MX2011010589A - Cartucho de ensayo microflidico desechable para el bioensayo de analitos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un cartucho de ensayo desechable para el análisis cualitativo y/o cuantitativo de analitos, que incluye un cuerpo estructurado en el que se incorporan cavidades que están unidas entre sí por canales, cartucho de ensayo que presenta al menos una entrada para la incorporación de uno de los líquidos de muestra que contienen analitos, al menos una cámara de reacción en la que se ubican uno o varios reactivos para la reacción con los analitos o para el mezclado con el líquido de muestra, y al menos una cámara de detección en la que se detecta una señal para la verificación o análisis cuantitativo del analito, caracterizado porque el suelo o la cubierta de la cámara de detección están compuestos por un transductor de señal o una ventana para la detección de una señal, los canales están configurados de modo que el líquido no pueda arrastrarse por fuerzas capilares hasta la cámara de reactivos o el orificio y los reactivos en la cámara de reactivos y eventualmente otros reactivos en la cámara de detección se ubican en forma seca. Además, la invención se refiere a un dispositivo para el bioensayo de analitos mediante biosensores y/o quimiosensores que presenta el cartucho de ensayo según la invención, al menos un sitio de acoplamiento para la colocación del cartucho de ensayo, al menos un medio para transportar los líquidos de ensayo al cartucho de ensayo y al menos una unidad de regulación de la temperatura, así como a un procedimiento para la operación de este dispositivo. El cartucho de ensayo, dispositivo y procedimiento según la invención pueden utilizarse en la analítica ambiental, el campo alimentario, el diagnóstico humano y veterinario y la protección de plantas para determinar cualitativa y/o cuantitativamente analitos.

Description

CARTUCHO DE ENSAYO MICROFLUÍDICO DESECHABLE PARA EL BIOENSAYO DE ANALITOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un cartucho de ensayo desechable basado en la tecnología microfluídica para el bioensayo de analitos mediante biosensores y/o quimiosensores, a un dispositivo para el bioensayo de analitos mediante biosensores y/o quimiosensores que comprende el cartucho de ensayo según la invención, a un procedimiento para la operación de este cartucho de ensayo, así como a su uso en la analítica ambiental, el campo alimentario, el diagnóstico humano y veterinario y la protección de plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se designan como biosensores o quimiosensores aparatos que pueden verificar cualitativa o cuantitativamente un analito con la ayuda de un transductor de señal y una reacción de reconocimiento. Como reacción de reconocimiento, se designa muy en general la unión específica o reacción del denominado analito con el denominado elemento de reconocimiento.

Son ejemplos de reacciones de reconocimiento la unión de ligandos a complejos, la complejación de iones, la unión de ligandos a receptores (biológicos), receptores de membrana o canales iónicos, de antígenos o haptenos a anticuerpos, de sustratos a enzimas, de ADN o ARN a determinadas proteínas, la hibridación de ADN/ARN/APN o el procesamiento de sustratos mediante enzimas.

Los analitos pueden ser: iones, proteínas, antígenos o haptenos naturales o artificiales, hormonas, citocinas, monosacáridos y oligosacáridos, productos metabóücos u otros marcadores bioquímicos que se usan en el diagnóstico, sustratos enzimáticos, ADN, ARN, APN, principios activos potenciales, medicamentos, células y virus.

Son ejemplos de elementos de reconocimiento: receptores naturales o artificiales como, por ejemplo, formadores de complejos con metales/iones metálicos, ciclodextrinas, éteres corona, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, enzimas anticalinas, ADN, ARN, APN, proteínas de unión a ADN/ARN, receptores de membrana, canales iónicos, proteínas de adhesión celular o también gangliósidos, enzimas, monosacáridos u oligosacáridos y haptámeros.

Estos biosensores o quimiosensores pueden utilizarse en la analítica ambiental, el campo alimentario, el diagnóstico humano y veterinario y la protección de plantas para determinar cualitativa y/o cuantitativamente analitos. La especificidad de la reacción de reconocimiento posibilita determinar también cualitativa o cuantitativamente analitos en muestras complejas como, por ejemplo, aire ambiental, agua sucia o fluidos corporales sin purificación previa o muy baja. Adicionalmente, los biosensores o quimiosensores pueden utilizarse también en la investigación (bio)química y la búsqueda de principios activos para examinar la interacción entre dos sustancias distintas (por ejemplo, entre proteínas, ADN, ARN o sustancias y proteínas biológicamente activas, ADN, ARN, etc.).

Una nueva clase de biosensores eléctricos está basada en la verificación de analitos que están marcados con partículas metálicas, por ejemplo nanopartículas. Para la detección, se amplifican estas partículas medíante deposición autometalográfica de modo que cortocircuiten un circuito microestructurado. Esto se demuestra mediante una medida de resistencia a la corriente continua sencilla (documentos US 4.794.089; US 5.137.827; US 5.284.748). Se ha demostrado recientemente la detección de ácidos nucleicos mediante medida de resistencia a la corriente continua (R. Móller, A. Csáki, J. M. Kóhler y W. Frítzsche, Langmuir 17, 5426 (2001)).

Pueden utilizarse transistores de efecto campo como transductores electrónicos, por ejemplo, para una reacción enzimática (Zayats et al. Biosens. & Bioelectron. 15, 671 (2000)).

Como transductores mecánicos, se describen cuarzos oscilantes en los que se realiza la alteración de la frecuencia de resonancia mediante la distribución de masas (Steinem er al. Biosens. & Bioelectronics 12, 787 (1997)). En un transductor mecánico alternativo, se regulan las ondas superficiales con estructuras interdigitales que se modifican mediante adsorción orientada (Howe ef al., Biosens. & Bioelectron. 15, 641 (2000)).

Si se marcan las moléculas diana con perlas magnéticas, la reacción de reconocimiento puede detectarse mediante la influencia magnética de las perlas sobre la magnetorresistencia gigante (MRG) de la correspondiente resistencia (Baselt er al. Biosens. and Bioelectron. 13, 731 (1998)).

La integración de la reacción de reconocimiento con el transductor de señal de un biosensor o quimiosensor puede efectuarse inmovilizando el elemento de reconocimiento o el analito sobre la superficie del transductor de señal. Mediante la reacción de reconocimiento, es decir la unión o la reacción del analito con el elemento de reconocimiento, se alteran las propiedades ópticas del medio directamente en la superficie del transductor de señal (por ejemplo, alteración del índice de refracción óptica, absorción, fluorescencia, fosforescencia, luminiscencia, etc.), lo que se traduce en una señal de medida en el transductor de señal.

Las guías de ondas ópticas (planas) son una clase de transductores de señal con las que puede detectarse la alteración de las propiedades ópticas de un medio que limita con una capa de guía de onda, típicamente un dieléctrico. En caso de transportar luz en modo guiado en la capa de guía de onda, el campo lumínico no cae bruscamente en el límite del medio/guía de onda plana, sino que decrece exponencialmente en el denominado medio de detección limitante con la guía de onda. Este campo lumínico decreciente exponencialmente se designa como campo evanescente. Si se usan guías de ondas muy finas cuyo índice de refracción difiere lo más posible del medio limitante, se alcanzan decrecimientos del campo evanescente < 200 nm (la intensidad cae al valor 1/e). Si se alteran las propiedades ópticas del medio limitante de la guía de ondas, por ejemplo mediante alteración del índice de refracción óptica (documentos US 4.815.843; US 5.442.169) o de la luminiscencia (documentos US 5.959.292; EP 0.759.159; WO 96/35940) dentro del campo evanescente, esto puede detectarse mediante una configuración medida adecuada. Es decisivo a este respecto para el uso de guías de ondas como transductores de señal en biosensores o quimiosensores que la alteración de las propiedades ópticas del medio se detecte solo muy cerca de la superficie de la guía de onda. Esto es, si se inmoviliza el elemento de reconocimiento o el analito sobre la superficie de contacto de la guía de onda, puede detectarse de modo sensible a la superficie la unión al elemento de reconocimiento o la reacción del elemento de reconocimiento cuando se alteran a este respecto las propiedades ópticas del medio de detección (líquido, sólido, gas) en la superficie de contacto de la guía de onda.

Para simplificar la operación de los quimiosensores o biosensores, se ha probado desde hace algunos años a reducir estos aparatos y disponer todos los reactivos posibles que son necesarios para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de una muestra en un denominado cartucho de ensayo "listo para usar". Se utiliza particularmente la tecnología microfluídica y a este respecto se aspira a poner a disposición cartuchos desechables económicos, almacenables y fáciles de operar que puedan proporcionar resultados instantáneos reproducibles.

