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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Mikroskopievorrichtung, insbesondere
eine Mikroskopievorrichtung zur bildgebenden Erfassung von Fluoreszenzlicht.
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Im
Bereich der Mikroskopie ist es bekannt, Fluoreszenzlicht bei der
Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Abbildungen eines Untersuchungsobjekts,
z. B. einer biologischen Probe, einzusetzen. Insbesondere kann dabei
die Fluoreszenzintensität erfasst werden. Darüber
hinaus ist es möglich, die individuelle Fluoreszenzlebensdauer
von Fluorophoren zur Erzeugung von Kontrasten einzusetzen. Die letztgenannte
Vorgehensweise wird mit FLIM bezeichnet (FLIM: Fluorescence Lifetime
Imaging Microscopy, Bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopie).
Die Fluoreszenzlebensdauer eines Fluorophors, welcher gezielt in
ein Untersuchungsobjekt eingebracht werden kann oder natürlicher
Bestandteil des Untersuchungsobjekts ist, hängt stark ab
von der molekularen Umgebung des Fluorophors und kann daher herangezogen
werden, um die Umgebungsparameter eines Fluorophors im Rahmen eines
bildgebenden Verfahrens darzustellen. Bei diesen Umgebungsparametern
kann es sich beispielsweise um die Fluorophorkonzentration, den pH-Wert,
die Temperatur oder die Viskosität handeln. Weiterhin kann
die Erfassung von Fluoreszenzlicht eingesetzt werden bei der Analyse
von Energietransferprozessen, z. B. über einen FREI-Mechanismus (FREI:
Fluorescent Resonance Energy Transfer, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer),
wodurch beispielsweise Aussagen über Bindungs- oder Faltungseigenschaften
von Proteinen möglich sind.
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Für
bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren sind grundsätzlich
zwei verschiedene Verfahren bekannt. Ein erster Verfahrenstyp arbeitet
in der Frequenzdomäne. Es wird in diesem Fall eine Anregungslichtquelle
eingesetzt, welche mit einer Frequenz im Kilohertzbereich bis Gigahertzbereich
zeitlich moduliert ist. Das von dem Untersuchungsobjekt in Reaktion
auf das Anregungslicht abgegebene Fluoreszenzlicht wird phasensensitiv
erfasst, so dass z. B. aus der Phasenverschiebung des erfassten
Fluoreszenzlichts eine mittlere Fluoreszenzlebensdauer abgeleitet
werden kann. Ein zweiter Verfahrenstyp arbeitet in der Zeitdomäne.
In diesem Fall wird zur Erzeugung des Anregungslichts ein gepulster
Laser mit Pulsdauern im Femtosekundenbereich bis Pikosekundenbereich
eingesetzt, und es wird die Fluo reszenzabklingkurve an jedem Bildpunkt
erfasst. Hierbei kann beispielsweise eine zeitkorrelierte Photonenzählung
zum Einsatz kommen.
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Mikroskopievorrichtungen,
welche geeignet sind für in der Frequenzdomäne
arbeitende bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren,
sind bekannt sowohl für Raster- bzw. Scanning-Mikroskopieverfahren,
d. h. mit einem einkanaligen Detektor, als auch für Weitfeldmikroskopieverfahren,
d. h. in Verbindung mit Kameras. Bei den Rasterverfahren besteht
jedoch allgemein ein Problem dahingehend, dass sie relativ zeitaufwändig sind,
wobei typische Bildaufnahmezeiten im Sekundenbereich liegen. Bei
den Weitfeldverfahren kommen typischerweise zeitfenstergesteuerte
Bildverstärker zu Einsatz, so genannte „Gated-Image
Intensifiers”, bei welchen vor einer CCD-Kamera (CCD: Charge
Coupled Device) eine Multikanalplatte (MCP, Multichannel Plate,
Multikanalplatte), angeordnet ist, deren Spannung moduliert werden
kann. Auf dies Weise können Zeitauflösungen im
Bereich von 100 ps erreicht werden, was für viele Anwendungen
ausreichend ist. Typischerweise sind mindestens drei Bildaufnahmen
erforderlich, um die Phasenverschiebung zu ermitteln. Bei multiexponentiellen
Abklingvorgängen erhöht sich die Anzahl von erforderlichen Bildaufnahmen
weiter. Hierdurch ergeben sich Probleme hinsichtlich des Zeitaufwands
für die Messungen. Weiterhin können Probleme hinsichtlich
möglicher Bleichprozesse in den Fluorophoren auftreten. Auch
besteht bei den bekannten Verfahren, welche in der Frequenzdomäne
arbeiten, ein Problem dahingehend, dass eine effiziente Diskriminierung
des Anregungslichts oder Autofluoreszenzlichts des Untersuchungsobjekts
bezüglich der interessierenden Fluoreszenzstrahlung nicht
möglich ist. Signalanteile von Anregungslicht oder Autofluoreszenzlicht
in der erfassten Emissionsstrahlung führen typischerweise
zu einer Verfälschung der ermittelten mittleren Fluoreszenzlebensdauer
und sollten daher möglichst vermieden werden.
