DE102004009454A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, bei denen man die die gewünschte L-Aminosäure produzierenden rekombinanten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien, fermentiert, die weniger oder kein Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen, in denen man eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, kodierend für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2, abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert, und diese rekombinanten Mikroorganismen.
Description
- Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformer Bakterien, die weniger oder kein Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen. Dies wird erfindungsgemäß durch das Abschwächen, insbesondere Ausschalten des Methionin-Aufnahmesystems
- Chemische Verbindungen, mit denen insbesondere L-Aminosäuren, Vitamine, Nukleoside und Nukleotide und D-Aminosäuren gemeint sind, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Kosmetik, in der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
- Zahlreiche dieser Verbindungen werden durch Fermentation von Mikroorganismen, bevorzugt von Stämmen coryneformer Bakterien, besonders bevorzugt von Corynebacterium glutamicum, hergestellt. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
- Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z.B. das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder die Methionin-Analoga α-Methyl-Methionin, Ethionin, Norleucin, N-acetylnorleucin, S-Trifluoromethylhomocystein, 2-amino-5-heprenoitsäure, Seleno-Methionin, Methioninsulfoximin, Methoxin, 1-Aminocyclopentan-Carboxylsäure sind oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren.
- Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion untersucht.
- Aufgabe der Erfindung
- Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, mit Mikroorganismen, bevorzugt mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.
- Beschreibung der Erfindung
- Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere der Proteinen Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin und L-Prolin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Methionin.
- Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen. Sie dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.
- Werden im folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze wie z.B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat gemeint.
- Die Methionin-Aufnahme aus dem Fermentationsmedium ist für die Produktion von Methionin sehr bedeutsam, da eine eventuelle Wiederaufnahme des exkretierten Produktes die Produktionsrate senken würde. Die in dieser Erfindung beispielhaft für Corynebacterium glutamicum beschriebenen, abzuschwächenden Gene yaeE, abc und yaeC kodieren für das periplasmatische Bindeprotein YaeC, das ATP-Bindeprotein ABC und die Permease YaeE, welche zusammen das Methionin-Aufnahmesystem MetD2 bilden.
- Das Abschwächen, insbesondere Ausschalten eines oder mehrerer der für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2 kodierenden Gene yaeC, abc und yaeE verbessert die Produktion von L-Methionin in den entsprechenden coryneformen Bakterien im Vergleich zu den Ausgangsorganismen ohne Abschwächung oder Ausschaltung dieser Gene.
- Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren, die weniger Methionin als die Ausgangsorganismen oder kein Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen und in denen eine oder mehrere der für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2 kodierende(n) Nukleotidsequenze(n) yaeC, abc und yaeC abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert werden (wird).
- Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, in dem folgende Schritte durchgeführt werden:
- a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden rekombinanten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien in einem Medium, wobei diese weniger Methionin als die Ausgangsorganismen oder kein Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen, und in denen mindestens eines der für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2 kodierenden Gene yaeE, abc und yaeC abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird (werden),
- b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen (> 0 bis 100 %) oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.
- Die eingesetzten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung oder dem Ausschalten der Aufnahme von Methionin aus dem umgebenden Medium, welche beispielsweise zu erreichen ist durch Abschwächung oder Ausschalten eines oder mehrerer der Gene yaeE, abc und yaeC, L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin.
- Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen, bevorzugt coryneforme Bakterien, die kein oder weniger Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen, was durch Abschwächung oder Ausschalten eines oder mehrerer der für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2 kodierenden Gene yaeE, abc und yaeC erreicht wird, in verbesserter weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, produzieren.
