DE102005011530A1

DE102005011530A1 - Vorrichtung und Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten, Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Grösse eines Moleküls, Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat und Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen

Info

Publication number: DE102005011530A1
Application number: DE102005011530A
Authority: DE
Inventors: Kenji Kawasaki Arinaga; Ullrich Rant; Tsuyoshi Kawasaki Fujihara; Shozo Kawasaki Fujita
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 2004-08-19
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2006-03-02
Also published as: US20060040378A1; US7169617B2; US8945944B2; DE102005063453B3; US20070048760A1; US20110100822A1

Abstract

Eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten ist vorgesehen, um die Leistung der quantitativen Bestimmung deutlich zu verbessern. Diese Vorrichtung ist versehen mit einem Fließkanal, einer Analytdetektionseinheit zum Fangen und Detektieren des Analyten und einer Einheit zur quantitativen Messung zum quantitativen Bestimmen des Analyten, bei der ein Signal, das erzeugt wird, wenn die Analytdetektionseinheit den Analyten detektiert hat, in der Einheit zur quantitativen Messung zur Verarbeitung in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal geteilt wird. Ferner sind Technologien vorgesehen, die eine zum Steuern der Dichte von Molekülen enthalten, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden. Bei diesen Technologien wird, wenn Moleküle auf ein Substrat aufgebracht werden, die Dichte von aufgebrachten Molekülen gesteuert, indem bewirkt wird, daß auch ein Elektrolyt in einer Lösung vorhanden ist, die die Moleküle enthält, um den Screening-Effekt durch den Elektrolyten einzustellen, und indem die effektive Größe eines Moleküls berücksichtigt wird.

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung basiert auf der früheren japanischen Patentanmeldung Nr. 2004-238980, eingereicht am 19. August 2004, und Nr. 2004-283245, eingereicht am 29. September 2004, deren gesamter Inhalt hierin durch Bezugnahme inkorporiert ist, und beansprucht deren Priorität.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten, der für Biochips, DNA-Chips, etc. verwendet wird, sowie ein Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat, das für Biochips, DNA-Chips, etc. verwendet wird, und eine Vorrichtung, die unter Verwendung des Verfahrens hergestellt wird.

2. Beschreibung der verwandten Technik

In jüngster Zeit ist die Nanotechnologie zu einem Schlüsselwort geworden, das auf Grund verschiedener Faktoren, einschließlich einer Nanotechnologie-Gesetzesinitiative, die in den Vereinigten Staaten im Jahr 2000 vorgeschlagen wurde, die Aufmerksamkeit vieler Menschen auf sich gezogen hat. Speziell wird mit dem Gebiet der Nanobiotechnologie, das eine Integration von Halbleitermikrobearbeitungs technologien (Halbleiter-Nanotechnologien) und Biotechnologien darstellt, als neuem technischen Gebiet gerechnet, das für die herkömmlichen Probleme einschneidende Lösungen herbeiführen kann, und viele Forscher arbeiten tatkräftig auf diesem Gebiet.

Von diesen erregen die Biochip-Technologien, die durch DNA-Chips (oder DNA-Mikroarrays) verkörpert werden, als effektives Mittel zur Genanalyse die Aufmerksamkeit. Biochips umfassen Substrate, die aus Glas, Silizium, Plastik, etc. hergestellt sind und auf deren Oberfläche zahlreiche verschiedene Testsubstanzen von Biomakromolekülen wie etwa DNAs und Proteine äußerst dicht als Punkte angeordnet sind. Sie können die Prüfung von Nukleinsäuren und Proteinen auf den Gebieten der klinischen Diagnose und Pharmakotherapie vereinfachen (siehe zum Beispiel die japanische ungeprüfte Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 2001-235468 (Absatznummern 0002-0009) und Annual Review von Biomedical Engineering, Bd. 4, S. 129-153, 2002, und Nature Biotechnology, Bd. 21, S. 1192-1199, 2003).

Vorrichtungen wie jene Chips, die durch das Integrieren von Mikrobearbeitungstechnologien und Abtasttechnologien unter Technologien zum Detektieren eines winzigen Analyten hergestellt werden, werden im allgemeinen als MEMSs oder μTASs bezeichnet, die die Aufmerksamkeit als Vorrichtungen zum weitgehenden Verbessern der Detektionsempfindlichkeit und Detektionszeit im Vergleich zum Stand der Technik auf sich ziehen. Der Ausdruck MEMS ist die Abkürzung für Micro-Electro-Mechanical-System, das heißt, eine Technologie zum Vorbereiten von mikroskopischen Bestandteilen auf der Basis von Halbleiterverarbeitungstechnologien oder mikroskopischen Präzisionsvorrichtungen, die unter Verwendung der Technolo gien vorbereitet werden. Im allgemeinen ist es ein System, bei dem eine Vielzahl von Funktionseinheiten, wie etwa mechanische, optische und hydrodynamische Einheiten, integriert und miniaturisiert sind. Der Ausdruck μ-TAS ist die Abkürzung für Micro-Total-Analysis-System und ist ein chemisches Analysesystem mit Mikropumpen, Mikroventilen, Sensoren oder dergleichen, die miniaturisiert, akkumuliert und integriert sind.

Die Merkmale dieser Vorrichtungen liegen darin, daß es möglich ist, eine sehr kleine Menge einer Probe auszuwerten, die einen Analyten enthält, und daß es möglich ist, eine Echtzeitauswertung auszuführen, indem bewirkt wird, daß eine Probe in eine Analytdetektionseinheit fließt. Es gibt viele andere Vorteile, einschließlich dessen, daß es möglich ist, eine Vielzahl von Analyten gleichzeitig auszuwerten, indem Analytdetektionseinheiten parallel oder seriell angeordnet werden.

Hinsichtlich der Technologie, die ein Schlüssel für diese Nanobiotechnologien ist, existiert ferner das Problem, wie Biomoleküle, wie beispielsweise DNAs und Proteine, auf einen festen Körper wie etwa Halbleitermaterial und Metall aufzubringen sind, damit die Oberfläche des festen Körpers eine spezifische Funktion aufweist. Das Aufbringen von Molekülen auf die Oberfläche eines festen Körpers durch physische Adsorption, das durch LB-(Langmuir Brodgett)-Membranen verkörpert wird, ist lange und weit und breit bekannt gewesen. Jedoch werden die Moleküle, die nur durch physische Adsorption gebildet werden, im Laufe der Zeit oder durch wiederholte Verwendung desorbiert. Daher sind in letzter Zeit Moleküle im allgemeinen durch chemische Adsorption unter Nutzung einer chemischen Reaktion zwischen der Oberfläche eines festen Körpers und Molekülen aufgebracht worden. Genauer gesagt, ein Verfahren zum Aufbringen von Molekülen durch chemische Adsorption, bei dem eine SH-(Thiol)-Gruppe an einem Ende eines Moleküls angeordnet wird, um die kovalente Bindung zwischen S (Schwefel) und einem Metall oder Halbleitermaterial zu nutzen, wird vorgeschlagen und bei verschiedenen Forschungen und Entwicklungen umfassend eingesetzt (siehe zum Beispiel Chemical Reviews, Bd. 96, S. 1533-1554, 1996).

Wenn Moleküle mit einer Alkylkette, die eine SH-Endgruppe hat, als Moleküle verwendet werden, kann durch die van-der-Waals-Kraft der Alkylkette ein monomolekularer Film mit einer regelmäßigen Anordnung von Molekülen auf einem festen Körper gebildet werden. Es ist leicht, diese Membran zu bilden. Das heißt, wenn die Oberfläche eines festen Körpers in eine Lösung getaucht wird, die diese Moleküle enthält, wird auf der Oberfläche des festen Körpers spontan ein monomolekularer Film (selbstorganisierter Monolagen-Film) gebildet.

Es ist möglich, einen Monolagen-Film zu bilden, der eine Funktion auf der Oberfläche hat, indem DNAs, Proteine oder funktionelle Gruppen, die andere Funktionen haben, an einen Teil der Alkylkette angelagert werden (siehe zum Beispiel Bioconjugate Chemistry, Bd. 8, S. 31-37, 1997).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Obwohl hinsichtlich der oben beschriebenen Vorrichtung, wie eines MEMS und μTAS, das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines Analyten detektiert werden kann, wenn eine extrem hochempfindliche Vorrichtung als Analytdetektionseinheit installiert wird, ist jedoch das Problem vorhanden, daß das Signal von der Analytdetektionseinheit durch eine kleine Menge des Analyten gesättigt werden kann und es daher schwierig ist, den Analyten quantitativ zu bestimmen, falls die Vorrichtungscharakteristiken für die Menge des Analyten nicht linear genug sind (mit anderen Worten, falls der dynamische Bereich für die Menge des Analyten niedrig ist).

Besonders beim Detektieren von Biomolekülen mit einem Biochip oder dergleichen werden Moleküle, wie z. B. Antikörpermoleküle, die an den Biomolekülen spezifisch adsorbiert werden, oft als Analytdetektionseinheiten verwendet. In solch einem Fall werden eine Analytdetektionseinheit und ein Analyt oft in einem 1:1-Verhältnis verbunden, wodurch eine kleine Anzahl von Analyten die Analytdetektionseinheiten sättigen wird, falls die Anzahl von Analytdetektionseinheiten klein ist, so daß es unmöglich wird, eine quantitative Bestimmung in einem breiten Bereich auszuführen. Falls andererseits die Anzahl von Analytdetektionseinheiten erhöht wird, um eine quantitative Bestimmung in einem breiten Bereich ausführen zu können, kommt es zu einer Minderung der Detektionsempfindlichkeit und Zunahme des Hintergrundrauschens.

Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf das Lösen des oben beschriebenen Problems und das Vorsehen einer neuen Technologie gerichtet, mit der es möglich ist, einen Analyten in einem breiten Bereich quantitativ zu bestimmen, ohne die Detektionsempfindlichkeit zu verringern, auch wenn eine Analytdetektionseinheit mit einem Analyten in einem 1:1-Verhältnis verbunden wird, wie es im Falle eines Biochips beobachtet wird.

Gemäß einer Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum quantitati ven Bestimmen eines Analyten vorgesehen, die versehen ist mit einem Fließkanal, einer Analytdetektionseinheit zum Fangen und Detektieren des Analyten und einer Einheit zur quantitativen Messung zum quantitativen Bestimmen des Analyten, bei der ein Signal, das erzeugt wird, wenn die Analytdetektionseinheit den Analyten detektiert hat, in der Einheit zur quantitativen Messung zur Verarbeitung in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal geteilt wird.

Unter Verwendung der Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird es möglich, einen Analyten in einem breiten Bereich quantitativ zu bestimmen, ohne die Detektionsempfindlichkeit zu verringern, mit dem Resultat, daß die Leistung bei der quantitativen Bestimmung eines Analyten deutlich verbessert wird.

In dieser Ausführungsform ist es vorzuziehen, daß die Analytdetektionseinheit eine Analytfängereinheit zum Fangen des Analyten hat; daß eine Vielzahl von Analytdetektionseinheiten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal angeordnet ist; daß die Länge der Analytdetektionseinheit in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal nicht kleiner als das Doppelte der Breite des Fließkanals ist; daß eine Vielzahl von Analytdetektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals angeordnet ist; daß die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines optischen Signals quantitativ bestimmt; daß die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines elektrischen Signals quantitativ bestimmt; daß die Dicke des Fließkanals in der Analytdetektionseinheit nicht mehr als das 100fache der effektiven Höhe eines gefangenen Analyten beträgt; daß die Dicke des Fließkanals in der Analytdetektionseinheit mit stromabwärts fließendem Fluß größer wird; daß die Analytdetektionseinheit eine Elektrode ist, auf die ein elektrisches Potential angewendet werden kann, damit geladene Analyten durch die Elektrode elektrisch angezogen werden; besonders, daß das elektrische Potential zum elektrischen Anziehen von geladenen Analyten durch die Elektrode gemäß der Stelle der Elektrode in der Richtung des Fließens verändert werden kann; daß eine Mikropumpe, ein elektrophoretischer Fluß oder ein elektroosmotischer Fluß genutzt wird, damit eine Lösung, die den Analyten enthält, in dem Fließkanal fließt; daß eine Vielzahl von Analytfängereinheiten zum spezifischen Fangen von verschiedenen Analyten in der Analytdetektionseinheit angeordnet ist; daß der Analyt eine DNA ist und die Analytfängereinheit eine Funktion hat, um mit einer DNA spezifisch verbunden zu werden; und daß der Analyt ein Protein ist und die Analytfängereinheit eine Funktion hat, um mit einem Protein spezifisch verbunden zu werden.

Gemäß einer anderen Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten vorgesehen, das umfaßt: Verwenden eines Fließkanals, einer Analytdetektionseinheit zum Fangen und Detektieren des Analyten und einer Einheit zur quantitativen Messung zum quantitativen Bestimmen des Analyten; und Teilen eines Signals, das erzeugt wird, wenn die Analytdetektionseinheit den Analyten detektiert hat, in der Einheit zur quantitativen Messung zur Verarbeitung in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal.

