleitmittel, Ab- und Adsorptionsmittel, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Cosolventien, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Geschmackskorrigentien, Färbemittel, Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer zum Einsatz kommen. Dabei ist auf Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.
Die pharmazeutischen Formulierungen können
in fester Form, zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Pillen, Suppositorien, Kapseln, transdermale Systeme oder
in halbfester Form, zum Beispiel als Salben, Cremes, Gele, Suppositorien, Emulsionen oder
in flüssiger Form, zum Beispiel als Lösungen, Tinkturen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Hilfsstoffe im Sinne der Erfindung können beispielsweise Salze, Saccharide (Mono-, Di-, Tri-, Oligo-, und/oder Polysaccharide), Proteine, Aminosäuren, Peptide, Fette, Wachse, Öle, Kohlenwasserstoffe sowie deren Derivate sein, wobei die Hilfsstoffe natürlichen Ursprungs sein können oder synthetisch bzw. partial synthetisch gewonnen werden können.
Für die orale oder perorale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulate, Pastillen, Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen in Frage. Für die parenterale Applikation kommen insbesondere Suspensionen, Emulsionen und vor allem Lösungen in Frage.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Verbindung A für die Prophylaxe und Therapie von menschlichen Erkrankungen, insbesondere von Tumorerkrankungen Die Verbindung A kann insbesondere verwendet werden, um die Zellproliferation und/oder die Zellteilung zu inhibieren oder zu reduzieren und/oder Apoptosis zu induzieren.
Die Verbindung A eignet sich insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von hyperproliferativen Erkrankungen wie beispielsweise

– Psoriasis,
– Keloide und andere Hyperplasien, die die Haut betreffen,
– gutartige Prostathyperplasien (BPH),
– solide Tumore und
– hämatologische Tumore.

Als solide Tumore sind erfindungsgemäß beispielsweise Tumore behandelbar der Brust, des Respirationstraktes, des Gehirns, der Fortpflanzungsorgane, des Magen-Darmtraktes, des Urogenitaltraktes, des Auges, der Leber, der Haut, des Kopfes und des Halses, der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Knochen sowie des Bindegewebes und Metastasen dieser Tumore.
Als hämatologische Tumore sind beispielsweise behandelbar

– multiple Myelome,
– Lymphome oder
– Leukämien.

Als Brusttumore sind beispielsweise behandelbar:

– Mammakarzinome mit positivem Hormonrezeptorstatus
– Mammakarzinome mit negativem Hormonrezeptorstatus
– Her-2 positive Mammakarzinome
– Hormonrezeptor- und Her-2 negative Mammakarzinome
– BRCA-assoziierte Mammakarzinome
– entzündliches Mammakarzinom.

Als Tumore des Respirationstraktes sind beispielsweise behandelbar

– nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome und
– kleinzellige Bronchialkarzinome.

Als Tumore des Gehirns sind beispielsweise behandelbar

– Gliome,
– Glioblastome,
– Astrozytome,
– Meningiome und
– Medulloblastome.

Als Tumore der männlichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar:

– Prostatakarzinome,
– Maligne Hodentumore und
– Peniskarzinome.

Als Tumore der weiblichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar:

– Endometriumkarzinome
– Zervixkarzinome
– Ovarialkarzinome
– Vaginalkarzimome
– Vulvarkarzinome

Als Tumore des Magen-Darm-Traktes sind beispielsweise behandelbar:

– Kolorektale Karzinome
– Analkarzinome
– Magenkarzinome
– Pankreaskarzinome
– Ösophagukarzinome
– Gallenblasenkarzinome
– Dünndarmkarzinome
– Speicheldrüsenkarzinome
– Neuroendokrine Tumore
– Gastrointestinale Stromatumore

Als Tumore des Urogenital-Traktes sind beispielsweise behandelbar:

– Harnblasenkarzinome
– Nierenzellkarzinome
– Karzinome des Nierenbeckens und der ableitenden Harnwege

Als Tumore des Auges sind beispielsweise behandelbar:

– Retinoblastome
– Intraokulare Melanome

Als Tumore des Leber sind beispielsweise behandelbar:

– Hepatozelluläre Karzinome
– Cholangiozelluläre Karzinome

Als Tumore der Haut sind beispielsweise behandelbar:

– Maligne Melanome
– Basaliome
– Spinaliome
– Kaposi-Sarkome
– Merkelzellkarzinome

Als Tumore der Kopf und Halses sind beispielsweise behandelbar:

– Larynxkarzinome
– Karzinome des Pharynx und der Mundhöhle

Als Sarkome sind beispielsweise behandelbar:

– Weichteilsarkome
– Osteosarkome

Als Lymphome sind beispielsweise behandelbar:

– Non-Hodgkin-Lymphome
– Hodgkin-Lymphome
– Kutane Lymphome
– Lymphome des zentralen Nervensystems
– AIDS-assoziierte Lymphome

Als Leukämien sind beispielsweise behandelbar:

– Akute myeloische Leukämien
– Chronische myeloische Leukämien
– Akute lymphatische Leukämien
– Chronische lymphatische Leukämien
– Haarzellleukämien

