DE102007006736B4

DE102007006736B4 - In-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz

Info

Publication number: DE102007006736B4
Application number: DE200710006736
Authority: DE
Inventors: Reinhard Wanner; Dagmar Briechle
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2012-01-12
Anticipated expiration: 2027-02-08
Also published as: DE102007006736A1; DE102008017990A1

Abstract

Verfahren zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, mit den Schritten: a) Humane Monozyten und Keratinozyten werden bereitgestellt und in Kokultur genommen. b) es wird die Einwirkung von Cytokinen auf diese Zellen gewährleistet, z. B. indem die Cytokine zugesetzt werden, wobei die folgenden Vorgänge c) bis e) gezielt ausgelöst werden. c) unter Aktivierung der Keratinozyten durch die Cytokine kommt es zur Differenzierung der Monozyten zu Dendritischen Zellen, hierdurch erfolgt die Generierung spezifisch für das Testverfahren geeigneter Dendritischer Zellen, d) zusätzlich wirken die Cytokine direkt auf die Differenzierung der Monozyten, e) Entstehung einer lockeren Kokultur aus aktivierten humanen Keratinozyten, die nicht ausdifferenziert sind, und aus beweglichen humanen Dendritischen Zellen, f) wobei keine weiteren Träger wie Kollagen/Fibroblastenschichten verwendet werden, g) Zugabe der auf ihr Sensibilisierungspotential zu testenden Substanz(en) zur fertigen Kokultur, h) Bestimmung der Expression von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen, wie z. B....

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz. Das Testkit besteht aus einer lockeren Kokultur aus aktivierten humanen basalen Keratinozyten und aus beweglichen humanen Dendritischen Zellen. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren das Herstellungsverfahren dieses Testkits.
Stand der Technik
Die Kontaktdermatitis ist ein weit verbreitetes berufsbezogenes oder umweltbedingtes Gesundheitsproblem.
Die Begriffe Kontaktdermatitis und Kontaktekzem (contact hypersensitivity) beschreiben Hautreaktionen nach Kontakt mit niedermolekularen Substanzen (typisch < 500 kDa). Ist diese Hautreaktion durch Aktivitäten des Immunsystems vermittelt, handelt es sich um ein allergisches Kontaktekzem/eine allergische Kontaktdermatitis. Die auslösenden Chemikalien werden als Allergene, Haptene oder als sensibilisierende Stoffe bezeichnet. Ist das Immunsystem nicht an der Ausbildung der Hautreaktionen beteiligt, werden die auslösenden Stoffe als Irritantien oder Toxine bezeichnet (Nomenklatur: Johansson et al., 2001).
Das Potential einer Chemikalie, eine allergische Kontaktdermatitis auslösen zu können, wird als sensibilisierendes Potential (sensitization potential) bezeichnet. Der derzeit gängige und von der OECD anerkannte Test, mit dem ein solches Potential ermittelt wird, ist der lokale Lymphknotentest an der Maus (mouse local lymph node assay, LLNA) (Kimber and Weisenberger 1989; OECD, Guideline 429, 2002). Durch die Einführung dieses Tests konnte gegenüber seinen Vorgängern die Anzahl der benötigten Tiere reduziert und auch deren Belastung vermindert werden. Ethisch vertretbarer wäre jedoch ein tierversuchsfreies Testverfahren (in-vitro assay). Außerdem liefert LLNA teilweise falsche Ergebnisse, wie beispielsweise bezüglich der Substanz Benzocaine (Basketter et al., 1995), so dass auch die Sicherheit der Testaussage betreffend weitere Fortschritte notwendig sind.
Langerhanszellen sind unreife Dendritische Zellen in der Haut (Banchereau and Steinman, 1998). Dendritische Zellen besitzen die Fähigkeit, eine primäre Immunreaktion zu initiieren und sind damit auch an der Initiation der allergischen Kontaktdermatitis zentral beteiligt. Sie können erkennen, ob sich in ihrer Umgebung Gefahr-signalisierende Moleküle befinden. Kontakt mit Gefahr-signalisierenden Molekülen induziert die Reifung der Dendritischen Zelle zur Antigen-präsentierenden Zelle, die Allergene in passender Form dem spezifischen Immunsystem zuführen kann. In der Folge werden damit auch T- und B-Lymphozyten sowie weitere Zellen in die Reaktion auf Allergenkontakt einbezogen (Übersicht in: Reis e Sousa, 2006). Es läge daher nahe, in einem alternativen in-vitro Testverfahren Langerhanszellen zu kultivieren und geeignete Reaktionen der Zellen auf Allergenkontakt zu messen (Übersicht in: Ryan et al., 2005). Dies ist derzeit nicht möglich, da kein Zellkulturverfahren beschrieben ist, mit dem aus der menschlichen Haut isolierte Langerhanszellen ausreichend lang reaktiv gehalten werden können (Peiser et al., 2003).
