DE102008053114B4

DE102008053114B4 - Pharmazeutischer Keratinschwamm

Info

Publication number: DE102008053114B4
Application number: DE200810053114
Authority: DE
Inventors: Stephan Dr. Reichl
Original assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Current assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Priority date: 2008-10-26
Filing date: 2008-10-26
Publication date: 2011-05-05
Anticipated expiration: 2028-10-27
Also published as: WO2010046413A2; DE102008053114A1; WO2010046413A3

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Keratinschwamms mit offenzelliger Porenstruktur mit den Schritten:
Solubilisierung von Haarkeratin unter reduzierenden Bedingungen in denaturierender, wässriger Lösung mit einem Gehalt an Reduktionsmittel,
Entfernen des Reduktionsmittels aus der wässrigen Lösung von Keratin zur Herstellung einer wässrigen Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel enthält,
partielles alkalisches Hydrolysieren eines Anteils der wässrigen Keratinlösung zur Herstellung einer partiell alkalisch hydrolysierten Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel enthält,
Mischen der wässrigen Keratinlösung mit dem partiell alkalisch hydrolysierten Anteil der Keratinlösung,
Zusetzen einer Polyhydroxyverbindung,
Trocknen der Mischung zur Herstellung einer porösen Struktur,
Erwärmen der getrockneten porösen Struktur auf eine Temperatur von mindestens 100°C.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Schwamm aus Keratin und dessen Verwendung für pharmazeutische Zwecke, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Verwendung des Keratinschwamms und zur Herstellung von Produkten für die medizinische Verwendung, beispielsweise zur Verwendung bei der Wundversorgung oder als Trägergerüst für neu zu bildendes Gewebe, z. B. für ein Implantat.
Der erfindungsgemäße Keratinschwamm ist in wässrigen Zusammensetzungen quellfähig und kann daher auch als Wundtamponade Verwendung finden. Weiterhin ist der erfindungsgemäße Keratinschwamm nicht zytotoxisch und kann über den gesamten Querschnitt von tierischen Zellen besiedelt werden, sodass sich der Keratinschwamm zur Implantation in den tierischen oder menschlichen Körper eignet, beispielsweise als Implantat zur Auffüllung von Defektstellen, optional mit immunkompatiblen Zellen, vorzugsweise mit autologen Zellen besiedelt.
Stand der Technik
Die WO 99/26570 A1 beschreibt offenzellige Schäume aus Keratin, beispielsweise durch Versprühen oder Gefriertrocknen einer Keratinlösung. Die Keratinlösung wird unter reduzierenden Bedingungen erzeugt, sodass Disulfidbrücken zu Thiolgruppen reduziert werden. Nach der Bildung eines Films oder Schaums aus der reduzierten Keratinlösung, die noch ein Reduktionsmittel enthält, wird nach Trocknung eine Oxidation des Keratins durchgeführt, was eine Vernetzung ergibt.
Tanaga et al. (Materials Science and Engineering C24, 441–446 (2004)) beschreiben die Erzeugung eines Films aus reduzierter Keratinlösung, die mit chemischen Vernetzungsmitteln versetzt ist. Die Keratinlösung wird nach Yamauchi et al. (Journal of Biomedical Materials Research 439–444 (1996)) bzw. Yamauchi et al. (Journal Biomaterials Science Polymer Vol 9, Nr. 3, 259–270 (1998)) durch Solubilisieren von Wolle unter reduzierenden Bedingungen hergestellt und wie von Yamauchi et al. vorbeschrieben, einschließlich des Reduktionsmittels getrocknet, beispielsweise durch Gefriertrocknen.
Reichl (5th World Meeting of Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology Genf, 27–30 März 2006) beschreibt die Beschichtung eines Trägers mit einer reduzierten Keratinlösung durch Ausfällung mit Trichloressigsäure.
Die WO 01/19305 A1 beschreibt die Herstellung von quellfähigem oxidiertem Keratin, in welchem Disulfidbrücken mit einem Peroxid behandelt wurden, um die Bildung von Disulfidbrücken im fertigen Gel zu verhindern.
Die EP 0 628 573 A1 beschreibt die Herstellung von Filmen und Fasern aus Keratin aus einer Keratinlösung, die in Gegenwart eines Reduktionsmittels hergestellt wird und anschließend in Gegenwart von Thioglycolsäure oxidiert wird, um ein gemischtes Disulfid, ein Carboxymethyldisulfid zu bilden. Das erhaltene Protein ist wasserlöslich.
Die EP 1 470 824 A1 beschreibt in einem Beispiel die Extraktion von Keratin aus Hautbiopsien und Hydrolyse von Haar in Gegenwart eines Reduktionsmittels, und anschließende Pelletierung, Resuspendierung des pelletierten Materials und dessen Dialyse zur Verwendung als Antigen.
