DE60115271T2

DE60115271T2 - Verfahren zur herstellung von seidenfibroinvliesstoffen

Info

Publication number: DE60115271T2
Application number: DE60115271T
Authority: DE
Inventors: Ubaldo Armato; Ilaria Dal Pra; Kemal Kesenci; Claudio Migliaresi; Antonella Motta
Original assignee: CONSORZIO PER GLI STUDI UNIVER; CONSORZIO PER GLI STUDI UNIVERISTARI
Current assignee: CONSORZIO PER GLI STUDI UNIVER; CONSORZIO PER GLI STUDI UNIVERISTARI
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2021-09-29
Also published as: ATE310840T1; AU2001295891A1; ES2254500T3; DE60115271D1; IT1316885B1; EP1327014A1; WO2002029141A1; ITVR20000096A1; ITVR20000096A0; US7285637B2; EP1327014B1; US20040097709A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von ungewebten Seidenfibroinstoffen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von ungewebten Seidenfibroinstoffen, welche Strukturen zur Verwendung als implantierbare Biomaterialien, Zellkultur-Trägergerüste für Anwendungen in der Gewebezüchtung, Zellträger und sogar biologische Fluidfiltersysteme und Proteinadsorption ausbilden.
STAND DER TECHNIK
Die den Anwendungen in der Gewebezüchtung zu Grunde liegende Lehre besteht im Wesentlichen darin, eine natürliche oder synthetische Matrix mit Zellen eines bestimmten Ursprungsgewebes derart zu kombinieren, dass die Zellen in einem Labor gezüchtet und dann in einen menschlichen Körper transplantiert werden können.
Ferner können durch eine Verwendung von Implantatmaterialien, welche mit Zellen positiv wechselwirken können, bestimmte Geweberegenerationsprozesse eingeleitet und die Neubildung ganzer Gewebestrukturen erreicht werden. In vielen Fällen werden solche regenerierten Gewebe ihre normalen Funktionen ausführen können, welche diese letztendlich infolge einer zuvor erlittenen Schädigung verloren haben.
Seidenfibroin ist ein Biomaterial, welches in der Chirurgie als Implantatmaterial sowie für Anwendungen in der Gewebezüchtung verwendet werden kann. In diesem Zusammenhang soll bemerkt werden, dass Seidenfibroin sehr gute Eigenschaften hat, wie z. B. eine hohe Festigkeit gekoppelt mit Flexibili tät, Blutkompatibilität, Wasserpermeabilität und Sauerstoffpermeabilität, weswegen Seidenfibroin, sowohl in Form ungewebter Membranen und Fasern als auch in Form gewebter Membranen und Fasern, ein herausragender Kandidat für biomedizinische Anwendungen ist.
Seidenfibroin hat einen Anteil von 75 Gew.% bis 80 Gew.% von Rohseide. Der Seidengehalt des Proteins Sericin, welches die beiden Fibroinfilamentarten umgibt, variiert in Abhängigkeit der Art, Hierkunft und Kulturbedingungen der Rohseide zwischen 20 Gew.% und 25 Gew.%.
Seidenfibroin ist ein faserförmiges Protein, dessen hierarchische Struktur aus Fibrillen und Mikrofibrillen besteht, bei welchen die Fasern in einer hochorientierten kristallinen Form angeordnet sind.
Seidenfibroin löst sich in einer gesättigten wässrigen Lösung anorganischer Salze leicht auf.
Durch Entsalzen einer solchen Lösung mittels Dialyse könnte eine wässrige Seidenfibroinlösung erhalten werden.
Wegen der Alpha-helikalen Struktur von Fibroin sind diese Lösungen nicht stabil und die Struktur der mit diesen Lösungen erhaltenen regenerierten Membran, kann leicht durch polare Lösungsmittel, Altern und physikalische Einflüsse (Scherung, Vibration, Mischen usw.) verändert werden.
Zur Gewinnung von Seidenfibroin kann Seide in Form von Kokons, Seidentextilien und Abfallseide verwendet werden.
Das Rohseidenfilament ist auf Grund einer vorhandenen externen Sericinschicht in Ameisensäure nicht löslich.
Zur Beseitigung der Sericinschicht muss Seide zuerst degummiert werden.
Unter dem Begriff "Degummieren" wird ein teilweises oder vollständiges Entfernen des Sericins, welches die beiden Fibroinfilamentarten bedeckt, verstanden.