Es liegen keine menschlichen Zelllinien vor, die authentische Dendritische Zellen ersetzen könnten. Versuche mit den Zelllinien THP-1, KG-1 oder MUTZ-3 zeigten, dass diese Zellen nur auf extrem starke Allergene reagieren und das in einem Konzentrationsbereich, der an der Grenze zu toxischer Aktivität liegt (borderline concentrations) (Yoshida et al., 2003; Azam et al., 2006). Außerdem neigen Zelllinien zu genetischer Instabilität.
Es wurden Verfahren entwickelt, mit denen sich aus Vorläufern Dendritische Zellen generieren lassen, die in ihren Leistungen authentischen Dendritischen Zelle nahe kommen. Vorläuferzellen sind dabei Monozyten, die aus adultem peripheren Blut oder aus Leukozytenkonzentrat (buffy coat) gewonnen werden, oder CD34⁺-Blutstammzellen aus Nabelschnurblut oder Knochenmark. Die Vorläuferzellen differenzieren, durch Cytokine stimuliert, zu unreifen Dendritischen Zellen. Eingesetzt wurden die Cytokine IL-4 zusammen mit GM-CSF, teilweise auch zusätzlich mit TNF-α (Sallusto and Lanzavecchia, 1994; Schuler et al., 1995; Steckel et al., 1995; Chapius et al., 1997; Caux et al., 1996). Der Begriff unreife Dendritische Zelle bedeutet hier, dass es sich bei diesen Zellen um differenzierte Zellen handelt, die auf einen Reifestimulus durch pathogenassoziierte Moleküle oder Allergene warten und die nach Kontakt damit zur Antigen-präsentierenden Zelle reifen können. Dieser Typ Dendritischer Zellen wurde ausgiebig auf seine Fähigkeit untersucht, sensibilisierende Substanzen in Testverfahren detektieren zu können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Dendritischen Zellen, wenn sie solitär kultiviert werden, als Testsystem für Allergene ungeeignet sind. Detektierbare Konzentrationen von Kontaktallergenen liegen im subtoxischen bis bereits toxischen Bereich, und eine Unterscheidung zwischen Allergenen und Irritantien ist kaum möglich (Hulette et al., 2002; Sträube et al., 2005; Übersicht in: Ryan et al., 2005). Außerdem zeigte sich, insbesondere für die aus CD14⁺ Monozyten gewonnenen Dendritischen Zellen, eine erhebliche Spendervarianz bezüglich der Testergebnisse, so dass Testzellen verschiedener Spender gepoolt werden mussten (Pichowski et al., 2000; Aeby et al., 2004).
Ein weiteres Problem bezüglich einer Anwendung generierter Dendritischer Zeilen in einem Testsystem auf sensibilisierende Substanzen ist, dass diese Zellen in Kultur zu einer spontanen, von Stimulation von außen unabhängigen Reifung neigen. Detektiert werden soll aber gerade eine potentielle allergeninduzierte Reifung. Ein Zellkulturverfahren, aus dem Dendritische Zellen mit typischen Merkmalen authentischer Langerhanszellen resultieren, benutzt für die Generierung aus CD14⁺ Zellen eine Kombination der Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β. So generierte Zellen neigen nicht zu spontaner Reifung, aber solitär kultiviert bleiben auch bei diesem System überzeugende Reaktionen der Zellen auf Allergene aus (Geissmann et al., 1998; Geissmann et al., 1999; Aiba et al., 2000; Peiser et al., 2004).
Niedermolekulare Allergene sind Haptene, die an Proteine gebunden werden müssen, bevor sie Immunreaktionen auslösen können. An dieser Proteinbindung sind Keratinozyten beteiligt. Keratinozyten könnten außerdem zur Reifung Dendritischer Zellen nach Allergenkontakt beitragen, indem sie Gefahrsignale an die Dendritischen Zellen senden (Vandebriel et al., 2005). In einem zellbasierten Testsystem für sensibilisierende Substanzen sollten daher Dendritische Zellen und Keratinozyten kombiniert benutzt werden.