Die US 2004/0210039 A1 beschreibt die Solubilisierung von Keratin, z. B. aus Federn, mit Sulfid unter alkalischen Bedingungen, wodurch reduzierte Cysteinreste alkyliert werden. Die Lösung kann zur Herstellung von Filmen verwendet werden.
Die DE 698 39 155 T2 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Keratinhydrogels durch Oxidation zumindest einiger Cysteinreste zu Cysteinsäuregruppen und anschließendes Reduzieren zu Cysteinresten, die anschließend wiederum zur Bildung von Disulfidgruppen oxidiert werden.
Die DE 29 40 220 A1 beschreibt die Herstellung eines wasserlöslichen Keratinhydrolysats durch Reduktion von Keratin mit Mercaptan und/oder Sulfid in wässriger alkalischer Zusammensetzung mit anschließender enzymatischer Hydrolyse. Dieses Hydrolysat soll reduzierte Mercaptogruppen enthalten und als Haarfixierer dienen.
Aufgabe der Erfindung
Gegenüber bekannten Keratinschwämmen ist es Aufgabe der Erfindung, einen alternativen Keratinschwamm und ein alternatives Verfahren zu dessen Herstellung bereitzustellen. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, einen für pharmazeutische Zwecke, d. h. für die medizinische Verwendung geeigneten Keratinschwamm bereitzustellen, der quellfähig ist, und z. B. als Absorber für Exudatwasser verwendet werden kann.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die vorgenannte Aufgabe durch Bereitstellung eines Keratinschwamms, der aus einer Keratinlösung hergestellt ist, die unter reduzierenden Bedingungen aus natürlichem Keratin, vorzugsweise menschlichem Haarkeratin hergestellt ist, und aus der reduzierende Verbindungen entfernt sind, beispielsweise durch Dialyse gegen ein wässriges Medium ohne reduzierende Inhaltsstoffe. Der erfindungsgemäße Keratinschwamm besteht vorzugsweise aus Keratin, das ohne chemische Derivatisierung in wässriger Lösung solubilisiert und anteilig alkalisch hydrolysiert ist, und ohne Anwesenheit von Reduktions- und/oder Oxidationsmittel aus wässriger Lösung in Gegenwart einer Polyhydroxyverbindung gefriergetrocknet und anschließend auf ca. 100–150°C an der Luft erwärmt wurde.
In bevorzugter Ausführungsform umfasst der Keratinschwamm eine Mischung einer ersten Keratinlösung, die unter reduzierenden Bedingungen aus natürlichem Keratin hergestellt ist, und aus der reduzierende Verbindungen, beispielsweise durch Dialyse gegen ein wässriges Medium ohne reduzierende Inhaltsstoffe bei neutralem bis leicht saurem pH-Wert entfernt wurden, und einem Anteil einer zweiten Keratinlösung, die ebenfalls vorzugsweise aus natürlichem Keratin durch Hydrolyse unter reduzierenden Bedingungen hergestellt ist, aus der Reduktionsmittel entfernt sind, beispielsweise durch Dialyse, die durch alkalische Behandlung teilweise hydrolysiert ist, vorzugsweise durch Dialyse der Keratinlösung gegen eine alkalische wässrige Zusammensetzung, gefolgt von anschließender Entfernung der alkalischen Zusammensetzung, beispielsweise durch Ultrafiltration, Waschen und/oder Dialyse, vorzugsweise gegen Wasser bei neutralem pH-Wert.
Vorzugsweise besteht der erfindungsgemäße Keratinschwamm aus reduzierter Keratin, das aus einer Lösung reduzierten Keratins ohne Anwesenheit von Reduktionsmitteln gebildet ist, mit anschließender Oxidation allein durch Kontakt mit Sauerstoff, beispielsweise in Mischung mit Stickstoff, z. B. Luft, wobei die Keratinlösung einen Anteil reduzierten Keratins, ebenfalls in Abwesenheit von Reduktionsmittel enthält, der teilweise hydrolysiert ist. Besonders bevorzugt besteht der erfindungsgemäße Keratinschwamm aus einem Gerüst aus der Mischung des Keratins mit teilweise hydrolysiertem Keratin, besonders bevorzugt mit einem Zusatz eines Weichmachers, der insbesondere ausgewählt ist unter Polyhydroxyverbindungen, insbesondere Glycerin und Propyplenglycol. Die der Gehalt an Polyhydroxyverbindung, vorzugsweise gemessen vor der Wärmebehandlung, beträgt insbesondere 0,5 bis 3 Gew.-% pro 15 bis 30 mg Keratin, gemessen als Gesamtprotein nach Bradford, vorzugsweise 1 bis 2 Gew.-% Polyhydroxyverbindung pro 20 mg Keratin, gemessen als Gesamtprotein nach Bradford.