Unter Verwendung des Verfahrens zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird es möglich, einen Analyten in einem breiten Bereich quantitativ zu bestimmen, ohne die Detektionsempfindlichkeit zu verringern, mit dem Resultat, daß die Leistung beim quantitativen Bestimmen eines Analyten deutlich verbessert wird.

In dieser Ausführungsform ist es vorzuziehen, daß die Analytdetektionseinheit eine Analytfängereinheit zum Fangen des Analyten hat; daß eine Vielzahl von Analytdetektionseinheiten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal angeordnet ist; daß die Anzahl von Analyten, die durch die Analytdetektionseinheit in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal gefangen werden, optimiert wird; genauer gesagt, daß die Optimierung durch Verändern wenigstens eines Faktors erfolgt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Zufuhrgeschwindigkeit des Analyten, der Länge der Analytdetektionseinheit in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal, der Anzahl der Analytdetektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals und der Dicke des Fließkanals; daß die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines optischen Signals quantitativ bestimmt; daß die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines elektrischen Signals quantitativ bestimmt; daß die Analytdetektionseinheit eine Elektrode ist und ein elektrisches Potential zum elektrischen Anziehen von geladenen Analyten durch die Elektrode auf die Elektrode angewendet wird; besonders, daß das elektrische Potential zum elektrischen Anziehen von geladenen Analyten durch die Elektrode gemäß der Stelle der Elektrode in der Richtung des Fließens verändert wird; daß eine Vielzahl von Analytfängereinheiten zum spezifischen Fangen von verschiedenen Analyten auf der Analytdetektionseinheit angeordnet ist; daß der Analyt eine DNA ist und die Analytfängereinheit eine Funktion hat, um mit einer DNA spezifisch verbunden zu werden; und daß der Analyt ein Protein ist und die Analytfängereinheit eine Funktion hat, um mit einem Protein spezifisch verbunden zu werden.

Gemäß anderen Ausführungsformen des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung sind ein MEMS und ein μTAS vorgesehen, die mit der oben beschriebenen Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten versehen sind.

Durch den oben beschriebenen ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es möglich, einen Analyten in einem breiten Bereich ohne Verringerung der Detektionsempfindlichkeit quantitativ zu bestimmen, mit dem Resultat, daß die Leistung beim quantitativen Bestimmen eines Analyten deutlich verbessert wird.

Hinsichtlich des Aufbringens von Biomolekülen ist, wenn die Oberfläche eines festen Körpers einfach mit Molekülen modifiziert wird, die eine Alkylkette umfassen, die funktionelle Gruppen hat, die verschiedene Funktionen haben, das Problem vorhanden, daß es schwierig ist, die Dichte der Moleküle, die die Alkylkette umfassen und auf die Oberfläche aufgebracht werden, zu steuern (die Dichte der Moleküle, die auf die Oberfläche eines festen Körpers wie etwa eines Substrats aufgebracht werden, wird bei der vorliegenden Erfindung als "Aufbringungsdichte" bezeichnet).

Auch wenn bekannt ist, daß solch eine chemische Adsorption von Molekülen von der Diffusion abhängt und es ein Beispiel gibt, bei dem von einer Veränderung der Aufbringungsdichte von Molekülen berichtet wird, die mit der Zeit beobachtet wird, wird zusätzlich ein Zustand einer relativ niedrigen Aufbringungsdichte in kurzer Zeit erreicht, und deshalb ist es schwierig, mit hoher Reproduzierbarkeit eine niedrige Aufbringungsdichte mit weiter Entfernung zwischen benachbarten Molekülen zu realisieren, bei der der Einfluß von Wechselwirkungen zwischen Molekülen vernachlässigt werden kann, indem die Zeit zur Vorbereitung gesteuert wird (siehe zum Beispiel Nucleic Acids Research, Bd. 29, S. 5163-5168, 2001).

Ferner sind Biomoleküle wie etwa DNAs und Proteine relativ groß im Vergleich zu gewöhnlichen Molekülen, die eine Alkylkette haben. Falls einfach ein selbstorganisierter Monolagen-Film, der kompakt ist (das heißt, der eine hohe Dichte von Biomolekülen hat), vorbereitet wird, wird daher die sterische Hinderung zwischen Biomolekülen groß, wodurch das Problem der Behinderung der freien Bewegung der Biomoleküle aufgeworfen wird. Auf solch einer Oberfläche ist es nicht möglich, Signale in bezug auf Reaktionen zwischen den Biomolekülen, ihre Wärmebewegungen (zum Beispiel Signale in bezug auf die Fluktuationsbewegung und Biege-/Dehnbewegungen) etc. zur Genüge zu erfassen.

Andererseits ist es auf dem Gebiet von Biosensoren, die Reaktionen zwischen solchen Molekülen und/oder Bewegungen von Molekülen für eine Abtasttechnologie nutzen, sehr wichtig, die Aufbringungsdichte zu steuern und/oder eine niedrige Aufbringungsdichte mit hoher Reproduzierbarkeit zu realisieren. Daher besteht eine starke Nachfrage nach einer Technologie zum Steuern der Dichte von Molekülen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden.

Eine DNA hat eine negative Ladung in einer wäßrigen Lösung auf der Phosphorsäuregruppe auf ihrer Hauptkette. Daher stoßen DNA-Moleküle in einer wäßrigen Lösung elektrostatisch einander ab. Es ist auch bekannt, daß in einer wäßrigen Lösung, die einen Elektrolyten enthält, Ionen mit positiver Ladung ein DNA-Molekül umgeben, was auf einen Prozeß zum Kompensieren der elektrischen Ladung des DNA-Moleküls hinweist (der als Screening-Effekt oder Debye-Effekt bezeichnet wird).

Dieser Screening-Effekt hängt von der Konzentration eines Elektrolyten ab. Das heißt, es ist möglich, den dichtesten Abstand zwischen DNA-Molekülen zu steuern, indem die Konzentration eines Elektrolyten gesteuert wird, wodurch eine Möglichkeit zum Steuern der schließlichen Aufbringungsdichte von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, wie etwa von DNA-Molekülen, vorgesehen wird.

Obwohl einige Berichte vorliegen, die solch einen Effekt bestätigen, sind dies nur qualitative Studien, die die Aufbringungsdichte nicht vorhersagen können (siehe zum Beispiel Journal of American Chemical Society, Bd. 119, S. 8916-8920, 1997).

Ferner ist weitgehend unbekannt, welche Struktur Moleküle in Form eines Strangs, wie beispielsweise DNA-Moleküle, in einer wäßrigen Lösung haben, wodurch es um so schwieriger wird, mit solchen Molekülen zu arbeiten.

Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf das Lösen der oben beschriebenen Probleme gerichtet und sieht eine Technologie zum Steuern der Dichte von Molekülen vor, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden.

Er ist auch auf das Vorsehen von Technologien gerichtet, die die Struktur und das Verhalten von Molekülen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, in einer Lösung klären können und eine Vorrichtung unter Verwendung von auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebrachten Molekülen mit hoher Zuverlässigkeit und hoher Empfindlichkeit realisieren können.

Andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden Erläuterung geklärt.

Gemäß einer Ausführungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls vorgesehen, das eine elektrische Ladung hat, bei dem die effektive Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung in einer Lösung hat, die einen Elektrolyten und das Molekül enthält, das eine elektrische Ladung hat, unter Verwendung des Screening-Effektes durch den Elektrolyten eingeschätzt wird.

Durch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die effektive Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, zum Steuern der Aufbringungsdichte von Molekülen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, in Erfahrung zu bringen.

Gemäß einer anderen Ausführungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat vorgesehen, bei dem die Aufbringungsdichte von Molekülen gesteuert wird, indem ein Elektrolyt in einer Lösung vorhanden ist, die die Moleküle enthält, um den Screening-Effekt durch den Elektrolyten einzustellen, und indem die effektive Größe eines Moleküls in einer Lösung berücksichtigt wird, wenn die Moleküle, die eine elektrische Ladung haben, auf das Substrat aufgebracht werden.

Durch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine erforderliche Aufbringungsdichte zu realisieren.

Es ist vorzuziehen, daß die effektive Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung in einer Lösung hat, die einen Elektrolyten und das Molekül mit einer elektrischen Ladung enthält, gemäß dem Screening-Effekt durch den Elektrolyten, wie oben erläutert, eingeschätzt wird und die so erhaltene effektive Größe als oben beschriebene effektive Größe verwendet wird.

Während ein beliebiger Elektrolyt in jeder der oben beschriebenen Ausführungsformen verwendet werden kann, ist es zusätzlich vorzuziehen, daß ein Elektrolyt, der aus einem einwertigen Kation und einem einwertigen Anion gebildet ist, als Elektrolyt verwendet wird; und daß der Elektrolyt, der ein einwertiges Kation und ein einwertiges Anion umfaßt, NaCl, KCl oder ein Gemisch daraus ist.

Gemäß noch einer anderen Ausführungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat vorgesehen, bei der die Dichte von Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, gesteuert werden kann, wobei das Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat gemäß dem oben beschriebenen Verfahren verwendet wird. Durch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Substrat zu erhalten, das eine gewünschte Aufbringungsdichte hat.

Gemäß noch einer anderen Ausführungsform des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen vorgesehen, bei der das oben beschriebene Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat verwendet wird und ein Substrat, dessen Aufbringungsdichte so gesteuert wird, daß der Abstand zwischen benachbarten Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, nicht kleiner als das Doppelte oder kleiner als das Doppelte der effektiven Länge eines Moleküls ist, als Moleküldetektionseinheit verwendet wird.

Durch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Strukturen und Verhaltensweisen von Molekülen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, in einer Lösung zu klären und eine Vorrichtung mit hoher Zuverlässigkeit und hoher Empfindlichkeit zu realisieren.

Es ist vorzuziehen, wenn das Substrat aus einem elektroleitfähigen Material, einem Halbleitermaterial oder einem Isoliermaterial ist und besonders, wenn es aus Gold oder Platin ist.

Ferner ist es in jeder Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorzuziehen, daß das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, ein Material umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNAs, RNAs, Antikörpern, natürlichen oder künstlichen einsträngigen Nukleotiden, natürlichen oder künstlichen doppelsträngigen Nukleotiden, Aptameren, Produkten, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, organischen Verbindungen mit einer Affinität für Proteine, Biomakromolekülen mit einer Affinität für Proteine, komplexen Materialien daraus, ionischen Polymeren, die positiv oder negativ geladen sind, und beliebigen Kombinationen daraus; daß das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, eine Thiolgruppe umfaßt; und daß das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, ein fluoreszierendes Pigment umfaßt.

Durch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Aufbringungsdichte von Molekülen zu steuern, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, wodurch es möglich ist, die Struktur und das Verhalten der Moleküle, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, in einer Lösung zu klären. Es ist auch möglich, eine Vorrichtung unter Verwendung der Moleküle, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, mit hoher Zuverlässigkeit und hoher Empfindlichkeit zu realisieren.

Jeder der oben beschriebenen zwei Aspekte der vorliegenden Erfindung kann auf den anderen Aspekt angewendet werden. Zum Beispiel kann die Vorrichtung gemäß dem ersten Aspekt zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls verwendet werden, das eine elektrische Ladung hat, und das Verfahren zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat gemäß dem zweiten Aspekt kann für eine Detektionseinheit in der Vorrichtung gemäß dem ersten Aspekt verwendet werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1-A ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine herkömmliche Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten detektiert wird;

1-B ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine herkömmliche Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten detektiert wird;

1-C ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine herkömmliche Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten detektiert wird;

2-A ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine herkömmliche Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten detektiert wird;

2-B ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine herkömmliche Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten detektiert wird;

2-C ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine herkömmliche Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten detektiert wird;

3-A ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert wird;

3-B ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert wird;

3-C ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert wird;

4-A ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert wird;

4-B ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert wird;

4-C ist eine schematische Ansicht, die erläutert, wie ein Analyt durch eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert wird;

5 ist eine schematische Ansicht, die die Dicke eines Fließkanals und die Höhe eines Analyten erläutert;

6 ist eine schematische Ansicht, die eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten erläutert, bei der keine Fängereinheit installiert ist;

7 ist ein Graph, der die Abhängigkeit einer Debye-Länge von der Ionenkonzentration des Elektrolyten zeigt, wenn ein Analyt des 1:1-Typs verwendet wird;

8 ist eine schematische Ansicht, die die dichteste Packungsstruktur von Molekülen, die auf ein Substrat aufgebracht werden, und das Prinzip zum Berechnen der Aufbringungsdichte zeigt;

9 ist eine schematische Ansicht, die die dichteste Packungsstruktur von Molekülen, die auf ein Substrat aufgebracht werden, und das Prinzip zum Berechnen der Aufbringungsdichte zeigt, wenn die Debye-Länge berücksichtigt wird;

10 ist ein Graph, der die Abhängigkeit der Aufbringungsdichte von adsorbierten Molekülen von der Ionenkonzentration des Elektrolyten zeigt, wenn die Aufbringungsdichte berechnet wird, wobei die Debye-Länge berücksichtigt wird;

11 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Aufbringungsdichte von einsträngigen Oligonukleotidmolekülen und der Ionenkonzentration des Elektrolyten und die Beziehung zwischen der Debye-Länge und der Ionenkonzentration des Elektrolyten zeigt;

12 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Fluoreszenzintensität und der Aufbringungsdichte zeigt; und

13 ist eine schematische Ansicht, die ein Beispiel für eine Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen zeigt, bei der ein fluoreszierendes Pigment geladenen Molekülen zum Detektieren der Fluoreszenz angelagert wird.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Unter Verwendung von Zeichnungen, Beispielen, etc. werden nun Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben. Diese Zeichnungen, Beispiele, etc. und Beschreibungen dienen zum Demonstrieren der vorliegenden Erfindung und grenzen den Umfang der Erfindung nicht ein. Es versteht sich von selbst, daß andere Ausführungsformen im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, solange sie dem wesentlichen Charakter gemäß der vorliegenden Erfindung entsprechen. Ein und dasselbe Bezugszeichen bezeichnet in den Zeichnungen ein und dasselbe Element.