Primäre humane Keratinozyten können in-vitro zu einer dreidimensionalen Zellkultur herangezüchtet werden, die Zellschichten verschiedener Differenzierungsstufen aufweist. Einige Modelle beinhalten alle epidermalen Schichten, von der basalen Schicht bis zur Hornschicht. Die basalen Keratinozyten liegen meist auf einer Schicht von Fibroblasten, die ihrerseits auf eine Kollagenmatrix aufgebracht wurden. Solche Kulturen werden als Hautäquivalent, Epidermis-Äquivalent, organtypisches Hautmodell oder rekonstruierte Epidermis bezeichnet (Bell et al., 1981; Limat and Hunziker, 2002). Epidermis-Äquivalente unter anderem zur Testung auf Irritantien und Toxine werden beispielsweise angeboten von den Firmen SkinEthic (Nizza, Frankreich), CellSystems (St. Katharinen, Deutschland), Euroderm (Leipzig, Deutschland) oder MatTek Inc. (Massachussets, USA).
Ein in-vitro Testsystem zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, das auf derart rekonstruierter Epidermis basiert, sollte zusätzlich Dendritische Zellen enthalten. Wird allerdings Epidermis in organische Kultur genommen, wandern die Langerhanszellen spontan aus der Epidermis in das Kulturmedium aus (Larsen et al., 1990). Es ist nicht bekannt, ob in der Epidermis zwischen suprabasalen Keratinozyten und Langerhanszellen tatsächlich feste Zellkontakte bestehen oder ob schon unreife Langerhanszellen beweglich sind. Vereinzelt wurde von mehrschichtigen Hautäquivalenten berichtet, in die sich Vorläufer Dendritischer Zellen kohärent integrieren und dann differenzieren ließen (Facy et al., 2004; Schaerli et al., 2005). Im Patent EP 0 789 074 B1 ist beschrieben, wie CD34⁺ Vorläuferzellen in ein Epidermisäquivalent eingebracht werden, differenzieren und sich dann suprabasal in das Epidermisäquivalent integrieren. Die Offenlegungsschrift DE 10 2004 061 289 A1 beschreibt die Integration von Immunzellen in ein Testkit, das aus einem geschichteten Epidermisäquivalent besteht. Unklar ist, wieso, anders als in-vivo, die Dendritischen Zellen im Hautäquivalent gebunden werden und es bleiben sollen, bis ihre Reifung induziert wird. Es gibt kein anerkanntes Testkit zur in-vitro Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, das auf geschichteten Hautäquivalenten mit integrierten Dendritischen Zellen basiert. Probleme bereiten eine hohe Spendervarianz bezüglich der Testergebnisse, schlechte Kohärenz der sich im Modell befindlichen Zellen sowie der Einfluss der Fibroblasten auf die Testergebnisse.
Vor diesem Hintergrund präsentiert die vorliegende Erfindung ein Testkit zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, bestehend aus einer lockeren Kokultur einer einschichtigen Lage von humanen nicht-differenzierenden Keratinozyten und aus beweglichen Dendritischen Zellen, die mittels IL-4, GM-CSF und TGF-β aus humanen allogenen CD14⁺ Monozyten in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden.
Die im Testkit eingesetzten Keratinozyten sind humane normale Keratinozyten, die während ihrer ersten Kultur durch „Antrypsinieren” hinsichtlich starker Adhärenz an Zellkultur-Plastikmaterial selektiert wurden sein können.
Die kokultivierten Keratinozyten erreichen ein aktiviertes Stadium, das vergleichbar ist mit dem Stadium von an der Wundheilung beteiligten Keratinozyten. Dies ist z. B. an der hohen Sekretionsrate der Metalloproteinase MMP-9 erkennbar.
Das Zellkulturmedium muss eine Differenzierung der Keratinozyten nicht unterstützen, z. B. durch eine niedrige Calciumkonzentration.
Das vorgeschlagene Testkit kann sensibilisierende Substanzen anhand der Erhöhung von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen detektieren. Bevorzugt wird die CD86-Expression auf den Dendritischen Zellen per FACS-Analyse gemessen (verwendeter Antikörper z. B. R-Phycoerythrin mouse anti-human CD86 (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland)). Weiterhin bevorzugt erfolgt für die FACS-Analyse eine Doppelfärbung zur Identifizierung der Zellen, z. B. CD86/CD11c (verwendeter Antikörper z. B. mouse anti-human CD11c:FITC (z. B. von Serotec, Düsseldorf, Deutschland)) oder CD86/HLA-DR (verwendeter Antiköper z. B. FITC-conjugated mouse anti-human HLA-DR (z. B. von BD)) oder CD86/CDIc (z. B. human CD1c-FITC von Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland), Dabei sind Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Detektion sensibilisierender Substanzen deutlich besser als bei bisherigen Assays.