Die erfindungsgemäßen Keratinschwämme können durch herkömmliche Verfahren zur Bildung einer porösen Struktur aus einer Lösung des Keratins hergestellt werden, vorzugsweise durch Gefriertrocknen einer wässrigen Lösung des Keratins, bevorzugt der Mischung des Keratins mit teilweise alkalisch hydrolysiertem Keratin.
Die erfindungsgemäßen Keratinschwämme zeichnen sich durch eine hohe Formstabilität für lange Zeit innerhalb des tierischen Körpers aus und sind im Wesentlichen nach Implantation in einen tierischen Körper biologisch nicht abbaubar.
Die erfindungsgemäßen Keratinschwämme sind in wässrigen Zusammensetzungen quellfähig, wobei die Quellfähigkeit mit zunehmendem Gehalt an alkalisch hydrolysiertem Keratin zunimmt, sodass die Quellfähigkeit durch den Anteil des alkalisch hydrolysierten Keratins am gesamten Keratin einstellbar ist.
Die erfindungsgemäßen Keratinschwämme werden durch ihr ganzes Volumen von Zellen besiedelt, die innerhalb der offenen Porenstruktur anhaften. Entsprechend eignen sich die erfindungsgemäßen Schwimme zur Verwendung als Gerüstsubstanz zur in vitro Kultivierung tierischer Zellen in dreidimensionaler Struktur und insbesondere zur Verwendung als Implantat zur Auffüllung von Defektstellen, beispielsweise von Gewebe, insbesondere von Weichgewebe des tierischen Körpers, einschließlich des Menschen.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren umfasst eine Härtung des Keratins, das in Wasser hydrolysiert ist, anteilig zusätzlich alkalisch hydrolysiert ist, und durch Gefriertrocknung aus wässriger Zusammensetzung, aus der reduzierende Mittel und/oder oxidierende Mittel entfernt und daher nicht enthalten sind, in Gegenwart einer Polyhydroxyverbindung durch Wärmebehandlung, beispielsweise bei 100°C bis 160°C, vorzugsweise bis 100 bis 110°C für 0,5 bis 1,5 h. Die Kombination der Abwesenheit reduzierender Mittel von der wässrigen Zusammensetzung solubilisierten Keratins mit der Anwesenheit einer Polyhydroxyverbindung und die Wärmebehandlung führen zu einem Keratinschwamm mit struktureller Stabilität, Elastizität, Wasseraufnahmefähigkeit und Beständigkeit gegen Abbau im tierischen Körper. Optional kann der Keratinschwamm einer Sterilisation durch γ-Bestrahlung unterworfen werden. Die erfindungsgemäßen Keratinschwämme weisen keine für die Zellkultur schädlichen Stoffe auf, beispielsweise keine zytotoxischen Stoffe und keine Viren. So zeigten Tests zur Kultivierung von tierischen Zellen auf dem Schwamm keine Kontamination der Schwämme mit zellschädlichen Agenzien und die Abwesenheit von Viren. Daher ermöglicht das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren, beispielsweise ausgehend von menschlichen Haaren bei der Herstellung von Keratinlösung, die Herstellung einer porösen Implantatstruktur, die frei von Viren und frei von Zytotoxinen ist.
Die besondere Eignung der erfindungsgemäßen Keratinschwämme zur Zellkultur und zur Verwendung bei der Herstellung von Implantaten für medizinische Zwecke, insbesondere als Gerüstsubstanz zur Ausfüllung von Defektstellen von Weichgewebe, wird darauf zurückgeführt, dass erfindungsgemäße Keratinschwämme Partikel von Keratin etwa gleicher Größe aufweisen, z. B. monomodal um etwa 50–250 nm, die eine Besiedelung durch Zellen fördern.
In Vergleichsversuchen lässt sich zeigen, dass die erfindungsgemäßen Keratinschwämme eine hohe Strukturstabilität und eine bessere Beständigkeit gegen den Abbau nach Implantation in den tierischen Körper haben und/oder schneller und gleichmäßiger von tierischen Zellen besiedelt werden, sodass sie bei der Verwendung zur Herstellung eines Implantats ein Implantat ergeben, das schneller zur Ausbildung natürlichen Gewebes innerhalb der Implantatstruktur führt.
So zeigen z. B. Keratinschwämme, die ohne Polyhydroxyverbindung unter ansonsten gleichen Bedingungen hergestellt wurden, eine hohe Brüchigkeit, bzw. niedrige Strukturstabilität, und eine wesentlich geringere Wasserfestigkeit als erfindungsgemäße Keratinschwämme.
Zum Vergleich können beispielsweise auch Keratinschwämme herangezogen werden, die unter ansonsten gleichen Bedingungen aus einer Keratinlösung hergestellt sind, die jedoch noch Reduktionsmittel enthält, oder ein Oxidationsmittel, beispielsweise ein Peroxid.
