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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Mikrofluidik-Technologie basierte
Einweg-Testkassette zur Bioassay von Analyten mittels Bio- und/oder
Chemosensoren, eine Vorrichtung zur Bioassay von Analyten mittels
Bio- und/oder Chemosensoren umfassend die erfindungsgemäße
Testkassette, ein Verfahren zu Bedienung dieser Testkassette, sowie
ihre Verwendung in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich,
der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz.
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Als
Bio- oder Chemosensoren bezeichnet man Geräte, die mit
Hilfe eines Signalwandlers und einer Erkennungsreaktion einen Analyten
qualitativ oder quantitativ nachweisen können. Als Erkennungsreaktion
wird ganz allgemein die spezifische Bindung oder Reaktion eines
sogenannten Analyten mit einem sogenannten Erkennungselement bezeichnet.
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Beispiele
für Erkennungsreaktionen sind die Bindung von Liganden
an Komplexe, die Komplexierung von Ionen, die Bindung von Liganden
an (biologische) Rezeptoren, Membranrezeptoren oder Ionenkanäle,
von Antigenen oder Haptenen an Antikörper, von Substraten
an Enzyme, von DNA oder RNA an bestimmte Proteine, die Hybridisierung
von DNA/RNA/PNA oder die Prozessierung von Substraten durch Enzyme.
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Analyten
können sein: Ionen, Proteine, natürliche oder
künstliche Antigene oder Haptene, Hormone, Cytokine, Mono-
und Oligosaccharide, Stoffwechselprodukte, oder andere biochemische
Marker, die in der Diagnostik verwendet werden, Enzymsubstrate,
DNA, RNA, PNA, potentielle Wirkstoffe, Medikamente, Zellen, Viren.
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Beispiele
für Erkennungselemente sind: natürliche oder künstliche
Rezeptoren wie z. B. Komplexbildner für Metalle/Metallionen,
Cyclodextrine, Kronenether, Antikörper, Antikörperfragmente,
Anticaline Enzyme, DNA, RNA, PNA, DNA/RNA-bindende Proteine, Membranrezeptoren,
Ionenkanäle, Zelladhäsionsproteine, oder auch
Ganglioside, Enzyme, Mono- oder Oligosaccharide und Haptamere.
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Diese
Bio- oder Chemosensoren können in der Umweltanalytik, dem
Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik
und dem Pflanzenschutz eingesetzt werden, um Analyten qualitativ und/oder
quantitativ zu bestimmen. Die Spezifität der Erkennungsreaktion
ermöglicht es, auch Analyten in komplexen Proben wie z.
B. Umgebungsluft, verschmutztem Wasser oder Körperflüssigkeiten
ohne oder nur mit geringer vorheriger Aufreinigung qualitativ oder
quantitativ zu bestimmen. Zusätzlich können Bio-
oder Chemosensoren auch in der (bio-)chemischen Forschung und Wirkstoffsuche
eingesetzt werden, um die Interaktion zwischen zwei unterschiedlichen
Substanzen zu untersuchen (z. B. zwischen Proteinen, DNA, RNA, oder
biologisch aktiven Substanzen und Proteinen, DNA, RNA etc.).
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Eine
neue Klasse von elektrischen Biosensoren beruht auf dem Nachweis
von Analyten, die durch metallische Partikel, z. B. Nanopartikel
markiert sind. Zur Detektion werden diese Partikel durch autometallographische
Abscheidung soweit vergrößert, dass sie einen
mikrostrukturierten Stromkreis kurzschließen. Dies wird
durch eine einfache Gleichstrom-Widerstandsmessung demonstriert
(
US 4,794,089 ;
US 5,137,827 ;
US 5,284,748 ). Die Detektion von Nukleinsäuren
durch Gleichstrom-Widerstandsmessung wurde jüngst demonstriert
(
R. Möller, A. Csáki, J. M. Köhler,
and W. Fritzsche, Langmuir 17, 5426 (2001)).
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Feldeffekttransistoren
können als elektronische Transducer z. B. für
eine enzymatische Reaktion eingesetzt werden (Zayats et
al. Biosens. & Bioelectron.
15, 671 (2000)).
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Als
mechanische Transducer werden Schwingquarze beschrieben, bei denen
die Veränderung der Resonanzfrequenz durch Massenbelegung erfolgt
(Steinern et al. Biosens. & Bioelectronics 12, 787 (1997)).
In einem alternativen mechanischen Transducer werden mit Interdigitalstrukturen
Oberflächenwellen angeregt, die durch Targetadsorption modifiziert
werden (Howe et al., Biosens. & Bioelectron. 15, 641 (2000)).
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Werden
die Targetmoleküle mit magnetischen Beads markiert, so
kann die Erkennungsreaktion über den magnetischen Einfluss
der Beads auf den Giant Magnetic Resistance (GMR) eines entsprechenden
Widerstands detektiert werden (Baselt et al. Biosens. and
Bioelectron. 13, 731 (1998)).
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Die
Integration der Erkennungsreaktion mit dem Signalwandler zu einem
Bio- oder Chemosensor kann geschehen, indem man das Erkennungselement
oder den Analyten auf der Oberfläche des Signalwandlers
immobilisiert. Durch die Erkennungsreaktion, d. h. das Binden oder
die Reaktion des Analyten mit dem Erkennungselement, ändern
sich die optischen Eigenschaften des Mediums direkt an der Oberfläche
des Signalwandlers (z. B. Änderung des optischen Brechungsindexes,
der Absorption, der Fluoreszenz, der Phosphoreszenz, der Lumineszenz etc.),
was vom Signalwandler in ein Messsignal übersetzt wird.
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Optische
(planare) Wellenleiter sind eine Klasse von Signalwandlern, mit
denen man die Änderung der optischen Eigenschaften eines
Mediums detektieren kann, das an eine wellenleitende Schicht, typischerweise
ein Dielektrikum, grenzt. Wird Licht als geführte Mode
in der wellenleitenden Schicht transportiert, fällt das
Lichtfeld an der Grenzfläche Medium/Wellenleiter nicht
abrupt ab, sondern klingt in dem an den Wellenleiter angrenzenden
sogenannten Detektionsmedium exponentiell ab. Dieses exponentiell
abfallende Lichtfeld wird als evaneszentes Feld bezeichnet. Werden
sehr dünne Wellenleiter verwendet, deren Brechungsindex
möglichst stark von dem des angrenzenden Mediums differiert,
werden Abfalllängen des evaneszenten Feldes (Intensität
fällt auf den Wert l/e ab) von < 200 nm erreicht. Ändern sich
die optischen Eigenschaften des an den Wellenleiter grenzenden Mediums – z.
B. durch Änderung des optischen Brechungsindexes (
US 4 815 843 ;
US 5 442 169 ) oder der Lumineszenz
(
US 5 959 292 ;
EP 0 759 159 ;
WO 96/35940 ) – innerhalb
des evaneszenten Feldes, kann dies über einen geeigneten
Messaufbau detektiert werden. Entscheidend für die Verwendung
von Wellenleitern als Signalwandler in Bio- oder Chemosensoren ist
dabei, dass die Änderung der optischen Eigenschaften des
Mediums nur sehr nahe an der Oberfläche des Wellenleiters detektiert
wird. Wird nämlich das Erkennungselement oder der Analyt
an der Grenzfläche des Wellenleiters immobilisiert, kann
das Binden an das Erkennungselement oder die Reaktion des Erkennungselementes
oberflächensensitiv detektiert werden, wenn sich dabei
die optischen Eigenschaften des Detektionsmediums (flüssig,
fest, gasförmig) an der Grenzfläche zum Wellenleiter ändern.
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Um
die Bedienung von Chemo- bzw. Biosensoren zu vereinfachen, wird
schon seit einigen Jahren versucht, diese Geräte zu verkleinern
und möglichst alle Reagenzien, die zur qualitativen und/oder quantitativen
Bestimmung einer Probe benötigt werden, in einer sogenannten
Testkassette „ready–to-use” fertig zu
stellen. Insbesondere wird die Mikrofluidik-Technologie eingesetzt
und dabei angestrebt, kostengünstige, lagerfähige
und einfach zu bedienende Einweg-Kassetten zur Verfügung
zu stellen, die zeitecht reproduzierbare Ergebnisse liefern können.
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Bekannte
Herausforderungen eines Mikrofluidsystems sind, dass:
- – das Mischen des Analyten mit dem Detektionreagenzen
zur Detektion wegen der nicht genau kontrollierbaren Laminarströmungen
nicht optimal verläuft,
- – der laminare Fluss durch unterschiedliche Oberflächeneigenschaften
beeinflusst wird, die bei der Herstellung und Lagerung einer Testkassette schwer
kontrollierbar sind, wie z. B. Oberflächenladung, Verschmutzung,
Hydrophobie, Benetzung etc.
- – Luftblasen sich bei der Beförderung der
Flüssigkeit bilden können,
- – die Flüsse und insbesondere deren Volumen und
Geschwindigkeit nicht genau kontrollierbar sind,
- – eine genaue zeitliche Kontrolle der einzelnen Reaktionsschritte
in dem Lateral Flow nicht möglich ist.
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Z.
B. beschreibt
DE102005011530 eine
mikrofluidische Vorrichtung zum Echtzeit-quantitativen Bestimmen
einer sehr kleinen Menge von Analyten. Die Echtzeitauswertung wird
erreicht, dadurch dass die Probe in eine Detektionseinheit fließt.