Die Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist versehen mit einem Fließkanal, einer Analytdetektionseinheit (die im folgenden auch als "Detektionseinheit" bezeichnet wird) zum Fangen und Detektieren des Analyten und einer Einheit zur quantitativen Messung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten, wobei ein Signal, das erzeugt wird, wenn die Detektionseinheit einen Analyten detektiert hat, in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal in der Einheit zur quantitativen Messung zur Verarbeitung geteilt wird. Dadurch ist es möglich, einen Analyten mit hoher Empfindlichkeit und hohem dynamischen Bereich quantitativ zu bestimmen.

Ein beliebiges Signal kann als Signal verwendet werden, das in der Einheit zur quantitativen Messung zum quantitati ven Bestimmen des Analyten verarbeitet wird. Jedoch ist ein elektrisches Signal oder optisches Signal äußerst zuverlässig und daher vorzuziehen.

Ein beliebiges Verfahren kann als Verfahren für die Detektionseinheit zum Fangen des Analyten verwendet werden. Ein Verfahren, bei dem die Detektionseinheit eine Analytfängereinheit zum Fangen eines Analyten hat (im folgenden auch einfach als "Fängereinheit" bezeichnet), ist das leichteste Verfahren und vorzuziehen. Obwohl die Detektionseinheit und die Fängereinheit bei der folgenden Erläuterung im allgemeinen getrennt erklärt werden, ist es zulässig, wenn die Fängereinheit in der Detektionseinheit enthalten ist und deren Gesamtheit als Detektionseinheit bezeichnet wird, solange dies nicht im Widerspruch zu dem Kern der vorliegenden Erfindung steht.

Ein beliebiges Verfahren kann als Verfahren verwendet werden, bei dem die Einheit zur quantitativen Messung das Signal, das erzeugt wird, wenn die Detektionseinheit den Analyten detektiert hat, in viele Teile zur Verarbeitung in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal teilen kann. Wenn die Einheit zur quantitativen Messung einen Analyten unter Verwendung eines optischen Signals quantitativ bestimmt, kann ein optisches Signal, wie etwa Fluoreszenz, über die Detektionseinheit gescant werden oder kann ein optisches Signal über die Detektionseinheit insgesamt empfangen werden und wird das Bild zur Analyse in viele Teile geteilt.

Im Falle eines optischen Signals ist es leicht, es zu beobachten, indem es in viele Teile geteilt wird, ohne die Quelle des Signals zuvor in viele Teile zu teilen. Wenn die Einheit zur quantitativen Messung einen Analyten jedoch durch ein elektrisches Signal quantitativ bestimmt, muß eine Vielzahl von separaten Detektionseinheiten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal installiert werden, um eine Vielzahl von elektrischen Signalen zu entnehmen.

Der Ausdruck "in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal" bedeutet "in der Richtung, längs derer ein Medium, das einen Analyten enthält, in dem Fließkanal fließt", und die Aktion zum "Teilen in viele Teile in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal zur Verarbeitung" kann zum Beispiel durch Scannen eines optischen Signals in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal oder durch Installieren einer Vielzahl von Detektionseinheiten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal und durch Entnahme von elektrischen Signalen von jeder der Detektionseinheiten realisiert werden. Es sei erwähnt, daß die "Richtung des Fließens in dem Fließkanal" in diesem Fall nicht unbedingt eine geradlinige Richtung ist. Es ist zum Beispiel nicht nötig, eine Vielzahl von Detektionseinheiten in einer geraden Linie zu installieren. Solche Signale können mit dem Scannen eines optischen Signals in der Richtung längs der Breite des Fließkanals kombiniert werden, und wenn eine Vielzahl von Detektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals vorhanden ist, können elektrische Signale von diesen Detektionseinheiten zusammen mit den oben beschriebenen Signalen verwendet werden.

Das folgende ist unter Bezugnahme auf 1-3 eine Erläuterung für den Fall, wenn eine Fängereinheit auf einer Detektionseinheit installiert ist und eine Einheit zur quantitativen Messung einen Analyten durch ein elektrisches Signal quantitativ bestimmt.

1-3 sind schematische Ansichten von Vorrichtungen zum quantitativen Bestimmen eines Analyten zum Erläutern der Prinzipien herkömmlicher Beispiele und des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung. Eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten 11 in 1-3 hat für solche Zwecke wie MEMSs und μTASs eine Detektionseinheit 13, die mit einer Fängereinheit 14 versehen ist, die sich spezifisch mit einem Analyten in einem 1:1-Verhältnis in einem Fließkanal 12 verbindet, und erzeugt ein elektrisches Signal, wenn diese verbunden ist.

Eine herkömmliche Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten wird unter Verwendung von 1-A bis 1-C und 2-A bis 2-C erläutert. Die Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten 11 ist mit einer Fängereinheit auf der Detektionseinheit versehen, wie in 1-A gezeigt, eine Lösung zur Prüfung (Prüfungslösung) 18, die einen Analyten 19 umfaßt, fließt in dem Fließkanal, wie in 1-B gezeigt, und wenn sie eine Prüfungseinheit 13 durchläuft, wird der Analyt 19 mit der Fängereinheit 14 spezifisch verbunden, wobei ein elektrisches Signal erzeugt wird, wie in 1-C gezeigt. Dieses Signal wird durch eine Signalempfangselektrode 15 entnommen, eine notwendige Verarbeitung (Verstärkung, Konvertierung, etc.) wird in einer Signalverarbeitungsschaltung 16 ausgeführt, und an einem Monitor 17 wird es als Veränderungssignal konstatiert.

Wenn eine Fängereinheit 14 für die Detektionseinheit 13 verwendet wird, wie im Fall der herkömmlichen Beispiele, wird nur einer der Analyten mit der Fängereinheit verbunden, wobei ein Signal erzeugt wird, wie es in 2-B gezeigt ist, wenn eine Lösung 18, die zwei oder mehr Analyten 19 enthält, in den Fließkanal 12 fließt, wie in 2-A ge zeigt. Daher fließen die übrigen Analyten aus dem Fließkanal heraus, ohne mit der Fängereinheit verbunden zu werden, mit dem Resultat, daß es unmöglich ist, die Analyten quantitativ präzise zu bestimmen.

Wenn ferner zum Beispiel drei Fängereinheiten auf der Detektionseinheit installiert sind, um die Kapazität der quantitativen Bestimmung zu verdreifachen, wie in 2-C gezeigt, ist es erforderlich, den dynamischen Bereich anzuheben, um dem elektrischen Signal zu entsprechen, das dreimal so groß ist (Monitor 17 oben in der Figur), oder die Empfindlichkeit auf ein Drittel zu verringern (Monitor 17 unten in der Figur).

Zum Vergleich wird die "Detektionseinheit" gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verarbeitung in viele Teile in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal geteilt. Zum Beispiel zeigt 3-A fünf Detektionseinheiten 13, die jeweils eine Fängereinheit 14 haben (durch Bezugszeichen 1-5 gekennzeichnet), elektrisch voneinander getrennt sind und seriell in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal installiert sind.

Zusätzlich ist eine Schaltelektrode 31 zum Überwachen von Signalen von den Elektroden auf alternierende Weise installiert. Auf diese Weise werden, wenn Analyten, die in den Fließkanal geflossen sind, mit den Fängereinheiten von der stromaufwärtigen Seite zu der stromabwärtigen Seite sequentiell verbunden werden, wie in 3-B gezeigt, Signale sequentiell von der oberen Detektionseinheit bis zu der unteren Detektionseinheit gemäß der Menge (das heißt, der Anzahl) der Analyten erzeugt.

In solch einem Fall werden die Signale von den Detektionseinheiten, die durch eingekreiste Zahlen 1-5 in der Figur dargestellt sind und durch das sequentielle Umschalten erhalten werden, wie in 3-C gezeigt, einer erforderlichen Verarbeitung (Verstärkung, Konvertierung, etc.) durch die Signalverarbeitungsschaltung 16 unterzogen. Wenn die Menge (oder Anzahl) der Analyten in der Lösung drei beträgt, werden Signale von der obersten Detektionseinheit bis zu der dritten durch kontinuierliches Überwachen durch den Monitor 17 detektiert, wodurch es möglich wird, die Menge von Analyten anhand der Stellen der Detektionseinheiten, durch die Signale beobachtet werden, quantitativ zu bestimmen. Die Schaltelektrode 31, die Signalverarbeitungsschaltung 16 und der Monitor 17 bilden die Einheit zur quantitativen Messung gemäß der vorliegenden Erfindung.

Unter Einsatz der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Kapazität zum quantitativen Bestimmen eines Analyten durch Kombinieren einer herkömmlichen Signalverarbeitungsschaltung zum Beispiel mit einem einfachen Schalter zu erhöhen und den dynamischen Bereich der Detektionsvorrichtung zu verbessern, ohne die Empfindlichkeit zu verringern.

Die obige Erläuterung betrifft den Fall, wenn eine Fängereinheit auf einer Detektionseinheit installiert ist. Ein ähnlicher Effekt kann auch vorgesehen werden, wenn eine Vielzahl von Fängereinheiten auf einer Detektionseinheit installiert ist, wobei der Fall berücksichtigt wird, wenn eine große Anzahl von Analyten vorhanden ist. Da es im allgemeinen nicht leicht ist, nur eine Fängereinheit auf einer Detektionseinheit zu installieren, ist es oft praktisch, eine Vielzahl von Fängereinheiten auf einer Detektionseinheit zu installieren. Da in diesem Fall die Detektionsempfindlichkeit abnimmt, wenn zu viele Fängereinheiten auf einer Detektionseinheit installiert sind, ist es oft vorzuziehen, wenn die Anzahl der Fängereinheiten, die auf einer Detektionseinheit installiert werden, so klein wie möglich ist, indem die Größe der Detektionseinheit kleiner gemacht wird, die Dichte von Fängereinheiten kleiner gemacht wird oder andere, ähnliche Maßnahmen zum Einsatz kommen.

Wenn Analyten durch eine Detektionseinheit ohne dazwischenliegende Fängereinheit direkt gefangen werden, kann ein Fall akzeptiert werden, bei dem eine Detektionseinheit, ähnlich wie oben, eine Vielzahl von Analyten fangen kann. Es ist jedoch oft besser, wenn die Anzahl der Analyten, die durch eine Detektionseinheit gefangen werden können, so klein wie möglich gehalten wird, indem die Größe der Detektionseinheit kleiner gemacht wird oder andere, ähnliche Maßnahmen zum Einsatz kommen.

Wenn optische Signale genutzt werden, emittiert jeder der Analyten, die durch eine Fängereinheit gefangen werden, ein optisches Signal. Daher ist es nicht erforderlich, viele Detektionseinheiten zu installieren, und es reicht aus, wenn die Einheit zur quantitativen Messung diese Signale in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal zur Verarbeitung teilen kann.

4-A bis 4-C sind schematische Ansichten von Vorrichtungen zum quantitativen Bestimmen eines Analyten, wobei Analyten, die durch Fängereinheiten gefangen werden, Fluoreszenz emittieren. In 4-A bis 4-C sind Fängereinheiten, die Analyten gefangen haben, und Fängereinheiten, die keinen Analyten gefangen haben, gezeigt. In diesem Fall ist eine Vielzahl von Fängereinheiten sowohl in der Richtung des Fließens als auch längs der Breite des Fließkanals in einer Detektionseinheit vorhanden. In solch einem Fall kann die Einheit zur quantitativen Messung die Signale, die durch Scannen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal erhalten werden, auch in viele Signale in der Richtung längs der Breite des Fließkanals zur Verarbeitung teilen. Wenn der Fall auftreten sollte, daß die Anzahlen von Fängereinheiten, die Analyten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal gefangen haben, in der Richtung längs der Breite des Fließkanals verschieden sind, wie in 4-C gezeigt, ist es vernünftig, zum Beispiel den Durchschnittswert für die quantitative Bestimmung zu verwenden.