Besonders vorteilhaft kann die Verbindung A verwendet werden zur Prophylaxe und/oder Therapie von:
Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen, Hormonrezeptor-positven oder BRCA-assoziierten Mammakarzinomen, sowie
Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinom, Kolorektalen Karzinomen und Prostatakarzinomen.
Diese Erkrankungen sind gut charakterisiert im Menschen, existieren aber auch bei anderen Säugetieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verbindung A zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Verbindung A zur Herstellung eines Arzneimittels.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung A zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische Formulierungen in Form von Tabletten enthaltend Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Verbindung A zur Behandlung von Erkrankungen, die mit proliferativen Prozessen einhergehen.
Verbindung A kann allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend Verbindung A und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie der zuvor genannten Erkrankungen.
Beispielsweise kann Verbindung A mit bekannten anti-hyperproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Die Kombination der Verbindung A mit anderen für die Krebstherapie gebräuchlichen Substanzen oder auch mit der Strahlentherapie ist besonders angezeigt.
Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
Afinitor, Aldesleukin, Alendronsäure, Alfaferon, Alitretinoin, Allopurinol, Aloprim, Aloxi, Altretamin, Aminoglutethimid, Amifostin, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Anzmet, Aranesp, Arglabin, Arsentrioxid, Aromasin, 5-Azacytidin, Azathioprin, BCG oder tice-BCG, Bestatin, Betamethason-Acetat, Betamethason-Natriumphosphat, Bexaroten, Bleomycin-Sulfat, Broxuridin, Bortezomib, Busulfan, Calcitonin, Campath, Capecitabin, Carboplatin, Casodex, Cefeson, Celmoleukin, Cerubidin, Chlorambucil, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, DaunoXome, Decadron, Decadron-Phosphat, Delestrogen, Denileukin Diftitox, Depomedrol, Deslorelin, Dexrazoxan, Diethylstilbestrol, Diflucan, Docetaxel, Doxifluridin, Doxorubicin, Dronabinol, DW-166HC, Eligard, Elitek, Ellence, Emend, Epirubicin, Epoetin-alfa, Epogen, Eptaplatin, Ergamisol, Estrace, Estradiol, Estramustin Natriumphosphat, Ethinylestradiol, Ethyol, Etidronsäure, Etopophos, Etoposid, Fadrozol, Farston, Filgrastim, Finasterid, Fligrastim, Floxuridin, Fluconazol, Fludarabin, 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5-Fluoruracil (5-FU), Fluoxymesteron, Flutamid, Formestan, Fosteabin, Fotemustin, Fulvestrant, Gammagard, Gemcitabin, Gemtuzumab, Gleevec, Gliadel, Goserelin, Granisetron-Hydrochlorid, Histrelin, Hycamtin, Hydrocorton, erythro-Hydroxynonyladenin, Hydroxyharnstoff, Ibritumomab Tiuxetan, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon-alpha, Interferon-alpha-2, Interferon-alpha-2α, Interferon-alpha-2β, Interferon-alpha-n1, Interferon-alpha-n3, Interferon-beta, Interferon-gamma-1a, Interleukin-2, Intron A, Iressa, Irinotecan, Kytril, Lapatinib, Lentinan-Sulfat, Letrozol, Leucovorin, Leuprolid, Leuprolid-Acetat, Levamisol, Levofolinsäure-Calciumsalz, Levothroid, Levoxyl, Lomustin, Lonidamin, Marinol, Mechlorethamin, Mecobalamin, Medroxyprogesteron-Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, Menest, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Metvix, Miltefosin, Minocyclin, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Modrenal, Myocet, Nedaplatin, Neulasta, Neumega, Neupogen, Nilutamid, Nolvadex, NSC-631570, OCT-43, Octreotid, Ondansetron-Hydrochlorid, Orapred, Oxaliplatin, Paclitaxel, Pediapred, Pegaspargase, Pegasys, Pentostatin, Picibanil, Pilocarpin-Hydrochlorid, Pirarubicin, Plicamycin, Porfimer-Natrium, Prednimustin, Prednisolon, Prednison, Premarin, Procarbazin, Procrit, Raltitrexed, RDEA119, Rebif, Rhenium-186-Etidronat, Rituximab, Roferon-A, Romurtid, Salagen, Sandostatin, Sargramostim, Semustin, Sizofiran, Sobuzoxan, Solu-Medrol, Streptozocin, Strontium-89-chlorid, Synthroid, Tamoxifen, Tamsulosin, Tasonermin, Tastolacton, Taxoter, Teceleukin, Temozolomid, Teniposid, Testosteron-Propionat, Testred, Thioguanin, Thiotepa, Thyrotropin, Tiludronsäure, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Tastuzumab, Teosulfan, Tretinoin, Trexall, Trimethylmelamin, Trimetrexat, Triptorelin-Acetat, Triptorelin-Pamoat, UFT, Uridin, Valrubicin, Vesnarinon, Vinbiastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin, Virulizin, Zinecard, Zinostatin-Stimalamer, Zofran; ABI-007, Acolbifen, Actimmun, Affinitak, Aminopterin, Arzoxifen, Asoprisnil, Atamestan, Atrasentan, BAY 43-9006 (Sorafenib), Avastin, CCI-779, CDC-501, Celebrex, Cetuximab, Crisnatol, Cyproteron-Acetat, Decitabin, DN-101, Doxorubicin-MTC, dSLIM, Dutasterid, Edotecarin, Eflornithin, Exatecan, Fenretinid, Histamin-Dihydrochlorid, Histrelin-Hydrogel-Implant, Holmium-166-DOTMP, Ibandronsäure, Interferon-gamma, Intron-PEG, Ixabepilon, Keyhole Limpet-Hemocyanin, L-651582, Lanreotid, Lasofoxifen, Libra, Lonafarnib, Miproxifen, Minodronat, MS-209, liposomales MTP-PE, MX-6, Nafarelin, Nemorubicin, Neovastat, Nolatrexed, Oblimersen, Onko-TCS, Osidem, Paclitaxel-Polyglutamat, Pamidronat-Dinatrium, PN-401, QS-21, Quazepam, R-1549, Raloxifen, Ranpirnas, 13-cis-Retinsäure, Satra-Platin, Seocalcitol, T-138067, Tarceva, Taxoprexin, Thymosin-alpha-1, Tiazofurin, Tipifarnib, Tirapazamin, TLK-286, Toremifen, TransMID-107R, Valspodar, Vapreotid, Vatalanib, Verteporfin, Vinflunin, Z-100, Zoledronsäure, sowie Kombinationen hiervon.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Verbindung A mit anti-hyperproliferativen Agentien kombiniert werden, welche beispielhaft – ohne dass diese Aufzählung abschließend wäre – sein können:
Aminoglutethimid, L-Asparaginase, Azathioprin, 5-Azacytidin, Bleomycin, Busulfan, Carboplatin, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Colaspase, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin, Diethylstilbestrol, 2',2'-Difluordeoxycytidin, Docetaxel, Doxorubicin (Adriamycin), Epirubicin, Epothilon und seine Derivate, erythro-Hydroxynonyladenin, Ethinylestradiol, Etoposid, Fludarabin-Phosphat, 5-Fluordeoxyuridin, 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5-Fluoruracil, Fluoxymesteron, Flutamid, Hexamethylmelamin, Hydroxyharnstoff, Hydroxyprogesteron-Caproat, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon, Irinotecan, Leucovorin, Lomustin, Mechlorethamin, Medroxyprogesteron-Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Paclitaxel, Pentostatin, N-Phosphonoacetyl-L-aspartat (PALA), Plicamycin, Prednisolon, Prednison, Procarbazin, Raloxifen, Semustin, Streptozocin, Tamoxifen, Teniposid, Testosteron-Propionat, Thioguanin, Thiotepa, Topotecan, Trimethylmelamin, Uridin, Vinblastin, Vincristin, Vindesin und Vinorelbin.
In viel versprechender Weise lässt sich die Verbindung A auch mit biologischen Therapeutika wie Antikörpern (z. B. Avastin, Rituxan, Erbitux, Herceptin) und rekombinanten Proteinen kombinieren.
Die Verbindung A kann auch in Kombination mit anderen, gegen die Angiogenese gerichteten Therapien positive Effekte erzielen, wie zum Beispiel mit Avastin, Axitinib, Regorafenib, Recentin, Sorafenib oder Sunitinib. Kombinationen mit Inhibitoren des Proteasoms und von mTOR sowie Antihormone und steroidale metabolische Enzyminhibitoren sind wegen ihres günstigen Nebenwirkungsprofils besonders geeignet.
Generell können mit der Kombination von Verbindung A mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agentien folgende Ziele verfolgt werden:

• eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;
• die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;
• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe;
• die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;
• das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie;
• eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.