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Mikroskopievorrichtungen
für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren,
die in der Zeitdomäne arbeiten, basieren beispielsweise auf
der Kombination von konfokalen oder Mehrphotonen-Laser-Rastermikroskopen
mit einer Einzelphotonenzählung und können in
diesem Fall auch die Möglichkeit zur Erzeugung optischer
Schnitte bieten. Dabei wird durch eine schnelle TDC-Elektronik (TDC: Time
to Digital Converter, Zeit-Digital-Wandler) die Ankunftszeit einzelner
Fluoreszenzphotonen relativ zu einem Puls des Anregungslichts gemessen.
Hierbei kommen Lichtquellen mit Pulsdauern im Femtosekundenbereich
bis Pikosekundenbereich zum Einsatz. Die erreichbaren Zeitauflösungen
liegen im Bereich weniger Pikosekunden. Weiterhin sind Mikroskopievorrichtungen
für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopie ver-fahren
in der Zeitdomäne bekannt, welche eine Weitfelddetektion
einsetzen und die Möglichkeit zur Erzeugung optischer Schnitte bieten.
Eine solche Mikroskopievorrichtung ist beispielsweise beschrieben
in „High speed optically sectioned fluorescence
lifetime imaging permits study of life cell signaling events" D.
M. Grant et al., Optics Express Vol. 15, No. 24, 15656 (2007).
Die Untersuchungsobjekte werden hier sowohl fokal als auch außerfokal
angeregt, obwohl nur die fokale Anregung tatsächlich genutzt
wird, so dass ein Problem bezüglich übermäßiger
Gleichung der Fluorophore besteht.
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Weiterhin
ist im Zusammenhang mit Fluoreszenzmikroskopieverfahren die Verwendung
der sogenannten SPIM-Technik (SPIM: Selective Plane Illumination
Microscopy, Mikroskopie mit selektiver Beleuchtung einer Ebene)
bekannt. Diese Technik ist beispielsweise beschrieben in
„Optical
Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination
Microscopy", H. K. Stelzer et al., Science VOL 305, 1007
(2004), in
„Resolution enhancement in
a light-sheet-based microscope (SPIM)", H. K. Stelzer et
al., Optics Letters Vol. 31, No. 10, 1477 (2006), in der
DE 10 257 423 A1 und
in der
WO 2004/053558 A1 .
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Ähnlich
wie die konfokale Laser-Rastermikroskopie erlaubt die SPIM-Technik
die dreidimensionale Aufnahme von Objekten in Form optischer Schnitte,
allerdings im Rahmen einer Weitfeldtechnik. Im Unterschied zu der
Fluoreszenzmikroskopie im Auf- oder Durchlichtverfahren werden die
Fluorophore hier im Untersuchungsobjekt mit Laserlicht in Form eines
Lichtblattes angeregt. Der Einsatz der SPIM-Technik bei bildgebenden
Fluoreszenzlebensdauermessungen ist beschrieben in „4D
Fluorescence Lifetime Imaging using Selective Plane Illumination
Microscopy", K. Greger et al., Abstract Book, Focus an
Microscopy (Jena, 2005), S. 225. In diesem Fall kommt als
Lichtquelle ein CW-Laser (CW: Continuous Wave) in Form eines Ar-Ionen-Lasers
zum Einsatz, dessen Ausgangsstrahlung durch einen nachgeschalteten
akusto-optischen Modulator moduliert wird.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine verbesserte
Mikroskopievorrichtung bereitzustellen für bildgebende
Untersuchungen an biologischen oder nicht biologischen Untersuchungsobjekten,
insbesondere auf Basis von Fluoreszenzlicht, bei welcher durch Verwendung
der SPIM-Technik mit geringer Bildaufnahmezeit und geringer Probenbelastung
optische Schnitte erzeugt werden können.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
eine Mikroskopievorrichtung gemäß Anspruch 1.
Die abhängigen Patentansprüche definieren bevorzugte
und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
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Die
erfindungsgemäße Mikroskopievorrichtung umfasst
Beleuchtungsmittel zur Erzeugung einer Beleuchtungsstrahlung, einen
bildgebenden Detektor zur ortsaufgelösten Erfassung einer
von einem Untersuchungsobjekt abgegebenen Emissionsstrahlung, einen
Beleuchtungsstrahlengang zwischen den Beleuchtungsmitteln und dem
Untersuchungsobjekt und einen Detektionsstrahlengang zwischen dem Untersuchungsobjekt
und dem Detektor. Der Beleuchtungsstrahlengang umfasst eine Beleuchtungsoptik,
welche zur Erzeugung eines Lichtblattes der Beleuchtungsstrahlung
ausgestaltet ist, welches sich quer zu der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs erstreckt,
wobei die Achse des Detektionsstrahlengangs in einem von 0° abweichenden
Winkel, insbesondere im Wesentlichen senkrecht zu einer Schnittebene
des Lichtblattes und des Untersuchungsobjekts ausgerichtet ist.
Der Aufbau der Mikroskopievorrichtung entspricht somit im Wesentlichen
der SPIM-Technik und ermöglicht somit die Aufnahme von
optischen Schnitten des Untersuchungsobjekts mit einer hohen Geschwindigkeit
und einem geringen Ausbleichen der Probe. Der Beleuchtungsstrahlengang
und der Detektionsstrahlengang sind vollständig voneinander
getrennt.