Es ist nicht immer erforderlich, daß die Einheit zur quantitativen Messung optische Signale zur Verarbeitung gemäß jedem Analyten, jeder Fängereinheit oder jeder Detektionseinheit teilt. Zum Beispiel wäre es möglich, einige Analyten, Fängereinheiten und/oder Detektionseinheiten in der Richtung des Fließens in einer Gruppe zusammenzufassen, die der Verarbeitung zu unterziehen ist. Zum Beispiel können Signale in einem gewissen Wellenlängenbereich für die Verarbeitung gruppiert werden.

Es ist nicht immer erforderlich, eine Fängereinheit zu installieren, falls eine Detektionseinheit einen Analyten direkt fangen kann. Ein Fall, wenn ein Analyt auf einer Detektionseinheit physisch oder elektrisch adsorbiert wird, ist solch ein Fall. Da solch eine Adsorption im allgemeinen schwach ist, ist es jedoch vorzuziehen, eine Fängereinheit zu installieren, die einen Analyten auf der Detektionseinheit fangen kann. Wenn eine Vielzahl von Fängereinheiten zum spezifischen Fangen von verschiedenen Analyten verwendet wird, können verschiedene Typen vieler Analyten gleichzeitig quantitativ bestimmt werden. Das ist daher vorzuziehen.

Es ist vorzuziehen, daß die Länge der Detektionseinheit oder der Detektionseinheiten in der Richtung des Fließens nicht kleiner als das Doppelte der Breite des Fließkanals ist. Falls eine Detektionseinheit in der Richtung des Fließens vorhanden ist, ist die Länge der Detektionseinheit in der Richtung des Fließens deren Länge, und falls viele Detektionseinheiten vorhanden sind, ist die Länge die Gesamtlänge. Dadurch ist es leichter, Analyten mit einer Vielzahl von Fängereinheiten oder Detektionseinheiten in der Richtung des Fließens zu fangen, wodurch die Detektionsempfindlichkeit erhöht wird.

Wenn die Breite des Fließkanals größer als die Breite einer Detektionseinheit ist, kann eine Vielzahl von Detektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals installiert werden. Da der Fließkanal gemäß der vorliegenden Erfindung so winzig ist, wie aus der Tatsache hervorgeht, daß die Breite zum Beispiel in einem Bereich zwischen 100 μm und 5 mm liegt und die Höhe in einem Bereich zwischen 1 μm und 1 mm liegt, und sich die Flußrate im allgemeinen auf den kleinen Wert von nicht mehr als 10 cm/Sekunde beläuft, der in der Region einer laminaren Strömung liegt, ist es nicht immer erforderlich, eine Vielzahl von Detektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals zu installieren. Es ist jedoch vorzuziehen, eine quantitative Bestimmung mit höherer Präzision zu realisieren. Zum Beispiel kann dadurch, daß Signale, die durch Scannen in der Längsrichtung des Fließkanals erhalten werden, einer Durchschnittsbildung in der Richtung längs der Breite unterzogen werden, dieselbe Anzahl von Daten durch eine Messung wie jene erhalten werden, die durch mehrmalige Wiederholung der Messung mit einer Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten erhalten wird, die nur eine Detektionseinheit in der Richtung längs der Breite des Fließkanals hat.

Während die obige Erläuterung solche Fälle betrifft, wenn Analyten mit Fängereinheiten sequentiell von der stromaufwärtigen Seite zu der stromabwärtigen Seite des Fließens verbunden werden, stellt dies keine wesentliche Forderung dar. In Abhängigkeit von den Fängereinheiten und den Analyten zur Verwendung kann es Fälle geben, bei denen die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Bindung für die Flußrate der Analyten nicht ausreicht und deshalb die Analyten von der Fängereinheit auf der stromaufwärtigen Seite bis zu der Fängereinheit auf der stromabwärtigen Seite des Fließens nicht sequentiell gefangen werden können. Falls hierbei die Anzahl oder die Länge von Detektionseinheiten, die so wie sie sind installiert sind und in viele Teile in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal geteilt sind, groß genug ist, ist eine präzise Bestimmung möglich, solange alle Analyten mit den Fängereinheiten verbunden werden, obwohl es sein kann, daß sie mit den Fängereinheiten von der stromaufwärtigen Seite zu der stromabwärtigen Seite nicht sequentiell verbunden werden.

Zusätzlich ist es auch effektiv, wenn die Dicke des Fließkanals an der Detektionseinheit im Vergleich zu der effektiven Höhe von Analyten dünn genug ist und/oder die Flußrate sequentiell kleiner gemacht wird, indem die Dicke des Fließkanals mit abströmendem Fluß dicker gemacht wird, wodurch die Zeit sichergestellt wird, damit sich Analyten, deren Anzahl kleiner wird, mit Fängereinheiten verbinden können, während die Anzahl von Detektionseinheiten, die in der Richtung des Fließens des Fließkanals seriell angeordnet sind, nicht erhöht wird oder die Anzahl erhöht wird.

Es wurde festgestellt, daß es vorzuziehen ist, wenn die Dicke des Fließkanals nicht mehr als 100mal so groß wie die effektive Höhe eines gefangenen Analyten ist, um den Analyten vollständig zu fangen. Die effektive Höhe eines Analyten ist die Höhe von der Oberfläche der Detektionseinheit bis zu dem höchsten Teil des Analyten. Die Höhe der Fängereinheit ist in der Definition enthalten, wie in 5 gezeigt. 5 ist eine schematische Querschnittsteilansicht einer Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten zum Erläutern der Höhe 51 eines Analyten 19 unter Berücksichtigung der Höhe einer Fängereinheit 14. Die "Dicke des Fließkanals" 52 ist in diesem Fall die Höhe von der Oberfläche der Detektionseinheit 53 bis zu dem Deckenteil des Fließkanals 54. Falls die Höhe der Oberfläche der Detektionseinheit höher als die Bodenfläche 55 des Fließkanals angeordnet ist, ist es vorzuziehen, daß die Detektionseinheit auf der vollen Breite des Fließkanals installiert ist oder die Sektionen des Fließkanals, die an die Seiten der Detektionseinheit (in der Richtung längs der Breite des Fließkanals) angrenzen und an denen die Detektionseinheit nicht angeordnet ist, eine erhöhte Bodenfläche haben, die so hoch wie die Oberfläche der Detektionseinheit oder höher ist.

Der Ausdruck "effektiv" bezieht sich auf den Durchschnittswert der Höhe, wenn ein Analyt durch eine Detektionseinheit (Bezugszeichen 51 in 5) tatsächlich gefangen wird. Wenn der Analyt und die Fängereinheit Moleküle sind, werden die Formen berücksichtigt. Wenn der Analyt und die Fängereinheit Moleküle sind, ist es im allgemeinen schwierig, die effektive Höhe zu erfahren. In solch einem Fall kann die effektive Höhe eines Analyten bestimmt werden, indem als effektive Länge des Moleküls ein Wert verwendet wird, der 50-80 % der größten Länge beträgt, die erhalten wird, wenn das Molekül gedehnt wird.

Ferner ist es vorzuziehen, wenn die Dicke des Fließkanals an der Detektionseinheit mit abströmendem Fluß dicker gemacht wird. Es kann den Fall geben, bei dem in Abhängigkeit von Fängereinheiten und Analyten zur Verwendung die Leichtigkeit und Geschwindigkeit des Bindens für die Flußrate nicht ausreichen und deshalb Analyten mit den Fängereinheiten nicht sequentiell von der stromaufwärtigen Seite zu der stromabwärtigen Seite des Flusses in einem dicken Fließkanal verbunden werden können, mit dem Resultat, daß die quantitative Bestimmung behindert wird. Der oben beschriebene Fließkanal ist in solch einem Fall besonders nützlich.

Ferner ist es in dem Fall, wenn Analyten Moleküle sind, die ganz oder teilweise geladen sind, wie etwa DNA- und Proteinmoleküle, vorzuziehen, wenn die Detektionseinheit eine Elektrode ist und ein elektrisches Potential auf die Elektrode angewendet werden kann, um die geladenen Analyten durch die Elektrode elektrisch anzuziehen. Auf diese Weise kann die Verbindung der Analyten mit der Fängereinheit durch Anwenden des elektrischen Potentials auf die Elektrode beschleunigt werden, um die Detektionszeit zu verkürzen und die Detektionsempfindlichkeit zu verbessern.

Ferner ist es vorzuziehen, wenn das elektrische Potential, um die geladenen Analyten durch die Elektrode elektrisch anzuziehen, entsprechend der Stelle der Elektrode in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal verändert werden kann. Auf diese Weise ist es zum Beispiel möglich, den Anziehungseffekt durch das elektrische Potential mit stromabwärts strömendem Fluß zu erhöhen und zu verhindern, daß die Empfindlichkeit reduziert wird, indem das elektrische Potential gemäß der Stelle der Elektrode verändert wird, da die Konzentration der Analyten in dem Medium mit stromabwärts strömendem Fluß kleiner wird, wodurch die Analytfangeffektivität verringert wird.

Auf diese Weise ist es möglich, einen Analyten oder Analyten mit hoher Empfindlichkeit und hohem dynamischen Bereich quantitativ zu bestimmen. Unter dem Gesichtspunkt eines Verfahrens zum quantitativen Bestimmen eines Analyten kann es als wichtig erachtet werden, die Anzahl von Analyten, die durch die Analytdetektionseinheit zu fangen sind, in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal zu optimieren. Hierbei bezeichnet der Ausdruck "optimieren" Selektionsbedingungen für die quantitative Bestimmung, so daß die Empfindlichkeit und der dynamische Bereich bei der quantitativen Bestimmung von Analyten in einem angemessenen Bereich sind, der den tatsächlichen Zwecken der quantitativen Bestimmung entspricht. Genauer gesagt, es ist vorzuziehen, die Optimierung vorzunehmen, indem wenigstens ein Faktor verändert wird, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Zufuhrrate von Analyten, der Länge der Detektionseinheit in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal, der Anzahl von Detektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals und der Dicke des Fließkanals.

Dabei ist es hinsichtlich der Zufuhrrate von Analyten, falls die Fluktuation der Flußrate klein ist und sie leicht verändert wird, einfach, die quantitative Bestimmung durch Verändern der Flußrate zu optimieren. Als Mittel zum Transport können für diesen Zweck Mikropumpen genutzt werden. Ein beliebiges Mittel kann genutzt werden, wie etwa der elektrophoretische Fluß und der elektroosmotische Fluß, indem ein externes elektrisches Feld angewendet wird, solange es das Medium, das Analyten enthält, zu der Detektionseinheit transportieren kann.

Durch die Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, einen Analyten in einem breiten Bereich ohne Verringerung der Detektionsempfindlichkeit quantitativ zu bestimmen, wobei die Kapazität der quantitativen Bestimmung eines Analyten weitgehend verbessert wird. Daher kann sie effektiv als Teil eines MEMS oder μTAS verwendet werden.

Eine beliebige bekannte Technologie kann zum Herstellen einer Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Es folgen einige Beispiele dafür.

Erstens werden Nuten für den Fließkanal auf einem Substrat gebildet. Ein beliebiges Material wie etwa Glas, Plastik, Halbleitermaterialien, etc. kann für das Substrat verwendet werden, solange es nicht im Widerspruch zu dem Kern der vorliegenden Erfindung steht. Die Nuten für den Fließkanal können durch eine beliebige Technologie gebildet werden, einschließlich mechanischer Bearbeitungs- und Ätztechnologien, die zu den Halbleiterverarbeitungstechnologien gehören. Es ist vorzuziehen, die Oberfläche des Substrats zu bedecken, um zu verhindern, daß die Lösung, die Analyten enthält, verdampft oder zerstreut wird. Es versteht sich von selbst, daß die Abdeckung mit einem Material erfolgen sollte, das hinsichtlich der Wellenlänge zur Verwendung bei der Beobachtung transparent ist, wenn es erforderlich ist, den Fließkanal optisch zu beobachten.

Eine Detektionseinheit zum Detektieren eines Analyten, an der eine Fängereinheit angebracht ist, wird auf einem Teil des Fließkanals installiert. Ein beliebiges Material kann für die Detektionseinheit gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange es nicht im Widerspruch zu dem Kern der vorliegenden Erfindung steht, wobei der Form keine Grenzen gesetzt sind.

Als Analyt gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Material verwendet werden, solange es durch die Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung quantitativ bestimmt werden kann. Als Analyt dient vorzugsweise ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNAs, RNAs, Antikörpern, natürlichen oder künstlichen einsträngigen Nukleotiden, natürlichen oder künstlichen doppelsträngigen Nukleotiden, Aptameren, Produkten, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, organischen Verbindungen mit einer Affinität für Proteine, Biomakromolekülen mit einer Affinität für Proteine, komplexen Materialien daraus, ionischen Polymeren, die positiv oder negativ geladen sind, und beliebigen Kombinationen daraus. Beispiele für die oben beschriebenen komplexen Materialien gemäß der vorliegenden Erfindung können kombinierte Materialien aus DNAs und negativ geladenen Polymeren und kombinierte Materialien aus den oben beschriebenen Materialien und anderen Materialien enthalten.

Ein beliebiger Verbindungstyp kann für das Fangen eines Analyten genutzt werden, solange er nicht im Widerspruch zu dem Kern der vorliegenden Erfindung steht, einschließlich der biologischen Verbindung, der elektrostatischen Verbindung, der physischen Adsorption, der chemischen Adsorption, etc., sowie der chemischen Bindung wie etwa einer kovalenten Bindung und koordinativen Bindung.