Darüber hinaus kann die Verbindung A auch in Verbindung mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen. Intervention eingesetzt werden.
Experimenteller Teil
1. Vergleichsbeispiele
Tabelle V zeigt das Beispiel I-1-a-16 der WO99/488691 und das Beispiel I-1-a-31 der WO03/059065 , welche die Anmelderin als den nächstliegenden Stand der Technik ansieht.
Tab. V
LC-MS- und HPLC-Methoden:
Methode 1 (UPLC-MS)

Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1 mm; Eluent A: Wasser + 0.1% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0–1.6 min 1–99% B, 1.6–2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60°C; Injektion: 2 μl; DAD scan: 210–400 nM.

Methode 2 (UPLC-MS):

Instrument: Waters Acquity UPLC-MS ZQ4000; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1 mm; Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril + 0.05% Ameisensäure; Gradient: 0–1.6 min 1–99% B, 1.6–2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60°C; Injektion: 2 μl; DAD scan: 210–400 nM.

Methode 3 (UPLC-MS):

Herstellung des Vergleichsbeispiels V.1.
a) Intermediate
Intermediat V.1.1
(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetylchlorid
5.00 g (19.18 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure ( EP 2029531 A1 und US 2009/298828 A1 ) wurden in 36.51 g (306.84 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde vier Stunden bei 80°C gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung im Feinvakuum erhielt man 5.4 g (100% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ [ppm] = 2.36 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 7.29 (d, 1H), 7.35–7.55 (m, 6H).
Intermediat V.1.2
Methyl-cis-1-{[(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4-methoxycyclohexancarboxylat
5.41 g (24.2 mmol) Methyl-cis-1-amino-4-methoxycyclohexancarboxylathydrochlorid ( EP 1791816 A1 und WO 2006/29799 A1 ), 14.8 mg (1.21 mmol) DMAP und 8.4 ml (60.5 mmol) Triethylamin wurden bei Raumtemperatur unter Stickstoff in 118 ml Dichlormethan gelöst. Anschließend tropfte man eine Lösung von 6.75 g (24.2 mmol) des Intermediates V.1.1 in 60 ml Dichlormethan hinzu. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und wässriger, 5%iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde filtriert und eingeengt. Man erhielt 10.9 g der Titelverbindung, die durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Hexan-Essigester-Gradient) weiter aufgereinigt wurden.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.31–1.47 (m, 2H), 1.60–1.73 (m, 2H), 1.75–1.86 (m, 2H), 2.00–2.11 (m, 2H), 2.27 (s, 3H), 3.09–3.20 (m, 1H), 3.21 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 7.23 (d, 114), 7.43 (dd, 1H), 7.46–7.54 (m, 3H), 7.61–7.68 (m, 2H), 8.31 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): R_t = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 430 [M + H]⁺.
b) Endprodukt V.1
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on
Zu 8.87 g (20.6 mmol) des Intermediates V.1.2 in 103 ml N,N-Dimethylformamid wurden bei Raumtemperatur unter Stickstoff 4.63 g (41.3 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80°C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 1 l Eiswasser gegossen, mit 1 N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung auf ein pH-Wert von 3 eingestellt, drei Stunden gerührt, der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Verrühren in Diethylether über Nacht, Abfiltrieren und Trocknung weiter gereinigt. Man erhielt 7.75 g (94% d. Th.) der Titelverbindung.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.39–1.62 (m, 4H), 1.84–2.05 (m, 4H), 2.18 (s, 3H), 3.07–3.20 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 7.30 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.45–7.53 (m, 3H), 7.62–7.68 (m, 2H), 8.18 (br. s, 1H), 10.82 (br. s, 1H).
LC-MS (Methode 3): R_t = 1.19 min; MS (ESIpos): m/z = 398 [M + H]⁺.
Vergleichsbeispiel V.2
Vergleichsbeispiel V.2 ist das Beispiel I-1-a-31 der WO03/059065.
Die therapeutische Verwendung von Beispiel I-1-a-31 der WO03/059065 ist auch ein Gegenstand in DE 10 2010 008 644.4 und der PCT-Anmeldung, die die Priorität von DE10 2010 008 644.4 in Anspruch nimmt (Beispiel 1-81).
2. Verbindung A
Herstellung der Verbindung A
a) Intermediate
Intermediat A.1
(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure
Zu einer Lösung von 40.0 g (175 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure ( EP 1791816 und WO 2006/29799 ) in einer Mischung aus 437 ml (437 mmol) entgaster IN wässriger Natriumhydroxid-Lösung, 160 ml entgastem Wasser und 160 ml entgastem Tetrahydrofuran wurden unter Argon 33.5 g (192 mmol) (4-Chlor-3-fluorphenyl)boronsäure gegeben. Man rührte 10 Minuten, versetzte mit 507 mg (1.75 mmol) Tri-tert-butylphosphoniumtetrafluoroborat und 532 mg (1.75 mmol) Palladium(II)acetylacetonat und rührte 20 h bei Raumtemperatur. Anschließend gab man Toluol und Wasser hinzu, stellte mit konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung einen pH-Wert von 1–2 ein, rührte 10 Minuten, trennte die Phasen, extrahierte zweimal mit Toluol, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Der Rückstand wurde in 300 ml einer 6/1-Mischung aus n-Hexan/tert-Butyl-methylether 30 Minuten gerührt, abgesaugt, mit n-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 38.0 g (78% d. Th.) der Titelverbindung.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 2.27 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 7.27 (d, 1H), 7.49–7.59 (m, 3H), 7.61–7.75 (m, 2H), 12.4 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): R_t = 1.31 min; MS (ESIneg): m/z = 277 [M – H]^–.
Intermediat A.2
Methyl-cis-1-{[(4'-chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4-methoxycyclohexancarboxylat
10.0 g (35.9 mmol) des Intermediates A.1 wurden in 14.9 ml (205 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 90°C gerührt und anschließend eingeengt. Man erhielt 10.8 g (100% d. Th.) (4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetylchlorid. 10.6 g (35.7 mmol) (4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetylchlorid wurden in 120 ml Acetonitril gelöst. 12.0 g (53.7 mmol) Methyl-cis-1-amino-4-methoxycyclohexancarboxylathydrochlorid (beschrieben in EP 1791816 und WO 2006/29799 ) wurden in Essigsäureethylester aufgenommen und mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt. Man trennte die Phasen und extrahierte die wässrige Phase zweimal mit Essigsäureethylester. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 8.50 g Methyl-cis-1-amino-4-methoxycyclohexancarboxylat. 8.02 g (42.8 mmol) Methyl-cis-1-amino-4-methoxycyclohexancarboxylat in 120 ml Acetonitril wurden mit 17.3 g (125 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säurechlorids hinzu und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, versetzte den Rückstand mit Wasser, extrahierte mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mit 1 N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 15.7 g (98% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.30–1.47 (m, 2H), 1.60–1.74 (m, 2H), 1.75–1.85 (m, 2H), 1.99–2.11 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 3.09–3.20 (m, 1H), 3.21 (s, 3H), 3.52 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 7.24 (d, 1H), 7.46 – 7.55 (m, 2H), 7.57 (d, 1H), 7.61–7.72 (m, 2H), 8.30 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): R_t = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 448 [M + H]⁺.
b) Endprodukt Verbindung A
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on
Zu 15.7 g (35.0 mmol) des Intermediates A.2 in 60 ml N,N-Dimethylformamid wurden unter Stickstoff 4.32 g (38.5 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 20 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend gab man das Reaktionsgemisch auf Eiswasser, tropfte 160 ml 1 N wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu, rührte 30 Minuten, saugte ab, wusch mit Wasser und trocknete den Niederschlag. Man erhielt 14.2 g (97% d. Th.) der Titelverbindung.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.40–1.62 (m, 4H), 1.85–2.04 (m, 4H), 2.19 (s, 3H), 3.07–3.20 (m, 1H), 3.27 (s, 3H), 7.31 (d, 1H), 7.39 (d, 1H), 7.48–7.57 (m, 2H), 7.60–7.73 (m, 2H), 8.20 (s, 1H), 10.82 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): R_t = 1.22 min; MS (ESIpos): m/z = 416 [M + H]⁺.