Die Detektionseinheit besteht aus einem Fließkanal, in
dem Analytenfängereinheiten zum Fangen des Analyten z.
B. Antikörper auf einer Vielzahl von Analytdetektionseinheit
entlang des Fließkanals immobilisiert sind. Das quantitative
Bestimmen des Analyten erfolgt z. B. mittels eines optischen Signals.
Die Analytenprobe wird z. B. mit einer Mikropumpe in den Fließkanal
befördert. Ziel der o. g. Vorrichtung ist, die Anzahl von
Analyten, die durch die Analytfängereinheit in der Richtung
des Fließens gefangen werden, zu optimieren. Die Analyten
werden über einen breiten Bereich (die Länge des
Fließkanals) quantitativ bestimmt, ohne die Detektionsempfindlichkeit
zu verringern. Diese Vorrichtung besteht aus einer Vielzahl von
mikroskopischen Bestandteilen auf der Basis der Halbleitertechnologien
oder mikroskopischen Präzisionsvorrichtungen-Mikropumpen,
Mikroventile, Sensoren und dergleichen, die miniaturisiert, akkumuliert und
integriert sind. Die Herstellung und Betrieb dieser Vorrichtung
ist aber zu kompliziert und teuer für eine mögliche
Anwendung als Einweg-Testassay.
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WO2005/070533 beschreibt
eine mikrofluidische Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines
Analyten in einer Probeflüssigkeit mit einem strukturierten
Körper, der Kammersysteme verbunden mit Kanalsysteme, ggf.
mit eingebauten Filtereinheiten mit einem Einlass und einem Auslass,
aufweist und der auf mindestens einer Seite mit einer Verschlussschicht
verschlossen ist. Diese Vorrichtung weist eine Reaktionskammer auf,
die Reagenzien zur Bindung zu mindestens einer Komponente der Probeflüssigkeit
enthält, die entweder auf dem Deckel der Kammer oder auf
beschichteten Partikeln immobilisiert sind. Eine Probekammer wird
durch den Einlass mit der Probeflüssigkeit befüllt
und der Einlass wird mittels eines Deckels abgeschlossen. Die Probeflüssigkeit
wird mittels einer Pumpe von der Probekammer durch ein Kanalsystem
in die Reaktionskammer befördert. Die Vorrichtung verfügt über weitere
Kanalsysteme, die eine Labelflüssigkeit und eine Waschflüssigkeit
enthalten, und ein Abfuhrkanalsystem zur Evakuierung von Abfallflüssigkeiten. Verschiedene
Teile der komplexen Kanalsysteme können mittels weicher
Dichtungen verschlossen werden, die sich unter geringem Druck nach
Bedarf aufbrechen lassen. Die Flussrichtung in der Vorrichtung wird
mittels Ventile und bürstenähnlicher oder ventilähnlicher
Flussdioden sichergestellt. Nach der Reaktion der Reaktionskammer
mit dem Bindungsreagenz wird die Labelflüssigkeit der Reaktionskammer
zugefügt und die nicht-immobilisierten Anteile der Probeflüssigkeiten
mittels Waschflüssigkeit abgewaschen. Die Detektion der
Reaktion erfolgt durch Bemessung eines optischen oder magnetischen
Signals in der Reaktionskammer. Optische Signale werden durch den
Deckel der Reaktionskammer gemessen. Die o. g. Verschlussschicht
bildet den Deckel der Reaktionskammer und ist entsprechend transparent. Die
Vorrichtung ermöglicht eine genaue Kontrolle der Volumen
und Reaktionszeiten. Der Aufbau dieser Vorrichtung erfordert aber
mehrere Vorgänge in der Reaktionskammer bevor bemessen
werden kann und ist entsprechend aufwändig. Durch die verwendeten
fluidischen Elemente wird die Vorrichtung sehr komplex, was sich
in Störanfälligkeit und hohen Produktionskosten
niederschlägt. Die Nutzung von fluidischen Elementen verringert
außerdem die Lagerfähigkeit der Vorrichtung.
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Zur
Lagerfähigkeit und Transportierbarkeit von Kassetten wird
im Stand der Technik insbesondere die Trocken-Assay-Technologie
eingesetzt, bei der alle Reagenzien im trockenen Zustand in der Kassette
ggf. in getrennten Kammern bereit stehen. Die Probeflüssigkeit
wird üblicherweise mittels mikrofluidischer Känale
von einer Kammer in die nächste weiterbefördert.
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WO 2005/088300 beschreibt
eine integrierte mikrofluidische Testkassette zur Blutanalyse, die
aus einem unteren und einem oberen Körperteil besteht. Beide
Elemente werden mit Kammern und Kanälen strukturiert, die
durch das Zusammenfügen der beiden Teile geschlossen werden.
Die Testkassette weist ein oder mehrere Vorbehandlungselemente (Vorbehandlungskammer
oder -kanäle) zur Vorbereitung einer Probe, eine oder mehrere
mehrschichtige Trocken-Assay-Elemente (Detektionskammer) zur Erkennung
einer oder mehrerer Analyten der Probe, und ein oder mehrere Kanäle
(Durchschnitt <=
3 mm), die die Vorbehandlungselemente mit den mehrschichtigen Trocken-Assay-Elementen
verbinden, auf. Die Vorbehandlungselemente sind insbesondere Filterelemente
oder Elemente mit porösen Eigenschaften in Form eines Kanals
oder eines (Mikro/Nano)-Kissens, die ggf. trockene Reagenzien tragen. Die
Probe wird zuerst durch die Vorbehandlungselemente, dann in das
mehrschichtige Trocken-Assay-Element geführt. Das mehrschichtige
Trocken-Assay-Erkennungselement weist mindestens eine funktionelle
Schicht, die Erkennungselemente für einen qualitativen
und quantitativen Assay in trockener und stabiler Form trägt,
auf. Diese Reagenzschicht besteht aus einer wasserabsorbierenden Schicht,
in der anregbare Erkennnungselemente einigermaßen regelmäßig
in einem hydrophilischen Polymerbindematerial (Gelatin, Agarose,
usw.) verteilt sind. Die Detektion erfolgt durch Reflektionsphotometrie
durch ein Licht-durchsichtiges Fenster, durch Einstrahlen einer
Detektionsschicht im mehrschichtigen Trocken-Assay-Element, in der
die optisch anregbare Flüssigkeit aus der Erkennungsreaktion
diffundiert ist. Zur Beförderung der Probe werden z. B.
kapillarische Kräfte oder Druck verwendet. Nachteil dieser
Vorrichtung ist, dass der Aufbau des mehrschichtigen Trocken-Assay-Elements
aufwändig ist. Eine genaue Kontrolle der Volumen, des Vermischens
und der Inkubationzeiten ist nicht möglich, so dass die
Testergebnisse quantitativ nicht reproduzierbar sind.
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Sowohl
in
WO 2005/088300 als
in
WO 2005/070533 wird
die Kassette in eine Vorrichtung zur Bedienung der Kassette eingeführt,
die eine Lichtquelle zur Einstrahlung der Reaktionskammer, einen
Filter zur Konzentration des Signals aus der Reaktionskammer und
eine Detektionseinheit aufweist.
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Lateral
Flow Assays (LFA) sind schon seit vielen Jahren für die
biochemische Analyse bekannt. Lateral Flow Assays (LFA) nutzen den
Effekt der Antikörper-Antigen Reaktion aus. Zusätzlich
wird die zu analysierende Probe (Lösung) durch Kapillärkräfte über
die Sensoroberfläche gezogen. Zum Nachweis von Analyten
mittels LFA kann beispielsweise ein direkter, kompetitiver Immunoassay
auf einem Nitrozellulosestreifen ausgeführt werden, wobei
die zu analysierende Probe aufgrund von Kapillarkräften durch
den gesamten Nitrozellulosestreifen durchgezogen wird. Die Zone,
in der der Anti-Analyt-Antikörper immobilisiert wurde,
dient als Detektionszone für den Streifentest. Ein Beispiel
für einen LFA-Assay zum Nachweis von Mykotoxinen (z. B.
Deoxynivalenol) ist der ”Reveal-Assay” (Testkassette)
der Firma Neogen, Lansing, MI, USA mit dem dazugehörigen Auslesegerät ”AccuScan”.
Die Testkassette wird in das Auslesegerät eingeführt
und das Gerät nimmt ein Bild des Ergebnisbereichs des Streifentests.
Das Auslesegerät interpretiert das Ergebnisbild und wenn eine
Linie erkannt wird, wird eine Bewertung abgegeben. Das Gerät
eliminiert die Subjektivität der Interpretation und gibt
eine objektive, nachvollziehbare Dokumentation des Testergebnisses.
Der beschriebene Test ist einfach und relativ schnell durchzuführen
und kommt ohne aufwändige Auslesegeräte aus. Nachteilig
ist, dass das Verfahren nur einen qualitativen Mykotoxin-Nachweis
erlaubt.
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Aus
dem Stand der Technik bestand Bedarf nach einem kostengünstigen,
lagerfähigen und einfach zu bedienenden Mittel zur Durchführung
von biochemischen Testverfahren zur Bioanalytik, Umweltanalytik,
Agrodiagnostik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik
und dem Pflanzenschutz, um Analyten qualitativ und/oder quantitativ
zu bestimmen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung
eine reproduzierbare quantitative Echtzeitbestimmung mittels einer
einfachen Vorrichtung, mit einfachem Handling zu ermöglichen.