Los retos conocidos de un sistema microfluídico son que el mezclado del analito con los reactivos de detección para la detección no proceda óptimamente a causa de las corrientes laminares no totalmente controlables, el flujo laminar esté influido por distintas propiedades de superficie que en la fabricación y almacenamiento de un cartucho de ensayo son difícilmente controlables como, por ejemplo, carga superficial, contaminación, hidrofobia, humectación, etc. pueden formarse burbujas de aire en el transporte del líquido, - los fluidos y particularmente su volumen y velocidad no son totalmente controlables, no es posible un control simultáneo exacto de las etapas de reacción individuales en el flujo lateral.

Por ejemplo, el documento DE102005011530 describe un dispositivo microfluídico para la determinación cuantitativa instantánea de una cantidad muy pequeña de analito. La valoración instantánea se consigue circulando la muestra por una unidad de detección. La unidad de detección está compuesta por un canal de flujo en el que se inmovilizan unidades captadores de analito para captar el analito, por ejemplo anticuerpos, sobre una pluralidad de unidades de detección de analito a lo largo del canal de flujo. Se realiza la determinación cuantitativa del analito, por ejemplo, mediante una señal óptica. La muestra de analito se transporta, por ejemplo, con una microbomba al canal de flujo. El fin del dispositivo anteriormente citado es optimizar el número de analitos que se captan por la unidad captadora de analito en la dirección del flujo. Los analitos se determinan cuantitativamente en un amplio intervalo (la longitud del canal de flujo) sin reducir la sensibilidad de detección. Este dispositivo está compuesto por una pluralidad de constituyentes microscópicos basados en la tecnología de los semiconductores o dispositivos de precisión microscópicos: microbombas, microválvulas, sensores y similares que se miniaturizan, se acumulan y se integran. Sin embargo, la fabricación y funcionamiento de este dispositivo son demasiado complicados y demasiado carao para una posible aplicación como ensayo desechable.

El documento W02005/070533 describe un dispositivo microfluídico para la determinación de la concentración de un analito en un líquido de muestra con un cuerpo estructurado, que presenta sistemas de cámaras unidas con sistemas de canales, eventualmente con unidades de filtro incorporadas con una entrada y una salida, y en que al menos un lado está cerrado con una capa de cierre. Este dispositivo presenta una cámara de reacción que contiene los reactivos para la unión con al menos a un componente del líquido de muestra, que se inmovilizan sobre la tapa de la cámara o sobre partículas recubiertas. Se rellena una cámara de muestra con líquido de muestra por la entrada y se sella la entrada mediante una tapa. Se transporta el líquido de muestra mediante una bomba desde la cámara de muestra a través de un sistema de canales a la cámara de reacción. El dispositivo dispone de otros sistemas de canales que contienen un líquido de mareaje y un líquido de lavado, y un sistema de canales de salida para evacuar los líquidos de desecho. Pueden cerrarse mediante juntas flexibles distintas partes de los sistemas de canales complejos, que pueden abrirse en caso necesario a baja presión. La dirección de flujo en el dispositivo se asegura mediante válvulas y diodos de flujo de tipo escobilla o de tipo válvula. Después de la reacción de la cámara de reacción con el reactivo de unión, se añade el líquido de mareaje a la cámara de reacción y se separa por lavado la proporción no inmovilizada de los líquidos de muestra mediante el líquido de lavado. Se realiza la detección de la reacción mediante la medida de una señal óptica o magnética en la cámara de reacción. Las señales ópticas se miden a través de la tapa de la cámara de reacción. La capa de cierre anteriormente citada forma la tapa de la cámara de reacción y es correspondientemente transparente. El dispositivo posibilita un control exacto del volumen y de los tiempos de reacción. La configuración de este dispositivo requiere sin embargo varios procesos en la cámara de reacción antes de poder medir y es correspondientemente costoso. Por los elementos fluídicos usados, el dispositivo es muy complejo, lo que repercute en la propensión a las averías y los altos costes de producción. El empleo de elementos fluídicos reduce además la capacidad de almacenamiento del dispositivo.

Para la capacidad de almacenamiento y capacidad de transporte de los cartuchos, se utiliza en el estado de la técnica particularmente la tecnología del ensayo seco, en la que todos los reactivos están disponibles en estado seco en el cartucho eventualmente en cámaras separadas. El líquido de muestra se transporta hacia delante habitualmente por canales microfluídicos desde una cámara a la siguiente.

El documento WO 2005/088300 describe un cartucho de ensayo microfluídico integrado para el análisis de sangre que está compuesto por la parte inferior y la superior de un cuerpo. Ambos elementos se estructuran con cámaras y canales que se cierran mediante el acoplamiento de ambas partes. El cartucho de ensayo presenta uno o varios elementos de pretratamiento (cámara o canales de pretratamiento) para preparar una muestra, uno o varios elementos de ensayo en seco multicapa (cámara de detección) para el reconocimiento de uno o varios analitos de la muestra y uno o varios canales (diámetro= 3 mm) que unen los elementos de pretratamiento con los elementos de ensayo en seco multicapa. Los elementos de pretratamiento son particularmente elementos de filtro o elementos con propiedades porosas en forma de un canal o una (micro/nano)almohadilla que portan eventualmente reactivos secos. La muestra se pasa en primer lugar por los elementos de pretratamiento y entonces por el elemento de ensayo en seco multicapa. El elemento de reconocimiento de ensayo en seco multicapa presenta al menos una capa funcional que porta los elementos de reconocimiento para un ensayo cualitativo y cuantitativo en forma seca y estable. Esta capa de reactivos está compuesta por una capa hidroabsorbente en la que están distribuidos más o menos regularmente elementos de reconocimiento excitables en un material aglutinante polimérico hidrófilo (gelatina, agarosa, etc.). La detección se realiza mediante fotometría de reflexión a través de una ventana transparente a la luz, mediante irradiación de una capa de detección del elemento de ensayo en seco multicapa en la que se difunde el líquido ópticamente excitable de la reacción de reconocimiento. Para el transporte de la muestra, se usan, por ejemplo, fuerzas capilares o presión. Es una desventaja de este procedimiento que la configuración del elemento de ensayo en seco multicapa sea costosa. No es posible un control exacto del volumen, mezclado y tiempos de incubación, de modo que los resultados del ensayo no son cuantitativamente reproducibles.

Tanto en el documento WO 2005/088300 como en el W02005/070533, el cartucho se introduce en un dispositivo para la operación del cartucho que presenta una fuente de luz para la irradiación de la cámara de reacción, un filtro para la concentración de la señal de la cámara de reacción y una unidad de detección.

Los ensayos de flujo lateral (EFL) son conocidos desde hace muchos años para los análisis bioquímicos. Los ensayos de flujo lateral (EFL) aprovechan el efecto de la reacción de anticuerpo-antígeno. Adicionalmente, se arrastra la muestra a analizar (solución) por fuerzas capilares a través de la superficie del sensor. Para la verificación de analitos mediante EFL, puede realizarse, por ejemplo, un inmunoensayo directo competitivo sobre una tira de nitrocelulosa, arrastrándose la muestra a analizar por toda la tira de celulosa por fuerzas capilares. La zona en que se ha inmovilizado el anticuerpo anti-analito sirve como zona de detección para el ensayo de tira. Es un ejemplo de un ensayo EFL para la verificación de micotoxinas (por ejemplo, desoxinivalenol) el ""Reveal-Assay" (cartucho de ensayo) de la compañía Neogen, Lansing, MI, EE.UU. con el aparato de lectura adjunto "AccuScan". Se introduce el cartucho de ensayo en el aparato de lectura y el aparato toma una imagen del intervalo de resultados del ensayo de tira. El aparato de lectura interpreta la imagen de resultados y, cuando reconoce una línea, emite una valoración. El aparato elimina la subjetividad de la interpretación y da una documentación objetiva y reproducible de los resultados del ensayo. El ensayo descrito es sencillo y relativamente rápido de llevar a cabo y no requiere aparatos de lectura costosos. Es una desventaja que el procedimiento permita solo una verificación cualitativa de la micotoxina.

Existía la necesidad en el estado de la técnica de un medio económico, almacenable y fácil de operar para la práctica de procedimientos de ensayo bioquímicos para bioanalítica, analítica ambiental, agrodiagnóstico, el campo alimentario, diagnóstico humano y veterinario y la protección de plantas para determinar cualitativa y/o cuantitativamente analitos. Es un objetivo adicional de la presente invención posibilitar una determinación instantánea cuantitativa reproducible mediante un dispositivo sencillo de manejo sencillo. Para ello, la presente invención debería posibilitar el control de las condiciones de reacción, particularmente volumen y tiempos, pero sobre todo también un mezclado óptimo y el control de la temperatura de funcionamiento.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se consigue este objetivo según la invención mediante un cartucho de ensayo microfluídico para el análisis cualitativo y/o cuantitativo de analitos, que contiene todos los reactivos necesarios para la práctica del procedimiento de ensayo en forma seca. El cartucho de ensayo según la invención presente un cuerpo estructurado en el que se han incorporado cavidades que están unidas entre sí mediante canales. El cartucho de ensayo según la invención presenta al menos una entrada para la introducción de un líquido de muestra que contiene analitos, al menos una cámara de reactivos en la que se ubican uno o varios reactivos para la reacción con los analitos o para el mezclado con el líquido de muestra, y al menos una cámara de detección en la que se detecta una señal para la verificación o análisis cuantitativo del analito, y que se caracteriza porque el suelo o la cubierta de la cámara de detección es un transductor de señal o una ventana para la detección de una señal, los canales están configurados de modo que el líquido de muestra no se arrastre por fuerzas capilares hasta la cámara o el orificio, los reactivos en la cámara de reactivos y eventualmente otros reactivos en la cámara de detección se ubican en forma seca.

