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DE102007027006A1 - Mikrobiologische Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd - Google Patents

Mikrobiologische Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd Download PDF

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DE102007027006A1
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glycerol
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cell
cells
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DE102007027006A
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English (en)
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Steffen Dr. Schaffer
Mirja Wessel
Thomas Dr. Haas
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Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden und die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, zu bilden vermag. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Verfahren erhältliche gentechnisch veränderte Zelle, Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, vorzugsweise von 3-Hydroxypropionaldehyd, sowie ein Verfahren zur Herstellung von C<SUB>3</SUB>-Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine gentechnisch veränderte Zelle, ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Verfahren erhältliche, gentechnisch veränderte Zelle, Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd, sowie ein Verfahren zur Herstellung von C3-Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd.
  • 3-Hydroxypropionaldehyd ist eine C3-Verbindung, die durch weitere Oxidation, Reduktion oder Dehydratisierung, sei es biokatalytisch oder chemisch-katalytisch, zu den für die chemische Industrie wichtigen „building blocks" 3-Hydroxypropionsäure, 1,3-Propandiol und Acrolein umgesetzt werden kann. Acrolein ist zum Beispiel ein wichtiges Intermediat für die Herstellung von Methionin (zur Verwendung als Pharma-Aminosäure oder Futtermittel-Additiv), Acrylsäure (Monomer der als Superabsorber verwendeten Polyacrylsäure) oder Acrylsäuremethylestern (Monomere für Hochleistungspolymere).
  • Aus dem Stand der Technik ist bereits bekannt, dass 3-Hydroxypropionaldehyd effizient durch Biotransformation aus Glycerin hergestellt werden kann. Das verantwortliche Enzym ist die Coenzym B12-abhängige Glycerin-Dehydratase, die in einer Reihe von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien nachgewiesen werden konnte. 3-Hydroxypropionaldehyd kann unter anderem durch Biotransformation von Glycerin mit Lactobacillus reuteri-Zellen hergestellt werden (siehe zum Beispiel Doleyres et al.. in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68 (4),2005, Seiten 467–474; Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16–27; Lüthi-Peng et al.. in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 60 (1–2), 2002, Seiten 73–80.)
  • Die Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd mit Lactobacillus reuteri weist mindestens zwei gravierende Nachteile auf. Zum einen vermag Lactobacillus reuteri das gebildete 3-Hydroxypropionaldehyd teilweise zu 1,3-Propandiol (mit Hilfe des Enzyms 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase bzw. 1,3-Propandiol-Dehydrogenase) (siehe zum Beispiel Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16–27) bzw. 3-Hydroxypropionsäure (mit Hilfe des Enzyms 3-Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase) (siehe zum Beispiel Chen et al. in Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61, 2002, Seiten 360–369) umzusetzen, wodurch der 3-Hydroxypropionaldehyd-Ertrag reduziert wird. Diese Nebenprodukte können im Weiteren auch die Aufarbeitung des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds erschweren. Zum anderen hat Lactobacillus reuteri, wie andere Lactobacillen, einen geringen Biomasse-Ertrag, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle. Ursache ist die Unfähigkeit dieser Zellen, Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor zu verwenden. Es werden daher erhebliche Mengen an reduzierten Gärungsprodukten, wie etwa Milchsäure, gebildet. Diese Milchsäure-Bildung wiederum inhibiert das Wachstum der Zellen und führt zu einer Reduzierung des kohlenstoffquellenbezogenen Biomasse-Ertrages und zu erhöhten Kosten für die Herstellung der Biomasse und damit des Biokatalysators.
  • Neben Lactobacillus reuteri wurden auch andere Wirtszellen, wie beispielsweise Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii oder Enterobacter agglomerans, zur fermentativen Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd eingesetzt (siehe zum Beispiel Slininger et al. in Applied Environmental Microbiology, Vol. 46, 1983, Seiten 62–67 und zur Übersicht Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16–27). Der Nachteil des Einsatzes solcher Mikroorganismen zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd besteht allerdings darin, dass aufgrund der im Hinblick auf diese Mikroorganismen bakterioziden Wirkung des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds Semicarbazid zugesetzt werden muss, dass durch Umsetzung mit 3-Hydroxypropionaldehyd zum entsprechenden Semicarbazon 3-Hydroxypropionaldehyd aus dem Nährmedium entfernt. Bei Abwesenheit von Semicarbazid werden nur geringe Mengen 3-Hydroxypropionaldehyd gebildet. (siehe zum Beispiel Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnologe, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16–27). Der Zusatz von Semicarbazid wäre aber im Falle einer großtechnischen Anwendung der Technologie ein erheblicher Kostenfaktor und würde die weitere Aufarbeitung des 3-Hydroxypropionaldehyds erschweren.
  • Schließlich wurden auch bereits rekombinante Zellen beschrieben, die in der Lage sind, 3-Hydroxypropionaldehyd zu bilden (siehe zum Beispiel EP-A-1 669 457 ). Jedoch musste hier Coenzym B12 zugesetzt werden, dass vom Enzym Glycerin-Dehydratase als Cofaktor aufgrund des radikalischen Reaktionsmechanismus benötigt wird, von den eingesetzten Zellen aber nicht selbst gebildet werden kann. Aufgrund des hohen Preises von Coenzym B12 ist auch diese Technologie für eine großtechnische Anwendung ungeeignet.
  • Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
  • Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Zellen bereitzustellen, welche noch effizienter als die aus dem Stand der Technik bekannten Zellen in der Lage sind, Aldehyde aus geeigneten Kohlenstoffverbindungen, insbesondere jedoch 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin herzustellen. Dabei sollten aus dem Glycerin in möglichst geringem Umfang von 3-Hydroxypropionaldehyd verschiedene C3-Verbindungen, so genannte Nebenprodukte, hergestellt werden. Die dafür verwendeten Zellen sollen in der Lage sein, selbsttätig das vom Enzym Glycerin-Dehydratase benötigte Coenzym B12 herzustellen.
  • Weiterhin lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd, anzugeben, mittels dessen diese Aldehyde unmittelbar und insbesondere ohne vorherige Umsetzung mit reaktiven Verbindungen, wie etwa Semicarbazid, hergestellt werden können.
  • Einen Beitrag zur Lösung der vorstehend genannten Aufgaben leistet eine Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden und die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, beispielsweise aus 1,2-Propandiol, aus Triolen oder aus Polyolen, beispielsweise aus D-Galactonat oder D-Mannonat, vorzugsweise jedoch mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, zu bilden vermag. Durch die Fähigkeit der Zelle, selbst Corrionoide zu bilden, ist diese in der Lage, die Aldehyde, vorzugweise 3-Hydroxypropionaldehyd, auch in einem Kulturmedium zu bilden, welches keine Corrionide enthält
  • Völlig überraschend, dafür aber nicht minder vorteilhaft, wurde festgestellt, dass sich gentechnisch veränderte Zellen, die in der Lage sind Coenzym B12 herzustellen, eignen, um effizient beispielsweise 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin herzustellen. Dieses war für den Fachmann keinesfalls vorherzusehen, da aus dem Stand der Technik bekannt war, dass 3-Hydroxypropionaldehyd auf zahlreiche Mikroorganismen, deren Wildtyp auf natürliche Weise kein 3-Hydroxypropionaldehyd bildet und die daher im Gegensatz zu Lactobacillus reuteri nicht an die Bildung dieser Verbindung adaptiert sind, bakteriostatisch oder bakteriozid wirkt (siehe zum Beispiel Chen et al.. in Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61 (3), 2002, Seiten 360–369). Der Einsatz von vorzugsweise ruhenden, gentechnisch veränderten Zellen, die in der Lage sind, Coenzym B12 herzustellen, ermöglicht die effiziente fermentative Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd, ohne dass zur Verminderung von dessen bakterioziden oder bakteriostatischen Wirkung reaktive Verbindungen wie etwa Semicarbazid zugesetzt werden müssen.
  • Unter einem „Corrionoid" wird ein heteroyclisches Ringsystem verstanden, welches mit dem Porphyrin-Ring im Hämoglobin verwand ist. Das Ringsystem des Corrinoids besteht aus vier reduzierten Pyrrol-Untereinheiten (Tetrapyrrol), die auf zwei gegenüberliegenden Seiten über je eine -C(CH3)= Methin-Brücke, auf einer Seite über eine -CH= Methin-Brücke und auf der letzten Seite direkt verbunden sind. Erfindungsgemäß bevorzugte Corrionoide sind insbesondere Vitamin B12, Coenzym B12 und Cobalamin.
  • Unter „ruhenden Zellen" im Sinne der Erfindung werden Zellen verstanden, welche sich in einem Zustand befinden, in dem die Teilungsfähigkeit der Zellen infolge eines Mangels an für eine Teilung erforderlichen Stoffwechselprodukten eingeschränkt, vorzugsweise überhaupt nicht gegeben ist.
  • Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise diejenige Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff "Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
  • Der Begriff „3-Hydroxypropionaldehyd", wie er hierin verwendet wird, beschreibt die entsprechende Verbindung in derjenigen Form, in der sie nach der Herstellung durch die Zellen im Nährmedium vorliegt. Der Begriff "3-Hydroxypropionaldehyd" umfasst daher insbesondere das freie Monomer des 3-Hydroxypropionaldehyds (C3O2H6), das Hydrat des 3-Hydroxypropionaldehyds (C3O3H8), das zyklisierte Dimer des 3-Hydroxypropionaldehyds (C6O4H12), Oligomere des 3- Hydroxypropionaldehyds sowie die als „Reuterin" bekannte Mischung aus dem Monomer, dem Hydrat des 3-Hydroxypropionaldehyd und dem zyklisierten Dimer des 3-Hydroxypropionaldehyds.
  • Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, zu bilden vermag" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine Aldehyde bzw. überhaupt kein 3-Hydroxypropionaldehyd, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindungen zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Verbindung gebildet werden können.
  • Weiterhin soll die Formulierung „mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin" verdeutlichen, dass die Zellen die Aldehyde bzw. 3-Hyroxypropionaldehyd direkt aus den über das Nährmedium angebotenen Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise aus Glycerin, herstellen können, oder aber, dass die Zellen andere Kohlenstoffverbindungen, wie etwa Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide, zunächst zu Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise zu Glycerin, umsetzen können und dann diese Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise das Glycerin, anschließend zu den entsprechenden Aldehyden, vorzugsweise zum 3-Hydroxypropionaldehyd, umsetzen können.
  • In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2 mal, besonders bevorzugt mindestens 10 mal, darüber hinaus bevorzugt mindestens 100 mal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens 1.000 mal und am meisten bevorzugt mindestens 10.000 mal mehr Aldehyde, vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (Aldehyd, vorzugsweise Monomer des 3-Hydroxypropionaldehyds, Hydrat des 3-Hydroxypropionaldehyds, zyklisiertes Dimer des 3-Hydroxypropionaldehyds, Oligomer des 3-Hydroxypropionaldehyds oder Reuterin) im Nährmedium bestimmt wird. Verfahren zur Bestimmung der Menge dieser Verbindungen in einem Nährmedium mittels GC-MS sind beispielsweise durch Chen et al. im Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61 (3), 2002, Seiten 360–369 beschrieben.
  • Die erfindungsgemäßen Zellen können sich grundsätzlich von allen Zellen ableiten, deren Wildtyp bereits in der Lage ist, Corrinoide, vorzugsweise Vitamin B12, Coenzym B12 und Cobalamin zu bilden. Denkbar ist jedoch auch der Einsatz von Zellen, deren Wildtyp nicht oder nicht ausreichend in der Lage ist, Corrinoide zu bilden, die jedoch durch rekombinante Techniken derart verändert wurden, dass sie ausreichende Mengen an Corrinoiden bilden können.
  • Gemäß einer ersten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zellen handelt es sich bei den Zellen um rekombinante Zellen der Gattung Bacillus, insbesondere um solche der Spezies Bacillus megaterium. Bacillus megaterium ist ein Gram-positives, unbewegliches, stäbchenförmiges Bakterium, welches eine Größe von etwa 2 × 5 μm aufweist. Das Bakterium wächst unter aeroben Bedingungen, ist oxidase-negativ und Katalase-positiv. Wie alle Bakterien aus der Gattung Bacillus ist Bacillus megaterium endosporenbildend. Zellen der Spezies Bacillus megaterium sind beispielsweise unter den Hinterlegungsnummern DSM 32T, DSM 90, DSM 319, DSM 321, DSM 322, DSM 333, DSM 337, DSM 339, DSM 344, DSM 509, DSM 510, DSM 786, DSM 1517, DSM 1668, DSM 1669, DSM 1670, DSM 1671, DSM 1804, DSM 2894, DSM 3228 und DSM 3641 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt.
  • Gemäß einer zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zellen handelt es sich bei den Zellen um rekombinante Zellen der Gattung Escherichia, insbesondere der Spezies Escherichia coli oder der Spezies Escherichia blattae. Escherichia blattae zählt zur Familie der Enterobacteriaceae und wächst ebenfalls unter aeroben Bedingungen. Zellen der Spezies Escherichia blattae sind beispielsweise unter den Hinterlegungsnummern DSM 4481 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt.
  • Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle gemäß der ersten und auch gemäß der zweiten besonderen Ausführungsform eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp ge steigerte Aktivität eines Enzyms E1 aufweist, welches die Umsetzung von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd katalysiert.
  • Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E1 als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann.
  • Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
  • Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999 , die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.
  • Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. in Electrophoresis, Volume 22: 1712–23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001), Journal of Bacteriology, 183: 2151–2155). Die Wirkung von DNAbindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624–5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277–2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al.., Electrophoresis, 22: 1712–23 (2001), Lohaus et al.., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999) und Wilson et al.., Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001) beschriebenen Methoden.
  • Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert feedback-inhibierbar sind.
  • Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Riboso menbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch so genannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al.. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al.. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al.. (Gene 102, 93–98 (1991)), in EP-A-0 472 869 , im US 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al.. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al.. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in WO-A-96/15246 , bei Malumbres et al.. (Gene 134, 15–24 (1993), in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vor stehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.
  • Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide eignen sich insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZ1 (Menkel et al.., Applied and Environmental Microbiology 64: 549–554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns et al.., Gene 107: 69–74 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al.., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBLl oder pGAl. Andere Plasmidvektoren, wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 ( US 4,489,160 ) oder pNG2 (Serwold-Davis et al.., FEMS Microbiology Letters 66: 119–124 (1990)), pAG1 ( US 5,158,891 ) oder pWH1520 (Rygus und Rillen, Applied Microbiology and Biotechnology 35: 594–599 (1991)) beruhen, können in gleicher Weise eingesetzt werden.
  • Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al.. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126–132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise Escherichia coli), nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.., Bio/Technology 1: 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al.., Gene 145: 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wiscon sin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84 (1994)), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEMi (Schrumpf et al.., Journal of Bacteriology 173: 4510–4516)) oder pBGS8 (Spratt et al.., Gene 41: 337–342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von Corynebacterium glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.., Applied and Environmental Microbiology 60: 756–759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al.., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356–362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067–1070 (1989) und Tauch et al.., FEMS Microbiology Letters 123: 343–347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
  • Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" ist vorzugsweise stets eine um ein den Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms Ex zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des für Enzyms Ex kodierenden Gens induziert wird.
  • Unter der nachfolgend verwendeten Formulierung „verminderte Aktivität eines Enzyms Ex" wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation, durch Zugabe von kompetitiven oder nicht kompetitiven Inhibitoren oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Expression eines für ein bestimmtes Enzym kodierenden Gens erfolgen.
  • Bei dem Enzym E1, welches die Umsetzung von Glycerin zu 3-Hydroxypropion-aldehyd katalysiert, handelt es sich vorzugsweise um eine Glycerin-Dehydratase bzw. eine Diol-Dehydratase (EC 4.2.1.30). Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere Zellen, die in der Lage sind, Corrinoide zu bilden und in denen die Aktivität der Glycerin-Dehydratase bzw. der Diol-Dehydratase erhöht worden ist. Dieses Enzym wird vorzugsweise von den Genen kodiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pduC, pduD, pduE, pddA, pddB, pddC, dhaB, dhaC, dhaE und den gldABC-Genen aus Lactobacillus reuteri ATCC55730. Vorteilhaft ist weiterhin der Einsatz der in WO-A-2004/056963 beschriebenen Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22, welche die in WO-A-2004/056963 offenbarte SEQ.-ID-Nr. 322 aufweist. Die Nukleotidsequenz dieser und weiterer geeigneter Gene für eine Glycerin-Dehydratase können beispielsweise der „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-Datenbank), den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories entnommen werden. Weiterhin kann es erfindungsgemäß vorteilhaft sein, in den Zellen insbesondere die Glycerin-Dehydratase aus den Gattungen Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Enterobacter, Caloramator, Salmonella und Listeria, besonders bevorzugt die Glycerin-Dehydratase aus den Spezies Klebsiella pneumoniae, Citrobacter pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus leichmannii, Citrobacter intermedium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Enterobacter agglomerans, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium kluyveri, Caloramator viterbensis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgardii, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes und Listeria innocua zu exprimieren, wobei die Expression der Glycerin-Dehydratase aus den Zellen der Spezies Lactobacillus reuteri in Bacillus megaterium-, Escherichia coli- oder Escherichia blattae-Zellen am meisten bevorzugt ist. Besonders bevorzugt ist daher eine Bacillus megaterium-, Escherichia coli- oder Escherichia blattae-Zelle, in der eine Glycerin-Dehydratase exprimiert wird, die von dem Gen für die Glycerin-Dehydratase aus Lactobacillus reuteri kodiert wird. Im Zusammenhang mit der Diol-Dehydratase kann es vorteilhaft sein, in den Zellen insbesondere die Diol-Dehydratase aus den Gattungen Klebsiella, Propionibacterium, Clostridium, Lactobacillus, Salmonella, Citrobacter, Flavobacterium, Acetobacterium, Brucella und Fusobacterium, besonders bevorzugt aus den Spezies Klebsiella pneumoniae, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium glycolicum, Lactobacillus brevis, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Lactobacillus buchneri, Brucella melitensis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes und Listeria innocua zu exprimieren.
  • Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in der Zelle zusätzlich zur Aktivität des Enzyms E1 auch die Aktivität eines Enzyms E2 erhöht ist, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym E1 katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E2 vorzugsweise um den Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor oder einen Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor handelt. Bei dem Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor bzw. dem Diol-Dehydratase-Reaktivierungs-faktor handelt es sich um einen Faktor, der in der Lage ist, dass nach Durchführung der Umsetzung von Glycerin zum 3-Hydroxypropionaldehyd inaktivierte Zentrum der Dehydratase zu reaktivieren. Das aktive Zentrum der Glycerin-Dehydratase bzw. der Diol-Dehydratase umfasst das Coenzym B12, welches nach der Umsetzung des Glycerins zum 3-Hydroxypropionaldehyd inaktiviert wird. Der Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor bzw. der Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor sind in der Lage, dieses inaktivierte Coenzym B12 durch ein aktives Coenzym B12 zu ersetzen. Vorzugsweise umfasst der Dehydratase-Reaktivierungsfaktor eine große Untereinheit des Glycerin-Dehydratase- Reaktivierungsfaktors oder des Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors und eine kleine Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors oder des Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors, besonders bevorzugt eines große Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors und eine kleine Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors oder des Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors, am meisten bevorzugt eines Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors und eine kleine Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors. Weiterhin kann beispielsweise die große Untereinheit des Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors vom ddrA-Gen und die große Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors vom gdrA-Gen kodiert werden, während die kleine Untereinheit des Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors vom ddrB-Gen und die kleine Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors vom gdrB-Gen kodiert werden kann. Besonders vorteilhaft ist insbesondere die Expression der gldDE-Gene aus Lactobacillus reuteri ATCC55730 in den erfindungsgemäßen Zellen. Beispielsweise kann in den erfindungsgemäßen Zellen der Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor aus Zellen der Gattung Lactobacillus, Klebsiella, Citrobacter, Clostridium und Enterobacter exprimiert werden, insbesondere aus Zellen der Spezies Lactobacillus sp., Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus leichmannii, Citrobacter freundii, Citrobacter intermedium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Clostridium pasteurianum, Enterobacter agglomerans und Clostridium kluyveri und am meisten bevorzugt aus Zellen der Spezies Lactobacillus reuteri. Der Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor stammt vorzugsweise aus Zellen der Gattung Klebsiella, Citrobacter, Propionibacterium, Lactobacillus, Flavobacterium und Acetobacterium, insbesondere aus den Spezies Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Flavobacterium sp. und Acetobacterium sp., wobei der Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor aus der Gattung Lactobacillus, insbesondere aus den Spezies Lactobacillus brevis und Lactobacillus buchneri am meisten bevorzugt ist.
  • Weiterhin können im Falle einer Expression der Dehydratase und des Dehydratase-Reaktivierungsfaktors in den erfindungsgemäßen Zellen diese beiden Komponenten aus der gleichen Spezies oder aber von unterschiedlichen Spezies stammen.
  • Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in der Zelle neben der Aktivität des Enzyms E1 und gegebenenfalls auch der Aktivität des Enzyms E2 die Aktivität eines Enzyms E3 erhöht ist, welches die Diffusion von Glycerin in die Zelle hinein erleichtert. Durch diese Maßnahme kann das Vermögen der Zelle, über das Nährmedium bereitgestelltes Glycerin aufzunehmen und intrazellulär zu 3-Hydroxypropionaldehyd umzusetzen, verbessert werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Enzym E3 um einen Glycerin-Kanal bzw. einen Glycerin-Facilitator (TC 1.A.8.1.1, TC 1.A.8.2.1 oder TC 1.A.8.2.2), der vorzugsweise vom glpF-Gen kodiert wird.
  • Im Falle einer erfindungsgemäßen Zelle, welche 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin herstellen kann, ist es grundsätzlich auch denkbar, die erfindungsgemäße Zelle durch rekombinante Maßnahmen derart zu modifizieren, dass sie nicht nur über das Nährmedium bereitgestelltes Glycerin aufnehmen und intrazellulär zu 3-Hydroxypropionaldehyd umsetzen kann, sondern dass sie gegebenenfalls auch über das Nährmedium bereitgestellte Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide aufnehmen, intrazellulär zu Glycerin umsetzen und dann das Glycerin intrazellulär zu 3-Hydroxypropionaldehyd umsetzen kann. Alternativ kann das gebildete Glycerin zwischenzeitlich auch extrazellulär akkumulieren, bevor es wieder in die Zelle aufgenommen und intrazellulär zu 3-Hydroxypropionaldehyd umgesetzt wird. In diesem Zusammenhang kann es insbesondere vorteilhaft sein, wenn in den Zellen zusätzlich zur Aktivität des Enzyms E1 und gegebenenfalls der Enzyme E2 und E3 auch die Aktivität mindestens eines der Enzyme E4, E5, E6 oder E7 erhöht ist:
    • – eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton-Phosphat zu Glycerin-3-Phosphat katalysiert;
    • – eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Glycerin-3-Phosphat zu Glycerin katalysiert;
    • – eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton-Phosphat zu Dihydroxyaceton katalysiert;
    • – eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton zu Glycerin katalysiert.
  • Bevorzugte Zellen sind insbesondere diejenigen Zellen, in denen die Aktivität folgender Enzyme bzw. Kombination von Enzymen erhöht ist: E1E4, E1E5, E1E6, E1E7, E1E4E5, E1E4E6, E1E4E7, E1E5E6, E1E5E7, E1E6E7, E1E2E4, E1E2E5, E1E2E6, E1E2E7 und E1E2E4E5E6E7, wobei die Kombination E1E2E4E5E6E7 am meisten bevorzugt ist.
  • In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass das Enzym
    E4 eine Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.8),
    E5 eine Glycerin-3-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.21),
    E6 Dihydroxyaceton-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.1), und
    E7 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6)
    ist.
  • Die Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gpo1, Gpd2, LOC607942, Gpdh und gpsA kodiert. Die Glycerin-3-Phosphat-Phosphatase wird vorzugsweise von dem entsprechenden Gen dieses Enzyms aus Escherichia coli kodiert. Die Dihydroxyaceton-Phosphat-Phosphatase wird vorzugweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend phoA, ALPI, ALPL, ALPP, ALPPL2, Akp2, Akp3 und Akp5 kodiert, während die Glycerin-Dehydrogenase vorzugsweise vom gldA-Gen kodiert wird.
  • Die Nukleotidsequenzen weiterer geeigneter Gene der Enzyme E4 bis E7 können der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
  • Weiterhin kann es im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Zelle auch vorteilhaft sein, wenn die Zelle zusätzlich zur Erhöhung des Enzyms E1, zur Erhöhung des Enzyms E1 und E2, zur Erhöhung der Enzyme E1, E2 und eines oder mehrerer der E3 bis E7 eine verminderte Aktivität mindestens eines der Enzyme E6 bis E11 aufweist:
    • – eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von Glycerin zu Glycerol-3-Phosphat katalysiert;
    • – eines Enzyms E9, welches die Umsetzung von Glycerin zu Dihydroxyaceton katalysiert;
    • – eines Enzyms E10, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionaldehyd zu 1,3-Propandiol katalysiert;
    • – eines Enzyms E11, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionaldehyd zu 3-Hydroxypropionsäure katalysiert.
  • Bevorzugte Zellen sind insbesondere diejenigen Zellen, in denen die Aktivität folgender Enzyme bzw. Kombination von Enzymen vermindert ist: E8, E9, E10, E11, E8E9, E8E10, E8E11, E9E10, E9E11, E10E11 und E8E9E10E11, wobei die Kombination E8E9E10E11 am meisten bevorzugt ist.
  • In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass das Enzym
    E8 eine Glycerin-Kinase (EC 2.7.1.30),
    E9 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6 oder EC 1.1.1.156 oder EC 1.1.99.22) und
    E10 eine 1,3-Propandiol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.202)
    E11 eine 3-Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3 oder EC 1.2.1.5)
    ist.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die in der Lage ist, Corrionoide zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhö hung der Aktivität eines Enzyms E1, welches die intrazelluläre Umsetzung von Diolen, Triolen oder Polyolen zu Aldehyden, vorzugsweise von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd, katalysiert. Bevorzugte Enzyme E1 sind dabei insbesondere diejenigen, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Zellen genannt worden sind.