Nachfolgend wird die bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung von Keratinschwämmen aus Keratinlösung beschrieben, die zur Ausbildung von Nanopartikeln aus Keratin in etwa monomodaler Größenverteilung führt. Die Keratinlösung, die zur Herstellung des Keratinschwamms durch Entzug des Lösungsmittels, insbesondere Wasser, eingesetzt wird, enthält keine reduzierenden Verbindungen, keine oxidierenden Verbindungen und hat vorzugsweise einen etwa neutralen pH. Besonders bevorzugt ist die zur Herstellung von Keratinschwämmen eingesetzte Keratinlösung eine wässrige Zusammensetzung, die reduziertes Keratin, und davon einen Anteil alkalisch hydrolysierten reduzierten Keratins in Wasser aufweist.
Vorzugsweise werden beim erfindungsgemäßen Verfahren eine Keratinlösung, d. h. die Lösung aus reduziertem Keratin oder eine Mischung einer Lösung aus reduziertem Keratin mit reduziertem Keratin, das teilweise alkalisch hydrolysiert ist, gegen reines Wasser dialysiert, vorzugsweise bei pH 6,5–7,5.
Besonders bevorzugt werden Aggregate aus der wässrigen Keratinlösung entfernt, z. B. durch Ultrazentrifugation bei 10.000 × g, optional durch Filtration.
Bevorzugt ist das zur Herstellung der Lösung eingesetzte Keratin α-Keratin; insbesondere bevorzugt wird die Keratinlösung aus Haaren hergestellt, beispielsweise menschlichen Haaren. Zur Solubilisierung von Keratin aus Haaren wird vorzugsweise eine wässrige Zusammensetzung einsetzt, die in wässriger Lösung aus Thioharnstoff, Harnstoff und Mercaptoethanol besteht, wobei das Mercaptoethanol durch eine andere reduzierende Verbindung ersetzt sein kann.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Keratinschwämme liegt darin, dass diese zumindest teilweise optisch transparent sind, und eine einfache optische Kontrolle der Besiedlung mit Zellen, insbesondere nach Anfärbung der Zellen erlauben, z. B. per Mikroskopie in den oberflächennahen Bereichen des Schwamms.
Die Analyse der Größenverteilung von solubilisiertem Keratin in den erfindungsgemäß für die Herstellung der Keratinschwämme eingesetzten Lösungen, die auch als nanopartikuläre Suspension von Keratin, wässrige Zusammensetzung von Keratin oder solubilisiertes Keratin bezeichnet werden können zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Lösen bzw. Solubilisieren des Keratins aus Haaren eine sehr enge, monomodale Größenverteilung um etwa 50 bis 250 nm erzeugt. Mittels Photonenkorrelationsspektroskopie mit dynamischer Laserlichtstreuung kann ein Polydispersitätsindex analysiert werden, der signifikant kleiner als der für Keratinlösungen nach dem Stand der Technik ist. Entsprechend werden aus der erfindungsgemäß verwendeten Keratinlösung zur Herstellung der von Keratinsschwämmen Keratinschwämme erzeugt, die eine monomodale Größenverteilung von Keratinpartikeln aufweisen, deren Hauptwert im Bereich von 20 bis 5.000 nm, vorzugsweise 100 bis 1.000 nm, bevorzugter 100 bis 200 nm liegt.
Weiterhin hat sich beim Vergleich der erfindungsgemäßen Keratinschwämme mit anderen porösen keratinhaltigen Materialien gezeigt, dass zumindest für einige Zelltypen und immortalisierte Zelllinien so wie Primärzellen eine erhöhte Aussaateffizienz und/oder ein besseres Wachstum auf den erfindungsgemäßen Keratinschwämmen erhalten wird. Gegenwärtig wird angenommen, dass die signifikant besseren Kultivierungsergebnisse auf die besondere Struktur der Keratinschwämme mit ihrer nanopartikulären Struktur zurückgehen.
Es hat sich herausgestellt, dass ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellter Keratinschwamm, der aus einer Mischung einer wässrigen Keratinlösung, die durch Hydrolyse von Haaren in denaturierender wässriger Lösung mit einem Gehalt an Reduktionsmittel, das zur Hydrierung von Disulfidbrücken des Keratins dient, anschließender Entfernung des Reduktionsmittels aus der Lösung, wobei die Lösung kein Oxidationsmittel enthält, hergestellt ist, mit einem Anteil der so hergestellten wässrigen Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel und kein Oxidationsmittel enthält, der partiell alkalisch hydrolysiert ist, durch Trocknen der Mischung mit einem Gehalt an Polyhydroxyverbindung, vorzugsweise zu 1 bis 3 Gew.-% pro 20 mg Keratin, gemessen als Gesamtprotein nach Bradford, zu einer porösen Struktur umgesetzt ist, und anschließend auf ca. 100 bis 150°C, bevorzugt 100 bis 110°C, für mindestens 1 h, bevorzugt 2,5 h ohne Zusatz weiterer Verbindungen an Luft erwärmt ist, vorteilhafte Eigenschaften aufweist. Die vorteilhaften Eigenschaften des so erhaltenen Keratinschwamms zeigen sich insbesondere bei Verwendung des Herstellungsverfahrens für medizinische Produkte, beispielsweise für Implantate. Zu den vorteilhaften Eigenschaften zählen neben der Stabilität gegen einen Abbau nach Implantation im tierischen Körper, d. h. der hohen Widerstandsfähigkeit gegen Resorption, die Elastizitäts- und Stabilitätseigenschaften und die gute Besiedelung durch Zellen, die die Keratinschwämme zur Verwendung als Implantat, z. B. zum Auffüllen von Defektstellen im tierischen Körper, einschließlich des Menschen, geeignet machen. Zu den vorteilhaften Eigenschaften zählen neben der Elastizität und der strukturellen Beständigkeit im Körper insbesondere die Quellfähigkeit, z. B. zur Aufnahme von Wundexudat.