En el sentido de la invención, se transporta por los canales y las cámaras un volumen definido precisamente de líquido de muestra, lo que se posibilita por el diseño de los canales y el empleo de un medio adecuado para transportar el líquido de muestra. A este respecto, pueden controlarse igualmente con exactitud los tiempos de reacción, lo que contribuye a una mejor reproducibilidad del análisis. Mediante un diseño conveniente de las cámaras y los canales, se garantiza un perfil de flujo óptimo con volumen muerto reducido y un contacto óptimo con los reactivos de detección inmovilizados eventualmente presentes. En las cámaras, se llevan a cabo distintas etapas de reacción como, por ejemplo, reconstitución de los reactivos, mezclado de los reactivos con el líquido de muestra, reacción entre reactivos y analitos. En la presente invención, la etapa de detección se realiza directamente después de la reacción de reconocimiento sin proceso de lavado previo, lo que simplifica adicionalmente la configuración del cartucho y su manejo.

El cuerpo puede ser transparente u opaco y estar compuesto por distintos materiales poliméricos como, por ejemplo, polioximetlleno (POM), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliestireno (PS), polipropileno (PP), poliamida, poliolefinas cíclicas, policarbonatos, polietileno (PE), poli(tereftalato de etileno) (PET), polidimetilsiloxano (PDMS), caucho natural o derivados del mismo, poliuretanos, teflón o análogos o distintos materiales inorgánicos como, por ejemplo, vidrio, cuarzo o silicio. Se prefiere el uso de POM y poliamida. Se fabrican los cuerpos con procedimientos conocidos como, por ejemplo, mecanizado automático (fresado, etc.), moldeo por inyección, técnicas de estampación o, en vidrio/materiales inorgánicos, mediante fotolitografía/decapado u otros procedimientos conocidos.

La forma y tamaño de los cartuchos de ensayo puede ser cualquiera a condición de que el volumen total del cartucho de ensayo permanezca bajo y sea sencillo de manejar.

Preferiblemente, se incorporan las cámaras y canales en el cuerpo y se cierra al menos un lado mediante una unidad de cierre con exclusión de la entrada y habitualmente orificios de ventilación opcionales y/o una cámara de ensayo.

Es ventajoso controlar la temperatura en la cámara de reactivos y en la cámara de detección durante la operación del cartucho de ensayo.

Para ello, el cartucho de ensayo se configura preferiblemente de modo que pueda termostatizarse por contacto con elementos termostatizables.

Preferiblemente, el diseño del cartucho de ensayo se estructura de modo que la cámara de muestra opcional, la cámara de reactivos y la cámara de detección se orienten hacia el lado inferior del cuerpo. El transductor de señal o la ventana para la detección forman entonces preferiblemente el suelo de la cámara de detección. Preferiblemente, se cierra este lado del cartucho con una unidad de cierre fina, particularmente una lámina de cierre. La unidad de cierre puede ser opaca o transparente. Cuando se pone el cartucho sobre una superficie termostatizada, puede tener lugar un equilibrado rápido de la temperatura entre la base termostatizada y la solución de muestra en las cámaras.

En una forma de realización preferida del cartucho de ensayo según la invención, la unidad de cierre es una lámina de cierre de 30 µ?t? a 1000 pm, preferiblemente de 50 µp? a 500 µ?? de grosor. Es ventajoso a este respecto que la lámina de cierre pueda fijarse firmemente sobre el cuerpo y no pueda doblarse. Por ejemplo, pueden usarse láminas de poliolefina o láminas de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) como láminas de cierre.

En una forma de realización especial de la invención, se aplica la unidad de cierre sobre el lado superior e inferior del cartucho de ensayo. Esto simplifica la fabricación del cartucho de ensayo según la invención. Las láminas de cierre superior e inferior pueden ser de igual o distinto grosor.

Las unidades de cierre pueden fijarse sobre el cuerpo con técnicas de unión habituales en el estado de la técnica como, por ejemplo, soldadura o adhesión, eventualmente con la ayuda de adhesivos.

En el sentido de la invención, se mantiene en las cámaras un volumen definido precisamente de líquido durante un tiempo determinado y se transporta hacia delante después de ese tiempo.

En los cartuchos de ensayo según la invención, se transportan habitualmente de 1 a 1000 µ?, preferiblemente de 10 a 500 µ?, con especial preferencia de 10 a 250 µ?.

La forma de las cámaras puede ser cualquiera. Se prefieren cámaras de detección cuadradas y/o cámaras de reactivos redondas.

El volumen de las cámaras asciende habitualmente a 1 a 1000 µ?, preferiblemente a 10 a 500 µ?.

La cámara de muestra es típicamente redonda, preferiblemente de 5 a 15 mm, preferiblemente de 8 a 12 mm, de diámetro. La cámara de reactivos es habitualmente redonda, preferiblemente de 5 a 15 mm, preferiblemente de 5 a 10 mm de diámetro. Ambas cámaras pueden contener un volumen de líquido de 1 a 1000 µ?.

La cámara de detección es habitualmente cuadrada con dimensiones preferiblemente de 5 a 15 mm de ancho y 5 a 15 mm de largo, con especial preferencia de 10 mm x 10 mm y admite típicamente un volumen de líquido de 1 a 1000 µ?, debiendo rellenarse completamente con líquido según la invención.

La configuración de la cámara de muestra, cámara de reactivos y cámara de detección debe garantizar un perfil de flujo óptimo con volumen muerto reducido y un contacto óptimo con los reactivos de detección inmovilizados eventualmente presentes.

Los canales pueden ser rectos o curvos, preferiblemente rectos con codos angulares. De este modo, pueden incorporarse canales relativamente largos a la superficie limitada del cartucho. La forma de la sección transversal del canal es cualquiera, habitualmente redonda o cuadrada, preferiblemente redonda. Los tamaños de la sección transversal de los canales pueden ser iguales o distintos, se prefieren canales de igual tamaño, habitualmente de 0,2 a 3 mm, preferiblemente de 0,5 a 1 ,5 mm de sección transversal o diámetro. La longitud de los canales asciende habitualmente de 5 mm a 1000 mm, preferiblemente de 5 mm a 500 mm.

En la presente invención, se transportan líquidos con la ayuda de un medio para el transporte definido exactamente en términos de tiempo y volumen de líquidos de muestra. Preferiblemente, se impulsan volúmenes de líquido predefinidos de una cámara a la siguiente.

El medio para transportar los líquidos de muestra es parte de un dispositivo para la operación del cartucho de ensayo según la invención, que es igualmente objeto de la presente invención. Particularmente, se integra el medio para transportar los líquidos de muestra en un sitio de acoplamiento para incorporar el cartucho de ensayo al dispositivo anteriormente citado.

Preferiblemente, se realiza el manejo de líquidos en el cartucho de ensayo según la invención solo de modo que el dispositivo anteriormente citado no entre en contacto con líquido de muestra ni reactivos. Habitualmente, se añaden al cartucho de ensayo mediante el medio para transportar líquidos de muestra chorros de aire definidos exactamente en términos de tiempo y volumen. Mediante estos chorros de aire, se conduce el líquido de muestra por los distintos canales y cavidades.

El líquido de muestra a analizar se incorpora al cartucho de ensayo por la entrada, preferiblemente a una cámara de muestra. El cartucho de ensayo se cierra herméticamente además habitualmente mediante una o varias tapas. Las tapas pueden ser de materiales poliméricos o inorgánicos, que se unen herméticamente con el cuerpo mediante distintas técnicas como, por ejemplo, adhesión, soldadura, laminación, etc.

En una forma de realización especial del cartucho de ensayo, se han ubicado los reactivos en la cámara de reactivos en un material de tipo fibra o poroso, por ejemplo, partículas finas o tejidos, en forma de una almohadilla de reactivos (en la que los reactivos se han adsorbido, fijado, dispersado o desecado).

La almohadilla de reactivos se selecciona de modo que satisfaga los requisitos de la cámara de detección respecto al volumen de líquido transportado de la solución sobrenadante y de la concentración de componentes individuales en esta solución.