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Die
Beleuchtungsmittel umfassen erfindungsgemäß einen
gepulsten Laser. Auf diese Weise kann die Beleuchtungsstrahlung über
eine große Bandbreite von Wellenlängen bereitgestellt
werden und es wird eine hohe Effizienz der Anregung beispielsweise
von Fluoreszenz in dem Untersuchungsobjekt durch die Beleuchtungsstrahlung
ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft,
wenn mit der Beleuchtungsstrahlung eine Bandbreite von wenigstens
200 nm abgedeckt werden kann. Die von dem gepulsten Laser bereitgestellte Pulsdauer
beträgt vorzugsweise weniger als 1 ns, insbesondere weniger
als 100 ps. Insbesondere kann ein Laser verwendet werden, welcher über
einen Wellenlängenbereich von 400 nm bis 750 nm Lichtpulse
mit einer Länge von 10 bis 40 ps mit einer Wiederholrate
im Bereich von 20 bis 50 MHz erzeugt. Auch der Einsatz eines Lasers
mit Pulslängen im Femtosekundenbereich ist möglich.
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Gemäß einer
Ausführungsform ist der Detektor zur zeitaufgelösten
Erfassung von Photonen der Emissionsstrahlung ausgestaltet. Insbesondere
kann der ortsaufgelöste Detektor als zeitfensterbasierter Bildverstärker
(d. h. als so genannter „Time-Gated Image Intensifier”)
oder als zeitaufgelöster Einzelphotonenzähler
ausgestaltet sein. Geeignete orts- und zeitaufgelöste Einzelphotonenzähler
sind beschrieben in „A space- and time-resolved
single-photon counting detector for fluorescence microscopy and
spectroscopy", X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092,
60920M (2006) und in "Position- and time-sensitive
single photone detector with delay-line readout", A. Czasch
et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 580
(2007), 1066–1070.
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Durch
Verwendung dieser zeitaufgelösten Detektoren ist die Mikroskopievorrichtung
einsetzbar für bildgebende Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren,
insbesondere in der Zeitdomäne, wobei beispielsweise der
Detektor als Ergebnis der Messung für jeden Bildpunkt eine
Fluoreszenzabklingkurve liefern kann. Darüber hinaus wird
durch die Zeitauflösung ermöglicht, zwischen verschiedenen
Signalanteilen der von dem Untersuchungsobjekt abgegebenen Emissionsstrahlung
zu diskriminieren, insbesondere zwischen Autofluoreszenzstrahlung
von in dem Untersuchungsobjekt natürlich enthaltenen Materialien
und Fluoreszenzstrahlung von gezielt in das Untersuchungsobjekt
eingebrachten Fluoreszenzfarbstoffen, sowie zwischen Fluoreszenzstrahlung
und reflektierter oder gestreuter Beleuchtungsstrahlung. Die auf
diese Weise diskriminierten verschiedenen Signalanteile können
zur Unterdrückung bestimmter Signalanteile, z. B. Autofluoreszenz,
oder zur parallelen bildgebenden Auswertung der verschiedenen Signalanteile
herangezogen werden. In jedem Fall wird eine äußerst
effiziente Bildaufnahme und Auswertung gewährleistet.
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Zur
Bereitstellung der Ortsauflösung umfasst der Detektor typischerweise
eine Vielzahl von Detektorelementen, welche angeordnet sein können
in Form eines regelmäßigen Gitters oder einer
Matrix, oder aber auch in Form einer im Wesentlichen linienartigen
Anordnung, um einen Zeilendetektor zu realisieren. Jedes der Detektorelemente
ist dazu ausgestaltet, ein von einem Erfassungszeitpunkt wenigstens
eines Photons relativ zu einem Puls der Beleuchtungsstrahlung abhängiges
Zeitsignal auszugeben und/oder die Erfassung von Photonen abhängig von
einem relativ zu dem Puls der Beleuchtungsstrahlung erzeugten Zeitsignal
zu steuern. In jedem Fall ist somit über das Zeitsignal
eine Zeitinformation verfügbar, welche im Wesentlichen
der Zeitdifferenz zwischen einem Puls der Beleuchtungsstrahlung
und dem Zeitpunkt des Erfassens eines Photons der Emissionsstrahlung
entspricht. Durch Erfassen mehrerer Photonen kann somit beispielsweise
die Abklingkurve der Fluoreszenzstrahlung eines Fluorophors in dem
Untersuchungsobjekt erfasst werden.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen
und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher
erläutert.
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1 zeigt
schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem
Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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2 zeigt
schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem
weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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3 veranschaulicht
eine Folge von Pulsen der Beleuchtungsstrahlung in einer Mikroskopievorrichtung
gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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4 zeigt
eine beispielhafte Fluoreszenzabklingkurve, welche durch eine Mikroskopievorrichtung
gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung
erfassbar ist.
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5 veranschaulicht
die Verwendung eines Zeitfensters zur Diskriminierung von Signalanteilen
einer Emissionsstrahlung in einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem
Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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1 zeigt
schematisch eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem
Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopievorrichtung
ist zur Verwendung bei bildgebenden Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren
in der Zeitdomäne ausgestaltet, wobei die Erzeugung optischer
Schnitte gemäß der SPIM-Technik vorgesehen ist.