Hierfür sollte die vorliegende Erfindung die Kontrolle
der Reaktionsbedingungen, insbesondere Volumen und Zeiten, aber
am Besten auch ein optimales Vermischen und die Kontrolle der Betriebstemperatur
ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine mikrofluidische
Testkassette zur qualitative und/oder quantitativen Analyse von
Analyten, die alle für die Durchführung des Testverfahrens
benötigten Reagenzien in trockener Form beinhaltet, gelöst.
Die erfindungsgemäße Testkassette weist einen
strukturierten Körper auf, in den Kavitäten, die
miteinander durch Kanäle verbunden sind, eingebracht wurden. Erfindungsgemäß weist
die Testkassette mindestens einen Einlass zur Einführung
einer Analyten enthaltenden Probeflüssigkeit, mindestens
eine Reagenzienkammer, in der ein oder mehrere Reagenzien zur Reaktion
mit dem Analyten oder zum Vermischen mit der Probeflüssigkeit
untergebracht sind, und mindestens eine Detektionskammer auf, in
der ein Signal zum Nachweis oder quantitativen Analyse des Analyten
detektiert wird, und ist dadurch gekennzeichnet, dass:
- – der Boden oder die Decke der Detektionskammer ein
Signalwandler oder ein Fenster zur Detektion eines Signals ist,
- – die Kanäle so gestaltet sind, dass die Probeflüssigkeit
nicht durch Kapillarkräfte bis in die Kammer bzw. zur Öffnung
gezogen ist,
- – die Reagenzien in der Reagenzienkammer und gegebenenfalls
weitere Reagenzien in der Detektionskammer in trockener Form untergebracht sind.
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Im
Sinne der Erfindung wird in den Kanälen und in den Kammern
ein präzis definiertes Volumen Probeflüssigkeit
befördert, was durch die Gestaltung der Kanäle
und den Einsatz eines geeigneten Mittels zur Beförderung
der Probeflüssigkeit ermöglicht ist. Dabei können
Reaktionszeiten ebenfalls genau kontrolliert werden, was zur besseren
Reproduzierbarkeit der Analyse beiträgt. Durch das passende
Design der Kammer und Kanäle wird ein optimales Flussprofil
mit reduziertem Totvolumen und optimalen Kontakt mit dem ggf. vorhandenen
immobilisierten Detektionreagenzien gewährleistet. In den
Kammern werden verschiedene Reaktionsschritte, wie z. B. Rekonstitution
der Reagenzien, Vermischung der Reagenzien mit der Probeflüssigkeit,
Reaktion zwischen Reagenzien und Analyten, durchgeführt.
Bei der vorliegenden Erfindung erfolgt der Detektionsschritt direkt
nach einer Erkennungsreaktion ohne vorherigen Waschgang, was den
Aufbau der Kassette und deren Handling weiter vereinfacht.
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Der
Körper kann transparent oder lichtdicht sein und aus verschiedenen
Polymermaterialien wie z. B. Polyoxymethylen (POM), Polymethymethacrylat (PMMA),
Polystyren (PS), Polypropylen (PP), Polyamid, Polycyclic olefine,
Polycarbonate, Polyethylen (PE), Polyethylenterephtalate (PET),
Polydimethylsiloxane (PDMS), natürliches Kautschuk oder
Derivate davon, Polyurethane, Teflon oder Analoga davon, oder verschiedenen
anorganischen Werkstoffen, wie z. B. Glas, Quartz, Silizium bestehen.
Bevorzugt ist die Verwendung von POM und Polyamid. Hergestellt werden
die Körper mit bekannten Verfahren, wie z. B. maschinelle
Bearbeitung (Fräsen etc.), Spritzguss, Prägetechniken
oder bei Glas/anorg. Materialien durch Photolithographie/Ätzen
oder andere bekannte Verfahren.
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Die
Form und Größe der Testkassette kann beliebig
sein, solange das Gesamtvolumen der Testkassette gering bleibt und
sie einfach zu handeln ist.
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Vorzugsweise
werden in den Körper die Kammer und die Kanäle
eingearbeitet und auf mindestens einer Seite mittels einer Verschlusseinheit mit
Ausnahme des Einlasses und üblicherweise von optionalen
Luftöffnungen und/oder einer Probekammer verschlossen.
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Es
ist vorteilhaft, die Temperatur in der Reagenzienkammer und in der
Detektionskammer während des Betriebs der Testkassette
zu kontrollieren.
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Hierfür
ist vorzugsweise die Testkassette so aufgebaut, dass sie per Kontakt
mit temperierbaren Elementen temperiert werden kann.
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Vorzugsweise
ist das Design der Testkassette so gestaltet, dass die optionale
Probenkammer, die Reagenzienkammer und die Detektionskammer nach
der Unterseite des Körpers gerichtet sind. Der Signalwandler
oder das Fenster zur Detektion bilden dann vorzugsweise den Boden
der Detektionskammer. Vorzugweise wird diese Seite der Kassette
mit einer dünnen Verschlusseinheit, insbesondere eine Verschlussfolie
verschlossen. Die Verschlusseinheit kann lichtdicht oder transparent
sein. Wenn man die Kassette auf eine temperierte Oberfläche
legt, kann so ein schneller Temperaturausgleich zwischen temperierter
Unterlage und Probenlösung in den Kammern stattfinden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Testkassette ist die Verschlusseinheit eine Verschlussfolie von
30 μm bis 1000 μm, bevorzugt 50 μm bis
500 μm, dick. Es ist dabei vorteilhaft, wenn die Verschlussfolie
straff über den Körper befestigt werden kann und
sich nicht biegen kann. Beispielsweise können Polyolefinfolien
oder Folien aus polymethylmethacrylate (PMMA) als Verschlussfolien
verwendet werden.
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In
einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die
Verschlusseinheit auf der oberen und unteren Seite der Testkassette
aufgebracht. Dies vereinfacht die Herstellung der erfindungsgemäßen Testkassette.
Die oberen und unteren Verschlussfolien können gleich oder
unterschiedlich dick sein.
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Die
Verschlusseinheiten können mit den im Stand der Technik üblichen
Bindungstechniken auf den Körper befestigt werden, wie
z. B. Schweißen oder Kleben ggf. mit Hilfe von Klebstoff.
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Im
Sinne der Erfindung wird in den Kammern ein präzise definiertes
Volumen Flüssigkeit für eine bestimmte Zeit aufgehalten
und nach dieser Zeit weiterbefördert.
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In
der erfindungsgemäßen Testkassette werden üblicherweise
von 1 bis 1000 μl, bevorzugt 10 bis 500 μl, besonders
bevorzugt 10 bis 250 μl befördert.
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Die
Form der Kammer kann beliebig sein. Bevorzugt werden viereckige
Detektionskammern und/oder runde Reagenzienkammern.
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Die
Volumen der Kammern betragen üblicherweise 1 bis 1000 μl,
bevorzugt 10 bis 500 μl.
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Die
Probenkammer ist typischerweise rund mit vorzugsweise 5 bis 15 mm,
bevorzugt 8 bis 12 mm Durchmesser. Die Reagenzienkammer ist üblicherweise
rund mit vorzugsweise 5 bis 15 mm, bevorzugt 5 bis 10 mm Durchmesser.
Beide Kammern können ein Flüssigkeitsvolumen von
1 bis 1000 μl aufnehmen.
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Die
Detektionskammer ist üblicherweise viereckig mit Dimensionen
von vorzugsweise 5 bis 15 mm breit und 5 bis 15 mm lang, besonders
bevorzugt 10 mm × 10 mm und nimmt typischerweise ein Flüssigkeitsvolumen
von 1 bis 1000 μl auf, wobei sie erfindungsgemäß von
der Flüssigkeit vollständig gefüllt werden
muss.
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Der
Aufbau der Probenkammer, Reagenzienkammer und Detektionskammer soll
ein optimales Flussprofil mit reduziertem Totvolumen und optimalen
Kontakt mit den ggf. vorhandenen immobilisierten Detektionreagenzien
gewährleisten.
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Die
Kanäle können gerade oder gebogen, bevorzugt gerade
mit eckigen Wendungen sein. Hierdurch können relativ lange
Kanäle in die begrenzte Fläche der Kassette eingebracht
werden. Die Form des Kanalsquerschnitts ist beliebig, üblicherweise rund
oder viereckig, bevorzugt rund. Die Querschnittsgrößen
der Kanäle können gleich oder unterschiedlich
sein; bevorzugt werden Kanäle gleicher Größe üblicherweise
von 0,2 bis 3 mm, bevorzugt 0,5 bis 1,5 mm Querschnitt oder Durchmesser.
Die Länge der Kanäle beträgt üblicherweise
5 mm bis 1000 mm, bevorzugt 5 mm bis 500 mm.
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Bei
der vorliegenden Erfindung werden Flüssigkeiten mit Hilfe
eines Mittels zur zeitlich und volumenmäßig genau
definierten Beförderung der Probenflüssigkeiten
befördert. Vorzugsweise werden vordefinierte Flüssigkeitsvolumen
von einer in die nächste Kammer gedrückt.