  • Weiterhin ist es gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt des Erhöhens der Aktivität eines Enzyms E2, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym E1 katalysiert, und gegebenenfalls auch zusätzlich die Erhöhung eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton-Phosphat zu Glycerin-3-Phosphat katalysiert, und/oder eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Glycerin-3-Phosphat zu Glycerin katalysiert, und/oder eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton-Phosphat zu Dihydroxyaceton katalysiert, und/oder eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton zu Glycerin katalysiert, umfasst, wobei bevorzugte Enzyme E2, E4, E5, E6 und E7 wiederum diejenigen sind, die bereits eingangs im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Zelle genannt worden sind.
  • Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle auch noch den Verfahrensschritt der Verminderung der Aktivität eines oder mehrere der im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Zelle genannten Enzyme E8 bis E11 umfassen.
  • Sofern die erfindungsgemäßen Zellen Aldehyde aus Diolen, beispielsweise Propionaldehyd aus 1,2-Propandiol, herstel len können, ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E12 aufweist, welches die Umsetzung von 1,2-Diolen zu den entsprechenden Aldehyden katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E12 vorzugsweise um eine Diol-Dehydratase handelt. Sofern die erfindungsgemäßen Zellen Aldehyde aus Polyolen, beispielsweise 2-Dehydro-3-deoxy-D-Galactonat aus D-Galactonat oder 2-Dehydro-3-deoxy-D-Gluconat aus D-Mannonat herstellen können, ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E13 aufweist, welches die Umsetzung von Polyolen zu den entsprechenden Aldehyden katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E13 vorzugsweise um eine D-Galactonat-Dehydratase oder um eine D-Mannonat-Dehydratase handelt.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältliche Zelle.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
    • i) in Kontakt bringen einer erfindungsgemäßen Zelle oder einer durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Zelle mit einem Kulturmedium, welches die Bildung von Biomasse ermöglicht, wobei dieses in Kontakt bringen der Zelle mit dem Nährmedium vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, unter denen keine Aldehyde, vorzugswei se kein 3-Hydroxypropionaldehyd, in für die Zellen toxischer Konzentration gebildet werden;
    • ii) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium;
    • iii) in Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Biomasse um mindestens 50 besonders bevorzugt um mindestens 90%, besonders bevorzugt um mindestens 99 gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrensschritt i) gebildeten Biomasse reduziert ist und welches Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise Glycerin, beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus den Diolen, Triolen oder Polyolen Aldehyde, vorzugsweise aus dem Glycerin 3-Hydroxypropionaldehyd, bilden;
    • iv) gegebenenfalls Aufreinigung der gebildeten Aldehyde, vorzugsweise des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds, aus dem Kulturmedium.
  • Im Verfahrensschritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine erfindungsgemäße Zelle oder eine durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche Zelle mit einem Kulturmedium, welches die Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht, in Kontakt gebracht. Die Formulierung „welches die Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht" soll dabei zum Ausdruck bringen, dass die Zellen in dem im Verfahrensschritt i) eingesetzten Kulturmedium in der Lage sind, sich ausreichend zu teilen.
  • Bei dem im Verfahrensschritt i) eingesetzten Kulturmedium handelt es sich vorzugsweise um ein Nährmedium beinhaltend als Kohlenstoffquelle vorzugsweise Kohlenhydrate, insbesondere Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide, Glycerin oder eine Mischung aus Kohlenhydraten, insbesondere Glucose, und Glycerin. Sofern die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, vorzugsweise von 3-Hydroxypropionaldehyd, eingesetzten Zellen in der Lage sind, Aldehyde, insbesondere 3-Hydroxypropionaldehyd aus Kohlenhydraten wie etwa Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide herzustellen, ist es vorteilhaft, dass die Aktivität des Enzyms E1 und gegebenenfalls auch die Aktivität des Enzyms E2 während der Durchführung des Verfahrensschrittes i) noch nicht erhöht ist, um zu verhindern, dass schon im Verfahrensschritt i) Aldehyde, insbesondere 3-Hydroxypropionaldehyd, gebildet wird. Dieses kann beispielsweise dadurch realisiert werden, dass die Gene des Enzyms E1 und gegebenenfalls des Enzyms E2 sich in den Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren befinden und erst im Verfahrensschritt iii) diese Promotoren induziert werden. Wird beispielsweise der lacZ-Promotor eingesetzt, so könnte die Expression der unter der Kontrolle dieses Promotors liegenden Gene für das Enzym E1 und gegebenenfalls auch für das Enzym E2 durch die Zugabe geeigneter Induktoren wie etwa IPTG erst im Verfahrensschritt iii) erfolgen. Denkbar ist weiterhin der Einsatz von Promotoren, die über bestimmte physikalische Parameter, wie etwa die Temperatur, reguliert werden können, um die Expression des Enzyms E1 und gegebenenfalls auch des Enzyms E2 zu steuern.
  • Die erfindungsgemäßen, gentechnisch veränderten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Erzeugung von Biomasse im Verfahrensschritt i) mit dem Nährmedium in Kontakt gebracht und somit kultiviert werden. Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.
  • Das zu verwendende Kulturmedium im Verfahrensschritt i) muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
  • Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie Z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure oder Glycerin verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kohlehydraten, insbesondere von Glucose, oder von Glycerin.
  • Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
  • Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
  • Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 80°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.
  • Nachdem im Verfahrensschritt i) eine ausreichende Biomasse von rekombinanten Bacillus megaterium-, Escherichia coli- oder Escherichia blattae-Zellen hergestellt worden ist, kann es, insbesondere dann, wenn die Zellen nicht an ein oder in einem Substrat immobilisiert und in dieser Form im Verfahrensschritt iii) zur Herstellung von Aldehyden bzw. 3-Hydroxypropionaldehyd eingesetzt werden sollen, vorteilhaft sein, die so erhaltenen Zellen im Verfahrensschritt ii) von dem verwendeten Kulturmedium abzutrennen. Das Abtrennen der Zellen erfolgt dabei mittels dem Fachmann bekannter Abtrennverfahren. Denkbar ist in diesem Zusammenhang insbesondere eine kontinuierliche Abtrennung der Zellen von dem Nährmedium beispielsweise mittels eines geeigneten Filters, etwa mittels eines Filters mit einer Ausschlußgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder einer Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.
  • Die auf diese Weise abgetrennten Zellen werden, wenn sie in mehreren nacheinander durchgeführten Trennstufen erhalten wurden, gegebenenfalls vereinigt und können direkt dem Verfahrensschritt iii) zugeführt werden. Es kann sich jedoch als vorteilhaft erweisen, die Zellen vor der Durchführung des Verfahrensschrittes iii) noch zu waschen, wobei dieses Waschen vorzugsweise bereits mit demjenigen Kulturmedium erfolgt, welches im Verfahrensschritt iii) eingesetzt wird. Zum Waschen der Zellen können diese beispielsweise in einem geeigneten Volumen des im Verfahrensschritt iii) eingesetzten Kulturmediums resuspendiert und anschließend durch die vorstehend beschriebenen Abtrennverfahren, insbesondere durch Filtration, Sedimentation oder Zentrifugation, oder aber durch eine Kombination dieser Maßnahmen, von dem Kulturmedium befreit werden. Auf diese Weise können die Zellen von denjenigen Komponenten des im Verfahrensschritt i) eingesetzten Nährmediums, welche insbesondere ein Wachstum der Zellen ermöglichen (Stickstoffverbindungen, Phosphorverbindungen, essentielle Aminosäuren und dergleichen) befreit werden.
  • Im Verfahrensschritt iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen dann als „ruhende Zellen" mit einem Kulturmedium, in welchem die auf eine Zeit- und Volumeneinheit bezogene Biomasse-Bildung um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 90%, besonders bevorzugt um mindestens 99% gegenüber der auf eine Zeit- und Volumeneinheit bezogene Biomassebildung im Verfahrensschritt i) reduziert ist, und welches Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise Glycerin, beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus den Diolen, Triolen oder Polyolen Aldehyde, vorzugsweise aus dem Glycerin 3-Hydroxypropionaldehyd, bilden, in Kontakt gebracht. Am meisten bevorzugt erfolgt im Verfahrensschritt iii) der Einsatz eines Kulturmediums, in dem keine nachweisbare Biomassenbildung mehr erfolgt, sich die Zellen also kaum noch nennenswert teilen. Eine Reduktion der Biomassebildung von 50% ist beispielsweise erreicht, wenn in dem im Verfahrensschritt i) eingesetzten Kulturme dium unter den Kultivierungsbedingungen im Verfahrensschritt i) 10 g Mikroorganismen pro Liter und pro Stunde gebildet werden, während im Verfahrensschritt iii) mittels des dort eingesetzten Kulturmediums unter den gleichen Kultivierungsbedingungen wie im Verfahrensschritt i) nur 5 g Mikroorganismen pro Liter und pro Stunde gebildet werden.