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Die
Mikroskopievorrichtung umfasst Beleuchtungsmittel, welche einen
breitbandigen Laser 1, ein akusto-optisches einstellbares
Filter 3 zur externen Wellenlängenselektion und
eine breitbandige Lichtleitfaser 4. Beispielsweise kann
der Laser 1 in einem Wellenlängenbereich von 450
bis 700 nm Pulse der Beleuchtungsstrahlung mit einer Länge
von 20 ps erzeugen. Die Wiederholrate der Pulse liegt beispielsweise
bei 40 MHz. Bei der Ausgangsstrahlung des Lasers 1 kann
es sich um ein Weisslichtkontinuum handeln, aus dem dann die in
der Beleuchtungsstrahlung verwendeten Wellenlängen extern
herausgefiltert werden, z. B. durch das akusto-optische einstellbare
Filter 3, oder der Laser 1 kann selbst ein geeignetes
Mittel zur Wellenlängenselektion beinhalten, wie z. B.
ein internes akusto-optisches einstellbares Filter oder eine Frequenzkonversionseinheit. Bei
dem Laser 1 kann es sich um einen faserbasierten Superkontinuum-Laser
handeln. In dem Fall, dass der Laser 1 selbst Mittel zur
Wellenlängenselektion beinhaltet, kann gegebenenfalls auf
das akusto-optische einstellbare Filter 3 verzichtet werden. Ein
geeigneter Laser ist beispielsweise über die Firma Fianium
Ltd. kommerziell verfügbar.
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Die
Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin einen Beleuchtungsstrahlengang 2,
in welchem die von dem Laser 1 erzeugte Beleuchtungsstrahlung über
die optische Faser 4 eingekoppelt wird. In dem Beleuchtungsstrahlengang 2 sind
eine Zylinderoptik 5 sowie Abbildungsoptiken 6 angeordnet,
welche eine Formung der Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt 7 bewerkstelligen.
Das Lichtblatt 7 ist auf ein Untersuchungsobjekt 8 gerichtet
und schneidet dieses in einer Fokusebene des Beleuchtungsstrahlengangs 2.
Bei dem Untersuchungsobjekt kann es sich insbesondere um eine biologische
Probe handeln, welche beispielsweise in ein transparentes Gel eingebettet
ist.
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Die
Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin einen Detektionsstrahlengang 10,
in welchem ein Detektionsobjektiv 9 angeordnet ist, über
welches von dem Untersuchungsobjekt 8 abgegebene Emissionsstrahlung
aufgenommen wird. Die Achse des Detektionsstrahlengangs 10 steht
im Wesentlichen senkrecht auf der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs 2 und
insbesondere im Wesentlichen senkrecht auf der Schnittebene des
Lichtblatts 7 mit dem Untersuchungsobjekt 8. Das
Untersuchungsobjekt 8 wird folglich nur in einer Ebene
beleuchtet. Das Detektionsobjektiv 9 dient der Fokussierung
in einer Fokusebene des Detektionsstrahlengangs 10. Der
Beleuchtungsstrahlengang 2 und der Detektionsstrahlengang
sind vollständig voneinander getrennt und treffen sich
lediglich in der jeweiligen Fokusebene. Es sind auch Anordnungen
denkbar mit einem Winkel zwischen Detektionsstrahlengang und Beleuchtungsstrahlengang
der zwischen 0° und 90° liegt. Entscheidend ist,
dass der Beleuchtungsstrahlengang 2 und der Detektionsstrahlengang
nicht parallel ausgerichtet sind.
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Die
Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin eine Vorrichtung (nicht
dargestellt) zur Positionierung des Untersuchungsobjekts 8 relativ
zu dem Lichtblatt 7, so dass durch eine Relativbewegung
des Untersuchungsobjekts 8 entlang der Achse des Detektionsstrahlengangs 10 und/oder
relativ zu dem Beleuchtungsstrahlengang 2 verschiedene
optische Schnitte des Untersuchungsobjekts 8 aufgenommen werden
können, welche als Grundlage für dreidimensionale
Bilddatensätze dienen können. Die Relativbewegung
kann auch eine Rotation des Untersuchungsobjekts 8 umfassen.
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Der
Detektionsstrahlengang 10 umfasst weiterhin eine Tubuslinse 12, über
welche die von dem Detektionsobjektiv 9 erfasste Emissionsstrahlung
einem Detektor 14 zugeführt ist. Weiterhin kann
in dem Detektionsstrahlengang 10 ein Farbteiler 11 vorgesehen
sein, welcher beispielsweise die Anbindung von Auflicht-Fluoreszenzanregungseinheiten,
z. B. ein konfokales Laser-Rastermikroskop oder ein Epi-Fluoreszenzmikroskop,
ermöglicht. Weiterhin kann in dem Detektionsstrahlengang 10 ein
Emissionsfilter 13 vorgesehen sein, welches über
das Untersuchungsobjekt 8 in den Detektionsstrahlengang 10 reflektierte
oder gestreute Beleuchtungsstrahlung blockiert. Das Emissionsfilter 13 ist
jedoch nicht für alle Betriebsweisen der Mikroskopievorrichtung
erforderlich und ist daher bevorzugt herausnehmbar. Bei einigen
Betriebsweisen kann die Erfassung von reflektierter oder gestreuter
Beleuchtungsstrahlung über den Detektor 14 sogar
wünschenswert sein.