Una almohadilla de reactivos preferidas está compuesta de vidrio o polímeros como, por ejemplo, celulosa. Se prefieren almohadillas de reactivos que se usan también en el denominado ensayo de flujo lateral y son obtenibles comercialmente en distintas formas. Para rellenar esta cámara de reactivos, se selecciona, por ejemplo, el "filtro de vidrio extragrueso" de la compañía Pall Corporation (tamaño de poro 1 µ?t?, grosor típico 1270 pm, caudal de agua típico 210 ml/min/cm2 a 30 kPa), apilando dos trozos de filtro circulares de diámetro coincidente.

Los reactivos de la cámara de reactivos son típicamente: elementos de reconocimiento marcados o no marcados que se utilizan en la reacción de reconocimiento, particularmente receptores naturales o artificiales como, por ejemplo, formadores de complejo para metales/iones metálicos, ciclodextrinas, éteres corona, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticalinas, enzimas, ADN, ARN, APN, proteínas de unión a ADN/ARN, receptores de membrana, canales iónicos, proteínas de adhesión celular o también gangliósidos, enzimas, monosacáridos u oligosacáridos y haptámeros y/o analitos marcados o no marcados como, por ejemplo, iones, proteínas, antígenos o haptenos naturales o artificiales, hormonas, citocinas, monosacáridos y oligosacáridos, productos metabólicos u otros marcadores bioquímicos que se usan en el diagnóstico, sustratos enzimáticos, ADN, ARN, APN, principios activos potenciales, medicamentos, células y virus.

Se usan particularmente anticuerpos marcados como elementos de reconocimiento. En caso necesario, se ubican igualmente en la cámara de reactivos cofactores u otros productos químicos que sean necesarios o ventajosos para la reacción de un elemento de reconocimiento con un analito.

Opcionalmente, la cámara de reactivos contiene además coadyuvantes para la supresión de interacciones inespecíficas entre los reactivos, para ayudar a la impregnación o liberación de los reactivos de la almohadilla de reactivos como, por ejemplo, sustancias' tensioactivas como tensioactivos, lípidos, biopolímeros, polietilenglicol, biomoléculas, proteínas y péptidos.

Preferiblemente, los reactivos se aplican a concentraciones predefinidas que garantizan la reproducibilidad de su liberación en la operación del cartucho.

La almohadilla de reactivos se impregna habitualmente con aproximadamente 50 a 500 µ? de una solución que contiene los reactivos a concentraciones de 10~3 M a 10"15 M, preferiblemente a concentraciones nanomolares, así como habitualmente coadyuvantes en cantidades de 15% en peso a 0,1 ppb. La impregnación se realiza, por ejemplo, mediante desecado o liofilización.

El medio para transportar líquidos de muestra desplaza al líquido de muestra de modo que circula por la cámara de reactivos y humedece completamente la almohadilla de reactivos.

Mediante la conducción de líquidos de muestra que contienen analitos a la cámara de reactivos, se disuelven los reactivos y se produce una reacción con los analitos o se mezclan perfectamente con el líquido de muestra.

Sorprendentemente, se ha comprobado que, mediante una humectación rápida, habitualmente de 1 ms a 10 s, preferiblemente de aprox. 500 ms a 5 s, con especial preferencia 1 s, de la almohadilla de reactivos con un volumen de muestra definido (mediante un chorro de aire definido), tanto se disuelven (reconstituyen) y se mezclan óptimamente los reactivos con el líquido de muestra, como se ajusta muy reproduciblemente la concentración de reactivos en el líquido de muestra. Por tanto, es posible realizar una determinación cuantitativa de los analitos en el volumen de muestra. Después de la humectación de la almohadilla de reactivos, puede esperarse un tiempo definido (tiempo de . preincubación), por ejemplo, hasta terminar una reacción bioquímica o hasta alcanzar una ! temperatura de reacción determinada.

Con otro chorro de aire definido, se vuelve a transportar el volumen de muestra con los reactivos disueltos por un canal a la cámara de detección.

Preferiblemente, se filtra el líquido de muestra en el cartucho de ensayo antes de la cámara de reactivos y se libera de células, componentes sanguíneos u otras partículas biológicas, orgánicas o inorgánicas. Con este fin, pueden incorporarse al cartucho de ensayo una o varias unidades de filtro, por ejemplo, de fibra de vidrio o material poroso en forma de una (micro)almohadilla o canal, un papel de filtro de vidrio o una membrana. La unidad de filtro puede separar preferiblemente del líquido de muestra las partículas de 0,2 a 100 pm, preferiblemente de 0,5 a 15 pm.

Preferiblemente, tiene lugar la ventilación del sistema de canales completo mediante un orificio u orificios de ventilación.

En una forma de realización preferida de la invención, la detección se realiza mediante un transductor de señal (plataforma sensora, biochip) que está incorporado a la cámara de detección como suelo. En este caso, se aplica la unidad de cierre sobre el lado inferior completo del cartucho con excepción de la cámara de detección.

Se definen habitualmente sobre la superficie del transductor de señal una o varias zonas de medida separadas entre sí en las que se inmovilizan uno o varios miembros de unión para la verificación de analitos en la muestra. En la cámara de detección, tiene lugar una reacción bioquímica entre miembros de unión inmovilizados y analitos en la superficie del biochip. Los miembros de unión marcados se excitan en la cámara de detección, se detecta la señal producida y se usa para cuantificar los analitos.

Para la detección, pueden usarse distintos biochips como, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, guía de onda plana, microbalanza de cuarzo, electroluminiscencia y emplearse distintos procedimientos, por ejemplo, medida de las variaciones del índice de refracción por la unión a la superficie del biochip (véanse, por ejemplo, los documentos W002/20873 y EP1316594).

Son ejemplos de reacciones en la cámara de detección: • unión directa de un analito (detectable) al miembro de unión inmovilizado (elemento de reconocimiento); • unión directa del analito al miembro de unión inmovilizado (elemento de reconocimiento) y mareaje del analito mediante un segundo o varios reactivos de la solución de reacción que pueden detectarse óptica o eléctricamente (ensayo de sándwich); • unión de un reactivo detectable al miembro de unión inmovilizado (elemento de reconocimiento) que está en competición con el analito en la solución (ensayo competitivo).

En una forma de realización especialmente preferida del cartucho de ensayo según la invención, se usa una guía de onda plana de capa fina como biochip, que presenta una primera capa ópticamente transparente (a) sobre una segunda capa ópticamente transparente (b) con bajo índice de refracción como capa (a), incorporando uno o varios elementos de acoplamiento a la primera capa óptica (a) o a la segunda capa óptica (b) orientados perpendicularmente a la ruta de la luz de excitación, acoplándose la luz de excitación en la guía de onda de capa fina con el uno o varios elementos de acoplamiento y desacoplándose opcionalmente con uno o varios elementos de desacoplamiento.

Preferiblemente, se utilizan según la invención como elementos de acoplamiento estructuras de rejilla de igual periodo y/o profundidad de modulación.

Preferiblemente, se inmovilizan sobre la superficie de la plataforma sensora uno o varios miembros de reacción para la verificación de analitos directamente mediante absorción física o interacción electrostática o, como alternativa, con una capa adhesiva transparente óptica. Preferiblemente, se aplican los miembros de unión selectivamente en zonas de medida separadas espacialmente sobre la superficie de la plataforma sensora y se pasiva la superficie entre las zonas de medida para inhibir las uniones no específicas.

Para la aplicación del asociado de unión selectivamente en zonas de medida separadas espacialmente sobre la superficie de la plataforma sensora, pueden usarse uno o varios procedimientos del grupo formado por punteado de chorro de tinta, punteado mecánico mediante clavija o resorte, impresión por microcontacto, puesta en contacto fluídica de las zonas de medida con los elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos mediante su alimentación en paralelo o en microcanales cruzados, mediante la acción de las diferencias de presión o de potenciales eléctricos o electromagnéticos.

Se describen distintas formas de realización de la plataforma sensora y los correspondientes procedimientos de verificación en los documentos W095/33197, W095/33198, W097/37321 1 o W02001 13096. Las distintas formas de realización de la plataforma sensora y los correspondientes procedimientos de verificación se integran como referencia en la presente.

En una forma de realización especial del cartucho de ensayo, se preparan a concentraciones predefinidas los elementos de reconocimiento detectables de unión específica en la cámara de reactivos para uno o varios analitos del líquido de muestra. Mediante la introducción de líquido de muestra que contiene analitos en la cámara de reactivos, se disuelven los elementos de reconocimiento y forman una unión específica con los analitos (conjugado analito-elemento de reconocimiento). A este respecto, se saturan los sitios de unión libres de los elementos de reconocimiento con cantidades crecientes de analitos en el líquido de muestra.