Zum Beispiel können Glas, Keramik, Plastik, Metalle, etc. für eine Detektionseinheit verwendet werden, um eine Fängereinheit zum Fangen eines Analyten auf der Oberfläche zu installieren. Die Detektionseinheit kann einschichtig oder mehrschichtig sein. Sie kann eine andere Struktur als die einer Schicht oder von Schichten haben.

Ein beliebiges Material kann für die Detektionseinheit in Abhängigkeit von dem Zweck willkürlich ausgewählt werden, aber Au ist besonders zu bevorzugen. Wenn es für eine Elektrode verwendet wird, ist es leicht, elektrische Signale zu entnehmen und das elektrische Potential vorzusehen, um das Fangen von Analyten zu erleichtern. Oft ist es auch leicht, Fängereinheiten auf einer Detektionseinheit zu befestigen.

Wenn die Detektionseinheit einen Analyten ohne spezielles Bilden einer Fängereinheit fangen kann, ist es nicht nötig, eine Fängereinheit auf der Oberfläche der Detektionseinheit zu installieren. Wenn der Fall betrachtet wird, bei dem ein Analyt ein Nukleotid umfaßt und mit einer Au-Schicht zum Beispiel direkt über seine Thiolgruppe verbunden werden kann, ergibt sich eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten, bei der ein Analyt 19, der eine fluoreszierende Signalisierungseinheit 61 hat, mit einer Au-Elektrode (Detektionseinheit 13) verbunden wird, die auf einem Saphirsubstrat 62 installiert ist, wie in 6 gezeigt, indem das Nukleotid mit der polierten Au-Elektrode bei Raumtemperatur 24 Stunden lang reagiert. "S", das in dem unteren Abschnitt der einsträngigen Oligonukleotidstruktur angeordnet ist, bedeutet, daß der Analyt 19 über eine Thiolgruppe direkt mit der Au-Elektrode 13 verbunden wird.

Ein beliebiges Material kann als Fängereinheit verwendet werden, solange es nicht im Widerspruch zu dem Kern der vorliegenden Erfindung steht. Es ist vorzuziehen, wenn das Material eine Eigenschaft zum spezifischen Verbinden mit dem oben beschriebenen Analyten hat. Falls der Analyt zum Beispiel eine DNA ist, ist es vorzuziehen, wenn die Fängereinheit eine Funktion zum spezifischen Verbinden mit der DNA hat, und falls der Analyt ein Protein ist, ist es vorzuziehen, wenn die Fängereinheit eine Funktion zum spezifischen Verbinden mit dem Protein hat.

Vorzugsweise umfaßt solch eine Fängereinheit wenigstens ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNAs, RNAs, Antikörpern, natürlichen oder künstlichen einsträngigen Nukleotiden, natürlichen oder künstlichen doppelsträngigen Nukleotiden, Aptameren, Produkten, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, organischen Verbindungen mit einer Affinität für Proteine, Biomakromolekülen mit einer Affinität für Proteine, komplexen Materialien daraus, ionischen Polymeren, die positiv oder negativ geladen sind, und beliebigen Kombinationen daraus. Beispiele für die oben beschriebenen komplexen Materialien bei der vorliegenden Erfindung können kombinierte Materialien aus DNAs und negativ geladenen Polymeren und kombinierte Materialien aus den oben beschriebenen Materialien und anderen Materialien enthalten.

Hierbei ist das "Nukleotid" gemäß der vorliegenden Erfindung irgendeines, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mononukleotiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden oder einem Gemisch daraus. Solche Materialien sind oft negativ geladen. Einsträngige Nukleotide und doppelsträngige Nukleotide können verwendet werden. Sie können spezifisch mit Analyten durch Hybridisierung verbunden werden. Proteine, DNAs und Nukleotide können als Gemisch verwendet werden. Die Biomakromoleküle enthalten jene, die aus lebenden Organismen gewonnen werden, jene, die aus Materialien hergestellt sind, die aus lebenden Organismen gewonnen werden, und synthetisierte Moleküle.

Hierbei sind die oben beschriebenen "Produkte" jene, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, und sie können beliebige umfassen, solange sie dem Kern der vorliegenden Erfindung entsprechen, einschließlich Fab-Fragmente oder (Fab)₂-Fragmente von Antikörpern, Fragmente, die aus Fab-Fragmenten oder (Fab)₂-Fragmenten von Antikörpern gewonnen werden, Derivate derselben, etc.

Als Antikörper können zum Beispiel monoklonale Immunglobulin-IgG-Antikörper verwendet werden. Fab-Fragmente oder (Fab)₂-Fragmente von IgG-Antikörpern können zum Beispiel als Fragmente verwendet werden, die aus IgG-Antikörpern gewonnen werden. Ferner können Fragmente verwendet werden, die aus jenen Fab-Fragmenten oder (Fab)₂-Fragmenten gewonnen werden. Beispiele für anwendbare organische Verbindungen mit einer Affinität für Proteine sind Enzym-Substrat-Analoge wie etwa Nicotinamidadenindinukleotid (NAD), Enzymaktivitätsinhibitoren, Neurotransmissionsinhibitoren (Antagonist), etc. Beispiele für Biomakromoleküle mit einer Affinität für Proteine sind Proteine, die als Substrat oder Katalysator für Proteine wirken können, Element-Proteine, die molekulare Verbundstoffe bilden, etc.

Es genügt, wenn die Gesamtzahl von Fängereinheiten, die aufzubringen sind, ausreichend größer als die Anzahl von erwarteten Analyten ist. Unter dem Gesichtspunkt der Detektionsempfindlichkeit ist sie vorzugsweise jedoch zwei- bis zehnmal so groß wie jene von Analyten, die erwartet wird. Wenn viele Arten von Analyten als Objekte zur quantitativen Bestimmung vorliegen, sollte die Anzahl der Fängereinheiten unter Bezugnahme auf die Anzahl von jeder Analytenart bestimmt werden.

Eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung, die entsprechend der Art dieses Beispiels hergestellt wird, ist zum Bestimmen einer winzigen Menge von sehr kleinen Analyten geeignet und wird zum Beispiel für das oben beschriebene MEMS und μTAS entsprechend genutzt. Hinsichtlich der Anwendung ist sie zum Beispiel für Biochips, DNA-Chips, etc. geeignet.

Ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt: Verwenden einer Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten mit den oben beschriebenen Funktionen oder, hinsichtlich einer verschiedenen Vorrichtung, Verwenden eines Fließkanals, einer Detektionseinheit zum Fangen und Detektieren des Analyten und einer Einheit zur quantitativen Messung zum quantitativen Bestimmen des Analyten; und Teilen eines Signals, das erzeugt wird, wenn die Detektionseinheit den Analyten detektiert hat, in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal in der Einheit zur quantitativen Messung zur Verarbeitung. Durch dieses Verfahren kann die quantitative Bestimmung eines Analyten in einem breiten Bereich ohne Verringerung der Detektionsempfindlichkeit ausgeführt werden und kann die Leistung beim quantitativen Bestimmen eines Analyten genauso deutlich verbessert werden, wie es bei der Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung erläutert worden ist.

In diesem Fall können solche Varianten wie etwa das Verwenden einer Vielzahl von Vorrichtungen seriell oder parallel und das Installieren von Zubehör zum Einsatz kommen. In solch einem Fall würde sich eine zunehmende Anzahl von Defekten wie etwa eine komplizierte Einrichtung und ein höherer Zeitaufwand für die Messung im Vergleich zu dem Fall ergeben, wenn eine Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Dennoch kann es möglich sein, Effekte zu erreichen, die jenen ähnlich sind, die erreicht werden, wenn die Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

Hinsichtlich dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorzuziehen, wenn die Detektionseinheit eine Fängereinheit zum Fangen des Analyten hat; wenn eine Vielzahl von Detektionseinheiten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal angeordnet ist, wenn die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines optischen Signals oder elektrischen Signals quantitativ bestimmt; und wenn eine Vielzahl von Fängereinheiten zum spezifischen Fangen von verschiedenen Analyten auf der Detektionseinheit angeordnet ist.

Bei der quantitativen Bestimmung ist es möglich, die Leistung bei der quantitativen Bestimmung zu verbessern, indem die Anzahl von Analyten, die durch die Detektionseinheit gefangen werden, in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal optimiert wird, wie es bereits hinsichtlich der Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung erläutert worden ist. Speziell ist es möglich, die Optimierung dadurch vorzunehmen, daß wenigstens ein Faktor verändert wird, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Zufuhrrate von Analyten, der Länge einer Detektionseinheit in der Richtung des Fließens, der Anzahl von Detektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals und der Dicke des Fließkanals.

Weiterhin ist es vorzuziehen, wenn die Detektionseinheit eine Elektrode ist und ein elektrisches Potential zum elektrischen Anziehen eines geladenen Analyten durch die Elektrode auf die Elektrode angewendet wird, um den Analyten durch die Fängereinheit schnell zu fangen. In solch einem Fall kann das elektrische Potential in Anbetracht der Zeit, die für die quantitative Bestimmung benötigt wird, und der Präzision der quantitativen Bestimmung angemessen bestimmt werden.

Es ist nützlich, das elektrische Potential zum elektrischen Anziehen eines geladenen Analyten durch die Elektrode gemäß der Stelle der Elektrode in der Richtung des Fließens zu verändern. Da die Konzentration des Analyten in dem Medium mit stromabwärts strömendem Fluß verringert wird, wird die Fangeffektivität des Analyten verringert. Daher ist es nützlich, das elektrische Potential gemäß der Stelle der Elektrode zu verändern und den Anziehungseffekt des elektrischen Potentials mit stromabwärts strömendem Fluß zu erhöhen, so daß verhindert wird, daß sich die Empfindlichkeit verringert.

Es sei erwähnt, daß das Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung besonders nützlich ist, wenn der Analyt eine DNA ist und die Fängereinheit eine Funktion zum spezifischen Verbinden mit einer DNA hat und wenn der Analyt ein Protein ist und die Fängereinheit eine Funktion zum spezifischen Verbinden mit einem Protein hat.

Als nächstes folgt die Erläuterung zu dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung. Wenn erforderliche Moleküle auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, ist es ein übliches Verfahren, den festen Körper in eine Lösung zu tauchen, die die Moleküle enthält. Dabei tritt eine elektrostatische Repulsion zwischen Molekülen auf, wenn Moleküle, die in einer Lösung geladen werden (elektrische Ladung erlangen), oder jene, die sich mit Materialien verbinden, die eine elektrische Ladung haben, als die aufgebrachten Moleküle verwendet werden. Auf Grund dessen wird durch die elektrostatische Repulsion verhindert, daß andere Moleküle den Molekülen nahekommen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden.

Hierbei sei erwähnt, daß Moleküle, die geladen werden, Moleküle, die mit Materialien verbunden werden, die eine elektrische Ladung haben, oder dergleichen unter dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung im allgemeinen einfach als "Moleküle, die geladen sind" oder als "geladene Moleküle" bezeichnet werden. Die Einzelheiten werden später erläutert.

Wenn eine wäßrige Lösung, die einen Elektrolyten enthält, als Lösungsmittel verwendet wird, werden die Moleküle mit Ionen (Gegenionen) umgeben, die eine elektrische Ladung haben, die zu jener der Moleküle entgegengesetzt ist, wobei dazwischen ein gewisser Abstand existiert, der durch die Auftrittswahrscheinlichkeit bestimmt wird, und daher werden die elektrischen Ladungen durch die Ionen neutralisiert. Dieser Effekt zum Kompensieren der Ladungen zwischen Molekülen wird als Screening-Effekt bezeichnet, und die Schicht dieser Gegenionen wird als diffundierte elektrische Doppelschicht bezeichnet.

Die Dicke der diffundierten elektrischen Doppelschicht hängt von der Salzkonzentration des Elektrolyten (Ionenkonzentration des Elektrolyten) ab, und je höher die Salzkonzentration ist, desto dünner ist die Schicht. Die Dicke der Schicht ist weithin als Debye-Länge (L_Debye) bekannt. Im Falle eines Elektrolyten des 1:1-Typs (eines Elektrolyten, der aus einem Paar aus einem einwertigen Kation und einem einwertigen Anion gebildet ist) kann sie durch die folgende Gleichung ausgedrückt werden. LDebye = (2,000NAcz2e2/(εrε0kT))-1/2 (m) (1).

Hierbei ist N_A die Avogadrozahl, ist c die Ionenkonzentration des Elektrolyten (mol/L), ist z die Valenz des Ions, ist e eine Einheitsladung, ist ε_r die relative Dielektrizitätskonstante eines Mediums, ist ε₀ die Dielektrizitätskonstante vom Vakuum, ist k die Boltzmann-Konstante und ist T die absolute Temperatur.