3. Assays
Human ACC1-Enzymassay
Die ACC1-Inhibitionsdaten wurden mit zwei verschiedenen Assays erhoben (A1 und B1)
Assay A1 (= (A1))
Die inhibitorische Aktivität der Substanzen dieser Erfindung gegenüber Acetyl-CoA-Carboxylase 1 (ACC1) wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen ACC1-Assay gemessen. Grundprinzip des Assays ist die Messung des als Ko-Produkt gebildeten Adenosindiphoshats (ADP) mittels eines HTRF^®-basierten kompetitiven Immunoassays (HTRF = Homogeneous Time Resolved Fluorescence).
Als Enzym wurde C-terminal FLAG-getagtes rekombinantes humanes ACC1 (GenBank Acession Nr. NM_198834, Aminosäuren 39 – Ende), exprimiert in Baculovirus-transfizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Affinitäts-Chromatographie an Anti-FLAG^®M2 Affinity Gel (Sigma-Aldrich), verwendet. Alternativ kann kommerziel erhältliches C-terminal His-getagtes ACC1 von BPS Bioscience (San Diego, CA, Katalog-Nr. 50200. Aminosäuren 39 – Ende) verwendet werden. Für den Assay wurden 50 nl einer 100fach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine schwarze low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2 μl einer Lösung von ACC1 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 12 mM Natriumhydrogencarbonat, 2 mM MgCl₂, 2 mM Kaliumcitrat, 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 3 μl einer Lösung von Adenosintriphosphat (ATP, 83,5 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 50 μM, Amersham Pharmacia Biotech #27-2056-01) und Acetyl-CoA (33,4 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 20 μM, Roche Bioscience #10101893001) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 20 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des ACC1 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 2,5 ng/μl.
Die Reaktion wurde gestoppt durch aufeinanderfolgende Zugaben von 2,5 μl einer Lösung von d2-markiertem ADP (HTRF^® Transscreener^TM ADP Kit, Cis biointernational, Marcoule, Frankreich) in dem EDTA-haltigen HTRF^® Transscreener^TM ADP-Nachweispuffer (im HTRF^® Transscreener^TM ADP Kit enthalten, 50 mM HEPES pH 7,0, 60 mM EDTA, 0,1% (w/v) BSA, 0,02% Natriumazid, 400 mM Kaliumfluorid) und 2,5 μl einer Lösung von Europium-Kryptatmarkierten anti-ADP-Antikörper (HTRF^® Transscreener^TM ADP Kit) in HTRF^® Transscreener^TM ADP-Nachweispuffer.
Die resultierende Mischung wurde 1 h bei 22°C inkubiert, um die Bindung des Europium-Kryptatmarkierten anti-ADP-Antikörpers an das durch die Enzymreaktion gebildete ADP und das d2-markierte ADP zu ermöglichen. Anschließend wurde die Menge des Komplexes aus d2-markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper bestimmt durch eine Messung des Resonanz-Energietransfers vom Europium-Kryptat zum d2. Hierzu wurden in einem HTRF-Meßgerät, z. B. einem Rubystar oder Pherastar (beide BMG Labtechnologies, Offenburg, Deutschland), die Fluoreszenz-Emissionen bei 620 nm and 665 nm nach Anregung bei 350 nm gemessen. Das Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm wurde als Maß für die Menge des des Komplexes aus d2-markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper und damit indirekt als Maß für die Menge des in der Enzymreaktion gebildeten unmarkierten ADP genommen (höheres Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm a mehr Komplex aus d2-markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper ⇔ weniger ADP). Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0% Inhibition, alle anderen Assaykomponenten aber kein Enzym = 100% Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanzen auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μM bis 1 nM (20 μM, 6,7 μM, 2,2 μM, 0,74 μM, 0,25 μM, 82 nM, 27 nM, 9,2 nM, 3,1 nM und 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der 100fach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC50-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde.
Assay B1 (= (B1))
Die hACC1-inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACC1-Assay gemessen.
Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymreaktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-Glo^TM-Nachweissystems der Firma Promega. Bei diesem wird zunächst das in der Enzymreaktion nicht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclase („ADP-GLO-Reagenz”) quantitativ in cAMP überführt, die Adenylatzyklase dann gestoppt und anschließend („Kinase Detection Reagenz”) wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt.
Als Enzym wurde rekombinantes C-terminal FLAG-getagtes humanes ACC1 (Acetyl-Coenzym A Carboxylase alpha Transkript Variante 1) (GenBank Accession No. NM_198834) (Aminosäuren 39 – Ende) verwendet, exprimiert in Baculovirus-infizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG-Affinitätschromatographie.
Für den Assay wurden 50 nl einer 100fach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine weiße low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2,5 μl einer Lösung von hACC1 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCl₂, 2 mM Kaliumcitrat, 12 mM NaHCO₃, 2 mM Di-thio-threitol (DTT), 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2,5 μl einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 50 μM) und Acetyl-CoA (20 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 10 μM) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACC1 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 1,75 ng/μl. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2,5 μl des „ADP-GLO-Reagenz” (1:1,5-fach verdünnt) und die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überführen. Anschließend wurden 2,5 μl des „Kinase Detection Reagenz” (1,2fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als Maß für die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzymaktivität der hACC1 genommen. Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0% Inhibition, alle anderen Assaykomponente aber kein Enzym = 100% Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μM bis 1 nM (20 μM, 6.7 μM, 2.2 μM, 0.74 μM, 0.25 μM, 82 nM, 27 nM, 9.2 nM, 3.1 nM and 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der 100fach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC₅₀-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde.
Human ACC2-Enzymassay
Die ACC2-Inhibitionsdaten wurden mit zwei verschiedenen Assays erhoben (A2 und B2)
Assay A2 (= (A2))
Die inhibitorische Aktivität der Substanzen dieser Erfindung gegenüber Acetyl-CoA-Carboxylase 2 (ACC2) wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen ACC2-Assay gemessen. Grundprinzip des Assays ist die Messung des als Ko-Produkt gebildeten Adenosindiphoshats (ADP) mittels eines HTRF^®-basierten kompetitiven Immunoassays (HTRF = Homogeneous Time Resolved Fluorescence).
Als Enzym wurde kommerziel erhältliches C-terminal His-getagtes ACC2 von BPS Bioscience (San Diego, CA, Katalog- Nr. 50201. Aminosäuren 39 – Ende, exprimiert in Baculovirus infizierten Sf9-Insektenzellen und gereinigt mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie) verwendet.
Für den Assay wurden 50 nl einer 100fach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine schwarze low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2 μl einer Lösung von ACC2 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 12 mM Natriumhydrogencarbonat, 2 mM MgCl₂, 2 mM Kaliumcitrat, 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 3 μl einer Lösung von Adenosintriphosphat (ATP, 83,5 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 50 μM, Amersham Pharmacia Biotech #27-2056-01) und Acetyl-CoA (33,4 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 20 μM, Roche Bioscience #10101893001) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 20 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des ACC2 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 0,6 ng/μl.