Dosis-Wirkungs-Beziehungen bislang ungeprüfter Substanzen können bestimmt und mit bekannten Allergenen verglichen werden, deren Potential z. B. aus LLNA-Assays verifiziert ist. Damit lässt sich die Stärke des sensibilisierenden Potentials einer Testsubstanz in Kategorien bezüglich ihrer Wirkstärke einteilen. Es können effektive Konzentrationen angegeben werden.
Eine messbare Reifung der Dendritischen Zellen durch Kontakt mit sensibilisierenden Substanzen erfolgt bereits weit unterhalb irritierender oder toxischer Konzentrationen. Die Viabilität der Dendritischen Zellen kann durch die Färbrate mit 7-AAD (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland) oder Propidiumiodid (z. B. von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) bestimmt werden. Damit kann das Testkit sensibilisierend und irritierend wirkende Konzentrationen einer Substanz differenzieren.
Die Zugabe des Cytokins TGF-β bedingt, dass die Dendritischen Zellen im Testkit nicht zu spontaner Reifung neigen.
Es besteht kein nennenswerter Einfluss der Zell-Spender auf die Testergebnisse. Es ist nicht notwendig, Spender zu poolen.
Da keine Zellen des spezifischen Immunsystems ins Testkit integriert sind, müssen Keratinozyten und Dendritische Zellen, bzw. ihre Vorläufer, nicht vom selben Spender stammen.
Das Testkit lässt sich aus cryokonservierten Zellen herstellen.
Die Kokultur erfolgt serumfrei (z. B. in KGM (PromoCell, Heidelberg, Deutschland)).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne dass sie einschränkend zu verstehen sind.
Beispiel für die Herstellung eines Testkits, bestehend aus einer lockeren Kokultur von humanen Keratinozyten und beweglichen humanen Dendritischen Zellen, die aus Vorläuferzellen durch die Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden.
1. Vorbereitende Arbeiten
1.1 Selektion und Cryokonservierung primärer humaner Keratinozyten
Normale menschliche Hautproben sind mit der Erlaubnis lokaler Ethikkomitees als übrigbleibendes Material nach chirurgischen Eingriffen, wie einer Mammareduktion, erhältlich. Alle Arbeiten erfolgen unter sterilen Bedingungen. Die Haut wird in Streifen geschnitten und 18 Stunden lang bei 4°C in einem Medium inkubiert, das 3 RMB units Dispase I (z. B. von Roche, Mannheim, Deutschland) in PBS (z. B. von Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland) enthält. Danach bisst sich die Dermis abziehen. Die epidermalen Streifen werden 15 Minuten lang bei 37°C in einer Lösung inkubiert, die 0.25% Trypsin (z. B. von Biochrom, Berlin, Deutschland) und 0.01% DNase (z. B. von Roche, Mannheim, Deutschland) in PBS enthält. Dabei zerfällt die Epidermis in eine Einzelzellsuspension, die durch ein 40 μm Zellsieb (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland) passagiert und anschlieβend dreimal mit PBS gewaschen wird. Die Keratinozyten werden dann in einem serumfreien Zellkulturmedium wie KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) resuspendiert und auf Zellkulturflaschen ausgesät, die für adhärierende Säugetierzellen geeignet sind (z. B. Costar Cell Culture Flask, von Corning Incorporated, Schiphol-Rijk, Niederlande). Die Dichte wird auf 2–5 × 10⁵ Zellen/cm² (Durchmesser > 8 um) eingestellt, und die Zellkulturflaschen werden in einem Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am Tag nach der Aussaat und danach an jedem zweiten Tag werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit frischem Medium versorgt. Etwa 8 Tage nach der Aussaat erfolgt bei erfolgreicher Bildung von Keratinozyteninseln eine Selektion durch „Antrypsinieren”. Die Zellen werden 3 Minuten lang bei Raumtemperatur 1 × Trypsin (Biochrom, Berlin, Deutschland) ausgesetzt, wodurch mir kräftig haftende, viable Zellen nicht abschwimmen. Nach Stoppen der Trypsinaktivität und Waschen mit PBS werden die selektierten Zellen bis zur Konfluenz weiterkultiviert. Die Ernte der Zellen erfolgt durch Ablösen von den Zellkulturflaschen durch Inkubation mit 1 × Trypsin für 15 Minuten bei 37°C. Dann wird 5% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (z. B. von Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland) in PBS zugegeben. Nach zweimaligen Waschen in PBS werden die Zellen in hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum mit 10% DMSO (z. B. Hybrimax von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer Dichte von etwa 6 × 10⁶ Zellen > 8 μm/ml resuspendiert, 1 ml-weise portioniert, langsam in einer Cryobox (z. B. in einem Cryo 1°C Freezing Container von Nalgene (Batavia, IL, USA)) auf –80°C heruntergekühlt und dann in flüssigem Stickstoff cryokonserviert. Jede Charge wird eifern Endotoxintest unterzogen, bevorzugt dem Limulus amoebocyte lysate Test (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA).