Gemäß dieser Gleichung ist es möglich, die Veränderung von L_Debye leicht einzuschätzen, wenn die Ionenkonzentration verändert wird. 7 zeigt die Veränderung von L_Debye, wenn die Ionenkonzentration eines Elektrolyten des 1:1-Typs, wie etwa von NaCl, verändert wird. Es versteht sich, daß L_Debye in einer Region klein ist, wo die Ionenkonzentration hoch ist, und daher ist der Screening-Effekt groß. Das heißt, daraus kann gefolgert werden, daß die elektrostatische Repulsion zwischen geladenen Molekülen eingeschränkt werden kann, und daher kann in solch einer Region der Ionenkonzentration ein Film aus geladenen Molekülen mit einer hohen Aufbringungsdichte hergestellt werden. Ferner ist eine präzisere Steuerung der Aufbringungsdichte möglich, indem der Screening-Effekt und die Größe von geladenen Molekülen in der Lösung berücksichtigt werden.

Auf diese Weise ist es möglich, L_Debye eindeutig zu berechnen, wenn bestimmt wird, welches Elektrolytion verwendet wird. Falls ferner die Größe eines geladenen Moleküls in einer Lösung bekannt ist, ist es möglich, durch die Berechnung die Aufbringungsdichte von geladenen Molekülen einzuschätzen, die sich gemäß der Ionenkonzentration verändert, wobei die Größe und L_Debye berücksichtigt werden.

Ein Beispiel, bei dem die geladenen kugelförmigen Moleküle, die negativ geladen sind und einen Radius von 1 nm haben, auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, wird im folgenden erläutert.

Wenn der Fall vorliegt, daß keine elektrostatische Repulsion zwischen geladenen Molekülen auftritt und ein monomolekularer Film auf einer flachen Oberfläche eines festen Körpers adsorbiert wird, kann daran gedacht werden, daß ein Film aus hexagonal angeordneten Molekülen als dichteste Packungsstruktur gebildet wird, wie in 8 gezeigt. In diesem Fall kann die Aufbringungsdichte (dickste Oberflächendichte) von Molekülen unter Verwendung des Radius r des Moleküls dargestellt werden durch: Aufbringungsdichte = 1/(2r2√3)(cm-2) (2).

Wenn r bei dem Molekül 1 nm beträgt, wird eine konstante Aufbringungsdichte von 2,9 × 10¹³ cm^-2 erhalten.

Wenn die statische Repulsion zwischen geladenen Molekülen und L_Debye berücksichtigt werden, hat die Schicht aus adsorbierten Molekülen Moleküle mit einem Abstand von L_Debye × 2 dazwischen, wie in 9 gezeigt, und die Aufbrin gungsdichte kann durch die folgende Gleichung dargestellt werden. Aufbringungsdichte = 1/(2(r + LDebye)2√3)(cm-2) (3).

Daher ist es in dem Fall, wenn ein Elektrolyt des 1:1-Typs wie etwa NaCl verwendet wird und das Molekül einen Radius von 1 nm hat, möglich, die Aufbringungsdichte durch Verändern der Ionenkonzentration des Elektrolyten zu steuern, wie in 10 gezeigt.

Obiges gilt für die Fälle, wenn die Größe eines geladenen Moleküls in einer Lösung bekannt ist. Aber auch wenn die Größe unbekannt ist, ist es möglich, die Größe des unbekannten Moleküls aus den Versuchsdaten einzuschätzen, die durch Messen der Aufbringungsdichte von geladenen Molekülen bei einer spezifischen Ionenkonzentration eines Elektrolyten durch Experimente erhalten werden, und daher die Abhängigkeit der Aufbringungsdichte von der Ionenkonzentration einzuschätzen, wobei die Größe und der Screening-Effekt berücksichtigt werden.

Mit anderen Worten, bei dem Entscheidungsverfahren über die effektive Größe von geladenen Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung wird die effektive Größe eines geladenen Moleküls in einer Lösung, die einen Elektrolyten und die geladenen Moleküle enthält, durch den Screening-Effekt durch den Elektrolyten eingeschätzt.

Genauer gesagt, die effektive Größe eines geladenen Moleküls kann zum Beispiel als Radius eines Moleküls bestimmt werden, wenn die Debye-Länge aus der Ionenkonzentration des Elektrolyten unter Verwendung der Gleichung (1) bestimmt wird und die Debye-Länge und die gemessenen Aufbringungsdichtedaten von geladenen Molekülen auf die Gleichung (3) angewendet werden. Die Aufbringungsdichte kann in diesem Fall durch ein quantitatives Bestimmungsverfahren unter Verwendung eines XPS erhalten werden, wobei ein spezifisches Element der aufgebrachten Moleküle beobachtet wird, durch ein quantitatives Bestimmungsverfahren, bei dem zuvor radioaktive Markierungen an den aufgebrachten Molekülen angebracht werden, durch ein quantitatives Bestimmungsverfahren zum Messen des Redoxstroms eines Redoxmarkers, um die Ladung der geladenen, aufgebrachten Moleküle zu neutralisieren, etc.

Ein beliebiges Material kann als Elektrolyt zur Verwendung in diesem Fall verwendet werden, solange es nicht im Widerspruch zu dem Kern der vorliegenden Erfindung steht. Unter dem Gesichtspunkt der Vereinfachung der Wirkung auf die geladenen Moleküle ist dies vorzugsweise ein Elektrolyt des 1:1-Typs wie etwa NaCl oder KCl. Ein Gemisch daraus kann verwendet werden.

Das "geladene Molekül" gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält Moleküle, die einfach eine Ladung haben, wie vorher erläutert wurde, jene, die eine Ladung als Cluster von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben oder keine elektrische Ladung haben, und einem Material, das eine elektrische Ladung hat, als Resultat der Verbindung der Moleküle mit dem Material erlangt haben, und jene, die eine Ladung als Cluster von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, und einem Material, das keine elektrische Ladung hat, als Resultat der Verbindung der Moleküle mit dem Material erlangt haben. In den zwei letzteren Fällen ist ein Cluster das "geladene Molekül" gemäß der vorliegenden Erfindung. In diesem Fall kann die "Verbindung" eine chemische Verbindung oder physische Verbindung sein.

Die erstere ist besser, da die Bindungsstabilität höher ist und zu bevorzugen ist.

Das oben beschriebene Material wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNAs, RNAs, Antikörpern, natürlichen oder künstlichen einsträngigen Nukleotiden, natürlichen oder künstlichen doppelsträngigen Nukleotiden, Aptameren, Produkten, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, organischen Verbindungen mit einer Affinität für Proteine, Biomakromolekülen mit einer Affinität für Proteine, komplexen Materialien daraus, ionischen Polymeren, die positiv oder negativ geladen sind, und beliebigen Kombinationen daraus. Moleküle, die sich mit solch einem Material verbinden können, haben vorzugsweise die Eigenschaft, mit dem Material spezifisch verbunden zu werden.

Deshalb umfaßt das "geladene Molekül" gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNAs, RNAs, Antikörpern, natürlichen oder künstlichen einsträngigen Nukleotiden, natürlichen oder künstlichen doppelsträngigen Nukleotiden, Aptameren, Produkten, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, organischen Verbindungen mit einer Affinität für Proteine, Biomakromolekülen mit einer Affinität für Proteine, komplexen Materialien daraus, ionischen Polymeren, die positiv oder negativ geladen sind, und beliebigen Kombinationen daraus. Das "geladene Molekül" gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt vorzugsweise eine Thiolgruppe, um das Aufbringen auf ein Substrat zu erleichtern.

Hierbei ist das "Nukleotid" gemäß der vorliegenden Erfindung irdendeines, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mononukleotiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden oder einem Gemisch daraus. Solche Materialien sind oft negativ geladen. Einsträngige Nukleotide und doppelsträngige Nukleotide können verwendet werden. Sie können hybridisiert werden, um Teil von geladenen Molekülen zu sein. Proteine, DNAs und Nukleotide können als Gemisch verwendet werden. Die Biomakromoleküle enthalten jene, die aus lebenden Organismen gewonnen werden, jene, die aus Materialien hergestellt sind, die aus lebenden Organismen gewonnen werden, und synthetisierte Moleküle.

Hierbei haben die oben beschriebenen "Produkte", der "Antikörper", organische Verbindungen, die eine Affinität für Proteine haben, und Biomakromoleküle mit einer Affinität für Proteine jeweils dieselbe Bedeutung, und sie können dieselben Beispiele haben, wie zuvor beschrieben.

Es sei erwähnt, daß das "geladene Molekül" gemäß der vorliegenden Erfindung eine Rolle erlangen kann, um die Oberfläche eines Substrats, durch das Aufbringen auf das Substrat, entweder hydrophob oder hydrophil zu machen, und eine Rolle, um durch die Adsorption von speziellen Molekülen, wie beispielsweise DNAs und Proteinen, auf der Oberfläche, Funktionen vorzusehen, die die Originaloberfläche eines festen Körpers nicht gehabt hat. Ein spezifisches Beispiel ist die Bildung eines Monolagen-Films mit einer Funktionalität, indem die Oberfläche durch Bedecken derselben mit -CH₃ hydrophob gemacht wird, indem die Oberfläche durch Bedecken derselben mit NH³⁺ oder COO^- hydrophil gemacht wird, um entweder eine positiv geladene Oberfläche oder eine negativ geladene Oberfläche zu bilden, indem die Oberfläche dazu gebracht wird, DNAs oder Proteine zu adsorbieren, oder indem eine ähnliche Modifikation vorgenommen wird.

Bei dem Verfahren zum Aufbringen von geladenen Molekülen auf ein Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Elektrolyt in der Lösung vorgesehen, die die Moleküle enthält, und der Screening-Effekt durch den Elektrolyten wird eingestellt, um geladene Moleküle auf das Substrat aufzubringen. Die effektive Größe eines Moleküls in der Lösung wird auch berücksichtigt.

Da die Aufbringungsdichte, die Debye-Länge und effektive Größe eines Moleküls durch die Gleichung (3) miteinander verbunden sind, ist es zum Beispiel möglich, eine gewünschte Debye-Länge aus der effektiven Größe eines Moleküls, das aufzubringen ist, und einer gewünschten Aufbringungsdichte zu berechnen und die Art eines Elektrolyten und dessen Ionenkonzentration zu bestimmen, um der Debye-Länge zu entsprechen. Daher können Moleküle auf ein Substrat so aufgebracht werden, daß die Oberfläche des Substrats die geforderte Aufbringungsdichte hat.

Falls hierbei die effektive Größe eines Moleküls bekannt ist, kann die Größe verwendet werden. Wenn die effektive Größe eines Moleküls unbekannt ist, kann die effektive Größe eines geladenen Moleküls in einer Lösung, die einen Elektrolyten und die geladenen Moleküle enthält, aus dem Screening-Effekt durch einen Elektrolyten eingeschätzt werden, wie oben beschrieben. Als Elektrolyt wird in diesem Fall vorzugsweise ein Elektrolyt des 1:1-Typs verwendet.

Wenn dieses Verfahren eingesetzt wird, kann eine Vorrichtung zum Aufbringen von geladenen Molekülen auf ein Substrat erhalten werden, bei der die Dichte von Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, gesteuert werden kann. Eine beliebige Vorrichtung kann für die Vorrichtung verwendet werden, solange sie dem Ziel der vorliegenden Erfindung entspricht. Diese Vorrichtung kann zum Beispiel als Teil oder Zubehör eines MEMS installiert werden, das ein Präzisionssystem ist, in dem eine Vielzahl von Funktionsteilen, wie etwa mechanische, optische und hydrodynamische Teile, integriert und miniaturisiert sind, oder eines μ-TAS, das ein chemisches Analysesystem mit Mikropumpen, Mikroventilen, Sensoren oder dergleichen ist, die miniaturisiert, akkumuliert und integriert sind, wobei beide Systeme unter Verwendung von Technologien zum Herstellen von sehr kleinen Vorrichtungen auf der Basis von Halbleiterverarbeitungstechnologien hergestellt werden. Als MEMS oder μ-TAS werden speziell ein Ionensensor, wie etwa ein pH-Sensor und Gassensor, und eine Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen, wie etwa ein DNA-Chip und Proteinchip, zur Verwendung beim Detektieren von vollständig oder teilweise geladenen Molekülen wie beispielsweise von DNAs und Proteinen genannt. Es sei erwähnt, daß "Detektion" bei der vorliegenden Erfindung das Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von geladenen Molekülen oder von Molekülen, die mit einem Material spezifisch verbunden sind, das mit den geladenen Molekülen verbunden wird, und das Bestimmen der Art, Größe und/oder Menge von geladenen Molekülen oder dem Material, das mit den geladenen Molekülen verbunden ist, enthält.

Unter Verwendung dieser Vorrichtung ist es möglich, die Bewegung von geladenen Molekülen in einem Zustand zu beobachten, wenn kein interaktiver Einfluß zwischen den geladenen Molekülen vorhanden ist, oder den interaktiven Einfluß zwischen geladenen Molekülen zu bewerten, indem ein gewünschter Wert der Aufbringungsdichte von geladenen Molekülen auf einem Substrat selektiert wird.