Mediante otro chorro de aire, llegan al transductor de señal los conjugados de analito-elemento de reconocimiento y eventualmente los elementos de reconocimiento con sitios de unión libres para miembros de unión inmovilizados, por ejemplo, conjugados de analito-proteína, particularmente conjugados de analito-BSA. Los elementos de reconocimiento con sitios de unión libres forman una unión específica con los conjugados de analito-proteína inmovilizados correspondientes.

Cuantos más elementos de reconocimiento detectables con sitios de unión libres en la solución estén presentes, es decir, cuanto menor proporción del correspondiente analito en el líquido de muestra, más elementos de reconocimiento detectables se unen al chip. Los elementos de reconocimiento saturados con analito del líquido de muestra permanecen en solución. Mediante el acoplamiento con radiación electromagnética en el biochip, pueden excitarse los elementos de reconocimiento unidos a conjugados de analito-proteína inmovilizados y marcados en el campo evanescente de la guía de onda. Los elementos de reconocimiento marcados encontrados en solución no se excitan a este respecto. De este modo, es posible una cuantificación indirecta del analito contenido en el líquido de muestra.

Se describen combinaciones de elementos de reconocimiento detectables y miembros de unión inmovilizados para la verificación de micotoxinas en el documento W02007/079893, cuyo contenido se incorpora como referencia a la descripción.

En otra forma de realización del cartucho de ensayo según la invención, la cámara de detección presenta como suelo una ventana transparente a través de la cual puede detectarse la reacción bioquímica que se desarrolla en la cámara de detección. La ventana transparente puede formarse mediante la lámina de cierre, que en este caso debe ser transparente, y, por ejemplo compuesta por poli(metacrilato de metilo) (PMMA) o representar un elemento independiente. En este caso, la ventana está compuesta preferiblemente por vidrio o un plástico que es transparente para la luz usada, y se fija sobre el lado del cartucho de ensayo mediante la unidad de cierre con excepción de la cámara de detección.

En esta forma de realización, se ubican reactivos preferiblemente solo en la cámara de reacción, en la que tiene lugar el mezclado con el líquido de muestra antes del transporte a la cámara de detección.

Habitualmente, un reactivo en la solución reacciona dependiendo de la concentración del analito a determinar de modo que se modifican sus propiedades espectrales, por ejemplo, absorción, luminiscencia, fluorescencia, etc., que pueden detectarse ópticamente. Como alternativa, se une un reactivo de verificación en la solución dependiendo de la concentración del analito a determinar con otro reactivo o al analito mismo, de modo que el reactivo de verificación altera sus propiedades espectrales, por ejemplo, absorción, luminiscencia, fluorescencia, electroluminiscencia, capacidad eléctrica, etc., que pueden detectarse ópticamente.

En otra forma de realización, se encuentran en la cámara de detección uno o más transductores de señal mediante los que puede detectarse la reacción bioquímica que se desarrolla en la cámara de detección. En esta forma de realización, la ventana puede ser transparente u opaca. Igualmente, los reactivos se ubican aquí preferiblemente solo en la cámara de reactivos, en que tiene lugar el mezclado con el líquido de muestra antes del transporte a la cámara de detección.

En este caso, un reactivo en la solución reacciona dependiendo de la concentración del analito a determinar de modo que se alteran sus propiedades físicas, por ejemplo, absorción, luminiscencia, fluorescencia, electroluminiscencia, capacidad, conductividad, pH, masa, etc., que pueden detectarse mediante el transductor de señal. Como alternativa, se une un reactivo de verificación en la solución dependiendo de la concentración del analito a determinar con otro reactivo o con el analito mismo, de modo que el reactivo de verificación altera sus propiedades físicas como, por ejemplo, absorción, luminiscencia, fluorescencia, electroluminiscencia, capacidad eléctrica, conductividad, pH, masa, etc., que pueden detectarse mediante el transductor de señal.

La combinación de una ventana transparente para la detección de señales ópticas como suelo de la cámara de detección con otros transductores de señal en la cámara de detección es igualmente posible en el sentido de la presente invención.

En otra forma de realización de la presente invención, cada cartucho de ensayo porta un código de barras que incluye preferiblemente la siguiente información para la descripción del cartucho de ensayo: - tipo de ensayo, carga/número de lote/fecha de fabricación fecha de caducidad codificación de la geometría de la matriz de puntos, que describe la geometría de las zonas de medida.

En una forma de realización preferida de la presente invención, se leen y usan estas informaciones del dispositivo para el bioensayo de analitos mediante biosensores y/o quimiosensores que contiene el cartucho de ensayo según la invención, que es igualmente objeto de la presente invención.

Para determinadas aplicaciones, puede ser ventajoso que un cartucho de ensayo presente varios sistemas de canales y cámaras dispuestos en paralelo de modo que puedan realizarse simultáneamente en un cartucho de ensayo distintas reacciones de detección.

Es objeto adicional de la presente invención un dispositivo para el bioensayo de analitos mediante biosensores y/o quimiosensores que presenta los cartuchos de ensayo según la invención, al menos un sitio de acoplamiento para la colocación del cartucho de ensayo según la invención y al menos un medio para transportar líquidos de muestra al cartucho de ensayo. Para asegurar resultados óptimos reproducibles, el dispositivo según la invención dispone además, para el control de la temperatura de funcionamiento en el cartucho de ensayo, de una unidad de regulación de la temperatura.

En una forma de realización preferida del dispositivo según la invención, la unidad de regulación de la temperatura presenta al menos un elemento termostatizable plano sobre el que se coloca el lado fino del cartucho de ensayo según la invención de modo que pueda tener lugar un equilibrado de temperatura rápido entre el soporte termostatizado y la solución de muestra en las cámaras. Por ejemplo, pueden usarse elementos de Peltier o Cartridge para la termostatización del soporte.

Idealmente, se controla informáticamente la unidad de regulación de la temperatura y se mantiene constante la temperatura durante el funcionamiento del cartucho de ensayo. Preferiblemente, se opera el cartucho de ensayo a una temperatura de 20 a 37°C, preferiblemente de 25°C.

En el control de temperatura, preferiblemente se tiene cuidado de que no tenga lugar condensación sobre el cartucho de ensayo, que podría perjudicar la detección óptica. A este respecto, debe tenerse cuidado con la temperatura del cartucho de ensayo, la temperatura ambiente y la respectiva humedad ambiental (Fig. 13: diagrama de temperatura del punto de rocío). Se prefiere operar el dispositivo según la invención a temperaturas de 15 a 40°C y una humedad ambiental relativa de un 65%.

Habitualmente, el sitio de acoplamiento presenta un disparador mecánico en el que se inicia la reacción, es decir, el primer chorro de aire, con la ayuda del medio para transportar el líquido de muestra y/o la termostatización mediante la unidad de termostatización.

En una forma de realización especial de la invención, el dispositivo según la invención presenta además al menos una unidad óptica, al menos una fuente de luz de excitación, particularmente un láser, y al menos una unidad de lectura para la detección de la reacción bioquímica en la cámara de detección del cartucho de ensayo según la invención Preferiblemente, la unidad de lectura es un detector con resolución espacial, por ejemplo, formado por el grupo de cámaras CCD, chips CCD, matrices de fotodiodos, matrices de diodos de avalancha, placas multicanales y fotomultiplicadores de múltiples canales.

Habitualmente, la unidad óptica presenta además espejos, prismas y/o lentes para la estructuración de la luz de excitación, particularmente enfoque, graduación, redireccionamiento y orientación.

Para la operación de un cartucho de ensayo con una plataforma sensora PWG, es ventajoso integrar en la unidad óptica un goniómetro para controlar y regular la ruta de excitación, particularmente para optimizar los parámetros de acoplamiento mediante la colocación del rayo láser respecto al ángulo de incidencia y la posición de la estructura de rejilla. Mediante un ajuste preciso del rayo láser, se maximiza la intensidad de la luz dispersada por la plataforma sensora PWG.

Preferiblemente, se sujeta el cartucho de ensayo en el sitio de acoplamiento dé forma igualmente precisa mediante una unidad de fijación.

Si se usa un cartucho de ensayo con plataforma sensora PWG, se prefiere una precisión de 100 pm paralelamente a la rejilla y 200 µ?t? perpendicularmente a la superficie del chip PWG. La segunda colocación se ajusta en el transcurso del ajuste de acoplamiento con una resolución de 50 µ?t?. Se observa que la calidad de la señal de una colocación exacta de la plataforma sensora depende del rayo láser, de modo que deberían considerarse los límites de tolerancia.