Bei elektronenmikroskopischer Analyse können Nanostrukturen im erfindungsgemäßen Keratinschwamm sichtbar gemacht werden, die vorliegend auch als Nanopartikel bezeichnet werden. Es wird angenommen, dass die mechanischen Eigenschaften und auch die Eignung des erfindungsgemäßen Keratinschwamms zur Besiedelung durch tierische Zellen durch diese nanopartikuläre Struktur begründet sind. Der Keratinschwamm enthält bereits nach der Trocknung und vor der Wärmebehandlung im Wesentlichen keine freien Thiol-Gruppen. Es wird angenommen, dass Thiolgruppen bereits im Dialysat aufgrund der Abwesenheit von Reduktionsmittel vollständig oxidiert sind.
Der erfindungsgemäße Keratinschwamm weist daher eine nanopartikuläre Mikrostruktur mit im Wesentlichen monomodaler Größenverteilung der Nanopartikel auf, und enthält keine dem Keratin zugesetzten Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel. Das Keratin ist durch Trocknung einer wässrigen Keratinlösung hergestellt, die keine zugesetzten Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel enthält und in wässriger Lösung solubilisiertes Keratin, insbesondere aus Haaren, enthält, wobei ein Anteil des solubilisierten Keratins teilweise alkalisch hydrolysiert ist. Besonders bevorzugt ist der Keratinschwamm aus Keratinlösung hergestellt, die aus solubilisiertem Keratin in Wasser besteht, d. h. ohne Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel. Erfindungsgemäß enthält der erfindungsgemäße Keratinschwamm einen Weichmacher, insbesondere ausgewählt aus Glycerin und Propylenglycol enthalten, der z. B. der wässrigen Keratinlösung vor deren Gefriertrocknung und vor der anschließenden Wärmebehandlung zugesetzt ist.
Dabei hat sich gezeigt, dass erfindungsgemäße Keratinschwämme auch im gequollenen Zustand, d. h. in Gegenwart wässriger Zusammensetzungen, eine strukturelle Stabilität beibehalten, so dass z. B. aufgenommene Flüssigkeit auch unter Druckbelastung im Wesentlichen nicht freigesetzt wird. So geben gequollene Schwämme unter Druckbelastung einen geringen Teil aufgenommener Flüssigkeit ab, z. B. den nur kapillar gebundenen Anteil der Flüssigkeit, und behalten den überwiegenden Anteil der aufgenommenen Flüssigkeit. Im gequollenen Zustand sind erfindungsgemäße Keratinschwämme z. B. fest und gelartig, so dass gebundene Flüssigkeit auch bei Druckbelastung im Wesentlichen nicht freigesetzt wird. Das elastische Rückstellvermögen bleibt im Wesentlichen auch im gequollenen Zustand erhalten. Mit zunehmendem Anteil alkalisch hydrolysierten Keratins nimmt das elastische Rückstellvermögen ab.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren beschrieben, in denen
1 das Messergebnis der Photonenkorrelationsspektroskopie der Keratinlösung nach Vergleichsbeispiel 1 zeigt (Y-Achse zeigt Intensität in Prozent),
2 das Messergebnis der Photonenkorrelationsspektroskopie der Keratinlösung nach Beispiel 1 zeigt (Y-Achse zeigt Intensität in Prozent),
3 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinschwamms mit ca. 10% hydrolysierten Keratins zeigt,
4 eine vergrößerte rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinschwamms von 3 zeigt,
5 eine vergrößerte rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinschwamms von 3 zeigt,
6 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinschwamms mit ca. 20% hydrolysierten Keratins zeigt und
7 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinschwamms mit ca. 30% hydrolysierten Keratins zeigt.
Vergleichsbeispiel: Herstellung eines Schwamms aus einer Keratinlösung mit einem Gehalt an reduzierenden Verbindungen
Als Vergleich wurde ein Keratinschwamm aus einer Keratinlösung durch Gefriertrocknen hergestellt, die entsprechend Yamauchi et al. (J. Biomater. Sci. Polym. Ed 9: 259–270 (1998)) erzeugt wurde, jedoch ohne einen Gehalt an SDS in der Keratinlösung.