Die herkömmlichen zum Degummieren verwendeten Mittel sind hauptsächlich alkalifreie Seifen.
Gemäß einem nach dem Stand der Technik bekannten Degummierverfahren wird Seide je nach Qualität und Art des Stoffs bzw. Gewebes bei 95°C bis 98°C für 2 bis 4 Stunden in einem Seifenbad behandelt.
Die Herstellung von Seidenfibroinlösungen ist im Stand der Technik wohl bekannt; beispielsweise erwähnt die US-A-976977 bereits die Möglichkeit, Fibroin in Ameisensäure zu lösen.
Ferner beschreibt die EP-A-00488687 Polypeptidfasern, faserspinnbare Lösungen und ein Verfahren zur Ausbildung von Polypeptidfasern sowie von Polypeptidfasern aus Spinnlösungen, welche ein Polypeptid und ein Lösungsmittel enthalten, welches aus der Gruppe umfassend Hexafluorisopropanol, und ein Gemisch aus Ameisensäure und zumindest einem Lithiumhalogenid ausgewählt ist.
Die DE-A-19841649 beschreibt auch ein Verfahren zum Herstellen einer konzentrierten Lösung faserartiger Proteine, insbesondere Fibroin des Seidenwurms Bombix Mori, in N-methylmorpholin-N-Oxid, welche weniger als 1,5 mol Wasser enthalten, sowie deren Verarbeitung zur Produktion von mono- und polysträngigen Filamenten, Stapelfasern, Mikrofasern, Stoffen, Folien, Schichten, Membranen, Beschichtungen, röh renförmigen Folien oder anderen Ausgestaltungsformen mittels Spinnen, Formen, Blasen und anderen Verarbeitungsverfahren.
Es ist bereits bekannt, Seidenfibroin zu verwenden als Zellkulturmatrix (siehe z. B. italienische Patentanmeldung Nr. VR99A000082), für eine Verbandsmembran für Brandwunden (N. Minoura, M. Tsukada, M. Nagura, "Physicochemical properties of silk fibroin membrane as a biomaterial" Biomaterials, 11, 430-434, 1990), als Enzym-immobilisierendes Material (M. Demura, T. Asakura, T. Kuroo, "Immobilization of biocatalyst with Bombix mori silk fibroin by several kinds of physical treatment and its application to glucose sensors", Biosensors, 361-372,1989) und für eine orale Dosierform (T. Hanawa, A. Wanabe, T. Touchiya, R. Ikoma, M. Hidika, M. Sugihara, "New oral dogase form for edlerly patients: Preparation and characterization of silk fibroin gel", Chem. Pharm. Bull. 43, 284-288, 1995).
Jedoch sind Seidenfibroinmembranen sehr brüchig und deren Herstellung ist schwierig und zeitraubend.
Bei Verwendung von Textilverfahren wäre es theoretisch möglich, zum Weben ausschließlich degummierte Seidenfibroinfasern zu verwenden, um einen flexiblen Stoff zu erhalten.
Die Herstellung dreidimensionaler Strukturen zeigt sich jedoch als außergewöhnlich schwierig, und die Anpassungsfähigkeit eines solchermaßen erhaltenen Gewebes wäre im Hinblick auf speziell erforderliche mechanische Eigenschaften, Struktur sowie die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit anderen Zellen für die unterschiedlichen Anwendungserfordernisse gänzlich unangemessen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen von ungewebten Seidenfaserstoffen bereitzustellen, welche aus einem Netzwerk bzw. Geflecht aus Fibroinfasern ausgebildet sind, um ein hochflexibles Material zu erhalten, bei welchem gleichzeitig die dargelegten vorteilhaften biologischen Funktionen von Seidenfibroin unverändert beibehalten sind.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Hauptanspruchs gelöst.
Die unabhängigen Ansprüche beschreiben besonders vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ferner beschreiben die Ansprüche 13 und 14 einen dreidimensionalen Seidenfibroinstoff.
Des Weiteren beschreiben die Ansprüche 15 und 16 besonders vorteilhafte Verwendungen eines dreidimensionalen Seidenfibroinstoffs.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst das anfängliche Degummieren von Seidenfibroin unter Verwendung einer auf einer NaHCO₃-Lösung basierenden Behandlung oder anderer nach dem Stand der Technik bekannter und in der Fachliteratur beschriebener Degummierverfahren.