1.2 Cryokonservierung humaner Monozyten
Humane Monozyten werden bevorzugt aus Leukozytenkonzentrat (buffy coat, z. B. von DRK-Blutspendediensten, Deutschland) isoliert, können aber auch aus Vollblut gereinigt werden. Das Konzentrat wird 1:2 mit PBS verdünnt, und es wird eine Ficoll-(z. B. von Biochrom, Berlin, Deutschland)Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Die Leukozytenfraktion wird entnommen und solange mit PBS gewaschen, bis die Überstände klar sind. Anschließend werden aus den Leukozyten die Monozyten bevorzugt durch magnetisches Sortieren (MACS) weiter aufgereinigt. Bevorzugt werden hier das Oberflächenantigen CD14 nach Herstellerprotokoll (CD 14 MicroBeads, human (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland)) oder das human Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi) benutzt. Die isolierten CD 14⁺-Monozyten werden in fötalem Kälberserum (z. B. von Gibco) mit 10% DMSO (z. B. Hybrimax von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer Dichte von 2–3 × 10 Zellen > 8 μm/ml resuspendiert und cryokonserviert wie oben für die Keratinozyten beschrieben. Jede Charge wird einem Endotoxintest unterzogen, bevorzugt dem Limulus amoebocyte lysate test (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA).
1.3. Cryokonservierung humaner Leukozyten
Alternativ werden Monozyten über ihre im Vergleich zu anderen Leukozyten stärkere Adhärenz an Zellkulturschalen und an Keratinozyten angereichert. Für diese spätere Anwendung werden nach der Dichtegradientenzentrifugation die gewaschenen Leukozyten (PBMC) ohne weitere Aufreinigung cryokonserviert wie oben beschrieben.
2. Aussaat des Testkits
2.1. Aussaat der cryokonservierten Keratinozyten
Cryokonservierte Keratinozyten, beschrieben in 1.1, werden in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut und mehrfach in PBS gewaschen. Danach werden die Keratinozyten in ein serumfreies Zellkulturmedium überführt. Vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) benutzt. Die Zelldichte wird so gewählt, dass sich nach der Aussaat 2–6 × 10⁴ Zellen > 8 μm/cm² in der Testschale (z. B. Costar Cell Culture Cluster, von Corning Incorporated, Schiphol-Rijk, Niederlande) befinden. Die Zellkulturen werden am nächsten Tag mit PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium versorgt. Die Kultivierung erfolgt solange, bis die heranwachsenden Keratinozyteninseln die Fläche der Testschale halb bedecken (halbkonfluent). Dies wird innerhalb von 2–4 Tagen erreicht.
2.2 Aussaat der cryokonservierten Monozyten
Cryokonservierte Monozyten, beschrieben in 1.2, werden in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut und mehrfach in PBS gewaschen. Danach werden die Monozyten in ein serumfreies Zellkulturmedium überführt, das für sie und für Keratinozyten gleichzeitig geeignet ist. Vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) benutzt. Die Testschale, die bereits halbkonfluent adhärierende Keratinozyten, wie in 2.1 beschrieben, enthält, wird mit PBS gewaschen, und dann wird die Flüssigkeit abgesaugt. Auf die Keratinozyten werden die Monozyten ausgesät. Die Zelldichte der Monozyten wird so gewählt, dass sich nach der Aussaat 2–5 × 10 Zellen der Monozytenpräparation > 8 μm/cm² zusätzlich zu den Keratinozyten in der Testschale befinden. Die Monozyten adhärieren zunächst an das Plastikmaterial und an die Keratinozyten, lösen sich aber nach einigen Stunden größtenteils wieder ab. Es entsteht eine Kokultur aus adhärenten Keratinozyten, auf denen locker Monozyten aufliegen. Die Viabilität der Monozyten wird durch die Keratinozyten aufrecht erhalten.