  • In diesem Kulturmedium sind die erfindungsgemäßen Zellen dann in der Lage, die über das Kulturmedium angebotenen Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise das angebotene Glycerin, in hoher Ausbeute zu Aldehyden, vorzugsweise zu 3-Hydroxypropionaldehyd, umzusetzen.
  • Sofern, wie vorstehend beschrieben, die Aktivität des Enzyms E1 und gegebenenfalls auch des Enzyms E2 beispielsweise durch den Einsatz geeigneter Promotoren erst im Verfahrensschritt iii) erhöht wird, enthält das im Verfahrensschritt iii) eingesetzte Kulturmedium neben dem Glycerin auch geeignete Induktoren des Promotors bzw. werden entsprechende physikalische Parameter, wie etwa die Temperatur, im Verfahrensschritt iii) entsprechend eingestellt, um die Expression der Enzyme zu induzieren.
  • Als Kulturmedium können im Verfahrensschritt iii) alle dem Fachmann bekannten Lösungsmittel bzw. Lösungen eingesetzt werden, die geeignet sind, um Zellen der Spezies Bacillus megaterium, Escherichia coli oder Escherichia blattae zu kultivieren, ohne dass sich diese Zellen in nennenswertem Maße teilen, jedoch ohne die Vitalität der Zellen in nennenswertem Maße zu beeinträchtigen. So sollen die Zellen nach einer gegebenenfalls in einem weiteren Verfahrensschritt v) erfolgenden Abtrennung von dem im Verfahrens schritt iii) eingesetzten Kulturmedium möglichst wieder in der Lage sein, bei einer Resuspendierung in einem die Zellteilung ermöglichenden Nährmedium wieder neue Biomasse zu bilden.
  • Denkbar als Kulturmedium im Verfahrensschritt iii) ist beispielsweise der Einsatz von Wasser, von gepufferten Salzlösungen wie etwa PBS („phosphate buffered saline") oder anderen Salzlösungen, wobei diese Medien vorzugsweise geeignete pH-Puffersysteme, wie etwa HEPES, MOPS oder andere Pufferkomponenten beinhalten.
  • Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass das im Verfahrensschritt iii) eingesetzte Kulturmedium keine Corrinoide, vorzugsweise kein Coenzym B12, kein Vitamin B12 und kein Cobalamin beinhaltet.
  • Die so gebildeten Aldehyde bzw. das so gebildete 3-Hydroxypropionaldehyd können dann in einem weiteren Verfahrensschritt iv) von dem im Verfahrensschritt iii) eingesetzten Kulturmedium und von gegebenenfalls nicht umgesetzten Glycerin abgetrennt und somit aufgereinigt werden, wobei diese Aufreinigung durch dem Fachmann bekannte Verfahren, wie beispielsweise durch Kristallisation, durch Lyophilisierung, durch chromatographische Verfahren oder durch eine Kombination dieser Verfahren erfolgen kann. Weitere Möglichkeiten zur Aufreinigung von beispielsweise 3 Hydroxypropionaldehyd und dessen Derivaten können unter anderem Vollenweider et al. in Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 51, 2003, Seiten 3.287–3.293 entnommen werden, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Aufreinigung von 3-Hydroxypropionaledehyd aus Fermentationslösungen hiermit als Referenz eingeführt wird und einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet. Nach Aufreinigung der Aldehyde kann im Falle des 3-Hydroxypropionaldehyds eine Zusammensetzung erhalten werden, die, je nach Art des Aufreinigungsverfahrens, neben dem Monomer des 3-Hydroxypropionaldehyds auch das Hydrat des 3-Hydroxypropionaldehyds, das zyklisierte Dimer des 3-Hydroxypropionaldehyds und gegebenenfalls weitere Oligomere des 3-Hydroxypropionaldehyds beinhaltet.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
    • I) in Kontakt bringen einer erfindungsgemäßen Zelle, in der neben der Aktivität des Enzyms E1 und gegebenenfalls auch des Enzyms E2 auch die Aktivität mindestens eines der, vorzugsweise aller Enzyme E4 bis E7 erhöht ist, mit einem Kulturmedium, welches eine Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht, wobei dieses in Kontakt bringen der Zelle mit dem Nährmedium vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, unter denen keine Aldehyde, vorzugsweise kein 3-Hydroxypropionaldehyd, in für die Zellen toxischer Konzentration gebildet werden;
    • II) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium;
    • III) in Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Biomasse um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 90 besonders bevorzugt um mindestens 99 gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrensschritt I) gebildeten Biomasse reduziert ist und welches Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide sowie gegebenenfalls auch Glycerin beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus der Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden über Glycerin als Zwischenprodukt und gegebenenfalls auch direkt aus Glycerin 3-Hydroxypropionaldehyd bilden;
    • IV) gegebenenfalls Aufreinigung des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds aus dem Kulturmedium.
  • Hinsichtlich der Einzelheiten zu diesem Verfahren wird auf die entsprechenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, umfassend die Verfahrensschritte i) bis iv) verwiesen.
  • Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von C3-Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd, umfassend die Verfahrensschritte:
    • A) Bereitstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin oder des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3- Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden;
    • B) chemische oder biokatalytische Umsetzung des 3-Hydroxypropionaldehys durch Reduktion, Oxidation oder Dehydratisierung unter Erhalt von C3-Verbindungen;
    • C) gegebenenfalls die weitere chemische oder biokatalytische Umsetzung der im Verfahrensschritt II) erhaltenen C3-Verbindung durch Reduktion, Oxidation oder Addition.
  • Zunächst wird im Verfahrensschritt I) 3-Hydroxypropionaldehyd mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin oder des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden bereitgestellt, wobei dieses gegebenenfalls, wie vorstehend im Zusammenhang mit diesen Verfahren beschrieben, aus der Fermentationslösung aufgereinigt worden sein kann.
  • Im Verfahrensschritt II) kann 3-Hydroxypropionaldehyd dann chemisch oder biokatalytisch durch Reduktion, Oxidation oder Dehydratisierung unter Erhalt von C3-Verbindungen, insbesondere unter Erhalt von 1,3-Propandiol (Reduktion), Acrolein (Dehydratisierung) oder 3-Hydroxypropionsäure (Oxidation), umgesetzt werden. Dabei sind Einzelheiten zur Umsetzung von 3-Hydroxypropionaldehyd zu Acrolein unter anderem durch Hall und Stern in Journal of the Chemical Society, 1950, Seiten 490–498 beschrieben, während Einzelheiten zur Herstellung von 1,3-Propandiol aus 3-Hydroxypropionaldehyd unter anderem der US 5,334,778 entnommen werden können. Die Herstellung von 3- Hydroxypropionsäure aus 3-Hydroxypropionaldehyd wiederum ist unter anderem in US 6,852,517 beschrieben.
  • Gegebenenfalls können die im Verfahrensschritt C) erhaltenen C3-Verbindungen in einem weiteren Verfahrensschritt D) chemisch oder mikrobiologisch durch Reduktion, Oxidation oder Addition noch weiter umgesetzt werden. In Betracht kommt hier insbesondere die Umsetzung von im Verfahrensschritt C) erhaltenem Acrolein durch Oxidation zur Acrylsäure, die dann gegebenenfalls in einem noch weiteren Verfahrensschritt D) radikalisch unter Bildung von auf Acrylsäure basierenden Polymeren umgesetzt werden kann. In Betracht kommt hier insbesondere die radikalische Polymerisierung von gegebenenfalls teilneutralisierter Acrylsäure in Gegenwart geeigneter Vernetzer unter Bildung wasserabsorbierender Polyacrylate, die auch als „Superabsorber" bezeichnet werden. Die chemische Oxidation von Acrolein zu Acrylsäure und die anschließende radikalische Polymerisation der so erhaltenen Acrylsäure ist unter anderem in der WO-A-2006/136336 beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Beispiele näher erläutert:
  • Beispiel 1
  • (Vergleichende Analyse der Resistenz von ruhenden Bakterienzellen gegenüber 3-Hydroxypropionaldehyd)
    • – Zur Analyse der Resistenz ruhender Bakterienzellen gegenüber 3-Hydroxypropionaldehyd (3-Hydroxypropionaldehyd) wurde in einem Zwei-Stufen- Prozess eine wässrige 3-Hydroxypropionaldehyd-Lösung hergestellt. Dazu wurden 10 ml MRS-Medium (Difco, Heidelberg), welches zusätzlich 20 mM Glycerin enthielt, mit 1% (v/v) einer Gefrierkultur von L. reuteri beimpft, 18 h ohne Schütteln bei 37°C inkubiert und diese Vorkultur vollständig zu 40 ml frischem MRS-Medium gegeben und weitere 6 h bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Die zweite Vorkultur wurde ebenfalls vollständig in 1 l frisches MRS-Medium überführt und 15 h bei 37°C ohne Schütteln in einer 1000-ml-Schottflasche kultiviert. Anschließend wurden die Zellen geerntet (10 min, 4000 g, RT), mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer gewaschen und direkt für die Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd eingesetzt. Das Zellpellet wurde in 100 ml 250 mM Glycerin resuspendiert, um die Biotransformation von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd zu starten. Nach 60 min wurde der Ansatz erneut zentrifugiert (10 min, 12000 g, 4°C; der resultierende Überstand enthielt 160 mM 3-Hydroxypropionaldehyd. Die Quantifizierung von 3-Hydroxypropionaldehyd wurde mittels eines colorimetrischen Tests gemäß Doleyres et al. („Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process with Lactobacillus reuteri, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68, 2005, Seiten 467–474) durchgeführt.