Erfindungsgemäß wird die degummierte Seide dann einer Behandlung unterworfen, bei welcher die Disulfidbindungen zwischen schweren (350 kDa) und leichten (27 kDa) Ketten des Seidenfibroins aufgebrochen werden.
Bei einer solchen Behandlung wird das Seidenfibroin vorzugsweise teilweise in einer Ameisensäurelösung gelöst.
Danach wird die sich ergebende Lösung homogenisiert und getrocknet, und es ergibt sich ein ungewebter Stoff mit den gewünschten Eigenschaften.
Schließlich wird der Stoff mehrmals gewaschen, um mögliche Reste bzw. Rückstände vorhergehender Behandlungen zu entfernen, und bis zur Verwendung in einem feuchten Zustand gehalten.
Nach einer Ausgestaltung der Erfindung enthält die bei dem Verfahren verwendete Ameisensäurelösung eine kleine Menge einer Mischung von Salzen, welche aus der Gruppe umfassend Kalziumchlorid, Zinkchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumbromid, Lithiumthiocyanat, Magnesiumchlorid, Kupfernitrat und Natriumchlorid ausgewählt sind.
Solche Salzzusätze können durch Waschen mit doppelt destilliertem Wasser entfernt werden.
Die erfindungsgemäßen ungewebten Seidenfibroinstoffe ermöglichen nachweislich die in vitro Co-Kultur von normalen adulten humanen Keratinozyten und Fibroblasten (nebst anderer humaner Zelltypen) und bilden daher für in vivo Tests geeignete dermo-epidermische Äquivalente.
Ferner wurden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweislich biofunktionale Fragmente gebildet, welche als spezielle, die Anhaftung und das Wachstum von Säugerzellen und humanen Zellen begünstigende, zelluläre Erkennungsstellen dienen können.
ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung einiger beispielhafter, nicht limitie render Ausgestaltungen der Erfindung unter Zuhilfenahme der angefügten Zeichnungen offensichtlich:
1a und 1b zeigen Rasterelektronenmikroskopie-(REM)-Bilder von Seidenfibroinstoffen eines ungewebten Geflechts aneinander gebundener Fasern und Fibrillen. Der 1a liegt ein 100 μm Maßstab zu Grunde, während dem Bild der 1b ein 10 μm Maßstab zu Grunde liegt.
2 zeigt ein typisches Infrarotspektrum von mit Ameisensäure behandeltem Seidenfibroin.
3 zeigt eine typische thermische gravimetrische Analyse von mit Ameisensäure behandeltem Seidenfibroin.
4 ist ein mittels Fluoreszenzmikroskopie (optischer Fluorescein [FITC] Filtersatz) hergestelltes Bild und zeigt verstreute normale adulte humane Fibroblasten, welche in vitro für 10 Tage auf einem Fibroingeflecht kultiviert wurden. Vor dem Überimpfen wurden die Fibroblasten mit 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanin-perchlorat markiert, so dass die lebenden Zellen bei einer Anregung mit ultraviolettem Licht eine helle grüne Fluoreszenz mit einem Intensitätsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 590 nm aussenden. Eine zu den Fibroinfasern gehörige schwache grünliche Autofluoreszenz kann ebenfalls beobachtet werden. Ursprüngliche Verstärkung, 100X.
5 zeigt die gleiche Probe wie in 4, jedoch bei einer Betrachtung mit dem Fluoreszenzmikroskop mit einem optischen Rhodamin-Filtersatz. Die Untersuchung zeigt mehrere orangerot fluoreszierende Inseln normaler humaner Keratinozyten, welche mit den Fibroblasten für 4 Tage auf dem Fibroingeflecht co-kultiviert wurden. Vor dem Überimp fen wurden die Keratinozyten mit 1,1'-dioctadecyl-3,3,3,3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat markiert, so dass diese bei Anregung mit ultraviolettem Licht als Flecken mit einer intravitalen orangeroten Fluoreszenz mit einem Maximum bei einer Wellenlänge von etwa 500 nm beobachtet wurden. Ursprüngliche Verstärkung, 100X.
BESCHREIBUNG EINIGER AUSGESTALTUNGEN
Wie oben beschrieben worden ist, kann Seide von Kokons, Seidentextilien und Abfallseide zur Gewinnung von Seidenfibroin verwendet werden.
Außerdem, weil das Rohseidenfilament auf Grund einer vorhandenen externen Sericinschicht in Ameisensäure nicht löslich ist, muss Seide zur Beseitigung der Sericinschicht zuerst degummiert werden.