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Das
Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten
ist Teil einer Vorrichtung zur Bedienung der erfindungsgemäßen
Testkassette, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist. Insbesondere wird das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten
in eine Ankopplungsstelle zum Einbringen der Testkassette in die
o. g. Vorrichtung integriert.
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Vorzugsweise
erfolgt das Handling von Flüssigkeiten nur in der erfindungsgemäßen
Testkassette, so dass die o. g. Vorrichtung mit Probeflüssigkeit bzw.
Reagenzien nicht in Kontakt tritt.
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Üblicherweise
werden über das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten
zeitlich und volumenmäßig genau definierte Luftstöße
in die Testkassette gegeben. Durch diese Luftstöße
wird die Probenflüssigkeit durch die verschiedenen Kanäle und
Kavitäten geleitet.
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Die
zu analysierende Probenflüssigkeit wird in die Testkassette
durch den Einlass vorzugsweise in eine Probenkammer eingebracht.
Die Testkassette wird daraufhin üblicherweise mittels eines
oder mehrerer Deckel luftdicht verschlossen. Die Deckel können
aus polymeren oder anorganischen Werkstoffen sein, die über
verschiedene Techniken, wie z. B. Kleben, Schweißen, Laminieren
etc. mit dem Körper luftdicht verbunden werden.
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In
einer besonderen Ausführungsform der Testkassette werden
die Reagenzien in der Reagenzienkammer in einem faserartigen oder
porösen Material z. B. feinen Partikeln oder Gewebe, in
Form eines Reagenzien-Pads, in das Reagenzien (adsorbiert auf, fixiert
auf, dispergiert in, eingetrocknet in) untergebracht wurden.
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Das
Reagenzien-Pad wird so ausgewählt, dass es die Anforderungen
der Detektionskammer bezüglich des geforderten Flüssigkeitsvolumens
der überstehenden Lösung und der Konzentration
der Einzelkomponenten in dieser Lösung erfüllt.
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Ein
bevorzugtes Reagenzien-Pad besteht aus Glas oder Polymeren wie z.
B. Zellulose. Geeignet sind Reagenzien-Pads, die auch in sog. Lateral Flow
Tests verwendet werden und in verschiedenen Formen kommerziell erhältlich
sind. Zum Befüllen dieser Reagenzienkammer wird beispielsweise
das „extra thick glass filter” der Firma Pall
Corporation (Porengröße 1 μm, typische
Dicke 1270 μm (50 mils), typisches Wasser Flussrate 210
mL/min/cm2 bei 30 kPa) ausgewählt,
wobei zwei kreisrunde Filterstücke mit einem passenden
Durchmesser übereinander gestapelt werden.
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Die
Reagenzien der Reagenzienkammer sind typischerweise:
- – markierte oder unmarkierte Erkennungselemente, die
in Erkennungsreaktion eingesetzt werden, insbesondere natürliche
oder künstliche Rezeptoren wie z. B. Komplexbildner für
Metalle/Metallionen, Cyclodextrine, Kronenether, Antikörper,
Antikörperfragmente, Anticaline Enzyme, DNA, RNA, PNA,
DNA/RNA-bindende Proteine, Membranrezeptoren, Ionenkanäle,
Zelladhäsionsproteine, oder auch Ganglioside, Enzyme, Mono-
oder Oligosaccharide und Haptamere, und/oder
- – markierte oder unmarkierte Analyten wie z. B. Ionen,
Proteine, natürliche oder künstliche Antigene
oder Haptene, Hormone, Cytokine, Mono- und Oligosaccharide, Stoffwechselprodukte,
oder andere biochemische Marker, die in der Diagnostik verwendet
werden, Enzymsubstrate, DNA, RNA, PNA, potentielle Wirkstoffe, Medikamente,
Zellen, Viren.
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Insbesondere
werden markierte Antikörper als Erkennungselemente verwendet.
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Bei
Bedarf werden Cofaktoren oder weitere Chemikalien, die zur Reaktion
eines Erkennungselements mit einem Analyten erforderlich oder vorteilhaft
sind, ebenfalls in der Reagenzienkammer untergebracht.
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Optional
enthält die Reagenzienkammer außerdem Hilfsstoffe
zur Unterdrückung von unspezifischen Wechselwirkungen zwischen
den Reagenzien, zur Unterstützung der Imprägnierung
oder des Auslösens der Reagenzien aus dem Reagenzien-Pad,
wie z. B. oberflächenaktiven Substanzen wie Tenside, Lipide,
Biopolymere, Polyethylenglycol, Biomoleküle, Proteine,
Peptide.
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Vorzugsweise
werden die Reagenzien in vordefinierten Konzentrationen aufgebracht
und die Reproduzierbarkeit ihrer Freisetzung beim Betrieb der Kassette
gewährleistet.
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Das
Reagenzien-Pad wird üblicherweise mit ca. 50 bis 500 μl
einer Lösung imprägniert, die die Reagenzien in
Konzentrationen von 10–3 M bis
10–15 M, bevorzugt nanomolare Konzentrationen,
sowie üblicherweise Hilfsstoffe in Mengen von 15 Gew.% bis
0,1 ppb enthält. Die Imprägnierung erfolgt z.
B. durch Eintrocknen oder Lyophilisieren.
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Das
Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten
verdrängt die Probenflüssigkeit, so dass sie in
die Reagenzienkammer strömt und den Reagenzien-Pad komplett
benetzt.
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Durch
Einleitung der Analyten enthaltenden Probeflüssigkeit in
die Reagenzienkammer werden die Reagenzien gelöst und gehen
mit den Analyten eine Reaktion ein oder werden mit der Probeflüssigkeit
perfekt durchmischt.
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Überraschenderweise
wurde festgestellt, dass durch eine schnelle – üblicherweise
von 1 ms bis 10 s, bevorzugt ca. 500 ms bis 5, besonders bevorzugt
1 s – Benetzung des Reagenzien-Pads mit einem definierten
Probenvolumen (durch den definierten Luftstoß) die Reagenzien
sowohl gelöst (rekonstituiert) und optimal mit der Probenflüssigkeit durchmischt
werden, als auch die Konzentration der Reagenzien in der Probenflüssigkeit
sehr reproduzierbar eingestellt wird. Dadurch wird es möglich, eine
quantitative Bestimmung der Analyten im Probenvolumen vorzunehmen.
Nach der Benetzung des Reagenzien-Pads kann eine definierte Zeit
(Präinkubationszeit) gewartet werden, z. B. bis eine biochemische
Reaktion abgeschlossen ist oder bis eine bestimmte Reaktionstemperatur
erreicht ist.
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Mit
einem weiteren definierten Luftstoß wird das Probenvolumen
mit den gelösten Reagenzien über einen Kanal weiter
in die Detektionskammer transportiert.
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Vorzugsweise
wird die Probeflüssigkeit in der Testkassette vor der Reagenzienkammer
filtriert und von Zellen, Blutbestandteilen oder sonstigen biologischen,
organischen oder anorganischen Partikeln befreit. Zu diesem Zweck
können eine oder mehrere Filtereinheiten z. B. aus Glasfaser
oder porösem Material in Form eines (Mikro)-Kissens oder Kanals,
ein Glasfilterpapier, oder eine Membrane in der Testkassette eingebaut
werden. Die Filtereinheit kann vorzugsweise Partikel von 0,2 bis
100 μm bevorzugt 0,5 bis 15 μm von der Probeflüssigkeit
abtrennen.
-
Vorzugsweise
findet die Entlüftung des kompletten Kanalsystems über
Entlüftungsöffnung(en) statt.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt
die Detektion über einen Signalwandler (Sensorplattform,
Biochip), der in der Detektionskammer als Boden eingebaut ist. In
diesem Fall wird die Verschlusseinheit über die komplette
untere Seite der Kassette mit Ausnahme der Detektionskammer aufgebracht.
-
Auf
der Oberfläche des Signalwandlers sind üblicherweise
ein oder mehrere voneinander getrennte Messbereiche definiert, an
denen ein oder mehrere weitere Bindungspartner zum Nachweis des Analyten
in der Probe immobilisiert sind. In der Detektionskammer findet
eine biochemische Reaktion zwischen immobilisierten Bindungspartner
und Analyten an der Oberfläche des Biochips statt. Die
markierten Reaktionspartner werden in der Detektionskammer angeregt,
das erzeugte Signal wird detektiert und verwendet, um die Analyten
zu quantifizieren.
-
Zur
Detektion können verschiedene Biochips, wie z. B. Surface
Plasmon Resonanz, Planare Wellenleiter, Quarz Mikro Waage, Elektrolumineszenz,
verwendet werden und verschiedene Verfahren, z. B. Bemessung der
Brechungsindexänderungen durch die Bindung an die Oberfläche
des Biochips, benutzt werden (siehe z. B.
WO02/20873 und
EP1316594 ).
-
Reaktionen
in der Detektionskammer sind beispielweise:
- • direkte
Bindung eines (detektierbaren) Analyten an den immobilisierten Bindungspartner
(Erkennungselement);
- • direkte Bindung des Analyten an den immobilisierten
Bindungspartner (Erkennungselement) und Markierung des Analyten
durch ein zweites oder mehrere Reagenzien aus der Reaktionslösung,
das optisch oder elektrisch detektiert werden kann (Sandwich Assay);
- • Bindung eines detektierbaren Reagenz an den immobilisierten
Bindungspartner (Erkennungselement), das in Kompetition mit dem
Analyten in der Lösung steht (kompetitiver Assay).