    • – Zur Analyse der Wirtsresistenz wurden 5 ml LB-Medium (nach Miller; Merck KGaA, Darmstadt) mit B. megaterium DSM319- bzw. E. blattae DSM4481-Zellen von einer frischen LB-Platte (nach Miller; Merck KGaA, Darmstadt) angeimpft und ca. 8 h bei 37°C und mit 180 rpm inkubiert. Anschließend wurden 100 ml LB-Medium mit 1,5% (v/v) der Vorkultur beimpft und die Zellen bis zur stationären Phase (ca. 16 h) bei 37°C, 180 rpm kultiviert. L. reuteri-Zellen wurden wie oben beschrieben in MRS-Medium (ohne Glycerin) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen durch eine Zentrifugation (10 min, 5292 g, 4°C) geerntet, einmal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und in 5 ml der oben beschriebenen 160 mM 3-Hydroxypropionaldehyd-Lösung resuspendiert. Die Biomassekonzentration betrug ~1 × 1010 Zellen pro ml.
    • – Die Ansätze wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und jeweils nach 10 min 100 μl-Proben zur Bestimmung der Lebendzellzahl entnommen. Dazu wurden geeignete Verdünnungen der Zellsuspension in Verdünnungslösung (0,85% (w/v) NaCl, 0,1% (w/v) Pepton aus Casein) auf MRS-Agarplatten ausplattiert und 48 h anaerob bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellkolonien ausgezählt und die Lebendzellzahl bestimmt. Es wurde beobachtet, dass ebenso wie bei Lactobacillus reuteri ATCC55730 die Inkubation ruhender B. megaterium DSM319- bzw. E. blattae DSM4481-Zellen mit 3-Hydroxypropionaldehyd nicht zu einer signifikanten Reduktion der Lebendzellzahl innerhalb des analysierten Zeitraums führt. Die 3-Hydroxypropionaldehyd-Konzentration nahm über den analysierten Zeitraums hinweg nicht signifikant ab.
  • Beispiel 2
  • (Herstellung einer rekombinanten B. megaterium-Zelle, bei der die Aktivität der Glycerin-Dehydratase erhöht worden ist)
    • – Zur Überexpression der Lactobacillus reuteri ATCC55730 Gene gldABC (Enzym E1) und gldDE (Enzym E2, siehe auch GenBank-Einträge DQ233724-DQ233720) (SEQ.-ID-Nr. 01) in Escherichia blattae DSM4481 und Bacillus megaterium DSM319 wurde das Plasmid pWH1520-gldABCDE konstruiert (SEQ.-ID Nr. 02). Chromosomale DNA aus Lactobacillus reuteri ATCC55730 diente als Matrize für eine PCR mit dem „ExpandTM High Fideltiy"-PCR-Kit von Roche Diagnostics (Mannheim), gemäß Angaben des Herstellers. Der kodierende Bereich der die Glycerin-Dehydratase (gldABC) und den zugehörigen Reaktivierungsfaktors (gldDE) kodierenden Gene einschließlich 34 bp vor dem gldA-Startkodon wurde mit Hilfe der Oligonukleotide Bm GDfw XmaI (SEQ.-ID-Nr. 03) und Bm GDRFrv SphI (SEQ.-ID-Nr. 04) aus der chromosmalen DNA von Lactobacillus reuteri ATCC55730 in einer PCR amplifiziert ("PCR protocols. A guide to methods and applications", 1990, Academic Press) und auf diesem Wege am 5'-Ende bzw. 3'-Ende mit einer XmaI bzw. einer SphI-Schnittstelle versehen. Dafür wurden die folgenden Oligonukleotide eingesetzt:
    • – Bm_GDfw_XmaI: 5'-TCC CCC CGG GCA TTA AGT AGA TCT GGA AGG AGG A-3' (SEQ.-ID-Nr. 02, beinhaltend eine XmaI-Erkennungssequenz am 5'-Ende)
    • – Bm_GDRFrv_SphI: 5'-ACA TGC ATG CAA ATC ACC TGT TTA CCA TTT CCT T-3' (SEQ.-ID-Nr. 03, beinhaltend eine SphI-Erkennungssequenz am 5'-Ende)
    • – Das PCR-Produkt (5.212 Basenpaare) wurde mittels des QIAquick PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt und anschlie ßend mittels der Restriktionsendonukleasen XmaI und SphI (gemäß den Angaben des Herstellers, New England Biolabs, Schwalbach) geschnitten. Das nunmehr 5.202 bp große Fragment wurde in den XmaI/SphI-geschnittenen Expressionsvektor pWH1520 (7.896 Basenpaare; beschrieben durch Rygus und Rillen in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 35 (5), 1991, Seiten 594–599) ligiert. Das resultierende Plasmid pWH1520-gldABCDE (SEQ.-ID-Nr. 02) ist 13.098 Basenpaare groß. Die Ligation sowie die Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen (New England Biolabs, Schwalbach) erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Die Authentizität des Inserts wurde durch eine DNA-Sequenzanalyse überprüft.
    • – Das Plasmid pWH1520-gldABCDE wie auch der Leervektor pWH1520 wurden mittels Protoplastentransformation gemäß Biedendieck (Biedendieck, „Versatile Tools for Production, Secretion and Purification of Recombinant Proteins", 2006, Dissertation, S. 45–47) in B. megaterium DSM319 eingebracht. Der resultierende Stamm wurde B. megaterium/pWH1520-gldABCDE genannt.
  • Beispiel 3
  • (Herstellung einer rekombinanten E. blattae-Zelle, bei der die Aktivität der Glycerin-Dehydratase erhöht worden ist)
    • – Um die Eignung von E. blattae für die Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd zu testen, wurde zunächst der B. megaterium xylA-Promoter in Plasmid pWH1520-g1dABCDE durch den lacZ-Promoter aus E. coli ersetzt. Dazu wurde der lacZ-Promoter mittels PCR gemäß Innis et al. unter Verwendung von pUC19-DNA (GenBank-Eintrag L09137) als Matrize und folgender Oligonukleotide amplifiziert: PlacZ-fw: 5'- TAT ATA GCT AGC CTC ATT AGG CAC CCC AGG C-3' (SEQ.-ID Nr. 05, beinhaltend eine NheI-Erkennungssequenz am 5'-Ende) PlacZ-rv: 5'- TAT ATA CCC GGG CAA TTC CAC ACA ACA TAC GAG CC-3' (SEQ.-ID Nr. 06, beinhaltend eine XmaI-Erkennungssequenz am 5'-Ende) Das PCR-Produkt (84 Basenpaare) wurde mittels des QIA-quick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde mittels NheI und XmaI (ebenfalls gemäß den Angaben des Herstellers der Restriktionsendonukleasen, New England Biolabs, Schwalbach) verdaut und in den NheI/XmaI-geschnittenen Vektor pWH1520-gldABCDE (Beispiel 2) unter Erhalt des Vektors pWH1520-gldABCDE-lacZ (10.896 Basenpaare, SEQ.-ID-Nr. 07) ligiert. Die Authentizität des Inserts wurde mittels DNA-Sequenzierung bestimmt. Ligation des Expressionsvektors sowie die Herstellung und die Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Um die Eignung von via directed evolution verbesserten Glycerin-Dehydratasen für die Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd zu prüfen, wurde die in Patenanmeldung WO-A-2004/056963 unter der SEQ.-ID-Nr. 322 aufgeführte Klebsiella pneumoniae Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22 verwendet. Diese Variante zeichnet sich gegenüber dem Wildtyp-Biokatalysator durch knapp sechsfach erhöhten Umsatz von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd in Gegenwart von 600 mM 1,3-Propandiol aus. Die entsprechende kodierende Sequenz (SEQ.-ID-Nr. 08) wurde durch die GeneArt AG (Regensburg) synthetisiert. Um ein synthetisches Operon aus der die Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22 kodierenden Sequenz und den kodierenden Sequenzen des zugehörigen Reaktivierungsfaktors (große und kleine Untereinheit) zu konstruieren, wurde zunächst die Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22 kodierende Sequenz mittels PCR (gemäß Innis et al.) mit dem durch GeneArt bereitgestellten Vektor, welcher als Insert die Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22 kodierende Sequenz enthält, als Matrize und folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: GD-fw: 5'- TAT ATA CCC GGG AAG GAG GAC TAC TTT ATT ATG AAA AGA TCA AAA CGA TTT GCA G-3' (SEQ.-ID Nr. 09, beinhaltend eine XmaI-Erkennungssequenz am 5'-Ende) GD-rv: 5'- GAC ATG GTA TAT CTC CTT AGC TTC CTT TAC GTA GCT TAT GCC-3' (SEQ.-ID Nr. 10) Das PCR-Produkt (2.738 Basenpaare) wurde mittels des QIAquick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt. Parallel wurde das in Patentanmeldung EP-A-1 669 457 beschriebene synthetische Operon aus den die große und kleine Untereinheit des zugehörigen Reaktivierungsfaktors aus Klebsiella pneumoniae ATCC25955 kodierenden Sequenzen unter Verwendung von Vektor 2 (SEQ.