Habitualmente, se sella el cartucho de ensayo, por ejemplo, con una tapa de silicona y el medio para transportar el líquido de muestra, por ejemplo, una sobrepresión, una jeringa, un pistón o una bomba, preferiblemente una bomba, impulsa un primer volumen de aire al cartucho de ensayo. La presión de aire transporta el líquido de muestra desde la cámara de muestra a la cámara de reactivos y retícula la almohadilla de reactivos. Con esto, se inicia la fase de preincubación, durante la cual reaccionan, por ejemplo, las toxinas de la muestra con el anticuerpo fluorescente. Habitualmente, el tiempo de preincubación asciende a 1 a 20 min, preferiblemente a 3 a 7 min, dependiendo de los miembros de reacción. Habitualmente, se produce una señal más fuerte mediante un tiempo de preincubación más largo. Se prefiere controlar el tiempo de preincubación con una precisión de 3 s. En una etapa adicional, el medio para transportar el líquido de muestra impulsa un segundo volumen de aire predefinido al cartucho de ensayo, lo que conduce a un transporte adicional del líquido de ensayo, eventualmente a través de un filtro, por el canal hasta la cámara de reacción. Allí tiene lugar la incubación principal, que habitualmente dura de 1 a 100 min.

La detección se realiza preferiblemente después de 1 a 30 minutos, preferiblemente 5 a 15 minutos, con una precisión de ± 5 s. Para ello, se conduce por ejemplo un rayo láser a la cámara de detección por la superficie de la plataforma sensora y se registra la fluorescencia producida en la unidad de lectura. Habitualmente, la reacción no ha alcanzado todavía el equilibrio. Se prefiere por tanto respetar exactamente la duración de las etapas respectivas para garantizar la reproducibilidad de la medida.

Preferiblemente, el dispositivo según la invención dispone de una unidad de control para el control automático del medio para transportar el líquido de muestra y/o de la unidad de regulación de la temperatura y/o de la unidad óptica y de la correspondiente colocación del cartucho de ensayo en el sitio de acoplamiento mediante la unidad de fijación, del control y ajuste de los parámetros de reacción bioquímicos como, por ejemplo, tiempo/temperatura de incubación, tiempo/temperatura de reacción, etc. La unidad de control dispone además de un elemento procesador para el cálculo de los valores de analitos con referencia a una curva de calibración y representaciones de los valores de analitos.

Habitualmente, la operación del dispositivo según la invención se realiza como sigue: 1. El usuario introduce el cartucho de ensayo en el sitio de acoplamiento. 2. El usuario aprieta el botón de activación para iniciar el dispositivo según la Invención.

El dispositivo según la invención lleva a cabo independientemente con la ayuda de la unidad de control las siguientes etapas: 3. La unidad de regulación de la temperatura calienta el cartucho de ensayo hasta alcanzar una temperatura de, por ejemplo, 25°C, y la mantiene. 4. Si se usa un cartucho con guía de onda plana integrada, se optimizan las condiciones de acoplamiento. Se ajusta la posición del láser con la ayuda del goniómetro. 5. El medio para transportar el líquido de muestra transporta el líquido de muestra a la cámara de reactivos. Se inicia la preincubación. 6. El medio para transportar el líquido de muestra transporta el líquido de muestra a la cámara de reacción. Se inicia la incubación principal. 7. Se optimizan con precisión las condiciones de acoplamiento. A este respecto, se considera una compensación de ángulo de 1o debido a la variación del índice de refracción (aire en la etapa 5, solución acuosa ahora). 8. Se conecta el rayo láser y se registra la señal resultante de la unidad de lectura.

Es otro objeto de la presente invención un procedimiento para la operación del cartucho de ensayo según la invención caracterizado por las siguientes etapas: A. introducción de un líquido de muestra que contiene analitos en el cartucho de ensayo, B. transporte del líquido de muestra a una cámara de reactivos mediante un medio para transportar el líquido de muestra, después C. humectación de una almohadilla de reactivos en la cámara de reactivos y liberación de los reactivos allí aplicados, humedeciéndose completamente la almohadilla de reactivos y controlando la velocidad de humectación, que preferiblemente asciende a 1 ms a 10 s.

D. preincubación opcional, controlándose el tiempo de preincubación preferiblemente con una precisión de 3 s, después E. transporte a la cámara de detección mediante un medio para transportar el líquido de muestra, rellenándose completamente la cámara de detección, F. reacción bioquímica eventualmente con los reactivos aplicados a la cámara de detección (incubación), que sirve para la determinación cuantitativa de uno o varios analitos, controlándose el tiempo de incubación, seguido de G. excitación y medida de los cambios de las propiedades espectrales y/o de las propiedades físicas del líquido de muestra en la cámara de detección, H. cálculo y visualización de los valores de analitos con referencia a una curva de calibración.

Para la reproducibilidad del procedimiento, se transporta preferiblemente un volumen definido con precisión de líquido de muestra. Es además ventajoso controlar la temperatura del cartucho en la cámara de reactivos y en la cámara de detección con la ayuda de la unidad de regulación de la temperatura durante el funcionamiento.

Para la reproducibilidad del resultado en la repetición del procedimiento con otro cartucho de ensayo, se prefiere establecer los parámetros, particularmente volumen, tiempos (tiempos de transporte e incubación) y/o temperatura y controlarlos automáticamente mediante la unidad de control.

Es una gran ventaja de la invención que la persona que lleva a cabo una analítica con el nuevo cartucho de ensayo microfluídlco no debe llevar a cabo ninguna etapa de proceso cuantitativa de la analítica como, por ejemplo, la dosificación exacta del volumen de muestra y la dosificación exacta de los reactivos. Así, el procedimiento de ensayo bioquímico puede llevarse a cabo también por personas que no sean analistas expertos. Es otra ventaja que, antes del inicio del ensayo, no están almacenados líquidos en el cartucho de ensayo, sino solo reactivos secos. Una gran ventaja del sistema consiste en que, aparte de la solución de muestra, no deben añadirse otros líquidos, lo que hace fácilmente practicable el procedimiento. Al final del análisis, la muestra permanece líquida en el cartucho de muestra, de modo que no puede aparecer ningún peligro para el medio ambiente por sustancias tóxicas o infecciosas. Este aprovechamiento del cartucho de ensayo como cartucho desechable se posibilita económicamente mediante una configuración sencilla y costes de fabricación correspondientemente bajos.

El uso del cartucho de ensayo según la invención, del dispositivo para la operación del cartucho de ensayo y del procedimiento para la operación del cartucho de ensayo en analítica ambiental, el campo alimentario, el diagnóstico humano y veterinario y la protección de plantas para determinar cualitativa y/o cuantitativamente analitos es igualmente objeto de la presente invención.

Son ejemplos de este uso la determinación cuantitativa y/o cualitativa de analitos químicos, bioquímicos o biológicos en procedimientos de cribado en la investigación farmacéutica, la química combinatoria, el desarrollo clínico y preclínico para estudios de unión instantáneos y para la determinación de parámetros cinéticos en cribados de afinidad e investigación, para determinaciones cualitativas y cuantitativas de analitos, particularmente para analítica de ADN y ARN y la determinación de diferencias genómicas o proteómicas en el genoma como, por ejemplo, polimorfismos mononucleotídicos, para la medida de interacciones proteína-ADN, para la determinación de los mecanismos de control para la expresión de ARNm y para la (bio)síntesis de proteínas, para la elaboración de estudios de toxicidad así como para la determinación de perfiles de expresión, particularmente para la determinación de sustancias marcadoras biológicas y químicas como ARNm, proteínas, péptidos o sustancias o mensajeros orgánicos de bajo peso molecular, así como para la verificación de anticuerpos, antígenos, patógenos o bacterias en la investigación y desarrollo de productos farmacéuticos, el diagnóstico humano y veterinario, la investigación y desarrollo de productos agroquímicos, el diagnóstico sintomático y presintomático de plantas, para la estratificación de pacientes en el desarrollo de productos farmacéuticos y para la selección de medicamentos terapéuticos, para la verificación de patógenos, contaminantes y gérmenes, particularmente de Salmonella, priones, virus y bacterias, particularmente en la analítica de alimentos y ambiental.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Se representan formas de realización especiales del cartucho de ensayo según la invención las siguientes figuras , sin limitarse a las mismas.

Fig. 1 : Cartucho de ensayo Fig. 2: Vista lateral del cartucho de ensayo Fig. 3: Cartucho de ensayo con acotaciones Fig. 4: Configuración del cartucho de ensayo, vista lateral desde arriba Fig. 5: Configuración del cartucho de ensayo, vista lateral desde abajo Fig. 6: Biochip PWG Fig. 7: Vista lateral del biochip PWG Fig. 8: Dimensiones del biochip PWG.

Fig. 9: Representación esquemática del dispositivo según la invención para la operación del cartucho de ensayo.

La Fig. 10 muestra la influencia de la temperatura sobre la curva de respuesta a la dosis de un ensayo.

La Fig. 11 muestra la configuración experimental para la medida de la regulación de temperatura mediante elementos de "Peltier".