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Testkassette wird ein planarer Dünnschichtwellenleiter
als Biochip verwendet, welcher eine erste optisch transparente Schicht
(a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem
Brechungsindex als Schicht (a) aufweist, wobei ein oder mehrere
Einkoppelelemente in der ersten optischen Schicht (a) oder in der
zweiten optischen Schicht (b) senkrecht zum Pfad eines Anregungslichts
orientiert eingebracht sind, und wobei das Anregungslicht in den
Dünnschichtwellenleiter über das eine oder mehrere
Einkoppelelemente eingekoppelt und optional über das eine
oder mehrere Auskoppelelemente ausgekoppelt wird.
-
Bevorzugt
werden erfindungsgemäß als Einkoppelelemente Gitterstrukturen
gleicher Periode und/oder Modulationstiefe.
-
Vorzugsweise
werden auf der Oberfläche der Sensorplattform ein oder
mehrere Reaktionspartner zum Nachweis der Analyten direkt durch
physikalische Absorption oder elektrostatische Wechselwirkung alternativ
mittels einer optischen transparenten Haftvermittlungsschicht immobilisiert.
Vorzugsweise werden die Bindungspartner selektiv in räumlich
getrennte Messbereiche auf der Oberfläche der Sensorplattform
aufgebracht und die Fläche zwischen den Messbereichen passiviert,
um unspezifische Bindungen zu unterdrücken.
-
Zur
Aufbringung der Bindungspartner selektiv in räumlich getrennte
Messbereiche auf die Oberfläche der Sensorplattform, können
ein oder mehrere Verfahren verwendet werden aus der Gruppe gebildet
von Ink jet spotting, mechanischem Spotting mittels Stift oder Feder,
micro contact printing, fluidische Kontaktierung der Messbereiche
mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen
durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen,
unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen
Potentialen.
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Verschiedene
Ausführungsformen der Sensorplattform und entsprechende
Nachweisverfahren sind beispielweise in
WO95/33197 ,
WO95/33198 ,
WO97/373211 oder
WO200113096 beschrieben. Die verschiedenen
Ausführungsformen der Sensorplattform und entsprechenden
Nachweisverfahren werden hiermit per Referenz integriert.
-
In
einer besonderen Ausführungsform der Testkassette werden
in der Reagenzienkammer bindungsspezifische detektierbare Erkennungselemente
für ein oder mehrere Analyten der Probeflüssigkeit in
vordefinierten Konzentrationen bereitgestellt. Durch Einleitung
der Analyten enthaltenden Probeflüssigkeit in die Reagenzienkammer
werden die Erkennungselemente gelöst und gehen mit den
in dem Analyten eine spezifische Bindung ein (Analyten-Erkennungselement- Konjugat).
Dabei werden die freien Bindungsstellen der Erkennungselemente mit
zunehmender Menge an Analyten in der Probeflüssigkeit zunehmend
gesättigt.
-
Durch
einen weiteren Luftstoß gelangen die Analyten-Erkennungselement-Konjugate
und ggf. Erkennungselemente mit freien Bindungsstellen zu immobilisierten
Bindungspartnern, z. B. Analyten-Protein-Konjugaten, insbesondere
Analyten-BSA-Konjugaten, auf den Signalwandler. Erkennungselemente mit
freien Bindungsstellen gehen eine spezifische Bindung mit den entsprechenden
immobilisierten Analyten-Protein-Konjugaten ein.
-
Je
mehr detektierbare Erkennungselemente mit freien Bindungsstellen
in der Lösung vorhanden sind, das heißt je geringer
der Anteil des korrespondierenden Analyten in der Probeflüssigkeit
ist, desto mehr detektierbare Erkennungselemente werden auf dem
Chip gebunden. Die mit Analyten gesättigten Erkennungselemente
aus der Probeflüssigkeit verbleiben in der Lösung.
Durch Einkoppelung elektromagnetischer Strahlung in den Biochip
können die an den immobilisierten Analyt-Protein-Konjugaten
gebundenen und markierten Erkennungselemente im evaneszenten Feld
des Wellenleiters angeregt werden. Die in Lösung befindlichen
markierten Erkennungselemente werden hierbei nicht angeregt. Auf
diese Weise ist eine indirekte Quantifizierung der in der Probeflüssigkeit
enthaltenden Analyten möglich.
-
Kombinationen
von detektierbaren Erkennungselementen und immobilisierten Bindungspartnern
zum Nachweis von Mykotoxinen werden in
WO2007/079893 beschrieben, dessen
Inhalt per Referenz in der Beschreibung eingeführt wird.
-
In
einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Testkassette weist die Detektionsskammer als Boden ein transparentes
Fenster auf, durch das die biochemische Reaktion, die in der Detektionskammer
abläuft, detektiert werden kann. Das transparente Fenster
kann durch die Verschlussfolie, die in diesem Fall transparent sein
muss und z. B. aus polymethylmethacrylate (PMMA) besteht, gebildet
werden oder ein selbständiges Element darstellen. In diesem
Fall besteht das Fenster bevorzugt aus Glas oder aus einem Kunststoff,
das für das verwendete Licht transparent ist, und wird
mittels der Verschlusseinheit mit Ausnahme der Detektionskammer auf
die Seite der Testkassette befestigt.
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In
dieser Ausführungsform werden Reagenzien vorzugsweise nur
in der Reagenzienkammer untergebracht, in der das Vermischen mit
der Probeflüssigkeit vor der Beförderung in die
Detektionskammer stattfindet.
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Üblicherweise
wird ein Reagenz in der Lösung abhängig von der
Konzentration des zu bestimmenden Analyten so umgesetzt, dass es
seine spektralen Eigenschaften – z. B. Absorption, Lumineszenz,
Fluoreszenz usw. – ändert, die optisch detektiert
werden können. Alternativ wird ein Nachweisreagenz in der
Lösung abhängig von der Konzentration des zu bestimmenden
Analyten an ein weiteres Reagenz oder an den Analyten selbst gebunden,
so dass das Nachweisreagenz seine spektralen Eigenschaften – z.
B. Absorption, Lumineszenz, Fluoreszenz, Elektrolumineszenz, elektrische
Kapazität, usw. – ändert, die optisch
detektiert werden können.
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In
einer weiteren Ausführungsform befinden sich in der Detektionskammer
ein oder mehrere Signalwandler, durch den die biochemische Reaktion, die
in der Detektionsskammer abläuft, detektiert werden kann.
In dieser Ausführungsform kann das Fenster transparent
oder lichtdicht sein. Die Reagenzien werden hier ebenfalls vorzugsweise
nur in der Reagenzienkammer untergebracht, in der das Vermischen
mit der Probeflüssigkeit vor der Beförderung in die
Detektionskammer stattfindet.
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In
diesem Fall kann ein Reagenz in der Lösung abhängig
von der Konzentration des zu bestimmenden Analyten so umgesetzt
werden, dass es seine Materialeigenschaften – z. B. Absorption,
Lumineszenz, Fluoreszenz, Elektrolumineszenz, Kapazität,
Leitfähigkeit, pH, Masse usw. – ändert,
die durch den Signalwandler detektiert werden können. Alternativ
wird ein Nachweisreagenz in der Lösung abhängig
von der Konzentration des zu bestimmenden Analyten an ein weiteres
Reagenz oder an den Analyten selbst gebunden, so dass das Nachweisreagenz
seine Materialeigenschaften – wie z. B. Absorption, Lumineszenz,
Fluoreszenz, Elektrolumineszenz, elektrische Kapazität,
Leitfähigkeit, pH, Masse usw. – ändert,
die durch den Signalwandler detektiert werden können.
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Die
Kombination eines transparenten Fensters zur Detektion von optischen
Signalen als Boden der Detektionskammer mit weiteren Signalwandlern in
der Detektionskammer ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ebenfalls
möglich.
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In
einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
trägt jede Testkassette einen Bar-Code, der vorzugsweise
folgende Information zur Beschreibung der Testkassette beinhaltet:
- – Assay-Typ,
- – Batch/lot number/Herstellungsdatum
- – Ablaufdatum
- – Spot array Geometrie Kodierung, die die Geometrie
der Messbereiche beschreibt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
werden diese Informationen von der Vorrichtung zur Bioassay von
Analyten mittels Bio- und/oder Chemosensoren enthaltend die erfindungsgemäße
Testkassette, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist, gelesen und verwendet.
-
Für
bestimmte Anwendungen kann es vorteilhaft sein, wenn eine Testkassette
mehrere nebeneinander gelegte Kanal- und Kammersysteme aufweist,
so dass in einer Testkassette verschiedene Detektionsreaktionen
gleichzeitig geführt werden könnten.
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Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bioassay
von Analyten mittels Bio- und/oder Chemosensoren die die erfindungsgemäße
Testkassette, mindestens eine Ankopplungsstelle für die
Positionierung der erfindungsgemäßen Testkassette,
mindestens ein Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten
in der Testkassette, aufweist. Um optimale reproduzierbare Ergebnisse
zu sichern, verfügt die erfindungsgemäße
Vorrichtung zur Kontrolle der Betriebstemperatur in der Testkassette
außerdem über mindestens eine Temperaturregulierungseinheit.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung weist die Temperaturregulierungseinheit mindestens ein
flaches temperierbares Element auf, auf das die dünne Seite
der erfindungsgemäßen Testkassette gelegt wird,
so dass ein schneller Temperaturausgleich zwischen temperierter
Auflage und Probenlösung in den Kammern stattfinden kann.