-ID-Nr. 02 in EP-A-1 669 457 ) mit folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: GDRF-fw: 5'-GGA AGC TAA GGA GAT ATA CCA TGT CGC TTT CAC C-3' (SEQ.-ID Nr. 11) GDRF-rv: 5'-TAT ATA GCA TGC TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG-3' (SEQ.-ID Nr. 12, beinhaltend eine SphI-Erkennungssequenz am 5'-Ende Das PCR-Produkt (2.234 Basenpaare) wurde mittels des QIAquick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt. Im nächsten Schritt wurde mittels crossover-PCR (gemäß Innis et al.) unter Verwendung der beiden primären PCR-Produkte, die zum einen die Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22, zum anderen die große und kleine Untereinheit des zugehörigen Reaktivierungsfaktors aus Klebsiella pneumoniae ATCC25955 kodieren, zusammengefügt. Dazu wurden je 1 ng der beiden primären PCR-Produkte kombiniert und gemeinsam als Matrize für eine PCR mit den Oligonukleotiden GD-fw (SEQ.-ID Nr. 09) und GDRF-rv (SEQ.-ID Nr. 12) verwendet. Das PCR-Produkt (4.938 Basenpaare) wurde mittels des QIAquick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde mittels XmaI und SphI (ebenfalls gemäß den Angaben des Herstellers der Restriktionsendonukleasen, New England Biolabs, Schwalbach) verdaut und in den XmaI/SphI-geschnittenen Vektor pWH1520-gldABCDE (Beispiel 2) unter Erhalt des Vektors pWH1520-SHGDH22 (10.118 Basenpaare, SEQ.-ID-Nr. 13) ligiert. Die Authentizität des Inserts wurde mittels DNA-Sequenzierung bestimmt. Ligation des Expressionsvektors sowie die Herstellung und die Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
    • – Die Plasmide pWH1520, pWH1520-gldABCDE-lacZ und pWH1520-SHGDH22 wurden mittels Elektroporation in E. blattae DSM4481 eingebracht und die resultierenden Stämme E. blattae/pWH1520, E. blattae/pWH1520-gldABCDE bzw. E. blattae/pWH1520-SHGDH22 genannt. Zur Präparation elektrokompetenter E. blattae-Zellen wurde 1 l LB-Medium (nach Miller; Merck KGaA, Darmstadt) mit 10 ml einer Übernachtkultur beimpft, bis zum Erreichen einer OD600 von 0,7 bei 37°C kultiviert und anschließend die Zellen 30 min auf Eis inkubiert. Alle weiteren Schritte wurden auf Eis durchgeführt. Nach einer Zentrifugation (15 min, 5292 g, 4°C), wurden die Zellen mit 1 l eiskaltem Wasser und erneut mit 500 ml eiskaltem Wasser gewaschen. Anschließend folgte ein weiterer Waschschritt mit 10 ml Glycerin-Lösung (10%, w/v, 15 min, 3300 g, 4°C). Das Zellpellet wurde in 2 ml 10%iger Glycerin-Lösung resuspendiert und 40 μl Aliquots bei –80°C gelagert.
    • – Für die Elektroporation wurde die zu transformierende DNA (1–2 μg) zu einem Aliquot gefrorener, kompetenter E. blattae-Zellen gegeben und auf Eis aufgetaut (maximal 10 min). Anschließend wurde der Ansatz in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt. Die Zellen wurden einem Strompuls ausgesetzt, wobei folgende Parameter eingestellt wurden: Spannung: 1,8 kV; Widerstand: 200 Ω; Kapazität: 25 μF. Sofort nach der Elektroporation wurde 1 ml LB-Medium zugegeben und der Ansatz 1 h bei 37°C und 700 rpm inkubiert. Danach wurden die Zellen auf selektiven LB-Platten (100 μg/ml Ampicillin) ausplattiert.
  • Beispiel 4
  • (HPLC-basierte Quantifizierung von Glycerin, 1,3-Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd)
    • – Zur Quantifizierung von Glycerin, 1,3-Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd wurde in je 1 ml Zellsuspension die Biomasse durch Zentrifugation (10 min, 16.100 g, 4°C) abgetrennt und 40 μl des Kulturüberstands unter Verwendung eines Agilent Technologies 1200 LC Systems (High Performance Autosampler, G136B; Thermostat für Probengeber, G1330B; Micro-Vacuum Degasser, G1379B; Binäre Pumpe, G1312A; Säulenthermostat, G1316A; Brechungsindex-Detektor, G1362A, Agilent Technologies, Waldbronn) mit einer Aminex HPX-87H 300 × 7,8 mm Trennsäule (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) mit 9 μm Partikelgröße analysiert. Die zu analysierenden Substanzen wurden isokratisch mit einer mobilen Phase aus 10 mM Schwefelsäure mit einer Flussrate von 0,6 ml/min 20 min bei 40°C eluiert. Glycerin, 1,3- Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd wurden durch einen Vergleich mit der Verweilzeit von Referenzsubstanzen (Glycerin und 1,3-Propandiol: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim; 3-Hydroxypropionaldehyd: eigene Herstellung) identifiziert. Die Konzentration der drei Verbindungen in den Kulturüberständen wurde über einen Vergleich der Peakflächen mit einer zuvor mit externen Standards erstellten Kalibriergerade berechnet.
  • Beispiel 5
  • (Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd mit rekombinanten E. blattae-Zellen, bei denen die Aktivität der Glycerin-Dehydratase erhöht worden ist)
    • – Die in Beispiel 3 konstruierten E. blattae-Stämme E. blattae/pWH1520, E. blattae/pWH1520-gldABCDE bzw. E. blattae/pWH1520-SHGDH22 wurden zunächst in 5 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin über Nacht bei 37°C und 180 rpm kultiviert. Am nächsten Morgen wurden 2 ml dieser Vorkulturen genutzt, um je 200 ml LB mit 2% (w/v) Glukose, 20 mM Glycerin und 100 μg/ml Ampicillin in 1-l-Schikanenkolben zu inokulieren. Beide Kolben wurden bei 37°C und 180 rpm inkubiert. Das Wachstum dieser Kulturen wurde anhand der scheinbaren optischen Dichte (OD600) verfolgt. Bei einer OD600 von ~2 wurden die Zellen geerntet, zweimal mit je 200 ml Saline (0,9% (w/v) NaCl) gewaschen und in 20 ml 250 mM Glycerin resuspendiert. Für einen Zeitraum von 1 h wurden alle 10 min Proben genommen und die Konzentration von Glycerin, 1,3-Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd per HPLC (Beispiel 4) analysiert. Während der Kontroll stamm E. blattae/pWH1520 keinerlei 3-Hydroxypropionaldehyd produzierte, konnte im Fall E. blattae/pWH1520-gldABCDE und E. blattae/pWH1520-SHGDH22 die Bildung von 3-Hydroxypropionaldehyd nachgewiesen werden.
  • Beispiel 6
  • (Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd mit rekombinanten B. megaterium-Zellen, bei denen die Aktivität der Glycerin-Dehydratase erhöht worden ist)
    • – Der in Beispiel 2 konstruierte B. megaterium-Stamm B. megaterium/pWH1520-gldABCDE sowie der entsprechende Kontrollstamm B. megaterium/pWH1520 wurden zunächst in 5 ml A5-Medium (Malten, M., Hollmann, R., Deckwer, W. D., Jahn, D. Production and secretion of recombinant Leuconostoc mesenteroides dextransucrase DsrS in Bacillus megaterium. Biotechnol. Bioeng. 2005. 89(2):206–18.) mit 4 g/l Hefeextrakt und 10 μg/ml Tetrazyklin über Nacht bei 37°C und 180 rpm kultiviert. Am nächsten Morgen wurden 2 ml dieser Vorkulturen genutzt, um je 200 ml A5-Medium mit 20 mM Glycerin und 10 μg/ml Tetrazyklin in 1-l-Schikanenkolben zu inokulieren. Beide Kolben wurden bei 37°C und 180 rpm inkubiert. Das Wachstum dieser Kulturen wurde anhand der scheinbaren optischen Dichte (OD600) verfolgt. Bei einer OD600 von ~0,4 wurde den Kulturen 0,5% (w/v) D-Xylose zugesetzt, um die Bildung des Biokatalysators zu induzieren. Bei einer OD600 von ~4 wurden die Zellen geerntet, zweimal mit je 200 ml Saline (0,9% (w/v) NaCl) gewaschen und in 20 ml 250 mM Glycerin resuspendiert. Für einen Zeitraum von 1 h wurden alle 10 min Proben genommen und die Konzentration von Glycerin, 1,3-Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd per HPLC (Beispiel 4) analysiert. Während der Kontrollstamm B. megaterium/pWH1520 pWH1520 keinerlei 3-Hydroxypropionaldehyd produzierte, konnte im Fall von B. megaterium/pWH1520-gldABCDE die Bildung von 3-Hydroxypropionaldehyd nachgewiesen werden.