2.3 Aussaat cryokonservierter Leukozyten
Alternativ zu 2.2 können, nachdem in der Testschale die Keratinozyten gewaschen sind und die Flüssigkeit abgesaugt ist, cryokonservierte Leukozyten, wie in 1.3 beschrieben, nach Auftauen, Waschen und Aufnahme ins Zellkulturmedium (vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell) benutzt) auf die Keratinozyten ausgesät werden. Hierbei werden Zelldichten der Leukozyten so gewählt, dass in der Zellkulturschale Leukozytendichten von 1–2 × 10⁶ Zellen > 8 μm/cm² vorliegen. Nach 2–3 Stunden werden Zellen, die nicht an das Plastikmaterial oder an die Keratinozyten haften, mit 37°C warmen Zellkulturmedium abgespült and abgesaugt. Anschließend wird frisches Zellkulturmedium zugegeben.
3. Generierung Dendritischer Zellen
2–3 Stunden nach der Aussaat der Monozyten auf die Keratinozytenkulturen, wie in 2.2 beschrieben, bzw. nach dem Abspülen nicht-adhärenter Leukozyten, wie in 2.3 beschrieben. werden die rekombinanten humanen Cytokine IL-4 ad 100 ng/ml (z. B. von Immuntools, Friesoythe, Deutschland), GM-CSF ad 100 ng/ml (z. B. von Immuntools) und TGF-β1 ad 10 ng/ml (z. B. von R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) zugegeben. An Tag 2 und an Tag 4 der Kokultur werden GM-CSF ad 100 ng/ml und TGF-β1 ad 10 ng/ml zugegeben. An Tag 5–6 ist die Kokultur als Testkit benutzbar.
Anwendungsbeispiel
Bestimmung der Konzentration, bei der eine Testsubstanz im Testkit eine halbmaximale Reifung der Dendritischen Zellen induziert
Ein Testkit wird in einer 12-Loch Testschale (Costar Cell Culture Cluster von Corning Inc.) mit Zellen wie im Herstellungsverfahren in 1.1 und 1.2 beschrieben nach Herstellungsverfahren 2.1 und 2.2 hergestellt. Die zu testende Substanz wird in einem geeigneten Lösungsmittel (wie Wasser, DMSO, Ethanol, Ölgemische) in maximal möglicher Konzentration gelöst. Den Vertiefungen der Testschale mit den Kokulturen wird zu jeweils 2 ml Zellkulturmedium KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell) die Testsubstanz in einer Verdünnungsreihe zugegeben. Dabei wird die Testsubstanz vor Zugabe zum Testkit so verdünnt, dass in den Kokulturen gleiche Endkonzentrationen des Lösungsmittels vorliegen. Es werden jeweils Doppelwerte angelegt. Das Testkit wird nach Zugabe der Testsubstanz 24 Stunden lang in einem Brutschrank inkubiert. Danach werden die nicht-adhärenten Zellen mit dem Zellkulturmedium abgezogen und in FACS-Röhrchen überführt (5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube, BD Falcon, Heidelberg, Deutschland). Nach einer Zentrifugation (334 rpm, 4 min., 20°C) werden für mögliche spätere ELISA-Assays die Medien abgenommen, ihr exaktes Volumen bestimmt und bei –80°C gelagert. Die Zellen werden 2 × in PBS gewaschen, und jede Probe wird in zwei Aliquote aufgeteilt. Je eins der Aliquote wird mit je 5 μl der Antikörperlösungen CD11c:FITC (von Serotec) und CD86-PE (von BD) für die FACS-Analyse gefärbt. Das jeweils zweite Aliquot wird mit 20 μl 7-AAD (Cell Viability Solution von BD) gefärbt. Es werden nur Proben mit mehr als 85% vitalen Zellen hinsichtlich ihrer CD86-Expression ausgewertet. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) für CD86 werden für CD11c-positive Zellen bestimmt. Die MFI-Werte der Testsubstanz-Proben werden durch den MFI-Mittelwert der Lösungsmittel-Proben dividiert. Die resultierenden Faktoren werden gegen die Konzentration der Testsubstanz aufgetragen, und aus der Kurve wird die Konzentration der Testsubstanz bestimmt, die zu halbmaximaler Erhöhung der MFI-Werte für CD86 führt. Nach Durchführung unabhängiger Tests unter Verwendung von Zellen, die von jeweils 3 verschiedenen Spendern für die Keratinozyten und für die Monozyten stammen. ergibt sich die Konzentration, die eine mittlere halbmaximale CD86-MPI-Erhöhung bewirkt.
Zitierte Literatur

Aeby P., Wyss C., Beck H., Griem P. et al. (2004) Characterization of the sensitizing potential of chemicals by in vitro analysis of dendritic cell activation and skin penetration. J. Invest. Dermatol. 122: 1154–1164.