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Bei
der Mikroskopievorrichtung können alle in der von dem Laser 1 bereitgestellten
Bandbreite der Beleuchtungsstrahlung verfügbaren Anregungslinien
zur Fluoreszenzanregung oder für eine anderweitige Beleuchtung
des Untersuchungsobjekts 8 verwendet werden. Hierdurch
ist es insbesondere möglich, die vollständige
Bandbreite an Fluoreszenzfarbstoffen abzudecken und sogar optimiert
anzuregen, wenn beispielsweise die Wellenlänge des Absorptionsmaximums
eines Fluoreszenzfarbstoffs für die Anregung ausgewählt
wird. Weiterhin ist es möglich, das Untersuchungsobjekt 8 mit
einem breiten spektralen Band der Beleuchtungsstrahlung anzuregen,
um beispielsweise eine erhöhte Leistung für die Anregung
zur Verfügung zu stellen. Es ist auch möglich,
strukturierte spektrale Bänder der Beleuchtungsstrahlung
zur Anregung einzusetzen. Letzteres kann bei einigen Fluoreszenzfarbstoffen
von Vorteil sein, wenn z. B. gezielt Bleichkanäle unterdrückt
werden sollen.
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Die
Mikroskopievorrichtung umfasst weiterhin den Detektor 14 sowie
eine Auswerte- und Steuerelektronik 15. Im Zusammenhang
mit der Auswerte- und Steuerelektronik 15 ist der Detektor 14 in
der Lage, das Auftreffen von Photonen der von dem Untersuchungsobjekt 8 ausgesendeten
Emissionsstrahlung räumlich und zeitlich aufzulösen.
Der Detektor 14 kann insbesondere einen zeitfensterbasierten Bildverstärker
umfassen, wie er beispielsweise über die Firma Kentech
Ltd. kommerziell verfügbar ist. Die Auswerte- und Steuerelektronik 15 ist über
Signalleitungen 17 und 18 mit dem Detektor 14 verbunden. Darüber
hinaus ist die Auswerte- und Steuereinheit 15 über
eine Signalleitung 16 mit dem Laser 1 verbunden.
Der Laser 1 übermittelt über die Signalleitung 16 ein
Triggersignal an die Auswerte- und Steuerelektronik 15.
Das Triggersignal umfasst Triggerpulse, welche im Wesentlichen zeitgleich
zu den er zeugten Pulsen der Beleuchtungsstrahlung sind oder einen
bekannten Zeitversatz zu diesen aufweisen. Die Auswerte- und Steuerelektronik 15 erzeugt
basierend auf diesem Trigger-Signal Zeitfenstersteuerungssignale,
welche über die Signalleitung 17 an den Detektor 14 übermittelt
werden. Der Detektor 14 übermittelt wiederum über
die Signalleitung 18 eine Information bezüglich
der Erfassung eines Photons sowie eine Information, an welchem Ort
dieses Photon erfasst wurde.
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Alternativ
kann der Detektor 14 auch einen orts- und zeitaufgelösten
Einzelphotonenzähler umfassen, wie er beispielsweise beschrieben
ist in „A space- and timeresolved single-photon
counting detector for fluorescence microscopy and spectroscopy",
X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092, 609220M (2006) oder
in „Position- and time-sensitive single photon
detector with delay-line readout", A. Czasch et al., Nuclear
Instruments and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066–1070.
Der Detektor 14 umfasst somit beispielsweise eine Multialkali-Fotokathode,
einen MCP-Stapel (MCP: Micro Channel Plate, Mikrokanalplatte) und
eine gekreuzte Verzögerungsdraht-Anode. Photonen, die auf
die Kathode treffen, werden über den MCP-Stapel in ihrer Wirkung
verstärkt und erzeugen auf der Anode einen Signalimpuls,
aus dessen Laufzeit zur Detektionselektronik Aussagen über
den Photonenauftreffpunkt abgeleitet werden können. Anstelle
der Verzögerungsdraht-Anode kann auch einen segmentierte
Anode verwendet werden. In diesem Fall dient die Signalleitung 17 im
Wesentlichen der Initialisierung des Detektors 14. Über
die Signalleitung 18 werden bevorzugt die folgenden Informationen übermittelt:
die Ankunftszeit eines Photons der Emissionsstrahlung relativ zum
Initialisierungssignal, ein verzögertes Signal für
eine erste Raumrichtung, z. B. eine x-Position, und ein verzögertes
Signal für eine zweite Raumrichtung, z. B. eine y-Position.
Aus diesen drei Informationen kann Ort und Zeitpunkt der Erfassung
des Photons bestimmt werden. Da bei dem Detektor 14 im Wesentlichen
ein Photonenzählverfahren zum Einsatz kommt, umfasst der
Detektor 14 vorzugsweise auch einen Diskriminator zur Unterdrückung
von elektronischen Rauschanteilen. Auf diese Weise kann Ausleserauschen
vermieden werden.
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Durch
Einsatz eines solchen ortsaufgelösten und zeitaufgelösten
Einzelphotonenzählers besteht keine Beschränkung
auf Zeitfenster bei der Erfassung der Photonen. So kann vermieden
werden, dass Verluste für Photonen der Emissionsstrahlung auftreten,
welche außerhalb der gesetzten Zeitfenster auf den Detektor 14 treffen.
Durch Verwendung von ortsaufgelösten und zeitaufgelösten
Einzelphotonenzählern als De tektoren können Ortsauflösungen von
wenigstens 150 × 150 Bildpunkten, z. B. 1000 × 1000
Bildpunkte, und zeitliche Auflösungen von etwa 100 ps erreicht
werden.
