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DE102007006736A1 - In-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz - Google Patents

In-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz Download PDF

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DE102007006736A1
DE102007006736A1 DE200710006736 DE102007006736A DE102007006736A1 DE 102007006736 A1 DE102007006736 A1 DE 102007006736A1 DE 200710006736 DE200710006736 DE 200710006736 DE 102007006736 A DE102007006736 A DE 102007006736A DE 102007006736 A1 DE102007006736 A1 DE 102007006736A1
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Abstract

Das technische Gebiet der Erfindung ist die Biotechnologie. Das Potential einer Substanz, eine allergische Kontaktdermatitis auslösen zu können, wird als sensibilisierendes Potential bezeichnet. Der derzeit gängige und von der OECD anerkannte Test, mit dem ein solchen Potential ermittelt wird, ist der lokale Lymphknotentest an der Maus (LLNA). Ethisch vertretbarer wäre jedoch ein tierversuchsfreies In-vitro-Testverfahren. Außerdem liefert LLNA teilweise falsche Ergebnisse, so dass auch die Sicherheit der Testaussage, betreffend weitere Fortschritte, notwendig ist. Bisher liegt kein akzeptables In-vitro-Testverfahren vor. Lösungsvorschläge basierten entweder auf der singulären Kultivierung der Zelltypen Keratinozyt oder Immunzelle (wie Monozyt, Dendritische Zelle und ihre Vorläuferzellen, Antigen-präsentierende Zelle) oder auf Kokulturen von Keratinozyten und Immunzellen, in denen die Keratinozyten naturnah zu mehrschichtigen Hautäquivalenten differieren, in die sich die Immunzellen kohärent integrieren. Die vorliegende Erfindung schlägt ein Testkit zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz vor, bestehend aus einer lockeren Kokultur einer einschichtigen Lage von humanen nicht-differenzierenden Keratinozyten und aus beweglichen Dendritischen Zellen, die mittels der Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-beta aus humanen allogenen CD14<SUP>+</SUP>-Monozyten in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisiernden Potentials einer Substanz. Das Testkit besteht aus einer lockeren Kokultur aus aktivierten humanen basalen Keratinozyten und aus beweglichen humanen Dendritischen Zellen. Die vorliegende Erfindung umfasst des weiteren das Herstellungsverfahren dieses Testkits.
  • Stand der Technik
  • Die Kontaktdermatitis ist ein weit verbreitetes berufsbezogenes oder umweltbedingtes Gesundheitsproblem.
  • Die Begriffe Kontaktdermatitis und Kontaktekzem (contact hypersensitivity) beschreiben Hautreaktionen nach Kontakt mit niedermolekularen Substanzen (typisch < 500 kDa). Ist diese Hautreaktion durch Aktivitäten des Immunsystems vermittelt, handelt es sich um ein allergisches Kontaktekzem/eine allergische Kontaktdermatitis. Die auslösenden Chemikalien werden als Allergene, Haptene oder als sensibilisierende Stoffe bezeichnet. Ist das Immunsystem nicht an der Ausbildung der Hautreaktionen beteiligt, werden die auslösenden Stoffe als Irritantien oder Toxine bezeichnet (Nomenklatur: Johansson et al., 2001).
  • Das Potential einer Chemikalie, eine allergische Kontaktdermatitis auslösen zu können, wird als sensibilisierendes Potential (sensitization potential) bezeichnet. Der derzeit gängige und von der OECD anerkannte Test, mit dem ein solches Potential ermittelt wird, ist der lokale Lymphknotentest an der Maus (mouse local lymph node assay, LLNA) (Kimber and Weisenberger 1989; OECD. Guideline 429, 2002). Durch die Einführung dieses Tests konnte gegenüber seinen Vorgängern die Anzahl der benötigten Tiere reduziert und auch deren Belastung vermindert werden. Ethisch vertretbarer wäre jedoch ein tierversuchsfreies Testverfahren (in-vitro assay). Außerdem liefert LLNA teilweise falsche Ergebnisse, wie beispielweise bezüglich der Substanz Benzocaine (Basketter et al., 1995), so dass auch die Sicherheit der Testaussage betreffend weitere Fortschritte notwendig sind.