Im einzelnen wurde menschliches Haar (20 g) nach Waschen in 0,5% SDS-Lösung, Trocknen und Entfetten Übernacht in n-Hexan nach Entfernen des Hexans in 360 mL 7 M Harnstoff mit 32 mL 2-Mercaptoethanol in einer geschlossenen Glasflasche bei 50°C für 24 h geschüttelt und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde dreimal gegen 12 L destilliertes Wasser mit 0,2 Gew.-% 2-Mercaptoethanol über Nacht dialysiert. Es wurde eine trübe Lösung von ca. 480 mL erhalten.
Die Analyse der Partikelgrößenverteilung mit Photonenkorrelationsspektroskopie ist in 1 gezeigt und ergab eine multimodale Größenverteilung mit einem Z-Average-Wert um eine Partikelgröße von ca. 125 nm und auf Grund einer stark multimodalen Verteilung einen Polydispersitätsindex von 0,41. Die Verteilungskurve zeigt drei Spitzenwerte bei ca. 115 nm, 700 nm und 4770 nm.
Die Lösung wurde entweder ummittelbar zur Herstellung von Schwämmen eingesetzt, oder nach Entfernen von Aggregaten durch Ultrazentrifugation. Die Lösung wurde bei –20°C eingefroren und anschließend gefriergetrocknet.
Die Analyse zeigte eine geringere Aussaateffizienz bzw. ein geringeres Anwachsen von tierischen Zellen in Kultur, eine geringere mechanische Strukturfestigkeit des trockenen und des in Wasser hydratisierten Schwamms, sowie eine geringe Quellfähigkeit in Verbindung mit einer geringen Volumenzunahme, z. B. bei der Aufnahme von Wundexudat.
Beispiel: Herstellung von Keratinschwämmen
Zur Herstellung einer erfindungsgemäß einzusetzenden wässrigen Keratinlösung wurden 20 g menschlicher Haare mit 0,5% SDS-Lösung gewaschen, getrocknet und durch Inkubation mit n-Hexan über Nacht entfettet. Nach Entfernen des Hexans wurden 400 mL einer 25 mM Tris-Lösung (pH 8,5) 2 M Thioharnstoff, 5 M Harnstoff und 5% Mercaptoethanol in Wasser zugeben. Nach Verschließen des Gefäßes mit Parafilm wurde für 72 h bei 50°C gerührt.
Ungelöste Bestandteile wurden durch Zentrifugieren bei ca. 4.500 × g (Laborzentrifuge), 10 min, 5.000 upm) entfernt. Der Überstand wurde zusätzlich durch einen Filter mit einer Porengröße von 2,5 μm filtriert. Das Filtrat konnte ohne wesentliche Veränderungen der Eigenschaften bei 4°C aufbewahrt oder in Aliquots eingefroren werden.
Zur Entfernung von Reduktionsmitteln wurde das Filtrat gegen destilliertes Wasser dialysiert, z. B. mit einer Spectrapore 1 Membran (Ausschlussgrenze 6.000–8.000 Da), üblicherweise je 100 mL Filtrat gegen 5 L Wasser über 72 h mit 6-fachem Auswechseln des Wassers. Das Dialysat wurde in einer Ultrazentrifuge bei 15.000 upm für 10 min zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen. Der Proteingehalt dieser Keratinlösung betrug etwa 20 mg/mL (Bradford). Das Zentrifugat kann unmittelbar zur Herstellung von Keratinschwämmen eingesetzt werden, vorzugsweise durch Einfrieren der Lösung und anschließendes Gefriertrocknen.
Für die bevorzugte Ausführungsform wurde ein Teil der vorstehend beschriebenen Keratinlösung alkalisch hydrolysiert, beispielsweise durch Dialyse gegen 0,1 M Natronlauge bei 4°C. Das erhaltene alkalische Dialysat wurde durch Ultrafiltration (Ausschlussgrenze 5000 Da, Filter erhältlich unter der Bezeichnung Vivaspin) gereinigt und mit 0,1 mM Natronlauge gewaschen, der verbleibende pH betrug 10. Der Proteingehalt wurde nach Bradford zu 25 bis 30 mg/mL bestimmt.