Erfindungsgemäß wird degummierte Seide mit einer wässrigen Ameisensäurelösung behandelt.
In diesem Zusammenhang können Lösungen mit 88 Gew.% bis 99 Gew.% Ameisensäure, vorzugsweise mit 99 Gew.% Ameisensäure, verwendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird das Seidenfibroin bei Raumtemperatur in Essigsäure getaucht, jedoch kann das Verfahren bei höheren Temperaturen, z. B. bis zu 60°C, durchgeführt werden.
Die Experimente wurden unter einem Abzug durchgeführt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann der Löslichkeitsgrad des Seidenfibroins erhöht werden, um hochfeste Stoffe zu erhalten.
Das wird durch Zugeben von 0,1 Gew.% bis 10 Gew.% einer Mischung von Salzen erreicht, welche aus der Gruppe Kalziumchlorid, Zinkchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumbromid, Lithiumthiocyanat, Magnesiumchlorid, Kupfernitrat und Natriumchlorid ausgewählt sind.
Vorzugsweise werden die Salze Kalziumchlorid und Lithiumbromid verwendet.
Erfindungsgemäß werden vorzugsweise Seidenfibroinkonzentrationen zwischen 0,1 Gew.% und 10 Gew.% verwendet. Die besten Ergebnisse werden mit Konzentrationen zwischen 0,5 Gew.% und 5 Gew.% erzielt.
Bezug nehmend auf 1a und 1b besteht die hierarchische Struktur der Seidenfibroinfasern aus Fibrillen, Mikrofibrillen und Polymermolekülen.
Erfindungsgemäß ermöglicht das Aufbrechen von Disulfidbindungen zwischen schweren (350 kDa) und leichten (27 kDa) Ketten von Seidenfibroin die Herstellung von Kettenfragmenten, welche als spezielle, die Anhaftung und das Wachstum von Zellen begünstigende, zelluläre Erkennungsstellen dienen können.
Die Seidenfibroinstoffe wurden unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (REM), thermogravimetrischer Analyse (TGA) und Differential-Rasterkalorimetrie (DSC) und darüber hinaus anhand mechanischer Tests charakterisiert.
BEISPIEL 1
Im folgenden Beispiel wurden 0,5 g degummiertes Seidenfibroin (von Kokons, Textilen oder Abfallseide) in 100 ml einer wässrigen Ameisensäurelösung überführt.
Die erhaltene Lösung wurde in Klarglas- oder Polystyrenschalen gegeben und dann bei 100 UpM für 30 Minuten gerührt, um homogen verteilte Fasern zu erhalten.
Die erhaltene Lösung wurde unter atmosphärischen Bedingungen stehen gelassen, um die Ameisensäure zu entfernen.
Sobald die Ameisensäure durch Evaporation bei Raumtemperatur entfernt war, wurden die erhaltenen Seidenfibroinstoffe mehrmals mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und dann in einem Vakuumofen bei 50°C getrocknet.
Zur Erhöhung der Löslichkeit des Seidenfibroins wurde Kalziumchlorid verwendet.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften einiger der verwendeten Seidenfibroinlösungen.
Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 zu entnehmen ist, kann das Seidenfibroin mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst werden.
Wie aus Tabelle 1 entnommen werden kann, wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine homogene, quellfähige, teilweise lösliche oder lösliche Masse erzeugt, welche durch Aufbrechen der Disulfidbindungen zwischen den schweren (350 kDa) und leichten (27 kDa) Ketten von Seidenfibroin erhalten wird.
Einige charakteristische Eigenschaften der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Seidenfibroinstoffe sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Tabelle 2
Dehnungseigenschaften von Seidenfibroin werden gewöhnlich mit einem Belastungs-Dehnungs-Test gemessen.
Gemäß der ASTM 638 wurden alle Tests bei Raumtemperatur im feuchten und trockenen Zustand durchgeführt. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wird der Modul des Geflechts und der Membranen auf Grund des Wassers vergrößert; außerdem verkleinert sich die Dehnung.
Die Morphologie des Seidenfibroinstoffs wurde mittels REM, optischer Mikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie ebenfalls überprüft. In REM-Bildern ist klar zu erkennen, dass Lücken zufällig verteilt sind und durch die Konzentration des Seidenfibroins oder durch Bereitstellen mehrerer Schichten an Seidenfibroinfaserstrukturen beeinflusst werden können.