Aiba S., Manome H., Yoshino Y., Tagami H. (2000) In vitro treatment of human transforming growth factor-betal-treated monocyte-derived dendritic cells with haptens can induce the phenotypic and functional changes similar to epidermal Langerhans cells in the initiation phase of allergic contact sensitivity reaction. Immunology 101: 68–75.
Azam P., Peiffer J, L., Chamousset D., Tissier M. H., et al. (2006) The cytokine-dependent MUTZ-3 cell line as an in vitro model for the screening of contact sensitizers. Toxicol. Appl. Pharmacol. 212: 14–23.
Banchereau J., Steinman R. M. (1998) Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392: 245–252.
Basketter D. A., Schales E. W., Wahlkvist H., Montelius J. (1995) An evaluation of the suitability of benzocaine as a positive control skin sensitizer. Contact Dermatitis 33: 28–32.
Bell E., Ehrlich H. P., Buttle D. J., Nakatsuji T. (1981) Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science 211: 1052–1454.
Caux C., Vanbervliet B., Massacrier C., Dezutter-Dambuyant C., et al. (1996) CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J Exp Med. 184: 695–706.
Chapius F., Rosenzweig M., Yagello M., Ekman M., Biberfeld P., Gluckman J. C. (1997) Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur. J. Immunology 27: 431–441.
Facy V., Flouret V., Regnier M., Schmidt R. (2004) Langerhans cells integrated into human reconstructed epidermis respond to known sensitizers and ultraviolet exposure. J. Invest. Dermatol. 122: 552–553.
Geissmann F., Prost C., Monnet J., Dy M., et al. (1998) Transforming growth factor b1, in the presence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and interleukin 4, induces differentiation of human peripheral blood monocytes into dendritic Langerhans cells. J. Exp. Med. 187: 961–996.
Geissmann F., Revy P., Regnault A., Lepelletier Y., et al. (1999) TGF-beta 1 prevents the noncognate maturation of human dendritic Langerhans cells. J. Immunol. 162: 4567–4575.
Hulette B. A., Ryan C. A., Gerberick G. F. (2002) Elucidating changes in surface marker expression of dendritic cells following chemical allergen treatment. Toxicol. Appl. Pharmacol. 182: 226–233.
Johansson S. G., Hourihane J. O., Bousquet J., Bruijnzeel-Koomen C., et al. (2001) A revised nomenclature for allergy. An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy 56: 813–824.
Kimber I., Weisenberger C. (1989) A murine local lymph node assay for the identification of contact allergens. Assay development and results of an initial validation study. Arch. Toxicol. 63: 274–282.
Larsen C. P., Steinman R. M., Witmer-Pack M., Hankins D. F. et al. (1990) Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. J. Exp. Med. 172: 1483–1493.
Limat A., Hunziker T. (2002) Use of epidermal equivalents generated from follicular outer root sheath cells in vitro and for autologous grafting of chronic wounds. Cells Tissues Organs 172: 79–85.
OECD (2002) Guidelines for testing of chemicals, Guideline No. 429. Skin sensitization: the local lymph node assay Organization of Economic Cooperation and Development, Paris, Peiser M., Grützkau A., Wanner R., Kolde G. (2003) CD1a and CD1c cell sorting yields a homogeneous population of immature human Langerhans cells. J. Immunol. Methods 279: 41–53.
Peiser M., Wanner R., Kolde G. (2004) Human epidermal Langerhans cells differ from monocyte-derived Langerhans cells in CD80 expression and in secretion of IL-12 after CD40 cross-linking. J. Leukoc. Biol. 76: 616–622.
Pichowski J. S., Cumberbatch M., Dearman R. J., Basketter D. A., et al. (2000) Investigation of induced changes in interleukin 1 beta mRNA expression by cultured human dendritic cells as an in vitro approach to skin sensitization testing. Toxicol. In Vitro 14: 351–360.
Reis e Sousa C. (2006) Dendritic cells in a mature age. Nat. Rev. Immunol. 6: 476–483. Ryan C. A., Gerberick G. F., Gildea L. A., Hulette B. C., et al. (2005) Interactions of contact allergens with dendritic cells: Opportunities and challenges for the development of novel approaches to hazard assessment. Toxicol. Sci. 88: 4–11.
Sallusto F., Lanzavecchia A. (1994) Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor a. J. Exp. Med. 179: 1109–1118.
Schaerli P., Willimann K., Ebert L. M., Walz A., et al. (2005) Cutaneous CXCL14 targets blood precursors to epidermal niches for Langerhans cell differentiation. Immunity 23: 331–342.