Z. B. können Peltiers- oder Cartridge-Elemente zur Temperierung
der Auflage verwendet werden.
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Idealerweise
wird die Temperaturregulierungseinheit computergesteuert und die
Temperatur wird während des Betriebs der Testkassette konstant gehalten.
Vorzugsweise wird die Testkassette bei einer Temperatur von 20 bis
37°C bevorzugt um 25°C betrieben.
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Bei
der Temperaturkontrolle wird vorzgusweise darauf geachtet, dass
keine Kondensation auf der Testkassette stattfindet, die eine optische
Detektion beeinträchtigen könnte. Dabei soll auf
die Temperatur der Testkassette, Raumtemperatur und die jeweilige
Raumfeuchtigkeit geachtet werden. (13: Taupunkttemperaturdiagramm).
Es wird bevorzugt, die erfindungsgemäße Vorrichtung
bei Temperaturen von 15 bis 40°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit
von 65% zu betreiben.
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Üblicherweise
weist die Kopplungsstelle einen mechanischen Auslöser,
der die Reaktion, das heißt den ersten Luftstoß,
mit Hilfe des Mittels zur Beförderung der Probeflüssigkeit
und/oder die Temperierung mittels der Temperiereinheit in der Testkassette
startet.
-
In
einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist die
erfindungsgemäßen Vorrichtung außerdem
mindestens eine optische Einheit, die mindestens eine Quelle für
ein Anregungslicht, insbesondere einen Laser und mindestens eine
Ausleseeinheit zur Detektion der biochemischen Reaktion in der Detektionskammer
der erfindungsgemäßen Testkassette auf.
-
Vorzugweise
ist die Ausleseeinheit ein ortauflösender Detektor beispielweise
aus der Gruppe, die von CCD-Kameras, CCD-Chips, Photodioden-Arrays,
Avalanche-Dioden-Arrays, Multichannelplates und Vielkanal-Photomultiplier
gebildet wird.
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Üblicherweise
weist die optische Einheit außerdem Spiegel, Prismen und/oder
Linsen zur Gestaltung – insbesondere Fokus, Teilung, Umleitung und
Orientierung – des Anregungslichts auf.
-
Zur
Bedienung einer Testkassette mit PWG-Sensorplattform ist es vorteilhaft,
einen Goniometer zur Kontrolle und Regelung des Anregungspfads,
insbesondere zur Optimierung der Koppelparameter durch Positionierung
des Laserstrahls bezüglich Einfallwinkel und Position zur
Gitterstruktur in die optische Einheit, zu integrieren. Durch präzise Einstellung
des Laserstrahls wird die Intensität des aus der PWG-Sensorplattform
gestreuten Lichts maximiert.
-
Vorzugsweise
wird die Testkassette ebenfalls präzise mittels einer Befestigungseinheit
in der Kopplungsstelle festgehalten.
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Wird
eine Testkassette mit PWG-Sensorplattform verwendet, wird eine Präzision
von 100 μm parallel zu dem Gitter und 200 μm normal
zu der Fläche des PWG-Chips bevorzugt. Die zweite Positionierung
wird im Laufe der Einkoppeleinstellung mit einer Resolution von
50 μm eingestellt. Es wird vermerkt, dass die Qualität
des Signals von der genauen Positionierung der Sensorplattform zum
Laserstrahl abhängig ist, so dass Toleranzgrenzen beachtet
werden sollten.
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Üblicherweise
wird die Testkassette z. B. mit einem Silikondeckel versiegelt und
das Mittel zu Beförderung der Probenflüssigkeit,
z. B. ein Druckstoß, eine Spritze, ein Stempel oder eine
Pumpe, bevorzugt eine Pumpe, drückt ein erstes Volumen
Luft in die Testkassette. Der Luftdruck befördert die Probeflüssigkeit
aus der Probenkammer in die Reagenzienkammer und vernetzt das Reagenzien-Pad.
Hiermit wird die Präinkubationsphase gestartet, währenddessen
z. B. die Toxin der Probe mit dem fluoreszierenden Antikörper
reagiert. Üblicherweise beträgt die Präinkubationszeit
von 1 bis 20 min bevorzugt 3 bis 7 min abhängig von den
Reaktionspartnern. Üblicherweise wird durch eine längere
Präinkubationszeit ein stärkeres Signal erzeugt.
Es wird bevorzugt, die Präinkubationszeit mit einer Präzision
von 3 Sekunden zu kontrollieren. In einem weiteren Schritt drückt
das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit
ein zweites vordefiniertes Volumen Luft in die Testkassette, was
zur weiteren Beförderung der Probenflüssigkeit – ggf.
durch einen Filter hindurch – in den Kanal bis in die Reaktionskammer
führt. Dort findet die Hauptinkubation statt, die üblicherweise
von 1 bis 100 min dauert.
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Die
Detektion erfolgt vorzugweise nach 1 bis 30 Minuten, bevorzugt 5
bis 15 Minuten mit einer Präzision von ± 5 Sekunden.
Hierfür wird beispielweise ein Laserstrahl in die Detektionskammer
auf die Oberfläche der Sensorplattform geleitet und die
erzeugte Fluoreszenz wird von der Ausleseeinheit registriert. Üblicherweise
hat die Reaktion noch kein Equilibrium erreicht. Es wird daher bevorzugt,
die Dauer der jeweiligen Schritte präzise einzuhalten,
um die Reproduzierbarkeit der Messung zu gewährleisten.
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Vorzugweise
verfügt die erfindungsgemäße Vorrichtung über
eine Steuereinheit zur automatischen Steuerung des Mittels zur Beförderung
der Probenflüssigkeit und/oder der Temperaturregulierungseinheit
und/oder der optischen Einheit und entsprechende Positionierung
der Testkassette in der Kopplungstelle mittels Befestigungseinheit,
Steuerung und Einstellung der biochemischen Reaktionsparameter,
wie z. B. Inkubationszeit/–temperatur, Reaktionszeit/-temperatur
usw. Die Steuereinheit verfügt außerdem über
ein Rechnerelement zur Berechnung der Analyten-Werte durch Bezug
auf eine Kalibrationskurve und Anzeige der Analyten-Werte.
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Üblicherweise
erfolgt die Bedienung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
wie folgt:
- 1. Der Nutzer führt die
Testkassette in die Ankopplungstelle ein.
- 2. Der Nutzer drückt den Auslöseknopf um die
erfindungsgemäße Vorrichtung zu starten.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung führt selbständig
mit Hilfe der Steuereinheit folgende Schritte durch:
- 3. Die Temperaturregulierungseinheit erwärmt die Testkassette,
bis eine Temperatur von z. B. 25°C erreicht und eingehalten
wird.
- 4. Wird eine Kassette mit integriertem planarem Wellenleiter
verwendet, werden die Koppelbedingungen optimiert. Die Position
des Lasers wird mit Hilfe des Goniometers eingestellt.
- 5. Das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit
befördert die Probeflüssigkeit in die Reagenzienkammer.
Die Präinkubation wird gestartet.
- 6. Das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit
befördert die Probeflüssigkeit in die Reaktionskammer.
Die Hauptinkubation wird gestartet.
- 7. Die Koppelbedingungen werden fein optimiert. Dabei wird eine
Winkelkompensation von 1° wegen der Veränderung
des refraktiven Indexes (Luft in Schritt 5, Wasserlösung
jetzt) berücksichtigt.
- 8. Der Laserstrahl wird eingeschaltet und das resultierende
Signal von der Ausleseeinheit registriert.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bedienung
der erfindungsgemäßen Testkassette durch folgende
Schritte gekennzeichnet:
- A. Einführung
einer Analyten enthaltenden Probeflüssigkeit in die Testkassette,
- B. Transport der Probeflüssigkeit in eine Reagenzienkammer
durch ein Mittel zur Beförderung der Probeflüssigkeit,
dann
- C. Benetzung eines Reagenzien-Pads in der Reagenzienkammer und
Auflösung von dort aufgebrachten Reagenzien, wobei das
Reagenzien-Pad komplett benetzt wird, die Geschwindigkeit der Benetzung
kontrolliert wird und vorzugsweise 1 ms bis 10 s beträgt,
- D. Optionale Präinkubation, wobei die Präinkubationszeit
vorzugsweise mit einer Präzision von 3 Sekunden kontrolliert
wird, dann
- E. Transport in eine Detektionskammer durch ein Mittel zur Beförderung
der Probeflüssigkeit, wobei die Detektionskammer komplett
gefüllt wird,
- F. biochemische Reaktion ggf. mit in der Detektionskammer aufgebrachten
Reagenzien (Inkubation), die zur quantitativen Bestimmung eines
oder mehrerer Analyten dient, wobei die Inkubationszeit kontrolliert
wird, gefolgt von
- G. Anregung und Bemessung von Änderungen der spektralen
Eigenschaften und/oder Materialeigenschaften der Probeflüssigkeit
in der Detektionskammer.