Die Reaktion wurde gestoppt durch aufeinanderfolgende Zugaben von 2,5 μl einer Lösung von d2-markiertem ADP (HTRF^® Transscreener^TM ADP Kit, Cis biointernational, Marcoule, Frankreich) in dem EDTA-haltigen HTRF^® Transscreener^TM ADP-Nachweispuffer (im HTRF^® Transscreener^TM ADP Kit enthalten, 50 mM HEPES pH 7,0, 60 mM EDTA, 0,1% (w/v) BSA, 0,02% Natriumazid, 400 mM Kaliumfluorid) und 2,5 μl einer Lösung von Europium-Kryptatmarkierten anti-ADP-Antikörper (HTRF^® Transscreener^TM ADP Kit) in HTRF^® Transscreener^TM ADP-Nachweispuffer.
Die resultierende Mischung wurde 1 h bei 22°C inkubiert, um die Bindung des Europium-Kryptatmarkierten anti-ADP-Antikörpers an das durch die Enzymreaktion gebildete ADP und das d2-markierte ADP zu ermöglichen. Anschließend wurde die Menge des Komplexes aus d2-markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper bestimmt durch eine Messung des Resonanz-Energietransfers vom Europium-Kryptat zum d2. Hierzu wurden in einem HTRF-Meßgerät, z. B. einem Rubystar oder Pherastar (beide BMG Labtechnologies, Offenburg, Deutschland), die Fluoreszenz-Emissionen bei 620 nm and 665 nm nach Anregung bei 350 nm gemessen. Das Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm wurde als Maß für die Menge des des Komplexes aus d2-markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper und damit indirekt als Maß für die Menge des in der Enzymreaktion gebildeten unmarkierten ADP genommen (höheres Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm » mehr Komplex aus d2-markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper ⇔ weniger ADP). Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0% Inhibition, alle anderen Assaykomponenten aber kein Enzym = 100% Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanzen auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μM bis 1 nM (20 μM, 6,7 μM, 2,2 μM, 0,74 μM, 0,25 μM, 82 nM, 27 nM, 9,2 nM, 3,1 nM und 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der 100fach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC₅₀-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde.
Assay B2 (= (B2))
Die hACC2-inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACC2-Assay gemessen.
Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymreaktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-Glo^TM-Nachweissystems der Firma Promega. Bei diesem wird zunächst das in der Enzymreaktion nicht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclase („ADP-GLO-Reagenz”) quantitativ in cAMP überführt, die Adenylatzyklase dann gestoppt und anschließend („Kinase Detection Reagenz”) wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt.
Als Enzym wurde rekombinantes C-terminal FLAG-getagtes humanes ACC2 (Acetyl-Coenzym A Carboxylase 2, GenBank Accession No. NP_001084) (Aminosäuren 27 – Ende) verwendet, exprimiert in Baculovirus-infizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG-Affinitätschromatographie.
Für den Assay wurden 50 nl einer 100fach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine weiße low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2,5 μl einer Lösung von hACC2 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCl₂, 2 mM Kaliumcitrat, 12 mM NaHCO₃, 2 mM Di-thio-threitol (DTT), 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2,5 μl einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 50 μM) und Acetyl-CoA (20 μM => Endkonzentration in 5 μl Assayvolumen ist 10 μM) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACC2 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 2 ng/μl. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2,5 μl des „ADP-GLO-Reagenz” (1:1,5-fach verdünnt) und die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überführen. Anschließend wurden 2,5 μl des „Kinase Detection Reagenz” (1,2fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als Maß für die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzymaktivität der hACC2 genommen. Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0% Inhibition, alle anderen Assaykomponente aber kein Enzym = 100% Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μM bis 1 nM (20 μM, 6.7 μM, 2.2 μM, 0.74 μM, 0.25 μM, 82 nM, 27 nM, 9.2 nM, 3.1 nM and 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der 100fach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC₅₀-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde.
Non-human ACCase-Assay
Der Assay wurde bei Raumtemperatur in einer durchsichtigen 384-well Mikrotiterplatte durchgeführt. Er bestimmt das aus ATP inder ACCase-Reaktion freigesetzte anorganische Phosphat.
Der Testansatz enthielt 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 0.5 mM ATP, 0.8 mM Dithiothreitol (DTT), 30 mM NaHCO₃, 0.1 mM Acetyl-CoA, 0.04% Rinderserumalbumin und 0.4 μg partiell gereinigtes ACCase-Enzym in einem finalen Volumen von 40 μl. Nach 45 Minuten Inkubation wurde die Reaktion mit 150 μl Malachitgrün-Lösung abgestoppt und die Extinktion bei 620 nach 30 Minuten ausgelesen.
Die Malachitgrün(MG)-Lösung wurde durch Mischen von 3 Teilen 0.6 mM MG-HCl-Lösung in destilliertem Wasser mit 1 Teil 8.5 mM Ammoniummolybdat in 4 M HCl hergestellt. Die Lösung wurde 30 Minuten stehen gelassen. Nach Filtration durch einen 0.45 μm Polytetrafluorethylen(PTFE)-Filter wurden 0.1 Teile Triton X-100 (1.5%) in destilliertem Wasser hinzugegeben.
ACCase-Enzym wurde aus 9 Tage nach der Aussaat geernteten Haferkeimlingen extrahiert und partiell aufgereinigt durch 0–40% Ammoniumsulfat Fällung gefolgt von einer Ionenaustausch-Chromatographie an Q-Sepharose.
Mode-of-action-Versuch
Vor der Bestimmung der Wirksamkeit im MCF-7 Modell wurde ein Teil der Testsubstanzen in einem „Mode of action”-Experiment untersucht. Prinzip dieses Experiments ist, dass die kurzzeitige Applikation einer Testsubstanz, die dazu in der Lage ist ACC1 und/oder ACC2 im lebenden Organismus nach oraler Applikation zu inhibieren, im Tumor zu einer Verringerung von Malonyl-CoA führt. Experimentell wurden hierfür 2 Mio humane MCF-7 Brustkrebszellen in weibliche Nacktmäuse (NMRI-nude (nu/nu) mice, Taconic M&B A/S, 1 Tag zuvor Applikation eines Pellets zur Freisetzung von Östrogen über einen Zeitraum von mindestens 60 Tagen) subcutan injiziert. Sobald der Tumor eine Fläche von ca. 60–70 mm² erreicht hatte, erfolgte die orale Applikation der Testsubstanz über einen Zeitraum von 1–3 Tagen, anschließend wurde zu definierten Zeitpunkten der intratumorale Gehalt an Malonyl-CoA bestimmt und mit der Vehikelkontrolle verglichen. Die Methode ist beschrieben in Anal Chem. 2008 Aug 1; 80 (15): 5736–42. Epub 2008 Jul 9.).
Cell-Assays
In Übereinstimmung mit der Erfindung, wurden die Substanzen in Zell-basierten Assays getestet, das bedeutet die Fähigkeit der Substanzen die Tumorzellproliferation nach einer 96stündigen Substanzinkubation zu hemmen. Die Zellviabilität wurde mittels dem CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) getestet. Die Zellen wurden in einer Dichte von 2000–5000 Zellen/Well (abhängig von der Zelllinie) in 100 μl Wachstumsmedium auf 96well Microtiterplatten ausgesät. Für jede untersuchte Zelllinie, wurden Zellen auf eine separate Platte zur Bestimmung der Lumineszenz an t = 0 Stunden und t = 96 Stunden ausgesät. Nach einer Übernachtinkubation bei 37°C, wurden die Lumineszenzwerte für die t = 0 Proben bestimmt. Die Dosis-Platten für die t = 96 Stunden Zeitpunkte wurden mit in Wachstumsmedium verdünnten Substanzen behandelt. Die Zellen wurden dann für 96 Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend die Lumineszenzwerte für die t = 96-Stunden Proben bestimmt. Für die Datenanalyse wurden die t = 0 Werte von den t = 96 Stunden Werte abgezogen für behandelte und unbehandelte Proben. Die prozentualen Unterschiede in der Luminescenz zwischen mit Substanz behandelten und Kontrollwerten wurden benutzt um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen.