Zur Herstellung eines Schwamms wurden die in der nachfolgenden Tabelle dargestellten Mischungen der Keratinlösung mit der alkalisch hydrolysierten Keratinlösung hergestellt und nach Einfrieren gefriergetrocknet. Als Weichmacher waren der Keratinlösung jeweils 1 Gew.-% Glycerin pro mL Keratinlösung zugegeben. Tabelle: Quellvermögen und Wasseraufnahme

Anteil alkalisch hydrolysierten Keratins (Vol.-%) Volumenzunahme (Faktor) Gewichtszunahme (Faktor)

0 1 ca. 1,3

25 2 2,6

50 2,3 3,3

75 2,75 4,9

100 3,25 7,1
Die Gewichtszunahme wurde als Abtropfgewicht nach Eintauchen in Wasser gemessen. Für die Schwammbildung wurde etwa 1 mL der Mischung von Keratinlösungen in zylindrischen Röhrchen bei –20°C eingefroren, gefriergetrocknet und anschließend bei 110°C für ca. 2,5 Stunden erwärmt.
Weiter in der Tabelle angegeben sind die Werte für die Volumenzunahme und die Gewichtszunahme der Schwämme bei Lagern in Wasser (20°C, 30 min) Die Ergebnisse zeigen, dass mit höheren Anteil alkalisch hydrolysierten Keratins das Quellvermögen zunimmt.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Keratinschwämme zeigen eine gleichmäßige offenporige Struktur. Im Einzelnen zeigt 3 darauf Kantenlänge der Abbildung 1.800 μm) einen Schwamm, der 10 Vol.-% alkalisch hydrolysierte Keratinlösung enthält,
4 einen Ausschnitt aus 3, Kantenlänge der Abbildung 450 μm, und 5 einen Ausschnitt der 3 mit einer Kantenlänge der Abbildung von 9 μm.
Die 3, 4 und 5 zeigen, dass die Struktur des Schwamms sehr gleichmäßig ist, und die Porenwände in sich glatt und geschlossen sind, wobei in 5 die nanopartikuläre Oberflächenstruktur deutlich wird.
6 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Schwamms, der aus einer Mischung von Keratinlösungen mit einem Anteil von 20 Vol.-% alkalisch hydrolysierter Keratinlösung hergestellt wurde, und 7 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Schwamms, der aus einer Mischung mit 30 Vol.-% alkalisch hydrolysierter Keratinlösung hergestellt wurde. Die Abbildungen von 6 und 7 haben jeweils eine Kantenlänge von 1.800 μm.
Im Vergleich mit 3 zeigen die 6 und 7, dass ein höherer Anteil alkalisch hydrolysierter Keratinlösung größere Poren im Keratinschwamm erzeugt, wobei jedoch die in sich geschlossene Oberfläche der Porenwände erhalten bleibt.
Die Kultivierung von Zellen kann in vitro mit dem erfindungsgemäßen Schwamm durch Inkubation des Schwamms in Zellkulturmedium unter Zellkulturbedingungen mit zugesetzten tierischen Zellen erfolgen. Vorliegend wurden ca. 100.000 humane stromale Keratozyten mit einem erfindungsgemäß hergestellten Schwamm (10 Vol.-% alkalisch hydrolysiertes Keratin) für drei Tage in Standardmedium inkubiert. Zur Kontrolle wurde ein Keratinschwamm gleich behandelt, jedoch ohne dass Zellen zugesetzt wurden.
Im Anschluss an die Kultivierung wurde eine Lebendfärbung mit MTT (gelbes Tetrazoliumsalz) durchgeführt, das durch die mitrochondriale Aktivität lebensfähiger Zellen zu blauem Formazan umgesetzt wird.
8 zeigt eine photografische Aufnahme, nämlich links im Bild die Kontrolle ohne Zellen, und rechts im Bild den mit Zellen inkubierten Schwamm nach Umsetzung von MTT. Es wird deutlich, dass die Lebendfärbung durch das gesamte Volumen des erfindungsgemäßen Schwamms erfolgt, was eine vollständige Besiedlung des Keratinschwamms durch sein gesamtes Volumen anzeigt.
Entsprechend wird der erfindungsgemäße Schwamm auch bei Verwendung als Implantat durch sein Gesamtvolumen von Zellen besiedelt, vorzugsweise schneller und/oder gleichmäßiger als Schwämme, die aus Keratinlösung hergestellt wurden, die ein Reduktions- oder ein Oxidationsmittel enthielt, oder die ohne Erwärmung der getrockneten Struktur hergestellt wurden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Keratinschwamms mit offenzelliger Porenstruktur mit den Schritten: Solubilisierung von Haarkeratin unter reduzierenden Bedingungen in denaturierender, wässriger Lösung mit einem Gehalt an Reduktionsmittel, Entfernen des Reduktionsmittels aus der wässrigen Lösung von Keratin zur Herstellung einer wässrigen Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel enthält, partielles alkalisches Hydrolysieren eines Anteils der wässrigen Keratinlösung zur Herstellung einer partiell alkalisch hydrolysierten Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel enthält, Mischen der wässrigen Keratinlösung mit dem partiell alkalisch hydrolysierten Anteil der Keratinlösung, Zusetzen einer Polyhydroxyverbindung, Trocknen der Mischung zur Herstellung einer porösen Struktur, Erwärmen der getrockneten porösen Struktur auf eine Temperatur von mindestens 100°C.