La Fig. 12 muestra una simulación de la velocidad de enfriamiento del cartucho de ensayo.

La Fig. 13 diagrama de temperatura del punto de rocío.

La Fig. 14 muestra la influencia del tiempo de incubación sobre la curva de respuesta a la dosis del ensayo mediante la micotoxina fumonisina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Según las figuras 1 a 8, el cartucho de ensayo 1 está compuesto por un cuerpo estructurado 2, en el que están incorporados canales y cavidades. Este cuerpo está dotado por el lado superior e inferior con una lámina de cierre 5, con lo que se consigue que las distintas cavidades y canales del cuerpo estructurado se cierren herméticamente (con excepción de las aberturas 3, 19 y 20).

Por ejemplo, se ha producido el cartucho de ensayo según la invención en un procedimiento de moldeo por inyección. El cuerpo está compuesto por una placa de polioximetileno (POM) negro, en la que se han abierto y taladrado los canales y cámaras.

El cartucho de ensayo 1 comprende una entrada 2 para la alimentación de un líquido de muestra con los analitos a detectar al cartucho de ensayo 1 , una cámara de reactivos 7 a la que se transporta el líquido de muestra por un canal 6 y una cámara de detección 9 a la que se transporta el analito por otro canal 6, y comprende un biochip PWG 10.

La cámara de muestra 4 es redonda de 10 mm de diámetro. La cámara de reactivos 7 es redonda de 8 mm de diámetro. La cámara de detección 9 es cuadrada de dimensiones 10 mm x 10 mm. Los canales 6 tienen una sección transversal redonda con un diámetro de 1 mm.

En la cámara de reactivos 7, se encuentran anticuerpos marcados con un colorante fluorescente, que son específicos de un analito del líquido de muestra, impregnados en una almohadilla de reactivos 8.

La almohadilla de reactivos 8 está compuesta por "filtro de vidrio extragrueso" de la compañía Pall Corporation (tamaño de poro 1 pm, grosor típico 1270 µ??, caudal de agua típico 210 ml/min/cm2 a 30 kPa), apilándose dos trozos de filtro circulares de 8 mm de diámetro.

Tanto el biochip PWG 10 como la almohadilla de reactivos 8 se adhieren entre dos láminas de poliolefina a las placas de POM 2, que sirven también como láminas de cierre 5 para el sellado del cartucho de ensayo. La lámina muestra en la zona del biochip PWG 10 una ventana 21 que permite acceso libre a la región de medida del biochip PWG 10. La lámina de cierre 5 superior es de 180 m de grosor y la lámina de cierre inferior 5 es de 80 pm de grosor.

El líquido de muestra se incorpora al inicio del ensayo a la cámara de muestra 4 y se cierra herméticamente con una tapa de silicona adecuada. El líquido se distribuye por la cámara de muestra 4 y por los canales adyacentes 6, que están configurados de modo que el líquido no se arrastre por fuerzas capilares hasta la cámara de reactivos 7 o la entrada 3. Con la ayuda de la unidad de transporte, se incorpora un volumen definido de aire a la cámara de muestra 4 por el canal 6. Este volumen de aire desplaza al líquido de muestra, de modo que circula a la cámara de reactivos 7 y humedece completamente la almohadilla de reactivos 8.

Mediante la conducción del líquido de muestra a la cámara de reactivos 7, se disuelven los anticuerpos y forman una unión específica con los analitos contenidos en el líquido de muestra (conjugado analito-anticuerpo). A este respecto, se saturan los sitios de unión del anticuerpo con cantidades crecientes de analitos en el líquido de muestra.

Después de un cierto tiempo de residencia (10 minutos) a una temperatura de 25°C, se transporta el líquido de muestra con los conjugados de analito-anticuerpo contenidos en la siguiente etapa con otro chorro de aire definido a la cámara de detección 9. La cámara de detección 9 se rellena completamente con el líquido de muestra.

La ventilación del sistema de canales completo tiene lugar mediante el o los orificios de ventilación 20, que se incorporan a la lámina de cierre superior 10.

La cámara de detección 9 comprende un biochip PWG 10. El biochip PWG 10 se muestra esquemáticamente en vista en planta y en la Fig. 7 esquemáticamente en vista lateral.

En la cámara de detección 9, se detecta el desarrollo o el punto final de la reacción de identificación bioquímica.

El biochip PWG 10 en la cámara de detección 9 está compuesto, por ejemplo, por una placa de vidrio de 10 mm x 12 mm con un grosor de 0,7 mm (12,0 ± 0,05 mm x 10,0 ± 0,05 mm x 0,70 ± 0,05mm). Por un lado del chip, se encuentra una capa fina de guía de onda 12 de 155 nm de Ta205 (pentóxido de tantalio). La región de medida del chip comprende una zona de detección cuadrada central de 10 mm x 6 mm. Paralelamente a esta zona de detección, se encuentra una banda falciforme de 500 µ?? de ancho: la rejilla 1 para el acoplamiento de la luz de excitación. La exactitud de la colocación de la rejilla 1 1 con los lados del biochip PWG 10 asciende a ± 0,05 mm. La profundidad de rejilla asciende a 18 nm y el periodo de rejilla a 318 nm, con un ciclo de trabajo de 0,5.

Sobre la capa fina de guía de onda 12 se aplica una monocapa de dodecilfosfato como capa adhesiva 13. Sobre la capa adhesiva 13 se aplican/inmovilizan conjugados de analito-BSA por adsorción en forma de una matriz 15. Las superficies libres entre los puntos de conjugado de analito-BSA 16 y los puntos de referencia 17 están bloqueadas con BSA 14 (pasivación).

En la cámara de detección 9, los conjugados de analito-anticuerpo, y eventualmente anticuerpos con sitios de unión libres, acceden a los puntos de conjugados de analito-BSA 16 inmovilizados sobre el biochip PWG 10. Los anticuerpos con sitios de unión libres forman una unión específica con los correspondientes conjugados de analito-BSA inmovilizados. Cuantos más anticuerpos con sitios de unión libres estén presentes en la solución, es decir, cuanto menor proporción del correspondiente analito haya en el líquido de muestra, más se unen los anticuerpos marcados sobre el biochip PWG 10 con un anticuerpo marcado con colorante de fluorescencia. Los anticuerpos saturados con analitos en el líquido de muestra permanecen en solución.

Mediante el acoplamiento de radiación electromagnética con la capa fina de guía de onda 12, pueden excitarse para fluorescencia los anticuerpos unidos a los conjugados de analito-BSA inmovilizados y marcados con un colorante de fluorescencia en el campo evanescente de la capa fina de guía de onda 12. Los anticuerpos que se encuentran en solución y marcados con un colorante de fluorescencia no se excitan en este sentido. De este modo, es posible una cuantificación indirecta de los analitos contenidos en el líquido de muestra.

Se representan en la Figura 9 formas de realización especiales del dispositivo según la invención para la operación del cartucho de ensayo, sin limitarse a las mismas.

El dispositivo para la operación del cartucho de ensayo según la invención presenta un sitio de acoplamiento 25 con un soporte 30 para la coloración del cartucho de ensayo 1 según la invención. Debajo del biochip PWG 10 se encuentra una ventana 31 en el soporte 30. El dispositivo presenta además el agente para transportar el líquido de muestra 32 al cartucho de ensayo 1 y el elemento de termostatización 33. En la Fig. 9, el elemento de termostatización 33 termostatiza el soporte 30 por contacto, que a su vez transfiere la termostatización al cartucho de ensayo 1.

Además, el dispositivo según la invención presenta en la unidad óptica un láser móvil 37 y al menos una cámara CCD 35 para la detección de la reacción bioquímica en la cámara de detección del cartucho de ensayo 1. La unidad óptica contiene además un espejo móvil 36 y un objetivo con filtros 34. Son también posibles otros prismas y/o lentes para configuración, particularmente enfoque, graduación, redireccionamiento y orientación de la luz de excitación, así como un goniómetro para el control y regulación de la ruta de excitación, particularmente para la optimización de los parámetros de acoplamiento mediante la colocación del rayo láser respecto al ángulo de incidencia y la posición con la estructura de rejilla del biochip PWG 10 (no indicado en la Fig. 9). Mediante un ajuste preciso del rayo láser, se maximiza la intensidad de la luz dispersada por el biochip PWG 10.

El rayo láser (véase la Fig. 9) se refleja en el chip PWG 10 del cartucho de ensayo 1. Los fotones de fluorescencia obtenidos por excitación lumínica se registran a través de la ventana óptica 13 por la cámara 35.

El sitio de acoplamiento presenta además un disparador mecánico que inicia la reacción en el cartucho de ensayo.

Para asegurar resultados óptimos reproducibles, la unidad de regulación de la temperatura 33 regula la temperatura de funcionamiento en el cartucho de ensayo 1. Se conecta típicamente con el accionamiento del disparador para el inicio del cartucho.