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  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - EP 1669457 A [0006, 0074, 0074]
    • - DE 10031999 A [0025]
    • - EP 0472869 A [0028]
    • - US 4601893 [0028]
    • - WO 96/15246 A [0028]
    • - JP 10-229891 A [0028]
    • - US 4489160 [0029]
    • - US 5158891 [0029]
    • - WO 2004/056963 A [0033, 0033, 0074]
    • - GB 1009370 A [0053]
    • - US 5334778 [0072]
    • - US 6852517 [0072]
    • - WO 2006/136336 A [0073]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Doleyres et al.. in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68 (4),2005, Seiten 467–474; Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16–27; Lüthi-Peng et al.. in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 60 (1–2), 2002, Seiten 73–80. [0003]
    • - siehe zum Beispiel Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16–27) bzw. 3-Hydroxypropionsäure (mit Hilfe des Enzyms 3-Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase) (siehe zum Beispiel Chen et al. in Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61, 2002, Seiten 360–369 [0004]
    • - siehe zum Beispiel Slininger et al. in Applied Environmental Microbiology, Vol. 46, 1983, Seiten 62–67 und zur Übersicht Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16–27 [0005]
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    • - Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. in Electrophoresis, Volume 22: 1712–23 (2001 [0026]
    • - Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989 [0026]
    • - Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647 [0026]
    • - auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001), Journal of Bacteriology, 183: 2151–2155 [0026]
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    • - Reinscheid et al.. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126–132 (1994) [0030]
    • - typischerweise Escherichia coli), nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.., Bio/Technology 1: 784–791 (1983) [0030]
    • - Schäfer et al.., Gene 145: 69–73 (1994) [0030]
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    • - Hall und Stern in Journal of the Chemical Society, 1950, Seiten 490–498 beschrieben [0072]
    • - „Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process with Lactobacillus reuteri, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68, 2005, Seiten 467–474 [0074]
    • - "PCR protocols. A guide to methods and applications", 1990, Academic Press [0074]
    • - 7.896 Basenpaare; beschrieben durch Rygus und Rillen in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 35 (5), 1991, Seiten 594–599 [0074]
    • - Biedendieck, „Versatile Tools for Production, Secretion and Purification of Recombinant Proteins", 2006, Dissertation, S. 45–47 [0074]

Claims (19)

  1. Eine Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden und die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, zu bilden vermag.
  2. Die Zelle nach Anspruch 1, wobei die Corrinoide ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Coenzym B12, Vitamin B12 und Cobalamin.
  3. Die Zelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle von einer Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Escherichia blattae und Bacillus megaterium.
  4. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E1 aufweist, welches die Umsetzung von Diolen, Triolen oder Polyolen zu Aldehyden, vorzugsweise von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd, katalysiert.
  5. Die Zelle nach Anspruch 4, wobei das Enzym E1 eine Glycerin-Dehydratase oder eine Diol-Dehydratase (EC 4.2.1.30) ist.
  6. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der Zelle zusätzlich zur Aktivität des Enzyms E1 auch die Aktivität eines Enzyms E2 erhöht ist, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym E1 katalysiert.
  7. Die Zelle nach Anspruch 5, wobei das Enzym E2 ein Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor oder ein Diol-Dehydratase-Reakti-vierungsfaktor ist.
  8. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der Zelle zusätzlich zu dem Enzym E1 und gegebenenfalls dem Enzym E2 auch die Aktivität eines Enzyms E3 erhöht ist, welches die Diffusion von Glycerin in die Zelle hinein erleichtert.
  9. Die Zelle nach Anspruch 8, wobei das Enzym E3 ein Glycerin-Kanal bzw. ein Glycerin-Facilitator (TC 1.A.8.1.1, TC 1.A.8.2.1 oder TC 1.A.8.2.2) ist.
  10. Die Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei in der Zelle zusätzlich zur Aktivität des Enzyms E1 und gegebenenfalls des Enzyms E2 auch die Aktivität mindestens eines der Enzyme E4, E5, E6 oder E7 erhöht ist: – eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton-Phosphat zu Glycerin-3-Phosphat katalysiert; – eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Glycerin-3-Phosphat zu Glycerin katalysiert; – eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton-Phosphat zu Dihydroxyaceton katalysiert; – eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton zu Glycerin katalysiert.
  11. Die Zelle nach Anspruch 10, wobei das Enzym E4 eine Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.8), E5 eine Glycerin-3-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.21), E6 eine Dihydroxyaceton-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.1), und E7 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6) ist.
  12. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine verminderte Aktivität mindestens eines der Enzyme E8 bis E11 aufweist – eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von Glycerin zu Glycerin-3-Phosphat katalysiert; – eines Enzyms E9, welches die Umsetzung von Glycerin zu Dihydroxyaceton katalysiert; – eines Enzyms E10, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionaldehyd zu 1,3-Propandiol katalysiert; – eines Enzyms E11, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionaldehyd zu 3-Hydroxypropionsäure katalysiert.
  13. Die Zelle nach Anspruch 12, wobei das Enzym E8 eine Glycerin-Kinase (EC 2.7.1.30), E9 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6 oder EC 1.1.1.156 oder EC 1.1.99.22), E10 eine 1,3-Propandiol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.202) und E11 eine 3-Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3 oder EC 1.2.1.5) ist.
  14. Ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität eines Enzyms E1, welches die intrazelluläre Umsetzung von Diolen, Triolen oder Polyolen zu Aldehyden, vorzugsweise von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd, katalysiert.
  15. Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt des Erhöhens der Aktivität eines Enzyms E2, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym E1 katalysiert, umfasst.
  16. Eine Zelle, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 14 oder 15.
  17. Ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: i) in Kontakt bringen einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 12 und 13 mit einem Kulturmedium, welches eine Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht; ii) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium; iii) n Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Biomasse um mindestens 50 gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrensschritt i) gebildeten Biomasse reduziert ist, und welches Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise Glycerin, beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus den Diolen, Triolen oder Polyolen Aldehyde, vorzugsweise aus Glycerin 3-Hydroxypropionaldehyd, bilden; iv) gegebenenfalls Aufreinigung der gebildeten Aldehyde, vorzugsweise des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds, aus dem Kulturmedium.
  18. Ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: I) in Kontakt bringen einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 13 mit einem Kulturmedium, welches eine Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht; II) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium; III) in Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Biomasse um mindestens 50 gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrensschritt I) gebildeten Biomasse reduziert ist und welches Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus der Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden über Glycerin als Zwischenprodukt 3-Hydroxypropionaldehyd bilden; IV) gegebenenfalls Aufreinigung des gebildeten 3-Hydroxypropion-aldehyds aus dem Kulturmedium.
  19. Ein Verfahren zur Herstellung von C3-Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd, umfassend die Verfahrensschritte: A) Bereitstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd mittels eines Verfahrens nach Anspruch 17 oder 18; B) chemische oder biokatalytische Umsetzung des 3-Hydroxypropionaldehys durch Reduktion, Oxidation oder Dehydratisierung unter Erhalt von C3-Verbindungen; C) gegebenenfalls weitere chemische oder biokatalytische Umsetzung der im Verfahrensschritt B) erhaltenen C3-Verbindung durch Reduktion, Oxidation oder Addition.
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Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al.., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) und Tauch et al.., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994)
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Schrumpf et al.., Journal of Bacteriology 173: 4510-4516)
siehe zum Beispiel Chen et al.. in Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61 (3), 2002, Seiten 360-369
siehe zum Beispiel Slininger et al. in Applied Environmental Microbiology, Vol. 46, 1983, Seiten 62-67 und zur Übersicht Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16-27
siehe zum Beispiel Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnologe, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16-27
siehe zum Beispiel Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16-27) bzw. 3-Hydroxypropionsäure (mit Hilfe des Enzyms 3-Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase) (siehe zum Beispiel Chen et al. in Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61, 2002, Seiten 360-369
typischerweise Escherichia coli), nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)

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