2 zeigt ein typisches Infrarotspektrum vom mit Ameisensäure behandeltem Seidenfibroin. Es kann erkannt werden, dass alle Zusammensetzungen ein ungefähr ähnliches FTIR Spektrum zeigen; 2 umfasst Amid I, Amid II, Amid III bzw. Amid IV Banden.
3 zeigt eine typische thermogravimetrische Analyse von mit Ameisensäure behandeltem Seidenfibroin. Eine solche Analyse wurde mit dem Ziel durchgeführt, die Wasserabsorption und die thermischen Degradationseigenschaften zu untersuchen.
Bei dem in 3 gezeigten Thermogramm verhalten sich alle Proben in der gleichen Weise: Der Wassergehalt der unter Milieubedingungen gelagerten Proben liegt im Bereich von 5 bis 10 Gew.% und eine Degradation beginnt bei Temperaturen über 280°C.
BEISPIEL 2
Ein dreidimensionaler Fibroinfaserstoff wurde gemäß des folgenden Verfahrens angefertigt.
Eine 200 μm dicke erste Schicht mit einem mittleren Porendurchmesser von 15 μm wurde mit einer 1200 μm dicken zweiten Schicht mit einem mittleren Porendurchmesser von 40 μm verbunden. Die beiden Schichten wurden voneinander getrennt angefertigt und durch Anwenden eines geeigneten Drucks zu einem Stoff mit einer Gesamtdicke von 1,5 mm zusammengefügt.
Das Material wurde sterilisiert, indem dessen beide Seiten bei Raumtemperatur mit ultravioletten Strahlen von in einem geschlossenen Kasten befindlichen bakteriziden Lampen bestrahlt wurden. Danach wurde es in 2,7 × 2,9 cm große quadratische Stücke geschnitten, welche in die quadratischen Ver tiefungen (jeweils 8,6 Quadratzentimeter) von Multidish-Platten (Nunc Ltd.) mit acht Vertiefungen gelegt wurden.
Normale humane Hautfibroblasten einer intraoperativen Biopsy (der Patient wurde informiert und hat zugestimmt) wurden mittels Trypsinverdau (Trypsinlösung 0,25 Vol.%) der zerkleinerten Hautschicht isoliert, und wurden dann zur Vermehrung in Standard TC75 Gewebekulturflaschen (Falcon Ltd.) mit 15 ml Minimalmedium nach Dulbecco (Dulbecco's Minimum Essential Medium, DMEM; Sigma Chemcial Co.) überführt, welches mit 5 Vol.% inaktiviertem (56°C für 30 min) fötalem Rinderserum (Biowhittaker SpA) angereichert war.
Vor dem Überimpfen auf den Fibroinstoff wurden die Fibroblasten vom Boden der Flaschen gelöst, dann mit 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanin-perchlorat markiert, welches eine intravitale Färbung ist, welche bei Anregung mit ultraviolettem Licht eine mit einem optischen FITC-Filtersatz sichtbare helle grüne Fluoreszenz zeigt (Molecular Probes Inc.), und schließlich gezählt.
Danach wurde jeder Quadratzentimeter der Stücke des oben beschriebenen Fibroinstoffs mit etwa 100.000 Fibroblasten überimpft.
Vor dem Überimpfen wurden die Stoffstücke gedreht, so dass deren Abschnitte, welche größere Poren aufwiesen, nach oben orientiert waren.
Die Proben wurden dann in einer mit (5 Vol.%) CO₂ versetzten Luftatmosphäre bei 37°C inkubiert.
Die Fibroblasten hafteten sofort an den Fibroinfasern, und es konnte ein prozentualer Anteil nicht am Fibroinstoff anhaf tender Fibroblasten von weniger als 1% der Gesamtzahl der überimpften Fibroblasten nachgewiesen werden.
Wie mit einer fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung festgestellt werden konnte, vermehrten sich die Fibroblasten stark (siehe 4).
Sie wurden kultiviert und wuchsen 10 aufeinander folgende Wochen auf Fibroinstoffstücken.
Deren zahlenmäßige Zunahme war nicht nur mittels Fluoreszenzmikroskopie feststellbar, sondern wurde ferner durch deren zunehmenden Verbrauch der im Medium vorhandenen Glucose bestätigt.