  • Langerhanszellen sind unreife Dendritische Zellen in der Haut (Banchereau and Steiman, 1998). Dendritische Zellen besitzen die Fähigkeit, eine primäre Immunreaktion zu initiieren und sind damit auch an der Initiation der allergischen Kontaktdermatitis zentral beteiligt. Sie können erkennen, ob sich in ihrer Umgebung Gefahr-signalisierende Moleküle befinden. Kontakt mit Gefahr-signalisierenden Molekülen induziert die Reifung der Dendritischen Zelle zur Antigen-präsentierenden Zelle, die Allergene in passender Form dem spezifischen Immunsystem zuführen kann. In der Folge werden damit auch T- und B-Lymphozyten sowie weitere Zellen in die Reaktion auf Allergenkontakt einbezogen (Übersicht in: Reis e Sousa, 2006). Es läge daher nahe, in einem alternativen in-vitro Testverfahren Langerhanszellen zu kultivieren und geeignete Reaktionen der Zellen auf Allergenkontakt zu messen (Übersicht in: Ryan et al., 2005). Dies ist derzeit nicht möglich, da kein Zellkulturverfahren beschrieben ist, mit dem aus der menschlichen Haut isolierte Langerhanszellen ausreichend lang reaktiv gehalten werden können (Peiser et al., 2003).
  • Es liegen keine menschlichen Zelllinien vor, die authentische Dendritische Zellen ersetzen könnten. Versuche mit den Zelllinien. THP-1, KG-1 oder MUTZ-3 zeigten, dass diese Zellen nur auf extrem starke Allergene reagieren und das in einem Konzentrationsbereich, der an der Grenze zu toxischer Aktivität liegt (borderline concentrations) (Yoshida et al., 2003; Azam et al., 2006). Außerdem neigen Zelllinien zu genetischer Instabilität.
  • Es wurden Verfahren entwickelt, mit denen sich aus Vorläufern Dendritische Zellen generieren lassen, die in ihren Leistungen authentischen Dendritischen Zelle nahe kommen. Vorläuferzellen sind dabei Monozyten, die aus adultem peripherem Blut oder aus Leukozytenkonzentrat (buffy coat) gewonnen werden oder CD34+-Blutstammzellen aus Nabelschnurblut oder Knochenmark. Die Vorläuferzellen differenzieren, durch Cytokine stimuliert, zu unreifen Dendritischen Zellen. Eingesetzt wurden die Cytokine IL-4 zusammen mit GM-CSF, teilweise auch zusätzlich mit TNF-α (Sallusto and Lanzavecchia, 1994; Schuler et al., 1995; Steckel et al., 1995; Chapius et al., 1997; Caux et al., 1996). Der Begriff unreife Dendritische Zelle bedeutet hier, dass es sich bei diesen Zellen um differenzierte Zellen handelt, die auf einen Reifestimulus durch pathogenassoziierte Moleküle oder Allergene warten und die nach Kontakt damit zur Antigen-präsentierenden Zelle reifen können. Dieser Typ Dendritischer Zellen wurde ausgiebig auf seine Fähigkeit untersucht, sensibilisierende Substanzen in Testverfahren detektieren zu können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Dendritische Zellen, wenn sie solitär kultiviert werden, als Testsystem für Allergene ungeeignet sind. Detektierbare Konzentrationen von Kontaktallergenen liegen im subtoxischen bis bereits toxischen Bereich, und eine Unterscheidung zwischen Allergenen und Irritantien ist kaum möglich (Hulette et al., 2002; Straube et al., 2005; Übersicht in: Ryan et al., 2005). Außerdem zeigte sich, insbesondere für aus CD14+ Monozyten gewonnenen Dendritischen Zellen, eine erhebliche Spendervarianz bezüglich der Testergebnisse, so dass Testzellen verschiedener Spender gepoolt werden mussten (Pichowski et al., 2000; Aeby et al., 2004).
  • Ein weiteres Problem bezüglich einer Anwendung generierter Dendritischer Zellen in einem Testsystem auf sensibilisierende Substanzen ist, dass diese Zellen in Kultur zu einer spontanen, von Stimulation von außen unabhängigen Reifung neigen. Detektiert werden soll aber gerade eine potentielle allergeninduzierte Reifung. Ein Zellkulturverfahren, aus dem Dendritische Zellen mit typischen Merkmalen authentischer Langerhanszellen resultieren, benutzt für die Generierung aus CD14+ Zellen eine Kombination der Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β. So generierte Zellen neigen nicht zu spontaner Reifung, aber solitär kultiviert bleiben auch bei diesem System überzeugende Reaktionen der Zellen auf Allergene aus (Geissmann et al., 1998; Geissmann et al., 1999; Aiba et al., 2000; Peiser et al., 2004).