Als Moleküldetektionsvorrichtung zur Verwendung beim Detektieren von geladenen Molekülen, um die Bewegung der geladenen Moleküle in einem Zustand zu beobachten, wenn kein interaktiver Einfluß zwischen den geladenen Molekülen vorhanden ist, ist es vorzuziehen, das oben beschriebene Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat zu verwenden, und als Moleküldetektionseinheit ein Substrat zu verwenden, wodurch die Aufbringungsdichte so gesteuert wird, daß der Abstand zwischen benachbarten Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, nicht kleiner als das Doppelte der effektiven Länge eines Moleküls ist, wodurch verhindert wird, daß Moleküle physisch einander kontaktieren.

Zusätzlich ist es vorzuziehen, als Moleküldetektionseinheit zur Verwendung beim Detektieren von geladenen Molekülen, um den interaktiven Einfluß zwischen geladenen Molekülen zu bewerten, das oben beschriebene Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat zu verwenden, und als Moleküldetektionseinheit ein Substrat zu verwenden, wodurch die Aufbringungsdichte so gesteuert wird, daß der Abstand zwischen benachbarten Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, kleiner als das Doppelte der effektiven Länge eines Moleküls ist, wodurch bewirkt wird, daß die Moleküle physisch einander kontaktieren.

Es sei erwähnt, daß der obige Abstand zwischen benachbarten Molekülen aus der Aufbringungsdichte bestimmt werden kann.

In solch einer Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen kann ein beliebiges bekanntes Verfahren als Verfahren zum Detektieren von Molekülen zum Einsatz kommen. Beispiele dafür sind ein Verfahren, bei dem eine Spannung zwischen einem Substrat und einer Lösung, die einen Elektrolyten enthält, angewendet wird und ein elektrisches Signal als Antwort entnommen wird, ein Verfahren, bei dem ein fluoreszierendes Pigment geladenen Moleküle angelagert wird und die Fluoreszenz detektiert wird, oder ähnliche andere Verfahren.

13 zeigt ein Beispiel für eine Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen, bei der ein fluoreszierendes Pigment geladenen Molekülen angelagert wird, um die Fluoreszenz zu detektieren. Die Vorrichtung 1 zum Detektieren von Molekülen in 13 zeigt Zustände eines geladenen Moleküls 5 mit einem fluoreszierenden Pigment 4 in gedehntem Zustand (auf der linken Seite) und eines geladenen Moleküls 5 mit einem fluoreszierenden Pigment 4 in kontrahiertem Zustand (auf der rechten Seite) auf einer Au-Elektrode 3 (entsprechend einem Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung), die auf einer Basis 2 installiert ist. Das geladene Molekül 5 in dem kontrahierten Zustand kann sich in eines in einem gedehnten Zustand verändern, indem eine gewisse Potentialdifferenz zwischen der Au-Elektrode 3 und einer Gegenelektrode 8 mit einer Vorrichtung zum Anwenden eines externen elektrischen Feldes 9 angewendet wird. Dadurch ändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Pigment 4 und der Au-Elektrode 3. Falls in diesem Moment Licht 11 von einer Lichteinstrahlungsvorrichtung 10 eingestrahlt wird, wird die Fluoreszenz 12 von dem geladenen Molekül 5 in dem gedehnten Zustand erhalten (auf der linken Seite).

Unter Verwendung der Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Aufbringungsdichte von Molekülen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, zu steuern, und daher kann die Struktur und/oder das Verhalten von Molekülen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, in einer Lösung geklärt werden und kann eine Vorrichtung unter Verwendung von Molekülen, die auf die Oberfläche eines festen Körpers aufgebracht werden, mit hoher Zuverlässigkeit und hoher Empfindlichkeit realisiert werden.

Falls zum Beispiel eine DNA oder ein Antikörper für geladene Moleküle verwendet wird, die auf die Oberfläche eines Substrats aufgebracht werden, und die Dichte quantitativ gesteuert wird, kann die Struktur und/oder das Verhalten des DNA- oder Protein-Targets in einer wäßrigen Lösung geklärt werden. Durch Optimieren der Detektionsbedingungen durch diese Einzelinformationen können auch Vorrichtungen mit hoher Zuverlässigkeit und hoher Empfindlichkeit realisiert werden. Daher wird es leicht, das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines Targets zu bewerten und/oder die Art, Größe und/oder Menge des Targets zu bestimmen.

Zusätzlich ist die Technologie der vorliegenden Erfindung auf dem Gebiet von Biosensoren wie etwa MEMSs oder μTASs sehr effektiv, da es erforderlich ist, einen Zustand, bei dem diese Moleküle ausreichend voneinander getrennt sind (das heißt, einen Zustand, bei dem keine sterische Hinderung vorhanden ist), mit hoher Reproduzierbarkeit vorzusehen, wenn die Beobachtung der elektrischen und/oder physischen Eigenschaften von jedem Molekül auf einer Funktionsoberfläche auf jene Biosensoren angewendet wird.

Wenn ferner die interaktive Aktion zwischen einem Molekül und den umgebenden Molekülen in solchen Fällen wie der Bindung zwischen aufgebrachten Molekülen, dem Austausch von Ladungen zwischen Molekülen, der optischen Energieübertragung, etc. erforderlich ist, müssen diese Moleküle, im Gegensatz zu oben, dicht genug beieinander liegen. Die Technologie der vorliegenden Erfindung ist auch auf solch einem Gebiet sehr effektiv.

Ferner kann die Technologie der vorliegenden Erfindung außerordentlich zu der Klärung von Funktionen von geladenen Molekülen mit unbekanntem Verhalten in einer wäßrigen Lösung beitragen. Daher kann fest mit der Entdeckung von neuen Funktionsmaterialien und Funktionsoberflächen gerechnet werden.

Es sei erwähnt, daß für das Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung ein beliebiges von elektroleitfähigen Materialien wie beispielsweise Metallen, Halbleitermaterialien wie etwa Silizium und Isoliermaterialien wie etwa Glas, Keramik, Plastik und Saphir zweckentsprechend verwendet werden kann. Als elektroleitfähiges Material kann eine elektroleitfähige Substanz selbst verwendet werden, sowie eines mit einer elektroleitfähigen Schicht auf der Oberfläche von Glas, Keramik, Plastik oder Metall. Als elektroleitfähige Substanz kann eine beliebige Substanz verwendet werden, die ein elementares Metall, eine Legierung oder ein Laminat enthält. Edelmetalle, die durch Au verkörpert werden, werden vorzugsweise verwendet, da sie chemisch stabil sind.

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele eingehend erläutert.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel betrifft einen DNA-Chip, bei dem eine einsträngige DNA auf einer Detektionseinheit als Fängereinheit installiert wird, um die Konzentration einer komplemen tären DNA oder eines Analyten in einer wäßrigen Lösung zu detektieren.
Ein Überblick über einen exemplarischen DNA-Chip dieses Beispiels und sein Operationsgrundprinzip folgt unter Verwendung von 4-A bis 4-C. Zuerst wird, wie in 4-A gezeigt, ein dünner Au-Film als Detektionseinheit 13 am Boden eines Teils eines Fließkanal von 1 mm Breite in länglicher Form längs des Fließkanals installiert. Eine einsträngige DNA 42 mit einer SH-Gruppe an einem Ende als Fängereinheit wird auf den dünnen Au-Film 13 mit einer Oberflächendichte von 5 × 10¹² Molekülen/cm² aufgebracht (siehe zum Beispiel Analytical Chemistry, Bd. 70, S. 4670-4677, 1998), um Fängereinheiten zu bilden. Eine zweidimensionale CCD-Lichtempfangseinheit 41 wird über dem Fließkanal mit der auf ihn aufgebrachten einsträngigen DNA installiert, um fluoreszierende Signale von den Fängereinheiten zu beobachten.
Als nächstes wird bewirkt, wie in 4-B gezeigt, daß eine wäßrige Lösung, die eine komplementäre DNA 43 als Analyten mit einer fluoreszierenden Markierung 44 enthält, in den Fließkanal fließt, um mit der einsträngigen DNA 42 hybridisiert zu werden, um Doppelstränge zu bilden, wie in 4-C gezeigt. Hinsichtlich der Einheiten, die Doppelstränge gebildet haben, wird die Fluoreszenz von den fluoreszierenden Markierungen 44, die an den komplementären Strängen angebracht sind, durch die Lichtempfangseinheit 41 detektiert.
Wenn die wäßrige Lösung, die einen Analyten enthält, von der stromaufwärtigen Seite in die Detektionseinheit fließt, beginnt die Bildung der Doppelstränge auf der stromaufwärtigen Seite der Detektionseinheit und schreitet zu der stromabwärtigen Seite voran, bis der Analyt aufgebraucht ist. Da die Anzahl von Fängereinheiten auf der Detektionseinheit durch die oben beschriebene Oberflächendichte bestimmt ist, kann die Anzahl der komplementären DNA oder des Analyten, das heißt, die Konzentration, aus der Länge der Fängereinheiten bestimmt werden, die durch die fluoreszierenden Signale detektiert wird.
Bei diesem Beispiel beträgt die Breite des Fließkanals 1 mm. Wenn die fluoreszierenden Signale auf 5 mm längs der Richtung des Fließens in dem Fließkanal beobachtet werden, beträgt der Bereich, in dem die fluoreszierenden Signale beobachtet werden, 0,05 cm², und daher beträgt die absolute Anzahl der komplementären DNA-Moleküle 5 × 10¹² Moleküle/cm² × 0,05 cm² = 2,5 × 10¹¹ Moleküle. Falls das Volumen der verwendeten Lösung, die die komplementären DNAs enthält, zum Beispiel 100 μL beträgt, kann daher die Originalkonzentration des Analyten oder der komplementären DNA als 2,5 × 10¹¹ Moleküle/(0,1 cm³) = 2,5 × 10¹²/cm³ Moleküle bestimmt werden.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel betrifft das Bestimmen des effektiven Radius eines einsträngigen Oligonukleotids in einer wäßrigen Lösung und ferner das Steuern der Aufbringungsdichte von Oligonukleotid, das auf ein Substrat aufgebracht wird.
Synthetisiert wurde ein einsträngiges 24-mer Oligonukleotid, in das eine Thiolgruppe mit einer C₆H₁₂-Alkylkette (-C₆H₁₂-SH) an dem 3'-Terminal eingebracht wurde, und die Thiolgruppe reagierte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer polierten Au-Elektrode, um das einsträngige Oligonukleotid mit der Elektrode zu verbinden. Die Thiolgruppe kann in eine Zwischensektion eines einzelnen Strangs oder an dem 5'-Terminal eingebracht werden. Die wäßrige Lösung, die für die Reaktion verwendet wurde, enthielt 10 mM eines Tris-Puffers (2-Amino-2-hydroxymethylpropan-1,3-diol) und war auf einen pH von 7,4 eingestellt.
NaCl wurde als Elektrolyt verwendet. Der Screening-Effekt eines negativ geladenen Oligonukleotids wurde durch Verändern der Ionenkonzentration des Elektrolyten (Salzkonzentration) gesteuert. Da die effektive Größe des Oligonukleotids in der wäßrigen Lösung unbekannt war, während die Struktur bekannt war, wurde die Aufbringungsdichte des Oligonukleotids, das auf die Oberfläche der Au-Elektrode aufgebracht wurde, durch Reaktion der Thiolgruppe des einsträngigen Oligonukleotids mit der Au-Elektrode im voraus gemessen, und zwar unter den Salzkonzentrationsbedingungen von 3 mM, 500 mM und 1000 mM.
11 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Aufbringungsdichte von einsträngigen Oligonukleotidmolekülen und der Ionenkonzentration des Elektrolyten und die Beziehung zwischen der Debye-Länge und der Ionenkonzentration des Elektrolyten zeigt. Der O (Hohlkreis) als Kennzeichen in 11 bezeichnet Aufbringungsdichtedaten, die experimentell bestimmt wurden. Als Resultat der Berechnung durch Eintragen der Versuchsresultate auf den berechneten Kurven, die aus den Gleichungen (1) und (3) erhalten wurden, wurde die effektive Größe des 24-mer Oligonukleotids in der wäßrigen Lösung als Radius von 1,9 nm bestimmt.
Um die Elektrodenoberfläche, die gesteuert wird, um die gewünschte Aufbringungsdichte von 3 × 10¹² Molekülen/cm² zu haben, aus dieser berechneten Kurve zu erhalten, ist klar, daß die Salzkonzentration, um 50 mM zu betragen, auf der Basis der durch die Berechnung erhaltenen Kurve gesteuert werden muß. Der
(Vollkreis) als Kennzeichen in der Figur bezeichnet Versuchsdaten, wenn das Oligonukleotid bei der Salzkonzentration von 50 mM angezogen wird. Aus der Berechnung kann die Salzkonzentrationsbedingung zum Erhalten einer gewünschten Aufbringungsdichte leicht bestimmt werden.
Zusätzlich bezeichnet das ∎ (Vollquadrat) als Kennzeichen das Resultat der Aufbringungsversuche, als ein einsträngiges, 12-mer Oligonukleotid mit einer ähnlichen Thiolgruppe verwendet wurde. Als Resultat der Berechnung durch Eintragen der Versuchsresultate auf den berechneten Kurven, die aus den Gleichungen (1) und (3) erhalten wurden, wurde festgestellt, daß das Molekül auch eine effektive Größe hatte, die jener des 24-mer in einer wäßrigen Lösung ähnlich war. Das einsträngige, 12-mer Oligonukleotid und das einsträngige, 24-mer Oligonukleotid sind jeweils ein Molekül in Form eines Strangs. Gemäß der Tatsache, daß sich die Debye-Längen nicht voneinander unterscheiden, wird daher angenommen, daß in dem Fall, wenn ein Molekül des Strangtyps, von dem ein Ende mit einer Thiolgruppe modifiziert ist, auf einem Substrat chemisch adsorbiert wird, die Länge des Moleküls die effektive Größe und Debye-Länge nicht beeinflußt.
Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung ist es auf diese Weise möglich, nicht nur die Aufbringungsdichte von geladenen Molekülen wie etwa Oligonukleotidmolekülen zu steuern, sondern auch die effektive Größe eines unbekannten Moleküls in wäßrigen Lösungen einzuschätzen und Informationen über den Zustand des Aufbringens zu sammeln.
BEISPIEL 3
Als verwandtes Beispiel wurde das oben beschriebene Verfahren eingesetzt und wurden einsträngige, 12-mer Oligonukleotidmoleküle mit einem fluoreszierenden Pigment an einem Ende und einer Thiolgruppe an dem anderen Ende auf eine Au-Elektrode aufgebracht. Das Resultat des Überwachens der Fluoreszenz von dem Pigment bei sich ändernder Dichte der aufgebrachten Moleküle ist in 12 gezeigt. Dieses fluoreszierende Pigment reduziert oder löscht das Licht durch den Auslöscheffekt, wenn es dem Au-Substrat nahekommt oder dieses kontaktiert, und emittiert oder verstärkt das Licht, wenn es sich von dem Substrat entfernt.
Aus 12 geht hervor, daß durch Verändern der Aufbringungsdichte drei Beobachtungsregionen erscheinen: (1) eine Region mit niedriger Dichte, wo benachbarte Oligonukleotidmoleküle miteinander nicht interferieren und die Fluoreszenzintensität nur von der Erhöhung der Aufbringungsdichte abhängt; (2) eine Region mit mittlerer Dichte, wo eine sterische Hinderung zwischen benachbarten Oligonukleotidmolekülen auftritt, wodurch ein Aufsteigen der Oligonukleotidmoleküle erzwungen wird, mit dem Resultat, daß der Auslöscheffekt auf dem Au-Substrat kleiner wird und deshalb die Fluoreszenzintensität durch die Erhöhung der Aufbringungsdichte und die Verringerung des Auslöscheffektes außerordentlich zunimmt; und (3) eine Region mit hoher Dichte, wo fast alle Oligonukleotidmoleküle aufsteigen, sich der Auslöscheffekt nicht verändert und die Fluoreszenzintensität wieder nur von der Erhöhung der Aufbringungsdichte abhängt.
Gemäß diesem Resultat ist es unter Einsatz der vorliegenden Erfindung möglich, eine Vorrichtung vorzusehen, bei der die Aufbringungsdichte in der Region (1) gesteuert wird, wenn die Vorrichtung für Anwendungen verwendet wird, wo eine freie Bewegung von Oligonukleotidmolekülen zulässig ist, ohne durch umgebende Nukleotidmoleküle behindert zu werden. Es ist auch möglich, eine Vorrichtung vorzusehen, bei der die Aufbringungsdichte in der Region (2) oder (3) gesteuert wird, wenn die interaktiven Aktionen mit umgebenden Molekülen in solch einem Fall wie dem erforderlich sind, daß aufgebrachte Moleküle zusammen verbunden werden, elektrische Ladungen ausgetauscht werden oder optische Energien zwischen Molekülen übertragen werden oder dergleichen.