Die Vitalität und der hohe anabolische Stoffwechsel der Zellen wurde auch durch die tatsächliche Abwesenheit von Harnstoff-Stickstoff (ein Maß für Proteinabbau) im konditionierten Wachstumsmedium bestätigt.
Mittels Dispaseverdau isolierte normale humane epidermische Keratinozyten einer intraoperativen Biopsy (der Patient wurde informiert und hat zugestimmt) wurden zunächst auf eine zuvor bestrahlte Schicht (6000 Rad; Nährschicht) mit humanen Fibroblasten überimpft und zur Vermehrung in eine 1:1 Mischung aus einem Volumen MCDB 153 Medium (Sigma) und einem Volumen Ham F12 Medium (Biowhittaker GmbH) überführt, welche mit 5 Vol.% inaktiviertem (56°C für 30 min) foetalem Rinderserum angereichert war.
Bei einer 70%-igen Konfluenz wurden die Keratinozyten von den Flaschen gelöst, dann mit 1,1'-dioctadecyl-3,3,3,3'-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat markiert, welches ein intravitaler Fluoreszenzfarbstoff ist, welcher bei Anregung mit ultraviolettem Licht bei Verwendung eines optischen Rho damin-Filtersatzes eine orangerote helle Fluoreszenz zeigt (Molecular Probes Inc.), und anschließend gezählt.
Danach wurde jeder Quadratzentimeter derselben Fibroinstoffstücke, an welchen bereits humane Fibroblasten anhafteten, mit etwa 100.000 Keratinozyten überimpft.
In diesem Fall wurden die Gewebestücke derart gedreht, dass deren Abschnitte, welche kleinere Poren aufwiesen, nach oben orientiert waren.
Die Proben wurden dann in einer mit (5 Vol.%) CO₂ versetzten Luftatmosphäre bei 37°C inkubiert.
Die Keratinozyten hafteten ebenso sofort am Fibroinfasergeflecht und der prozentuale Anteil der nicht am Fibroin anhaftenden Keratinozyten war unerheblich.
Wie erwartet wuchsen die Keratinozyten zu Beginn langsam, jedoch nach 3 bis 4 Tagen wurde deren Wachstum schneller, weswegen sich große Zellflecken ausbildeten, welche wegen ihrer intensiven roten Fluoreszenz im Mikroskop einfach detektierbar und von den co-kultivierten Fibroblasten, welche mit optischen FITC-Filtern grün fluoreszierten und sich in der unteren Schicht des Fibroingeflechts befanden, eindeutig unterscheidbar waren (siehe 5).
Folglich zeigt die obige Beschreibung, dass der erfindungsgemäße Fibroinfaserstoff die in vitro Herstellung einer gänzlich neuen Art eines dermo-epidemischen Äquivalenz ermöglicht, welches in vivo als künstliche Haut verwendet werden kann.
Die oben beschriebene Erfindung betrifft einige besondere Ausgestaltungen.
Es ist jedoch klar, dass die Erfindung alle Modifikationen und Variationen umspannt, welche ohne den Rahmen der Ansprüche der vorliegenden Erfindung zu verlassen, in Betracht kommen können.
Beispielsweise ist es klar, dass auf der Grundlage des oben offenbarten Modells andere dreidimensionale ungewebte Fibroinstoffe mit Ad-hoc-Eigenschaften versehen werden können, und folglich als Trägergerüst für die Züchtung anderer Gewebe (wie z. B. Arterien, Sehnen, Knorpel, Knochen usw.) oder Organe (Luftröhre, Speiseröhre, Leber, usw.) verwendet werden können, welche vorübergehend (z. B. künstliche biologische Lebersysteme) oder permanent in vivo in den Organismus eingepflanzt oder damit verbunden werden können.