- H. Berechnung und Anzeige der Analyten-Werte durch Bezug auf
eine Kalibrationskurve.
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Für
die Reproduzierbarkeit des Verfahrens wird bevorzugt ein präzis
definiertes Volumen Probeflüssigkeit befördert.
Es ist außerdem vorteilhaft die Temperatur der Kassette
in der Reagenzienkammer und in der Detektionskammer mit Hilfe der
Temperaturregulierungseinheit während des Betriebs zu kontrollieren.
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Für
die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses bei der Wiederholung des
Verfahrens mit einer anderen Testkassette wird bevorzugt, die Parameter
insbesondere Volumen, Zeiten (Beförderungs- und Inkubationszeiten)
und/oder Temperatur festzulegen und automatisch durch die Steuereinheit
zu kontrollieren.
-
Ein
großer Vorteil der Erfindung ist, dass die Person, die
eine Analytik mit der neuen mikrofluidischen Testkassette durchführt,
keine quantitativen Prozessschritte der Analytik durchführen
muss, wie z. B. exakte Dosierung des Probenvolumens und exakte Dosierung
der Reagenzien. Dadurch kann das biochemische Testverfahren auch
von Personen durchgeführt werden, die keine Analytikexperten sind.
Ein weiterer Vorteil ist, dass vor Beginn des Tests in der Testkassette
keine Flüssigkeiten gelagert sind, sondern nur trockene
Reagenzien. Ein großer Vorteil des Systems besteht darin,
dass außer der Probenlösung keine weiteren Flüssigkeiten
zugegeben werden müssen, was das Verfahren leicht durchführbar
macht. Am Ende der Analyse verbleibt die Probenflüssigkeit
in der Testkassette, so dass keine Gefährdung der Umwelt
durch giftige oder infektiöse Stoffe stattfinden kann.
Diese Nutzung der Testkassette als Einwegkassette wird durch einen
einfachen Aufbau und entsprechend geringe Herstellungskosten wirtschaftlich
ermöglicht.
-
Die
Verwendung der erfindungsgemäßen Testkassette,
Vorrichtung zur Bedienung der Testkassette und Verfahren zur Bedienung
der Testkassette in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich,
der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz,
um Analyten qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen, ist ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
-
Beispiele
für diese Verwendung sind die quantitative und/oder qualitative
Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten
in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen
Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu
Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter
im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und
quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die
DNA- und RNA-Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen
Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid-Polymorphismen,
zur Messung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerungsmechanismen
für die m-RNA-Expression und für die Protein(bio)synthese,
für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie
für die Bestimmung von Expressionsprofilen, insbesondere
zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA,
Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten)Stoffen,
sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen
oder Bakterien in der pharmazeutischen Produktforschung und -entwicklung,
der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen
Produktforschung und -entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik,
zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung
und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis
von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen,
Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel-
und Umweltanalytik.
-
Besondere
Ausführungsformen der erfindungsgemäßen
Testkassette werden in den 1 bis 6 dargestellt,
ohne sich darauf zu begrenzen.
-
1:
Testkassette
-
2:
Testkassette Seitenansicht
-
3:
Testkassette mit Bemaßung
-
4:
Aufbau der Testkassette – Sicht von oben seitlich
-
5:
Aufbau der Testkassette – Sicht von unten seitlich
-
6:
PWG-Biochip
-
7:
PWG-Biochip Seitenansicht
-
8:
Dimensionen des PWG-Biochips.
-
- 1
- Testkassette
- 2
- Strukturierter
Körper
- 3
- Einlass
- 4
- Probenkammer
- 5
- Verschlussfolie
- 6
- Kanal
- 7
- Reagenzienkammer
- 8
- Reagenzien-Pad
- 9
- Detektionskammer
- 10
- PWG-Biochip
- 11
- Gitter
- 12
- Dünne
wellenleitende Schicht auf eine Glassplatte (nicht gezeichnet)
- 13
- Haftvermittlungsschicht
- 14
- BSA
- 15
- Arrays
- 16
- Mykotoxin-BSA-Konjugate-Spots
- 17
- Referenzspots
- 18
- Luftkanal
- 19
- Luftöffnung
- 20
- Entlüftungsöffnung
- 21
- Fenster
der Verschlussfolie
- 22
- Entlüftungskanal
-
Die
Testkassette 1 besteht aus einem strukturierten Körper 2,
in den Kanäle und Kavitäten eingebracht sind.
Dieser Körper ist an der Ober- und Unterseite mit einer
Verschlussfolie 5 versehen, wodurch erreicht wird, dass
die verschiedenen Kavitäten und Kanäle des strukturierten
Körpers luftdicht abgeschlossen werden (mit Ausnahme der Öffnungen 3, 19 und 20).
-
Beispielweise
wurde die erfindungsgemäße Testkassette in einem
Spritzgussverfahren produziert. Der Körper besteht aus
einer Platte aus schwarzem polyoxymethylen (POM), in der die Kanäle
und Kammern aufgebohrt und abgefräst wurden.
-
Die
Testkassette 1 umfasst einen Einlass 2 zur Eingabe
einer Probenflüssigkeit mit dem zu detektierenden Analyten
in die Testkassette 1, eine Reagenzienkammer 7,
in die die Probeflüssigkeit über einen Kanal 6 befördert
wird, und eine Detektionskammer 9, in die der Analyt über
einen weiteren Kanal 6 befördert wird und die
einen PWG-Biochip 10 umfasst.
-
Die
Probenkammer 4 ist rund mit 10 mm Durchmesser. Die Reagenzienkammer 7 ist
rund mit 8 mm Durchmesser. Der Detektionskammer 9 ist viereckig
mit Dimensionen von 10 mm × 10 mm. Die Kanäle 6 haben
einen runden Querschnitt mit einen Durchmesser von 1 mm.
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In
der Reagenzienkammer 7 befinden sich mit einem Fluoreszenzfarbstoff
markierte Antikörper, die für einen Analyten aus
der Probeflüssigkeit spezifisch sind, imprägniert
auf einem Reagenzien-Pad 8.
-
Das
Reagenzien-Pad 8 besteht aus „extra thick glass
Filter” der Firma Pall Corporation (Porengröße
1 μm, typische Dicke 1270 μm (50 mils), typisches
Wasser Flussrate 210 mL/min/cm2 bei 30 kPa), wobei
zwei kreisrunde Filterstücke 8 mm Durchmesser übereinander
gestapelt werden.
-
Sowohl
der PWG-Biochip 10 als das Reagenzien-Pad 8 werden
zwischen zwei Polyolefinfolien in der POM-Platte 2 festgehalten,
die auch als Verschlussfolien 5 zur Dichtung der Testkassette
dienen. Die Folie weist im Bereich des PWG-Biochips 10 ein
Fenster 21, das freier Zugang zu der Messregion des PWG-Biochips 10 gewährt.
Die obere Verschlussfolie 5 ist 180 μm dick und
die untere Verschlussfolie 5 ist 80 μm dick.
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Die
Probenflüssigkeit wird bei Testbeginn in die Probenkammer 4 eingebracht
und mit einem geeigneten Silikondeckel luftdicht verschlossen. Die Flüssigkeit
verteilt sich in der Probenkammer 4 und in den angrenzenden
Kanälen 6, die so gestaltet sind, dass die Flüssigkeit
nicht durch Kapillarkräfte bis in die Reagenzienkammer 7 bzw.
zum Einlass 3 gezogen wird. Mit Hilfe der Beförderungseinheit
wird an dem Einlass ein definiertes Luftvolumen in die Probenkammer 4 über
den Kanal 6 eingebracht. Dieses Luftvolumen verdrängt
die Probenflüssigkeit, so dass sie in die Reagenzienkammer 7 strömt
und das Reagenzien-Pad 8 komplett benetzt.
-
Durch
Einleitung der Probeflüssigkeit in die Reagenzienkammer 7 werden
die Antikörper gelöst und gehen mit den in der
Probeflüssigkeit enthaltenen Analyten eine spezifische
Bindung ein (Analyten-Antikörper-Konjugat). Dabei werden
die freien Bindungsstellen der Antikörper mit zunehmender Menge
an Analyten in der Probeflüssigkeit zunehmend gesättigt.
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Nach
einer gewissen Verweilzeit (10 Minuten) bei einer Temperatur von
25°C wird die Probeflüssigkeit enthaltend Analyten-Antikörper-Konjugate in
einem nächsten Schritt mit einem weiteren definierten Luftstoß in
die Detektionskammer 9 befördert. Die Detektionskammer 9 wird
von der Probeflüssigkeit komplett gefüllt.
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Die
Entlüftung des kompletten Kanalsystems findet über
die Entlüftungsöffnung(en) 20, die in
der oberen Verschlussfolie aufgebracht sind, statt.
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Die
Detektionskammer 9 umfasst einen PWG-Biochip 10.
Der PWG-Biochip 10 ist in 6 schematisch
in Aufsicht und in 7 schematisch in Seitenansicht
gezeigt.
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In
der Detektionskammer 9 wird der Verlauf oder der Endpunkt
der biochemischen Nachweisreaktion detektiert.