Preferiblemente, se opera el cartucho de ensayo a una temperatura de 25°C ± 2°C. La Fig. 10 muestra la influencia de la temperatura sobre la curva de respuesta a la dosis de un ensayo. La Fig. 11 muestra la configuración experimental para la medida de la regulación de temperatura mediante elementos de "Peltier" y la Fig. 12 muestra una simulación de la velocidad de enfriamiento del cartucho de ensayo.

El medio para transportar el líquido de muestra 32 admite chorros de aire definidos exactamente en términos de tiempo y volumen en el cartucho de ensayo sellado. Mediante estos chorros de aire, se conduce el líquido de muestra por los distintos canales 6 y cavidades y tienen lugar allí distintas etapas de reacción como, por ejemplo, reconstitución de los reactivos, mezclado de los reactivos con la muestra, etc.

El cartucho de ensayo 1 se sella con una tapa de silicona 21 y el medio para transportar el líquido de muestra 32 (una bomba) impulsa un primer volumen de aire al cartucho de ensayo 1. La presión de aire transporta el líquido de muestra desde la cámara de muestra 4 a la cámara de reactivos 7 y retícula la almohadilla de reactivos 8. Con esto, se inicia la fase de preincubación durante la cual, por ejemplo, reacciona la toxina de la muestra con el anticuerpo fluorescente. Habitualmente, el tiempo de preincubación asciende de 2 a 5 min ± 3 s, dependiendo de los miembros de reacción. Habitualmente, se produce una señal más fuerte con un tiempo de preincubación más largo. La Fig. 14 muestra la influencia del tiempo de incubación sobre la curva de respuesta a la dosis del ensayo mediante la micotoxina fumonisina. En una etapa adicional, el medio para transportar el líquido de muestra 32 impulsa un segundo volumen de aire predefinido al cartucho de ensayo 1 , lo que conduce a otro transporte del líquido de muestra, eventualmente a través de un filtro, por en canal 6 hasta la cámara de detección 9. Allí tiene lugar la incubación principal. La detección se realiza preferiblemente después de 10 minutos con una precisión de ± 5 s. Para ello, se conduce un rayo láser a la cámara de detección 9 por la superficie del biochip PWG 10 y se registra la fluorescencia producida en la cámara CCD 35. Habitualmente, la reacción no ha alcanzado todavía el equilibrio. La duración de las etapas respectivas se respeta exactamente.

Los valores de analitos se calculan con referencia a una curva de calibración mediante un elemento de cálculo de la unidad de control 38 y se representan.

Para la reproducibilidad del resultado en la repetición del procedimiento con otro cartucho de ensayo, se prefiere establecer los parámetros, particularmente volumen, tiempos (tiempos de transporte e incubación) y/o temperatura y controlar los elementos respectivos del dispositivo automáticamente mediante la unidad de control 38.

Números de referencia: 1 cartucho de ensayo 2 cuerpo estructurado 3 entrada 4 cámara de muestra 5 lámina de cierre 6 canal 7 cámara de reactivos 8 almohadilla de reactivos 9 cámara de detección 10 biochip PWG 11 rejilla 12 capa fina de guía de onda sobre una placa de vidrio (no mostrada) 13 capa adhesiva 14 BSA 15 matrices 16 puntos de conjugados de micotoxina-BSA 17 puntos de referencia 18 canal de aire 19 orificio de aireación 20 orificio de ventilación 21 ventana de la lámina de cierre 22 canal de ventilación 30: soporte 31: ventana óptica 32: medio para transportar el líquido de muestra 33: elemento de termostatizacion, elemento de Peltier o Cartridge 34: objetivo con filtros 35: cámara CCD 36: espejo móvil 37: láser móvil 38: unidad de control

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Cartucho de ensayo para el análisis cualitativo y/o cuantitativo de analitos, que incluye un cuerpo estructurado en el que se incorporan cavidades que están unidas entre sí por canales, el cartucho de ensayo que presenta: « al menos una entrada para la introducción de uno de los líquidos de muestra que contienen analitos, • al menos una cámara de reactivos en la que se ubican uno o varios reactivos para la reacción con los analitos o para el mezclado con el líquido de muestra, y • al menos una cámara de detección en la que se detecta una señal para la verificación o análisis cuantitativo del analito, caracterizado porque. • el suelo o la cubierta de la cámara de detección están compuestos por un transductor de señal o una ventana para la detección de una señal, • los canales están configurados de modo que los líquidos no puedan arrastrarse por fuerzas capilares hasta la cámara de reactivos o el orificio, • los reactivos en la cámara de reactivos y eventualmente otros reactivos en la cámara de detección se ubican en forma seca.

2. Cartucho de ensayo según la reivindicación 1 , caracterizado porque los reactivos en la cámara de reactivos están apilados en una almohadilla de reactivos.

3. Cartucho de ensayo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque al menos un lado del cuerpo está cerrado mediante una unidad de cierre.

4. Cartucho de ensayo según la reivindicación 3, caracterizado porque la unidad de cierre es una lámina de cierre.

5. Cartucho de ensayo según la reivindicación 4, caracterizado porque la lámina de cierre presenta un grosor de 30 pm a 1000 pm.

6. Cartucho de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cámara de reactivos y la cámara de detección están ubicados en el lado inferior del cuerpo.

7. Cartucho de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el transductor de señal o la ventana para la detección de una señal forman el suelo de la cámara de detección.

8. Cartucho de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la cámara de detección presenta un transductor de señal como suelo y sobre el transductor de señal están definidas una o varias zonas de medida separadas entre sí, en las que están inmovilizados uno o varios asociados de unión para la verificación del analito en la muestra.

9. Cartucho de ensayo según la reivindicación 8, caracterizado porque el transductor de señal es una guía de onda plana.

10. Dispositivo para el bioensayo de analitos mediante biosensores y/o quimiosensores, caracterizado porque comprende un cartucho de ensayo tal como se reclama en alguna de las reivindicaciones 1 a 9, al menos un sitio de acoplamiento para la colocación del cartucho de ensayo, al menos un medio para transportar los líquidos de muestra al cartucho de ensayo y al menos una unidad de regulación de la temperatura.

11. Dispositivo según la reivindicación 10, caracterizado porque la unidad de regulación de la temperatura presenta al menos un elemento termostatizable plano que se pone en contacto con el lado inferior del cartucho de ensayo.

12. Dispositivo según la reivindicación 11 , caracterizado porque el elemento termostatizable plano se termostatiza mediante un elemento de Peltier o Cartridge.

13. Dispositivo según una de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque el dispositivo presenta una unidad óptica que contiene al menos una fuente para la excitación del líquido de muestra en la cámara de detección, al menos una unidad de lectura para la detección de una señal en la cámara de detección y opcionalmente espejos, prismas y/o lentes.

14. Dispositivo según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el dispositivo presenta una unidad de control para el control automático del medio para transportar los líquidos de muestra y/o la unidad de regulación de la temperatura y/o la unidad óptica.

15. Un procedimiento para la operación de un dispositivo tal como se reclama en alguna de las reivindicaciones 10 a 14, el procedimiento estando caracterizado porque comprende las siguientes etapas: A. introducción de un líquido de muestra que contiene analitos en el cartucho de ensayo, B. transporte del líquido de muestra a la cámara de reactivos mediante el medio para transportar el líquido de muestra, C. humectación de una almohadilla de reactivos en la cámara de reactivos y liberación de los reactivos allí aplicados, humedeciéndose completamente la almohadilla de reactivos y controlándose la velocidad de humectación, D. preincubación opcional, controlándose el tiempo de preincubación, después E. transporte a la cámara de detección mediante el medio para transportar el líquido de muestra, rellenándose completamente la cámara de detección, F. reacción bioquímica eventualmente con los reactivos aplicados en la cámara de detección (incubación), que sirve para la determinación cuantitativa de uno o varios analitos, controlándose el tiempo de incubación, seguida de G. excitación y medida de los cambios de las propiedades espectrales y/o de las propiedades físicas del líquido de muestra en la cámara de detección, y H. cálculo y visualización de los valores de analitos con referencia a una curva de calibración.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la velocidad de la humectación asciende a 1 ms a 10 s.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 15 o 16, caracterizado porque se transporta un volumen definido con precisión de líquido de muestra.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque se controla la temperatura en la cámara de reactivos y en la cámara de detección durante el funcionamiento.

19. Uso del cartucho de ensayo tal como se reclama en alguna de las reivindicaciones 1 a 8, del dispositivo tal como se reclama en alguna de las reivindicaciones 9 a 13 y 7 o del procedimiento tal como se reclama en alguna de las reivindicaciones 14 a 17 en la analítica ambiental, el campo alimentario, el diagnóstico humano y veterinario y la protección de plantas para determinar cualitativa y/o cuantitativamente analitos.