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Die
Mikroskopievorrichtung umfasst darüber hinaus einen Analyserechner 20,
welcher über eine Signalleitung 19 mit der Auswerte-
und Steuerelektronik 15 verbunden ist. Über die
Signalleitung 19 werden dem Analyserechner 20 von
der Auswerte- und Steuerelektronik 15 ermittelte Messresultate
zugeführt. Mittels des Analyserechners 20 können
beispielsweise zeitliche Fluoreszenzabklingkurven optisch dargestellt
und gespeichert werden oder mit der Mikroskopievorrichtung erfasste
zweidimensionale oder dreidimensionale Bilddaten dargestellt, gespeichert
und weiterverarbeitet werden. Es versteht sich, dass die Auswerte-
und Steuerelektronik 15 und der Analyserechner 20 in
einem einzigen mikroprozessorbasierten System implementiert sein
können, welches auch gleichzeitig der Steuerung der wesentlichen
Funktionen der Mikroskopievorrichtung dienen kann, z. B. über
eine graphische Benutzeroberfläche.
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2 zeigt
eine Mikroskopievorrichtung gemäß einem weiteren
Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopievorrichtung
von 2 entspricht im Wesentlichen derjenigen von 1,
und ähnliche Komponenten wurden mit den gleichen Bezugszeichen
gekennzeichnet. Auf die Erläuterung dieser Komponenten
wird an dieser Stelle verzichtet. Vielmehr wird diesbezüglich
auf die entsprechenden Ausführungen im Zusammenhang mit 1 verwiesen.
Nachfolgend sollten lediglich die wesentlichen Unterschiede der
Mikroskopievorrichtung von 2 zu derjenigen
von 1 erläutert werden.
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Während
bei der Mikroskopievorrichtung von 1 das Lichtblatt 7 durch
eine Zylinderoptik geformt wurde, wird es bei der Mikroskopievorrichtung von 2 durch
einen die Fokusebene abrasternden annähernd linienförmigen
Lichtstrahl aufgespannt. Die Mikroskopievorrichtung umfasst zu diesem Zweck
eine erste Rastereinheit 21, welche eine entsprechende
Ablenkung des von dem Laser 1 über die optische
Faser 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 2 eingekoppelten
Lichtstrahls vornimmt. Weiterhin ist die in 1 dargestellte
Zylinderoptik 5 durch ein weiteres Element der Abbildungsoptik 6 ersetzt.
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Weiterhin
ist im Detektionsstrahlengang 10 eine zweite Rastereinheit 22 eingefügt,
welche mit der ersten Rastereinheit 21 derart synchronisiert
ist, dass die zum jeweiligen Aufnahmezeitpunkt in der Fokusebene
beleuchtete Zeile auf eine zeilenartige Anordnung von Detektorelementen
eines Detektors 24 abgebildet wird. Die Synchro nisation
erfolgt mittels einer Synchronisationssignals, welches über eine
Signalleitung 23 zwischen den Rastereinheiten 21, 22 oder
an die Rastereinheiten 21, 22 übermittelt wird.
Der Detektor 24 ist folglich nicht als flächenhafter
Detektor, sondern als Zeilendetektor ausgestaltet. Der Detektor 24 liefert
folglich nur ein eindimensionales Positionssignal, wobei ein weiteres
Positionssignal über die Ansteuerung der ersten und zweiten Rastereinheit 21, 22 verfügbar
ist. Im Übrigen entsprechen die Eigenschaften des Detektors 24 denjenigen
des Detektors 14 von 1. Es sind
folglich insgesamt die gleichen räumlichen und zeitlichen
Informationen für eine Auswertung in der Auswerte- und
Steuerelektronik 15 verfügbar. Aufgrund eines technischen
vereinfachten Aufbaus eines Zeilendetektors gegenüber einem
flächigen Detektor können jedoch höhere
räumliche und zeitliche Auflösungen erreicht werden.
Weiterhin können Sättigungseffekte und so genannte
Pile-Up-Effekte (Überlagerungseffekte) vermindert werden.
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3 zeigt
eine beispielhafte Folge von Pulsen der Beleuchtungsstrahlung. In 3 ist
die Intensität der Beleuchtungsstrahlung mit I bezeichnet. Die
Zeitachse ist mit t bezeichnet. Es ist zu erkennen, dass die Beleuchtungsstrahlung
scharf definierte Pulse umfasst, wobei bei dem dargestellten Beispiel die
Pulslänge bei etwa 20 ps liegt. Der Abstand zweier Pulse
liegt wiederum bei 25 ns, was einer Wiederholrate von 40 MHz entspricht.
Wie bereits erwähnt, umfassen die Beleuchtungsmiltel zur
Erzeugung der gepulsten Beleuchtungsstrahlung einen geeignet ausgestalteten
Laser. Bei dem Laser kann es sich insbesondere um einen Superkontinuum-Laser
handeln, welcher einen Wellenlängenbereich von wenigstens
450–700 nm abdeckt.
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4 zeigt
beispielhaft den Verlauf einer Fluoreszenzabklingkurve, wie sie
als Resultat der zeitaufgelösten Auswertung der Emissionsstrahlung mittels
des Detektors 14, 24 und der Auswerte- und Steuerelektronik 15 der
Mikroskopievorrichtungen von 1 und 2 gewonnen
werden kann. Die Signalstärke der Fluoreszenzstrahlung
ist in 4 mit F bezeichnet. Die Zeitachse ist mit t bezeichnet.