-
Der
PWG-Biochip 10 in der Detektionskammer 9 besteht
beispielweise aus einer 10 mm × 12 mm Glasplatte mit einer
Dicke von 0.7 mm (12.0 +/– 0.05 mm × 10.0 +/– 0.05
mm × 0.70 +/– 0.05 mm). Auf einer Seite des Chips
befindet sich eine 155 nm dünne wellenleitende Schicht 12 aus
Ta2O5 (Tantalum pentoxide).
Die Messregion des Chips umfasst einen zentralen 10 mm × 6
mm viereckigen Detektionsbereich. Parallel zu diesem Detektionsbereich
befindet sich ein 500 μm breites sichelförmiges
Band: das Gitter 11 zur Einkopplung des Anregungslichts.
Die Positionsgenauigkeit des Gitters 11 zu den Kanten des PWG-Biochips 10 beträgt
+/– 0.05 mm. Die Gittertiefe beträgt 18 nm und
die Gitterperiode 318 nm mit einem Duty Cycle von 0,5.
-
Auf
der dünnen wellenleitenden Schicht 12 ist eine
Monoschicht aus Dodecylphosphat als Haftvermittlungsschicht 13 aufgebracht.
Auf der Haftvermittlungsschicht 13 sind Analyten-BSA-Konjugate adsorptiv
in Form eines Arrays 15 aufgebracht/immobilisert. Die freien
Flächen zwischen den Analyten-BSA-Konjugat-Spots 16 und
Referenzspots 17 sind mit BSA 14 geblockt (Passivierung).
-
In
der Detektionskammer 9 gelangen die Analyten-Antikörper-Konjugate
und ggf. Antikörper mit freien Bindungsstellen zu den immobilisierten Analyten-BSA-Konjugaten
Spots 16 auf dem PWG Biochip 10. Antikörper
mit freien Bindungsstellen gehen eine spezifische Bindung mit den
entsprechenden immobilisierten Analyten-BSA-Konjugaten ein. Je mehr
Antikörper mit freien Bindungsstellen in der Lösung
vorhanden sind, das heißt je geringer der Anteil des korrespondierenden
Analyten in der Probeflüssigkeit ist, desto mehr mit einem
Fluoreszenz- Farbstoff markierte Antikörper werden auf dem PWG-Biochip 10 gebunden.
Die mit Analyten in der Probeflüssigkeit gesättigten
Antikörper verbleiben in der Lösung.
-
Durch
Einkoppelung elektromagnetischer Strahlung in den Dünnschichtwellenleiter 12 können die
an die immobilisierten Analyten-BSA-Konjugate gebundenen und mit
einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörper im evaneszenten
Feld des Dünnschichtwellenleiters 12 zur Fluoreszenz
angeregt werden. Die in Lösung befindlichen und mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörper werden hierbei
nicht angeregt. Auf diese Weise ist eine indirekte Quantifizierung
der in der Probeflüssigkeit enthaltenden Analyten möglich.
-
Besondere
Ausführungsformen der erfindungsgemäßen
Vorrichtung zur Bedienung der Testkassette werden 9 dargestellt,
ohne sich darauf zu begrenzen.
-
9:
Schematische Darstellung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung zur Bedienung der Testkassette.
-
- 30
- Auflage
- 31
- Optisches
Fenster
- 32
- Mittel
zur Beförderung der Probeflüssigkeit
- 33
- Temperierelement-Peltiers-
oder Cartridge-Elemente
- 34
- Objektiv
mit Filtern
- 35
- CCD-Kamera
- 36
- Bewegbarer
Spiegel
- 37
- Bewegbarer
Laser
- 38
- Steuereinheit
-
Die
Vorrichtung zur Bedienung der erfindungsgemäßen
Testkassette weist eine Kopplungsstelle mit einer Auflage 30 für
die Positionierung der erfindungsgemäßen Testkassette 1 auf.
Unter dem PWG-Biochip 10 befindet sich ein Fenster 31 in
der Auflage 30. Die Vorrichtung weist außerdem
das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit 32 in
der Testkassette 1 und das Temperierelement 33 auf.
Im 9 temperiert die Temperierelement 33 die
Auflage 30 per Kontakt, die wiederum die Temperierung an die
Testkassette 1 weiterleitet.
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Außerdem
weist die erfindungsgemäße Vorrichtung in der
optischen Einheit einen bewegbaren Laser 37 auf, und mindestens
eine CCD-Kamera 35 zur Detektion der biochemischen Reaktion
in der Detektionskammer der Testkassette 1 auf. Die optische Einheit
enthält außerdem einen bewegbaren Spiegel 36 und
ein Objektiv mit Filtern 34. Weitere Prismen und/oder Linsen
zur Gestaltung – insb. Fokus, Teilung, Umleitung und Orientierung – des
Anregungslichts, sowie ein Goniometer zur Kontrolle und Regelung
des Anregungspfads, insbesondere zur Optimierung der Koppelparameter
durch Positionierung des Laserstrahls bezüglich Einfallwinkels
und Position zur Gitterstruktur des PWG-Biochips 10, sind
auch möglich (auf 9 nicht
aufgeführt). Durch präzise Einstellung des Laserstrahls
wird die Intensität des aus dem PWG-Biochip 10 gestreuten
Lichts maximiert.
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Der
Laserstrahl (siehe 9) wird auf den PWG-Chip 10 der
Testkassette 1 reflektiert.
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Durch
die Lichtanregung erhaltene Fluoreszenzphotonen werden durch das
optische Fenster 31 von der CCD-Kamera 35 registriert.
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Die
Kopplungsstelle weist außerdem einen mechanischen Auslöser
auf, der die Reaktion in der Testkassette startet.
-
Um
optimale reproduzierbare Ergebnisse zu sichern, reguliert die Temperaturregulierungseinheit 33 die
Betriebstemperatur in der Testkassette 1. Sie wird typischerweise
mit der Betätigung des Auslösers zum Start der
Kassette eingeschaltet.
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Vorzugsweise
wird die Testkassette bei einer Temperatur um 25°C +/– 2
K betrieben. 10 zeigt den Einfluss der Temperatur
auf die Dosiswirkungskurve eines Assays. 11 zeigt
den experimentellen Aufbau zur Bemessung der Temperaturregulierung
mittels „Peltiers”-Elemente und 12 zeigt eine
Simulation der Kühlungsrate der Testkassette.
-
Das
Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit 32 gibt
zeitlich und volumenmäßig genau definierte Luftstöße
in die versiegelte Testkassette zu. Durch diese Luftstöße
wird die Probenflüssigkeit durch die verschiedenen Kanäle 6 und
Kavitäten geleitet und es werden dort verschiedene Reaktionsschritte
durchgeführt, wie z. B. Rekonstitution der Reagenzien,
Vermischung der Reagenzien mit der Probe etc.
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Die
Testkassette 1 wird mit einem Silikondeckel 21 versiegelt
und das Mittel zu Beförderung der Probenflüssigkeit 32 (eine
Pumpe) drückt ein erstes Volumen Luft in die Testkassette 1.
Der Luftdruck befördert die Probeflüssigkeit aus
der Probenkammer 4 in die Reagenzienkammer 7 und
vernetzt das Reagenzien-Pad 8. Hiermit wird die Präinkubationsphase gestartet,
währenddessen z. B. die Toxin der Probe mit dem fluoreszierenden
Antikörper reagiert. Üblicherweise beträgt
die Präinkubationszeit von 2 bis 5 min ± 3 Sekunden
abhängig von den Reaktionspartnern. Üblicherweise
wird durch eine längere Präinkubationszeit ein
stärkeres Signal erzeugt. 14 zeigt den
Einfluss der Inkubationszeit auf die Dosiswirkungskurve des Assays
anhand des Mykotoxins Fumonisin. In einem weiteren Schritt drückt
das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit 32 ein
zweites vordefiniertes Volumen Luft in die Testkassette 1, was
zur weiteren Beförderung der Probenflüssigkeit – ggf.
durch einen Filter hindurch – in den Kanal 6 bis in
die Detektionskammer 9 führt. Dort findet die Hauptinkubation
statt. Die Detektion erfolgt vorzugweise nach zehn Minuten mit einer
Präzision von ± 5 Sekunden. Hierfür wird
ein Laserstrahl in die Detektionskammer 9 auf die Oberfläche
des PWG-Biochips 10 geleitet und die erzeugte Fluoreszenz
wird von der CCD-Kamera 35 registriert. Üblicherweise
hat die Reaktion noch kein Equilibrium erreicht. Die Dauer der jeweiligen
Schritte wird präzise eingehalten.
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Die
Analyten-Werte werden durch Bezug auf eine Kalibrationskurve mittels
eines Rechnungselements der Steuereinheit 38 berechnet
und angezeigt.
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Für
die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses bei der Wiederholung des
Verfahrens mit einer anderen Testkassette werden die Parameter,
insbesondere Volumen, Zeiten (Beförderungs- und Inkubationszeiten)
und/oder Temperatur festgelegt und die jeweiligen Elemente der Vorrichtung
durch die Steuereinheit 38 automatisch kontrolliert.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
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- - US 5137827 [0007]
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- - US 4815843 [0012]
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- - US 5959292 [0012]
- - EP 0759159 [0012]
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- - DE 102005011530 [0015]
- - WO 2005/070533 [0016, 0019]
- - WO 2005/088300 [0018, 0019]
- - WO 02/20873 [0063]
- - EP 1316594 [0063]
- - WO 95/33197 [0069]
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- - WO 97/373211 [0069]
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