Claims

Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten, die mit einem Fließkanal, einer Analytdetektionseinheit zum Fangen und Detektieren des Analyten und einer Einheit zur quantitativen Messung zum quantitativen Bestimmen des Analyten versehen ist, bei der: ein Signal, das erzeugt wird, wenn die Analytdetektionseinheit den Analyten detektiert hat, in der Einheit zur quantitativen Messung zur Verarbeitung in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal geteilt wird.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der die Analytdetektionseinheit eine Analytfängereinheit zum Fangen des Analyten hat.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der eine Vielzahl von Analytdetektionseinheiten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal angeordnet ist.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der die Länge der Analytdetektionseinheit in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal nicht kleiner als das Doppelte der Breite des Fließkanals ist.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der eine Vielzahl von Analyt detektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals angeordnet ist.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines optischen Signals quantitativ bestimmt.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines elektrischen Signals quantitativ bestimmt.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der die Dicke des Fließkanals an der Analytdetektionseinheit nicht mehr als das 100fache der effektiven Höhe eines gefangenen Analyten beträgt.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der die Dicke des Fließkanals an der Analytdetektionseinheit mit stromabwärts strömendem Fluß größer gebildet ist.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der die Analytdetektionseinheit eine Elektrode ist, so daß ein elektrisches Potential zum elektrischen Anziehen von geladenen Analyten durch die Elektrode auf die Elektrode angewendet werden kann.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 10, bei der das elektrische Potential zum elektrischen Anziehen von geladenen Analyten durch die Elektrode gemäß der Stelle der Elektrode in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal verändert werden kann.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der eine Mikropumpe, ein elektrophoretischer Fluß oder elektroosmotischer Fluß genutzt wird, um eine Lösung, die den Analyten enthält, in dem Fließkanal zum Fließen zu bringen.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 1, bei der eine Vielzahl von Analytfängereinheiten zum spezifischen Fangen von verschiedenen Analyten auf der Analytdetektionseinheit angeordnet ist.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 13, bei der die Analyten DNAs sind und die Analytfängereinheiten eine Funktion haben, um mit DNAs spezifisch verbunden zu werden.
Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 13, bei der die Analyten Proteine sind und die Analytfängereinheiten eine Funktion haben, um mit Proteinen spezifisch verbunden zu werden.
Micro-Electro-Mechanical-System, das mit einer Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach einem der Ansprüche 1-15 versehen ist.
Micro-Total-Analysis-System, das mit einer Vorrichtung zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach einem der Ansprüche 1-15 versehen ist.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten mit: Verwenden eines Fließkanals, einer Analytdetektionseinheit zum Fangen und Detektieren des Analyten und einer Einheit zur quantitativen Messung zum quantitativen Bestimmen des Analyten; und Teilen eines Signals, das erzeugt wird, wenn die Analytdetektionseinheit den Analyten detektiert hat, in der Einheit zur quantitativen Messung zur Verarbeitung in eine Vielzahl von Teilen in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18, bei dem die Analytdetektionseinheit eine Analytfängereinheit zum Fangen des Analyten hat.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18, bei dem eine Vielzahl von Analytdetektionseinheiten in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal angeordnet wird.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18, bei dem die Anzahl von Analyten, die durch die Analytdetektionseinheit gefangen werden, in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal optimiert wird.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18 oder 21, bei dem die Optimierung ausgeführt wird, indem wenigstens ein Faktor verändert wird, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Zufuhrgeschwindigkeit des Analyten, der Länge der Analytdetektionseinheit in der Richtung des Fließens in dem Fließkanal, der Anzahl von Analytdetektionseinheiten in der Richtung längs der Breite des Fließkanals und der Dicke des Fließkanals.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18, bei dem die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines optischen Signals quantitativ bestimmt.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18, bei dem die Einheit zur quantitativen Messung den Analyten unter Verwendung eines elektrischen Signals quantitativ bestimmt.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18, bei dem die Analytdetektionseinheit eine Elektrode ist, so daß ein elektrisches Potential zum elektrischen Anziehen von geladenen Analyten durch die Elektrode auf die Elektrode angewendet wird.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 25, bei dem das elektrische Potential zum elektrischen Anziehen von geladenen Analyten durch die Elektrode gemäß der Stelle der Elektrode in der Richtung des Fließens verändert wird.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 18, bei dem eine Vielzahl von Analytfängereinheiten zum spezifischen Fangen von verschiedenen Analyten auf der Analytdetektionseinheit angeordnet wird.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 27, bei dem die Analyten DNAs sind und die Analytfängereinheiten eine Funktion haben, um mit DNAs spezifisch verbunden zu werden.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen eines Analyten nach Anspruch 27, bei dem die Analyten Proteine sind und die Analytfängereinheiten eine Funktion haben, um mit Proteinen spezifisch verbunden zu werden.
Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, bei dem die effektive Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, in einer Lösung, die einen Elektrolyten und das Molekül mit einer elektrischen Ladung enthält, unter Verwendung des Screening-Effektes durch den Elektrolyten eingeschätzt wird.
Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, nach Anspruch 30, bei dem ein Elektrolyt, der aus einem einwertigen Kation und einem einwertigen Anion gebildet ist, als Elektrolyt verwendet wird.
Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, nach Anspruch 31, bei dem der Elektrolyt, der aus einem einwertigen Kation und einem einwertigen Anion gebildet ist, NaCl, KCl oder ein Gemisch daraus ist.
Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, nach Anspruch 30, bei dem das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, ein Material umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNAs, RNAs, Antikörpern, natürlichen oder künstlichen einsträngigen Nukleotiden, natürlichen oder künstlichen doppelsträngigen Nukleotiden, Aptameren, Produkten, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, organischen Verbindungen mit einer Affinität für Proteine, Biomakromolekülen mit einer Affinität für Proteine, komplexen Materialien daraus, ionischen Polymeren, die positiv oder negativ geladen sind, und beliebigen Kombinationen daraus.
Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, nach Anspruch 30, bei dem das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, eine Thiolgruppe umfaßt.
Verfahren zum Bestimmen einer effektiven Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, nach Anspruch 30, bei dem das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, ein fluoreszierendes Pigment umfaßt.
Verfahren zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat, bei dem die Dichte der aufgebrachten Moleküle gesteuert wird, indem bewirkt wird, daß auch ein Elektrolyt in einer Lösung vor handen ist, die die Moleküle enthält, um den Screening-Effekt durch den Elektrolyten einzustellen, und indem die effektive Größe eines Moleküls berücksichtigt wird, wenn die Moleküle, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat aufgebracht werden.
Verfahren zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat nach Anspruch 36, bei dem die effektive Größe eines Moleküls, das eine elektrische Ladung hat, in einer Lösung, die den Elektrolyten und die Moleküle mit einer elektrischen Ladung enthält, gemäß dem Screening-Effekt durch den Elektrolyten eingeschätzt wird und die so erhaltene effektive Größe als die effektive Größe verwendet wird.
Verfahren zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat nach Anspruch 36, bei dem ein Elektrolyt, der ein einwertiges Kation und ein einwertiges Anion umfaßt, als Elektrolyt verwendet wird.
Verfahren zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat nach Anspruch 38, bei dem der Elektrolyt, der ein einwertiges Kation und ein einwertiges Anion umfaßt, NaCl, KCl oder ein Gemisch daraus ist.
Vorrichtung zum Aufbringen von Molekülen, die eine elektrische Ladung haben, auf ein Substrat, bei der die Dichte von Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, unter Verwendung des Verfahrens zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat nach Anspruch 36 gesteuert werden kann.
Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen, bei der das Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat nach Anspruch 36 verwendet wird und ein Substrat, dessen Dichte von aufgebrachten Molekülen so gesteuert wird, daß der Abstand zwischen benachbarten Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, nicht kleiner als das Doppelte der effektiven Länge eines Moleküls ist, als Detektionseinheit für das Molekül verwendet wird.
Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen, bei der das Verfahren zum Aufbringen von Molekülen auf ein Substrat nach Anspruch 36 verwendet wird und ein Substrat, dessen Dichte von aufgebrachten Molekülen so gesteuert wird, daß der Abstand zwischen benachbarten Molekülen, die auf das Substrat aufgebracht werden, kleiner als das Doppelte der effektiven Länge eines Moleküls ist, als Detektionseinheit für das Molekül verwendet wird.
Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen nach Anspruch 41 oder 42, bei der das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, ein Material umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNAs, RNAs, Antikörpern, natürlichen oder künstlichen einsträngigen Nukleotiden, natürlichen oder künstlichen doppelsträngigen Nukleotiden, Aptameren, Produkten, die durch begrenzte Zersetzung von Antikörpern mit einer Protease erhalten werden, organischen Verbindungen mit einer Affinität für Proteine, Biomakromolekülen mit einer Affinität für Proteine, komplexen Materia lien daraus, ionischen Polymeren, die positiv oder negativ geladen sind, und beliebigen Kombinationen daraus.
Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen nach Anspruch 41 oder 42, bei der das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, eine Thiolgruppe umfaßt.
Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen nach Anspruch 41 oder 42, bei der das Molekül, das eine elektrische Ladung hat, ein fluoreszierendes Pigment umfaßt.
Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen nach Anspruch 41 oder 42, bei der das Substrat aus einem elektroleitfähigen Material, einem Halbleitermaterial oder einem Isoliermaterial gebildet ist.
Vorrichtung zum Detektieren von Molekülen nach Anspruch 46, bei der das Substrat aus Gold oder Platin gebildet ist.