- Die Nukleotidsequenzen der genannten Gene von Corynebacterium glutamicum gehören zum Stand der Technik und können verschiedenen Patentanmeldungen sowie der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) entnommen werden. yaeC-Gen:
Bezeichnung: periplasmatisches Bindeprotein YaeC Funktion: Teil des Methionin-Aufnahmesystems MetD2 Referenzen: Sequenzen Nr. 7061 und Nr. 709 aus EP1108790 Accession No.: AX127145 und AX120793 Bezeichnung: ATP-Bindeprotein ABC Funktion: Teil des Methionin-Aufnahmesystems MetD2 Referenzen: Sequenzen Nr. 7061, Nr. 708, Nr. 7060 und Nr. 707 aus EP1108790; Sequenz Nr. 363 aus WO0100805; Sequenz Nr. 509 aus WO0100844 Accession No.: AX127145; AX120792; AX127144; AX120791; AX066781; AX065383 Bezeichnung: Permease YaeE Funktion: Teil des Methionin-Aufnahmesystems MetD2 Referenzen: Sequenzen Nr. 7060, Nr. 7061 und Nr. 706 aus EP1108790; Sequenz Nr. 365 aus WO0100805 Accession No.: AX127144; AX127145; AX120790; AX066783 - Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen kodierend für d abc und yaeE können erfindungsgemäß verwendet wie Gene yaeC,erden. Weiterhin können Allele der genannten Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Kodes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen („sense mutations") ergeben.
- Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
- Der Begriff „Abschwächung" bzw. „Abschwächen" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, abgesenkt.
- Die Angabe „weniger" betrifft dieselben Prozentsätze gesehen im Hinblick auf die Aufnahmefähigkeit der rekombinanten Mikroorganismen im Vergleich zu den Ausgangsmikroorganismen ohne Abschwächung oder Ausschaltung des Methionin-Aufnahmesystems MetD2.
- Die Herabsetzung der Proteinkonzentration ist über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit enstprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden wie beispielsweise im Lehrbuch „Bioanalytik" (Lottspeich/Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag Gmbh, Heidelberg, Deutschland, 1998) beschrieben und bei Wilson et al. (J. Bacteriol. 183: 2151-2155 (2001)) angewendet. Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene, kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
- Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
- Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder wie beispielsweise der L-Methionin produzierende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC21608. - Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) ist in der US-A-5.250.434 beschrieben.
- Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
- Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949-5952 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3584-3590 (1998), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297-309 (1996) und Journal of Biotechnology 104: 311-323 (2003)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
- Ein Beispiel für die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des abzuschwächenden Gens unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac-Promotors. Hierzu eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor pXK99E (WO0226787; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31. Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Deutschland (1997)), die eine IPTG-abhängige Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.
- Eingesetzt wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO0226787 zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors pxK99EdeaD in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors pK18mobglyA' in Corynebacterium glutamicum.
- Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxyukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 – 4371).
- Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel (Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland (1994)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
- Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
- Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung („gene disruption") und des Gen-Austauschs („gene replacement").
- Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird zum Beispiel ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob, pK19mob, pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der den zentralen Bereich der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Journal of Bacteriology 172: 1663-1666 (1990) und Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
- Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Vektoren, die mindestens 15, bevorzugt 25 aufeinanderfolgende Nukleotide des zentralen Teils der Kodierregion von mindestens einem der Gene yaeD, abc oder yaeE enthalten.
- Bei der Methode des Genaustausches („gene replacement") wird eine Mutation wie z.B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode ist bei Scharzer und Pühler (Bio/Technology 9: 84-87 (1991) beschrieben und wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915 – 927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten oder von Wehmeier et al. (Microbiology 144: 1853-1862 (1998)) zum Einfügen einer Deletion in das rel-Gen von C. glutamicum.
- Einen Überblick über verschiedene gentechnische Methoden bei C. glutamicum geben Kirchner und Tauch (Journal of Biotechnology 104: 287-299 (2003).
- In eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc unc yaeE kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verringerung des Importes von Methionin aus dem umgebenden Medium, erfindungsgemäß zu erreichen durch Abschwächung eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine entweder zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren, oder abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
- Der Begriff „Verstärkung" bzw. „Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
- Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
- So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Methionin neben der Verringerung des Importes von Methionin aus dem umgebenden Medium, erfindungsgemäß zu erreichen durch Abschwächung eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Gene oder Allele der Methioninproduktion verstärkt, insbesondere überexprimiert werden. Unter „Gene oder Allele der Methioninproduktion" sind sämtliche, bevorzugt endogene, offene Leserahmen, Gene oder Allele zu verstehen, deren Verstärkung/Überexpression eine Verbesserung der Methioninproduktion bewirken kann.