Verfahren zur Herstellung eines Keratinschwamms mit offenzelliger Porenstruktur mit den Schritten: Solubilisierung von Haarkeratin unter reduzierenden Bedingungen in denaturierender, wässriger Lösung mit einem Gehalt an Reduktionsmittel, Entfernen des Reduktionsmittels aus der wässrigen Lösung von Keratin durch Dialyse gegen wässriges Medium ohne reduzierende Inhaltsstoffe bei neutralem bis leicht saurem pH-Wert zur Herstellung einer ersten wässrigen Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel und/oder Oxidationsmittel enthält, Herstellen einer zweiten Keratinlösung, die durch alkalische Hydrolyse teilweise hydrolysiert ist, unter reduzierenden Bedingungen in denaturierender, wässriger Lösung mit einem Gehalt an Reduktionsmittel und Entfernen der Reduktionsmittel durch Dialyse der Keratinlösung gegen eine alkalische wässrige Zusammensetzung, gefolgt von anschließender Entfernung der alkalischen Zusammensetzung, Mischen der ersten Keratinlösung mit einem Anteil der zweiten Keratinlösung, Zusetzen einer Polyhydroxyverbindung, Trocknen der Mischung zur Herstellung einer porösen Struktur, Erwärmen der getrockneten porösen Struktur auf eine Temperatur von mindestens 100°C.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Keratinlösung aus solubilisiertem Keratin und Wasser besteht.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trocknen Gefriertrocknen ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Aggregate aus der Keratinlösung abgetrennt werden.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyhydroxyverbindung Glycerin, Propylenglycol oder eine Mischung dieser ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyhydroxyverbindung zu 0,5 bis 3 Gew.-% pro 20 mg Keratin, gemessen als Gesamtprotein nach Bradford, zugesetzt ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung eines medizinischen Implantats.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil partiell alkalisch hydrolysierter Keratinlösung an der Mischung mit wässriger Keratinlösung 10 bis 100% beträgt.
Keratinschwamm zur Verwendung als Implantat, kennzeichnet durch eine nanopartikuläre Struktur der Porenzellwände mit monomodaler Größenverteilung von Keratinpartikeln, wobei die Porenzellwände aus einer Mischung aus solubilisierten Keratin natürlichen Ursprungs und ohne Anwesenheit eines Reduktionsmittels und/oder eines Oxidationsmittels und einem Anteil alkalisch hydrolysierten reduzierten Keratins natürlichen Ursprungs und ohne Anwesenheit eines Reduktionsmittels und/oder eines Oxidationsmittels in Mischung mit einer Polyhydroxyverbindung besteht.
Keratinschwamm nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Keratinschwamm erhältlich ist durch Hydrolyse von Haar in denaturierender wässriger Lösung mit einem Gehalt an Reduktionsmittel, Entfernen des Reduktionsmittels aus der wässrigen Lösung von Keratin zur Herstellung einer wässrigen Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel enthält, partielles alkalisches Hydrolysieren eines Anteils der wässrigen Keratinlösung zur Herstellung einer partiell alkalisch hydrolysierten Keratinlösung, die kein Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel enthält, Mischen der wässrigen Keratinlösung mit dem partiell alkalisch hydrolysierten Anteil der Keratinlösung, Zusetzen einer Polyhydroxyverbindung, Trocknen der Mischung zur Herstellung einer porösen Struktur und Erwärmen der getrockneten porösen Struktur auf eine Temperatur von mindestens 100°C.
Keratinschwamm nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Keratinschwamm erhältlich ist durch Mischung einer ersten Keratinlösung, die unter reduzierenden Bedingungen aus natürlichem Keratin hergestellt ist, aus der reduzierende Bedingungen durch Dialyse gegen ein wässriges Medium ohne reduzierende Inhaltsstoffe bei neutralem bis leicht saurem pH-Wert entfernt sind und einem Anteil einer zweiten Keratinlösung, die durch alkalische Behandlung teilweise hydrolysiert ist und die aus natürlichem Keratin durch Hydrolyse unter reduzierenden Bedingungen hergestellt ist und aus der Reduktionsmittel durch Dialyse gegen eine alkalische wässrige Zusammensetzung entfernt sind, gefolgt von anschließender Entfernung der alkalischen Zusammensetzung, Zusetzen einer Polyhydroxyverbindung, Trocknen der Mischung zur Herstellung einer porösen Struktur und Erwärmen der getrockneten porösen Struktur auf eine Temperatur von mindestens 100°C.
Keratinschwamm nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyhydroxyverbindung Glycerin, Propylenglycol oder eine Mischung dieser ist.
Keratinschwamm nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyhydroxyverbindung zu 0,5 bis 3 Gew.-% pro 20 mg Keratin, gemessen als Gesamtprotein nach Bradford, zugesetzt ist.