Die Detektoren 14, 24 liefern für jedes
ihrer Detektorelemente, d. h. für jeden Bildpunkt, eine
Abklingkurve des in 4 dargestellten Typs. Die Fluoreszenzabklingkurve
kann im Wesentlichen über den gesamten Zeitraum zwischen
zwei aufeinander folgenden Pulsen der Beleuchtungsstrahlung erfasst
werden.
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Wenn
in dem Detektor 14, 24 ein zeitfensterbasierter
Bildverstärker verwendet wird, wird die Fluoreszenzabklingkurve
erfasst, indem mehrere Messungen mit unterschiedlich gesetzten Zeitfenstern
erfolgen. Aus der Lage des Zeitfensters ergibt sich dann die Position
eines Punktes der Abklingkurve entlang der Zeitachse. Wenn in dem
Detektor 14, 24 ein orts- und zeitaufgelöster
Einzelphotonenzähler verwendet wird, kann die Zeitinformation
direkt aus der Ausgabe des Detektors 14, 24 gewonnen
werden. Der Wert F für einen bestimmten Punkt auf der Zeitachse
ergibt sich aus der für den Bereich dieses Zeitpunkts gezählten
Anzahl von Photonen, d. h. durch eine histogrammartige Auswertung
der erfassten Photonen.
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Eine
Fluoreszenzabklingkurve des in 4 dargestellten
Typs kann bei bildgebenden Untersuchungen zur Kontrastgebung gemäß einem Fluoreszenzlebensdauermikroskopieverfahren
genutzt werden. Beispielsweise können zwei unterschiedliche
fluoreszierende Farbstoffe voneinander unterschieden werden, was
in eine Kontrastinformation umgesetzt werden kann. Bei einer detaillierten Erfassung
der Fluoreszenzabklingkurve kann auch die Fluoreszenzlebensdauer
rechnerisch ermittelt werden.
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In
dem Fall, dass lediglich zwischen zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen
unterschieden werden soll, kann bei Verwendung eines zeitfensterbasierten
Bildverstärkers darauf verzichtet werden, im Wesentlichen
die gesamte Fluoreszenzabklingkurve aufzunehmen. Vielmehr kann es
ausreichen, lediglich zwei geeignet gesetzte Zeitfenster zu verwenden.
Allgemein ist es möglich, anhand einer Abklingkurve des
in 4 dargestellten Typs, verschiedene Signalanteile
der Emissionsstrahlung voneinander zu unterscheiden und diese zu
diskriminieren, wenn diese ein unterschiedliches Abklingverhalten
aufweisen. Dies kann bei den Mikroskopievorrichtungen von 1 und 2 einerseits
genutzt werden, um unerwünschte Signalanteile, z. B. Autofluoreszenzstrahlung
oder reflektierte oder gestreute Beleuchtungsstrahlung, zu unterdrücken.
Es ist jedoch auch möglich, diese verschiedenen Signalanteile
separat auszuwerten und in Kontrastinformationen für das
Bildgebungsverfahren umzusetzen.
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5 veranschaulicht
beispielhaft eine Situation, in welcher sich die erfasste Fluoreszenzabklingkurve
aus mehreren Signalanteilen zusammensetzt. Die Signalstärke
der Fluoreszenzstrahlung ist mit F bezeichnet. Die Zeitachse ist
mit t bezeichnet. In 5 ist der Laserimpuls durch
eine gestrichelte Linie dargestellt. Ein erster Signalanteil der
erfassten Abklingkurve ist durch eine strichpunktierte Linie dargestellt.
Diesem Signalanteil ist eine das Abklingverhalten charakterisierende
Lebensdauer von τ = 10 ns zugeordnet. Ein zweiter Signalanteil
der erfassten Abklingkurve ist durch eine gepunktete Linie dargestellt.
Diesem Signalanteil ist eine das Abklingverhalten charakterisierende
Lebensdauer von τ = 1 ns zugeordnet. Eine durchgezogene
Linie veranschaulicht das Gesamtsignal, welches sich aus dem ersten
Signalanteil und dem zweiten Signalanteil zusammensetzt. Ein für
die Detektion verwendetes Zeitfenster ist in 5 durch
die schraffierte Fläche G dargestellt. Beispielsweise kann
der erste Signalanteil der Fluoreszenz eines gezielt in das Untersuchungsobjekt
eingebrachten Fluoreszenzfarbstoffs entsprechen, während
der zweite Signalanteil einer Autofluoreszenz von in dem Untersuchungsobjekt
natürlich enthaltenem Material entspricht. Bei vielen Anwendungen
führt ein solcher auf Autofluoreszenz basierender Signalanteil
zu einer starken Kontrastminderung.
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Wie
aus 5 ersichtlich, ist das Zeitfenster G derart gesetzt,
dass innerhalb des Zeitfensters G der Verlauf der Gesamtabklingkurve
im Wesentlichen demjenigen des ersten Signalanteils entspricht,
da zu Beginn des Zeitfensters der Abklingvorgang des ersten Signalanteils
bereits im Wesentlichen abgeschlossen ist. Dies wird erreicht, indem
die Anfangszeit des Zeitfensters G relativ zu dem Puls der Beleuchtungsstrahlung
derart gesetzt ist, dass er wesentlich größer
ist als die Lebensdauer τ des zu unterdrückenden
Signalanteils. Um die beiden Signalanteile separat auswerten zu
können, könnte ein zweites Zeitfenster gesetzt
werden, welches den Zeitraum vor Beginn des Zeitfensters G abdeckt.