- Hierzu gehören unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: accBC, accDA, aecD, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, gnd, glyA, hom, homFBR, lysC, lysCFBR, metA, metB, metE, metH, metY, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf und zwf A213T. Diese sind in Tabelle 1 zusammengefasst und erläutert.
- Tabelle 1 Gene und Allele der Methioninproduktion
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- Weiterhin kann es für die Produktion L-Methionin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verringerung des Importes von Methionin aus dem umgebenden Medium, beispielsweise zu erreichen durch Abschwächung eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe der Gene oder Allele, die für das Wachstum oder die Methioninproduktion nicht essentiell sind, abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
- Hierzu gehören unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: brnQ, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, metD, metK, pck, pgi, poxB und zwa2. Diese sind in Tabelle 2 zusammengefasst und erläutert.
- Tabelle 2: Gene und Allele, die für die Methioninproduktion nicht essentiell sind
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- Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, vorteilhaft sein, neben der Verringerung des Importes von Methionin aus dem umgebenden Medium, beispielsweise zu erreichen durch Abschwächung eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
- Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
- Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
- Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z.B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
- Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
- Mit den Methoden der Erfindung kann die Leistung der Bakterien oder des Fermentationsprozesses bezüglich der Produkt-Konzentration ((Produkt pro Volumen), der Produkt-Ausbeute (gebildetes Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff- Quelle), der Produkt-Bildung (gebildetes Produkt pro Volumen und Zeit) oder anderer Prozess-Parameter und Kombinationen davon um mindestens 0,5%, mindestens 1% oder mindestens 2% verbessert werden.
- Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1185-1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben. Informationen dazu findet der Fachmann auch bei Ashman et al. (in: Tschesche (Hrsg), Modern Methods in Protein Chemistry. 155-172, de Gruyter, Berlin 1985).
- Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Methionin.
- Die Konzentration von L-Methionin im Endprodukt kann gegebenenfalls durch den Zusatz von L-Methionin auf den gewünschten Wert eingestellt werden.
Claims (12)
- Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation rekombinanter Mikroorganismen, bevorzugt coryneformer Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, die weniger Methionin als der Ausgangsorganismus oder kein Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen, und in denen man eines oder mehrere der Gene yaeC, abc und yaeE, kodierend für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2, abschwächt, ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.
- Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass man L-Methionin herstellt.
- Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien, die weniger Methionin als der Ausgangsorganismus oder kein Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen, in denen man eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, kodierend für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2, abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert; b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder Biomasse in ihrer Gesamtheit oder in Anteilen (> 0 bis 100) im Endprodukt verbleiben.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges von L-Methionin verstärkt.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung von L-Methionin verringern.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der) Polynukleotids (e), das (die) für Komponenten der Aufnahme von Methionin aus dem umgebenden Medium kodiert (kodieren), beispielsweise für eines oder mehrere, der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, kodierend für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2, verringert.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften der Polypeptide (Enzymproteine) verringert, für die die Polynukleotide yaeC, abc und yaeE kodieren.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, Mikroorganismen, bevorzugt coryneforme Bakterien fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der in Tabelle 1 aufgeführten Gruppe verstärkt, insbesondere überexprimiert:
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, Mikroorganismen, bevorzugt coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der in Tabelle 2 aufgeführten Gruppe abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert:
- Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
- Rekombinante Mikroorganismen, bevorzugt coryneforme Bakterien, in denen eines oder mehrere der Gene, die für die Aufnahme von Methionin aus dem umgebenden Medium kodieren, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, kodierend für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2, abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert vorliegt (en) verglichen mit dem Ausgangsorganismus ohne Abschwächung oder Abschaltung des Methionin-Aufnahme-Systems MetD2.
- Vektor, der ein Fragment mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Sequenz(en) von mindestens einem der Gene yaeC, abc und yaeE enthält und in C. glutamicum nicht replizieren kann.
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