Die Substanzen wurden in folgenden Zelllinien untersucht, die beispielhaft die angegebenen Indikationen vertreten:

Zelllinie	Quelle	Indikation
MCF7	ATCC	Hormonrezeptor-positives Mammakarzinom
PC3	ATCC	Prostatakarzinom
Du145	NCI	Prostatakarzinom
ECC1	ATCC	Endometriumkarzinom
KM12	NCI	Kolorektales Karzinom
HEC1A	ATCC	Endometriumkarzinom

Xenograft Modell
Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit im lebenden Organismus wurden Xenograft-Modelle in immunsupprimierten Mäusen verwendet.
Zunächst wurde hierzu die maximal tolerierbare Dosis (MTD) nach folgendem Protokoll ermittelt: Weibliche Nacktmäuse (NMRI-nude (nu/nu) mice, Taconic M&B A/S) erhielten über einen Zeitraum von 1, 2 oder 3 Wochen täglich oral eine definierte Dosis der Testsubstanz und wurden täglich bezüglich Sterblichkeit und Körpergewicht beobachtet. Als MTD definiert wurde die höchste verabreichbare Dosis, bei der während der Behandlungsphase und in der 7tägigen Nachbeobachtungszeit kein Tier starb und es nicht zu einem mehr als 10% Abfall des Körpergewichts im Vergleich zum Ausgangsgewicht kam.
Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit wurden dann verschiedene Xenograftmodelle verwendet, in denen die Testsubstanzen an ihrer MTD sowie in niedrigeren Dosierungen gegeben wurden. Neben verschiedenen anderen Modellen wurde primär das Brustkrebsmodell mit hormonabhängigen humanen MCF-7 Zellen in weiblichen Nacktmäusen (NMRI-nude (nu/nu) mice, Taconic M&B A/S) verwendet. Hierfür wurden diesen Mäusen am Tag vor der Tumorzellimplantation ein Pellet zur Freisetzung von Östrogen (17β-Estradiol 0.36 mg, Freisetzung über 60 Tage) subcutan appliziert. Pro Tier wurden dann am nächsten Tag 2 Mio Tumorzellen (suspendiert in Medium + Matrigel) 1:1, final 0,1 ml) in die Flanke subcutan injiziert. Wenn die Tumore 20–25 mm² Tumorfläche erreicht hatten, wurden die Mäuse in die Therapiegruppen randomisiert und mit der Therapie begonnen. Die Therapie wurde dann unter 2–3-mal wöchentlicher Messung von Tumorfläche und Körpergewicht fortgesetzt, bis die durchschnittliche Tumorgröße in der Kontrollgruppe, die nur den Vehikel der Testsubstanz erhalten hatte, oder in einer der Behandlungsgruppen 120 mm² erreicht hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Versuch in allen Gruppen abgebrochen und die präparierten Tumore gewogen. Als primärer Erfolgsparameter wurde der T/C-Wert kalkuliert entweder anhand des Effektes auf das Tumorgewicht oder auf die Tumorfläche errechnet: Mittelwert der Tumorgewichte/flächen in der Behandlungsgruppe dividiert durch den Mittelwert der Tumorgewichte/flächen in der Vehikelgruppe.
Analyse der ACC1 Expression in Tumor- and Normalgewebe
Die ACC1 Expression wurde mittels eines Microrrays bestimmt. Dafür wurde die RNA aus verschiedenen Tumorgeweben und den korrespondierenden Normalgeweben isoliert. Methodisch wurde Trizol RNA extraction Reagenz (Invitrogen) verwendet und eine Aufreinigung mittels des RNeasy Mini Kit (Qiagen) angeschlossen. Ausserdem wurde ein DNaseI (Qiagen) Verdau durchgeführt, um genomische DNA zu eliminieren. Zur Qualitätskontrolle wurde eine Analyse der totalen RNA mittels eines RNA LabChip auf einer Agilent Bioanalyzer 2100 Platform (Agilent Technologies) durchgeführt und die RNA Konzentration mittels des Peqlab NanoDrop Systems bestimmt. Zur Hybridisierung wurde der „one-cycle eukaryotic target labeling assay” von Affymetrix verwendet und der Array anschliessend auf einem AffymetrixGeneChip 3000 scanner (Affymetrix) ausgelesen. Auswertung und Qualitätskontrolle erfolgten unter Verwendung der Expressionist Pro 4.0 Refiner (GeneData) Software.
4. Ergebnisse:
4.1. Enzymassay