Claims

Verfahren zum Herstellen von ungewebten Seidenfaserstoffen umfassend die folgenden Schritte: a) Ansetzen einer Seidenfibroinlösung durch Zugeben von degummiertem Seidenfibroin zu einer Ameisensäurelösung; b) Homogenisieren der Lösung, um die Disulfidbindungen zwischen schweren (350 kDa) und leichten (27 kDa) Ketten des Seidenfibroins aufzubrechen, um die Erzeugung von Kettenfragmenten zu erreichen, welche als spezifische, die Anhaftung und das Wachstum von Zellen begünstigende, zelluläre Erkennungsstellen dienen; c) Entfernen der Ameisensäure; d) Waschen der erhaltenen ungewebten Seidenfaserstoffe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das degummierte Seidenfibroin durch Verwenden einer auf einer NaHCO₃ Lösung basierenden Behandlung oder einer anderen an sich bekannten Degummiermethode erhalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die Ameisensäurelösung eine wässrige Ameisensäurelösung ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem die Ameisensäurelösung eine Ameisensäurekonzentration von 88 Gew.% bis 99 Gew.%, vorzugsweise von 99 Gew.%, hat.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei Seidenfibroinkonzentrationen in der Lösung in einem Bereich zwischen 0,1 Gew.% und 10 Gew.%, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 0,5 Gew.% und 5 Gew.%, enthalten sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt a) und/oder b) bei Temperaturen nicht höher als 60°C ausgeführt werden/wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei Schritt a) und/oder b) bei Raumtemperatur ausgeführt werden/wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lösung 0,1 Gew.% bis 10 Gew.% einer Mischung von Salzen enthält, welche aus der Gruppe umfassend Kalziumchlorid, Zinkchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumbromid, Lithioumthiocyanat, Magnesiumchlorid, Kupfernitrat und Natriumchlorid ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lösung 0,1 Gew.% bis 5 Gew.% Kalziumchlorid enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Homogenisieren durch Mischen der Lösung für eine vorgegebene Zeitdauer erhalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ameisensäure durch Evaporation entfernt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Material mehrere Male mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und nachfolgend getrocknet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei ein Trocknen des Materials in einer Kammer mit einer vorgegebenen und kontrollierten Temperatur ausgeführt wird.
Seidenfibroinlösung zum Herstellen von Stoffen aus ungewebten Seidenfibroinfasern, umfassend Seidenfibroin, bei welchem die Disulfidbrücken zwischen schweren (350 kDa) und leichten (27 kDa) Ketten des Seidenfibroins aufgebrochen sind, um die Erzeugung von Kettenfragmenten zu erreichen, welche als spezifische, die Anhaftung und das Wachstum von Zellen begünstigende, zelluläre Erkennungsstellen dienen, und welche in einem Bereich zwischen 0,1 Gew.% und 10 Gew.%, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 0,5 Gew.% und 5 Gew.%, enthaltene Konzentrationen haben.
Seidenfibroinlösung nach Anspruch 14, bei welcher die Lösung eine wässrige Ameisensäurelösung ist.
Seidenfibroinlösung nach einem der Ansprüche 14 bis 15, bei welcher die Ameisensäurelösung eine Ameisensäurekonzentration von 88 Gew.% bis 99 Gew.%, vorzugsweise von 99 Gew.%, hat.
Seidenfibroinlösung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Lösung 0,1 Gew.% bis 10 Gew.% einer Mischung von Salzen enthält, welche aus der Gruppe umfassend Kalziumchlorid, Zinkchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumbromid, Lithiumthiocyanat, Magnesiumchlorid, Kupfernitrat und Natriumchlorid ausgewählt sind.
Seidenfibroinlösung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Lösung 0,1 Gew.% bis 5 Gew.% Kalziumchlorid enthält.
Dreidimensionaler Stoff aus ungewebten Seidenfibroinfasern, dadurch gekennzeichnet, dass dieser aus einer Netzwerkstruktur gebildet ist, bei welcher die Bindungen zwischen schweren (350 kDa) und leichten (27 kDa) Ketten des Seidenfibroins aufgebrochen sind, und welcher bifunktionale Fragmente umfasst, welche als spezifische, die Anhaftung und das Wachstum von Zellen begünstigende, zelluläre Erkennungsstellen dienen.
Stoff nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass dieser durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthalten wird.
Verwendung eines Stoffs nach einem der Ansprüche 19 und 20 für die Biotechnologie von Geweben, wie z. B. Haut, Gefäße, Sehnen, Knorpel, Knochen oder Organen, wie z. B. Luftröhren, Speiseröhren, Lebern, welche zum vorübergehenden oder permanenten Verbinden mit dem oder Einpflanzen in den Organismus geeignet sind.
Verwendung von Stoffvarianten nach einem der Ansprüche 19, 20 und 21, welche kommerziell als Gerüste bereitgestellt werden, welche geeignet sind, um dreidimensionale in vitro Kulturen von isolierten Zellen oder gewebeartige Aggregate oder Organoide bildenden Zellen für wissenschaftliche und/oder industrielle experimentelle Untersuchungen anzusetzen.