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Die
Unterdrückung von Autofluoreszenzstrahlung ist insbesondere
von Vorteil im Zusammenhang mit auflösungssteigernden Verfahren,
wie z. B. dargestellt in „Imaging Intracellular
Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution", E. Betzig
et al., Science 313, 1542 (2006). Hier wird aus mehreren
Einzelmolekülanregungen der Schwerpunkt der Intensitätsverteilung
auf einem ortsaufgelösten Detektor für ein einzelnes
Molekül ermittelt, wodurch Auflösungen bis zu
20 nm erreicht werden können. Da wie oben dargestellt bei
den Mikroskopievorrichtungen von 1 und 2 Autofluoreszenzstrahlung
effektiv unterdrückt werden kann, ermöglichen
diese, ein solches auflösungssteigerndes Verfahren auch
bei der bildgebenden Untersuchung von optischen Schnitten mit der
SPIM-Technik einzusetzen. Insbesondere kann auf das Anregungsvolumen
begrenzende Verfahren, wie z. B. Fluoreszenzmikroskopie mit interner Totalreflexion
oder TIRF-Mikroskopie (TIRF: Total Interal Reflection Fluorescence),
verzichtet werden.
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Weiterhin
ist aus 5 auch ersichtlich, dass die
zeitaufgelöste Erfassung der Emissionsstrahlung geeignet
ist, Signalanteile der Beleuchtungsstrahlung, insbesondere reflektierte
Beleuchtungsstrahlung, von den anderen Signalanteilen abzutrennen.
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Dies
kann wiederum eingesetzt werden, um den Signalanteil reflektierter
Beleuchtungsstrahlung in der erfassten Emissionsstrahlung zu unterdrücken, ohne
dass hierfür das Emissionsfilter 13 erforderlich ist,
oder um basierend auf der reflektierten Beleuchtungsstrahlung parallel
eine separate bildgebende Auswertung vorzunehmen. Im letzteren Fall
wird das Emissionsfilter 13 bevorzugt aus dem Detektionsstrahlengang
entfernt. Hierbei ergibt sich als besonderer Vorteil, dass bei der
Erzeugung der Beleuchtungsstrahlung keine Einschränkung
hinsichtlich möglicher Anregungswellenbereiche oder -kombinationen
besteht. Es können z. B. auch solche Anregungswellenbereiche
oder -kombinationen verwendet werden, für welche keine
als Emissionsfilter geeigneten optischen Filter verfügbar
sind oder für welche solche Filter nur mit hohen Kosten
oder hohem technischen Aufwand bereitgestellt werden können.
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Es
versteht sich, dass die vorangegangene Beschreibung lediglich einige
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung abdeckt
und dass in diesen Ausführungsbeispielen verschiedene Modifikationen
vorgenommen werden können, ohne von den wesentlichen Konzepten
der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können die Beleuchtungsmittel
auch mehrere Laser umfassen, deren Ausgangsstrahlung gemeinsam in
den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt wird. Außerdem
ist es auch möglich, das Lichtblatt durch zeilenartiges
Abrastern in der Fokusebene des Beleuchtungsstrahlengangs zu erzeugen,
wie im Zusammenhang mit 2 erläutert, jedoch
zur Erfassung der Emissionsstrahlung einen flächigen Detektor
einzusetzen, wie im Zusammenhang mit 1 erläutert.
In diesem Fall kann auf die zweite Rastereinheit im Detektionsstrahlengang
verzichtet werden. Darüber hinaus ist es auch möglich, einen
orts- und zeitaufgelösten Einzelphotonenzähler
mit Detektionszeitfenstern zu betreiben, wie in Zusammenhang mit 5 erläutert.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 10257423
A1 [0006]
- - WO 2004/053558 A1 [0006]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - „High
speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits
study of life cell signaling events” D. M. Grant et al.,
Optics Express Vol. 15, No. 24, 15656 (2007) [0005]
- - „Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective
Plane Illumination Microscopy”, H. K. Stelzer et al., Science
VOL 305, 1007 (2004) [0006]
- - „Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope
(SPIM)”, H. K. Stelzer et al., Optics Letters Vol. 31,
No. 10, 1477 (2006) [0006]
- - „4D Fluorescence Lifetime Imaging using Selective
Plane Illumination Microscopy”, K. Greger et al., Abstract
Book, Focus an Microscopy (Jena, 2005), S. 225 [0007]
- - „A space- and time-resolved single-photon counting
detector for fluorescence microscopy and spectroscopy”,
X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092, 60920M (2006) [0012]
- - ”Position- and time-sensitive single photone detector
with delay-line readout”, A. Czasch et al., Nuclear Instruments
and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066–1070 [0012]
- - „A space- and timeresolved single-photon counting
detector for fluorescence microscopy and spectroscopy”,
X. Michalet et al., Proc. of SPIE Vol. 6092, 609220M (2006) [0029]
- - „Position- and time-sensitive single photon detector
with delay-line readout”, A. Czasch et al., Nuclear Instruments
and Methods in Physics Research A 580 (2007), 1066–1070 [0029]
- - „Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer
Resolution”, E. Betzig et al., Science 313, 1542 (2006) [0042]