Die Tabelle 1 fasst die Ergebnisse in Bezug auf Verbindung A und der Vergleichsbeispiele aus den Enzymassays zusammen. Tab. 1

Bsp. Nr	ACC1 (= A1) IC50 [μmol/l]	ACC2 (= A2) IC50 [μmol/l]	ACC1 (= B1) IC50 [μmol/l]	ACC2 (= B2) IC50 [μmol/l]
V.1	0.28	0.37	0.084	0.822
V.2	0.327	1.414	0.428	2.61
A	0.129	0.690	0.102	1.38

Diese Werte zeigen, dass die Verbindung A und das Vergleichsbeispiel V.1 die Enzyme vergleichbar stark inhibieren, während das Vergleichsbeispiel V.2 unterlegen ist.
4.2 Cellassays

Die Tabelle 2 fasst die Ergebnisse in Bezug auf Verbindung A und der Vergleichsbeispiele aus den Cellassays zusammen. Tab. 2

Bsp. Nr	MCF7 IC50 [μmol/l]	PC3 IC50 [μmol/l]	Du145 IC50 [μmol/l]	ECC1 IC50 [μmol/l]	KM12 IC50 [μmol/l]	HEC-1A IC50 [μmol/l]
V.1	0.057
V.2	0.270
A	0.037	0.025	0.039	0.221	0.275	1.76

4.3 Maximal tolerierbare Dosis (MTD)
Vergleichsbeispiel V.1

Vergleichsbeispiel V.1 wurde weiblichen Nacktmäusen (NMRI nu/nu) appliziert:

Dosis:	s. Tab. 3
Applikationsart:	per os
Vehikel:	PEG400/Ethanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v) (Solutol HS 15: Polyoxyethylenester der 12-Hydroxystearinsäure)
Applikationsvolumen:	10 ml/kg
Schema:	s. Tab. 3

Der Behandlungsphase folgte eine Beobachtungsphase von 7 Tagen. Die dabei aufgetretenen Todesfälle sowie die Wirkung auf das Körpergewicht sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tab. 3

Substanz	Dosis (mg/kg)	Schema	Körpergewicht (%)	Todesfälle
V.1	10	14 Tage, 2mal täglich	minus 12	1 von 3
V.1	20	14 Tage, 2mal täglich	minus 29	2 von 3
V.1	30	14 Tage, 2mal täglich	minus 11	2 von 3

Vehikel		21 Tage, 1mal täglich	plus 15	0 von 5
V.1	15	21 Tage, 1mal täglich	minus 1	1 von 5
V.1	20	21 Tage, 1mal täglich	minus 2	1 von 5
V.1	25	21 Tage, 1mal täglich	minus 3	1 von 5

Demzufolge liegt die MTD für eine 14tägige Behandlung bei 2mal täglicher Gabe unterhalb von 10 mg/kg.
Demzufolge liegt die MTD für eine 21tägige Behandlung bei 1mal täglicher Gabe unterhalb von 15 mg/kg.
Da es in allen Gruppen zu Todesfällen und einem Körpergewichtsverlust kam, konnte die MTD nicht bestimmt werden.
Vergleichsbeispiel V.1 wurde nachfolgend im MCF-7 Brustkrebs-Xenograft-Modell weiblichen Nacktmäusen (NMRI nu/nu) appliziert:

Dosis: 7.5 mg/kg

Applikationsart: per os

Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 70/5/25, v/v/v)

Applikationsvolumen: 10 ml/kg

Schema: 27 Tage, 2mal täglich (2qd)

Mäuse: 10
Diese Dosis wurde bis zum Tag 37 des Experiments relativ gut vertragen (kein Körpergewichtsverlust, 1 von 10 Tieren gestorben). Eine therapeutische Wirksamkeit definiert als T/C-Wert von <= 0.5 konnte in dieser Dosisgruppe im Vergleich zur Vehikelkontrolle nicht beobachtet werden (T/C-Wert basierend auf Tumorfläche = 0,86).
2 zeigt die Tumorfläche in Abhängigkeit von der Anzahl der Tage nach Implantation der Tumorzellen.
Die verbleibenden Tiere wurden mit 10 mg/kg 2qd oder 12.5mg/kg 2qd bis zum Tag 43 weiterbehandelt. Diese beiden höheren Dosierungsschemata wurden jedoch schlecht vertragen (1 von 4 bzw. 4 von 5 Todesfälle)
Zusammenfassend ist das therapeutische Fenster des Vergleichsbeispiels V.1, sofern überhaupt vorhanden, als sehr klein anzunehmen.
Verbindung A
Verbindung A wurde weiblichen Nacktmäusen (NMRI nu/nu) appliziert:

Dosis: s. Tab. 4

Applikationsart: per os

Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 70/5/25, v/v/v)

Applikationsvolumen: 10 ml/kg

Schema: s. Tab. 4

Der Behandlungsphase folgte eine Beobachtungsphase von 7 Tagen. Die dabei aufgetretenen Todesfälle sowie die Wirkung auf das Körpergewicht sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tab. 4

Substanz	Dosis (mg/kg)	Schema	Körpergewicht (%)	Todesfälle
Vehikel		21 Tage, 1mal täglich	plus 5	0 von 5
Verbindung A	20	21 Tage, 1mal täglich	plus 2	0 von 5
Verbindung A	30	21 Tage, 1mal täglich	plus 1	0 von 5
Verbindung A	40	21 Tage, 1mal täglich	minus 3	1 von 5
Verbindung A	50	21 Tage, 1mal täglich	minus 29	5 von 5
Verbindung A	60	21 Tage, 1mal täglich	minus 24	5 von 5

Demzufolge liegt die MTD für eine 21tägige Behandlung bei 1mal täglicher Gabe unterhalb von 40 mg/kg und oberhalb von 30 mg/kg.

Verbindung A wurde nachfolgend im MCF-7 Brustkrebs-Xenograft-Modell weiblichen Nacktmäusen (NMRI nu/nu) appliziert:

Dosis:	s. Tab. 5
Applikationsart:	per os
Vehikel:	PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 70/5/25, v/v/v)
Applikationsvolumen:	10 ml/kg
Schema:	30 Tage, 1mal täglich (qd)
Mäuse pro Dosisgruppe:	10–13

Tab. 5

Substanz	Dosis (mg/kg)	T/C (basierend auf Tumorfläche	T/C (basierend auf Tumorgewicht)
Vehikel		1.00	1.00
Verbindung A	20	0.56 (ns)	0.42 (p = 0.003)
Verbindung A	25	0.51 (p < 0.05)	0.37 (p < 0.001)
Verbindung A	30	0.49 (p < 0.05)	0.35 (p < 0.001)
Verbindung A	35	0.44 (p < 0.05)	0.31 (p < 0.001)