Schuler G., Brang D., Romani N. (1995) Production and properties of large numbers of dendritic cells from human blood. In: Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology. Eds. J. Banchercau and D. Schmitt. Vol. 2, pp. 43–52. Plenum Press, New York.
Steckel F., Degwert J., Hoppe U. (1995) Phenotype and alloactivating capacity of dendritic cells generated under different culture conditions from human peripheral blood. In: Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology. Eds. J. Banchereau and D. Schmitt. Vol. 2, pp. 355–357. Plenum Press, New York.
Straube F., Grenet O., Bruegger P., Ulrich P. (2005) Contact allergens and irritants show discrete differences in the activation of human monocyte-derived dendritic cells: consequences for in vitro detection of contact allergens. Arch. Toxicol. 79: 37–46.
Vandebriel R. J., Van Och F. M., van Loveren H. (2005) In vitro assessment of sensitizing activity of low molecular weight compounds. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207(2 Suppl.): 142–148.
Yoshida Y., Sakaguchi H., Ito Y., Okuda M., et al. (2003) Evaluation of the skin sensitization potential of chemicals using expression of co-stimulatory molecules, CD54 and CD86, on the naive THP-1 cell line.
Toxicol. in Vitro 17: 221–228.

Claims

Verfahren zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, mit den Schritten: a) Humane Monozyten und Keratinozyten werden bereitgestellt und in Kokultur genommen. b) es wird die Einwirkung von Cytokinen auf diese Zellen gewährleistet, z. B. indem die Cytokine zugesetzt werden, wobei die folgenden Vorgänge c) bis e) gezielt ausgelöst werden. c) unter Aktivierung der Keratinozyten durch die Cytokine kommt es zur Differenzierung der Monozyten zu Dendritischen Zellen, hierdurch erfolgt die Generierung spezifisch für das Testverfahren geeigneter Dendritischer Zellen, d) zusätzlich wirken die Cytokine direkt auf die Differenzierung der Monozyten, e) Entstehung einer lockeren Kokultur aus aktivierten humanen Keratinozyten, die nicht ausdifferenziert sind, und aus beweglichen humanen Dendritischen Zellen, f) wobei keine weiteren Träger wie Kollagen/Fibroblastenschichten verwendet werden, g) Zugabe der auf ihr Sensibilisierungspotential zu testenden Substanz(en) zur fertigen Kokultur, h) Bestimmung der Expression von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen, wie z. B. CD86.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Cytokine zumindest IL-4. GM-CSF und/oder TGF-β sind.
In-vitro-Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche, zumindest umfassend a) humanes Leukozytenkonzentrat, humane Keratinozyten und Cytokine oder b) humane Monozyten, humane Keratinozyten und Cytokine.
Testkit nach Anspruch 3, zusätzlich umfassend Mittel zum Nachweis der Expression von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen, z. B. Antikörper zum Nachweis von CD86.
Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Testkits nach Anspruch 3 zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass in einem für die Kultur von Säugerzellen geeigneten Plastikmaterial humane Keratinozyten und humane Monozyten kokultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinozyten cryokonserviert gewesen sein können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass bevorzugt Keratinozyten eingesetzt werden, die während ihrer ersten Kultivierung durch Antrypsinieren hinsichtlich starker Adhärenz an Plastikmaterial selektiert wurden.
Verfahren nach einem der Anspruchs 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten nach erfolgter Adhäsion den Keratinozyten zugefügt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten bereits vor dem Einfügen in die Kokultur durch magnetisches Sortieren aus Vollblut oder Leukozytenkonzentrat angereichert wurden oder alternativ, dass die Monozyten erst in der Kokultur angereichert wurden, indem ans einer ausgesäten Leukozytenfraktion Zellen selektiert wurden, die stärker an die Plastikoberfläche des Zellkulturmaterials oder an die bereits enthaltenen Keratinozyten haften.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisch angereicherten Monozyten und die Leukozytenfraktion cryokonserviert gewesen sein können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Zugabe der Monozyten die Cytokine IL-4, GM-CSF und/oder TGF-β zugegeben werden, so dass die Monozyten zu Dendritischen Zellen differenzieren und die Keratinozyten aktiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Kokultur nach erfolgter Differenzierung der Monozyten zu Dendritischen Zellen als Testkit benutzt werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass serumfreie Zellkulturmedien benutzt werden können,
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Keratinozyten und Monozyten nicht vom selben Spender stammen müssen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen nicht von verschiedenen Spendern gepoolt werden müssen.