Zur statistischen Evaluierung des Experiments wurde für die auf der Tumorfläche basierenden T/C-Werte der nicht-parametrische ANOVA-Test verwendet, da keine Normalverteilung der Messwerte vorlag. Anschließend erfolgte der Vergleich aller Therapiegruppen versus der Vehikelgruppe mittels des Dunns Posttest. Die resultierenden p-Werte sind in der Tabelle gezeigt (ns: nicht signifikant = p > 0.05). Da für die auf dem Tumorgewicht basierenden T/C-Werte eine Normalverteilung vorlag, wurde zur Analyse der ANOVA-Test für parametrische Werte verwendet. Anschließend erfolgte der Vergleich aller Therapiegruppen versus der Vehikelgruppe mittels des Bonferroni Posttest. Die resultierenden p-Werte sind in der Tabelle 5 gezeigt.
Da in diesem Experiment alle verwendeten Dosisgruppen den Zielwert einer T/C (basierend auf dem Tumorgewicht) von < 0.5 erreichten, wurde eine statistische Evaluierung des Experiments durchgeführt, deren Ergebnisse ebenfalls in der Tabelle 5 gezeigt werden. Die Verbindung A inhibierte statistisch signifikant das Tumorwachstum (basierend sowohl auf Tumorgewicht und Tumorfläche) ab einer Dosis von 25 mg/kg bei 1mal täglicher Gabe. Basierend auf dem Tumorgewicht war dieser Effekt bereits statistisch signifikant ab einer Dosis von 20 mg/kg bei 1mal täglicher Gabe.
3 zeigt die Tumorfläche in Abhängigkeit von der Anzahl der Tage nach Implantation der Tumorzellen.
Der Vergleich zwischen Vergleichsbeispiel V.1 und der Verbindung A zeigt demnach, dass für das Vergleichsbeispiel V.1 selbst bei einer nicht gut tolerierten Dosis keine antitumorale Wirksamkeit zu beobachten ist, während biologisch bedeutsame und signifikante antitumorale Effekte für die Verbindung A in einem tolerierbaren Dosisbereich von 20 mg/kg qd bis 35 mg/kg qd festzustellen sind.
ACC1 Expression in Tumor- und Normalgewebe
Die ACC1 Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe wurde mittels Microarray bestimmt (1). Die Expression von ACC1 war signifikant hochreguliert im Vergleich zum Normalgewebe in Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Bronchialkarzinomen und Pankreaskarzinomen.
5. Formulierung
Tabletten enthaltend Verbindung A
a) Herstellung einer Pharmazeutischen Formulierung durch Direkttablettierung
Es wurden Tabletten gemäß der Zusammensetzung aus Tabelle 6 enthaltend die Verbindung A mittels einer Direkttablettierung hergestellt. Tab. 6

Ausgangsstoffe Masse/Tablette [mg]

Verbindung A 80,0

Mannitol, sprühgetrocknet 67,0

Cellulose, mikrokristallin 40,0

Na-Croscarmellose 10,0

Magnesiumstearat 3,0

gesamt 200,0
Die pharmazeutische Formulierung kann durch geeignete Verfahren, insbesondere Pulvermischung und Direkttablettierung in beliebigem Scale hergestellt werden.
Für die Herstelluung von 50 Tabletten wurden in einer Fantaschale

3,351 g Mannitol, sprühgetrocknet

2,004 g Cellulose, mikrokristallin

0,499 g Na-Croscarmellose und

3,992 g Beispielverbindung 1–118

durch vorsichtiges Verreiben vorgemischt. Die Mischung wurde in ein 100 ml Schraubdeckelglas überführt und 10 Minuten in einem Turbula-Mischer homogenisiert. Nach Hinzufügung von 0,149 g Magnesiumstearat wurde erneut für 1 min im Turbula-Mischer gemischt.
Die so erhaltene Pressmasse wurde mittels einer Exzenter-Tablettenpresse (Korsch EK 2) zu bikonvexen Tabletten mit einem Durchmesser von 8 mm und einem Wölbungsradius von 12 mm verpresst.
b) Bruchfestigkeit
Die Bruchfestigkeit (mittels Schleuniger Bruchfestigkeitstester), Masse und Zerfallszeit in Wasser bei 37°C (mittels der in der Monographie 2.9.1 Europäischen Pharmakopoe beschriebenen Apparatur) der erhaltenen Tabletten wurde zu Anfang, Mitte und Ende des Tablettierprozesses geprüft.

Bruchfestigkeit Masse Zerfallszeit

Anfang 81 N 198,7 mg 1:28 min

Mitte 95 N 196,8 mg 1:28 min.

Ende 97 N 199,0 mg 1:32 min.

Mittel 91 N 198,2 mg 1:29 min.
c) In-vitro Dissolution

Die in-vitro-Freisetzung der Verbindung A aus den hergestellten Tabletten wurde mittels Apparatus 2 (Paddle-Methode) gemäß USP bestimmt. Der Freisetzungstest wurde jeweils in 900 mL unterschiedlicher Medien bei 37°C und mit einer Rührgeschwindigkeit von 75 Undrehungen pro Minute durchgeführt. Jede Bestimmung wurde dreifach durchgeführt. Die Gehaltsbestimmung erfolgte per HPLC. Tabelle 7 und 4 zeigen die Ergebnisse. Tab. 7

Medium	% freigesetzt nach
	15 min	30 min	45 min	60 min	90 min
0,1 N HCl + 1% SDS* (pH 1)	20,5%	32,1%	37,1%	41,2%	45,3%
USP Phosphatpuffer pH = 6.8 + 1% SDS*	43,2%	55,6%	62,0%	65,7%	70,1%
USP Phosphatpuffer pH = 8.0	80,1 %	87,5 %	89,6 %	90,4 %	91,2 %

* SDS = Natriumlaurylsulfat (zugesetzt, da Löslichkeit bei pH 1 und pH 6,8 nicht ausreichend ist)

d) Kurzzeit-Stabilität der Pharmazeutische Formulierung
Die hergestellten Tabletten wurden einer Kurzzeit-Stabilitätsprüfung für 1 Monat bei 25°C/60% relative Feuchte und bei 40°C/75% relative Feuchte unterzogen. Die Tabletten waren unter beiden Bedingungen stabil hinsichtlich Gehalt und Abbauprodukten, untersucht mittels HPLC.
Figuren:
1: ACC1 Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe
2: Therapeutische Wirksamkeit von Vergleichsbeispiel V.1 in Hormon-abhängigen MCF-7 Brustkrebs-Xenograft-Modell.
3: Therapeutische Wirksamkeit von Verbindung A in Hormon-abhängigen MCF-7 Brustkrebs-Xenograft-Modell.
4: Freisetzungskurve von Verbindung A aus Tabletten
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verwendung von (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Herstellung eines Medikamentes.
Verwendung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Verwendung gemäß Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Verwendung von (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen des Menschen oder eines anderen Säugetiers.
Verwendung gemäß Anspruch 4 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Verwendung gemäß Anspruch 5 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Verwendung als Arzneimittel.
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Pharmazeutische Formulierung in Form einer Tablette enthaltend (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen. Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on in Kombination mit einem weiteren Wirkstoff