  • Niedermolekulare Allergene sind Haptene, die an Proteine gebunden werden müssen, bevor sie Immunreaktionen auslösen können. An dieser Proteinbindung sind Keratinozyten beteiligt. Keratinozyten könnten außerdem zur Reifung Dendritischer Zellen nach Allergenkontakt beitragen, indem sie Gefahrsignale an die Dendritischen Zellen senden (Vandebriel et al., 2005). In einem zellbasierten Testsystem für sensibilisierende Substanzen sollten daher Dendritische Zellen und Keratinozyten kombiniert benutzt werden.
  • Primäre humane Keratinozyten können in-vitro zu einer dreidimensionalen Zellkultur herangezüchtet werden, die Zellschichten verschiedener Differenzierungsstufen aufweist. Einige Modelle beinhalten alle epidermalen Schichten, von der basalen- bis zur Hornschicht. Die basalen Keratinozyten liegen meist auf einer Schicht von Fibroblasten, die ihrerseits auf eine Kollagenmatrix aufgebracht wurden. Solche Kulturen werden als Hautäquivalent, Epidermis-Äquivalent, organtypisches Hautmodell oder rekonstruierte Epidermis bezeichnet (Bell et al., 1981; Limat and Hunziker, 2002). Epidermis-Äquivalente unter anderem zur Testung auf Irrttantien und Toxine werden beispielsweise angeboten von den Firmen SkinEthic (Nizza, Frankreich), CellSystems (St. Katharinen, Deutschland), Euroderm (Leipzig, Deutschland) oder MatTek Inc. (Massachussets, USA).
  • Ein in-vitro Testsystem zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, das auf derart rekonstruierter Epidermis basiert, sollte zusätzlich Dendritische Zellen enthalten. Wird allerdings Epidermis in organische Kultur genommen, wandern die Langerhanszellen spontan aus der Epidermis in das Kulturmedium aus (Larsen et al., 1990). Es ist nicht bekannt, ob in der Epidermis zwischen suprabasalen Keratinozyten und Langerhanszellen tatsächlich feste Zellkontakte bestehen oder ob schon unreife Langerhanszellen beweglich sind. Vereinzelt wurde von mehrschichtigen Hautäquivalenten berichtet, in die sich Vorläufer Dendritischer Zellen kohärent integrieren und dann differenzieren ließen (Facy et al., 2004; Schaerli et al., 2005). Im Patent EP 0789074 ist beschrieben, wie CD34+ Vorläuferzellen in ein Epidermisäquivalent eingebracht werden, differenzieren und sich dann suprabasal in das Epidermisäquivalent integrieren. Die Offenlegungsschrift DE 102004061289 A1 beschreibt die Integration von Immunzellen in ein Testkit, das aus einem geschichteten Epidermisäquivalent besteht. Unklar ist, wieso, anders als in-vivo, die Dendritischen Zellen im Hautäquivalent gebunden werden und es bleiben sollen, bis ihre Reifung induziert wird. Es gibt kein anerkanntes Testkit zur in-vitro Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, das auf geschichteten Hautäquivalenten mit integrierten Dendritischen Zellen basiert. Probleme bereiten eine hohe Spendervarianz bezüglich der Testergebnisse, schlechte Kohärenz der sich im Modell befindlichen Zellen sowie der Einfluss der Fibroblasten auf die Testergebnisse.
  • Vor diesem Hintergrund präsentiert die vorliegende Erfindung ein Testkit zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, bestehend aus einer lockeren Kokultur einer einschichtigen Lage von humanen nicht-differenzierenden Keratinozyten und aus beweglichen Dendritischen Zellen, die mittels IL-4, GM-CSF und TGF-β aus humanen allogenen CD14+ Monozyten in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden.
  • Die im Testkit eingesetzten Keratinozyten sind humane normale Keratinozyten, die während ihrer ersten Kultur durch „Antrypsinieren" hinsichtlich starker Adhärenz an Zellkultur-Plastikmaterial selektiert worden sein können.
  • Die kokultivierten Keratinozyten erreichen ein aktiviertes Stadium, das vergleichbar ist mit dem Stadium von an der Wundheilung beteiligten Keratinozyten. Dies ist z. B. an der hohen Sekretionsrate der Metalloproteinase MMP-9 erkennbar.
  • Das Zellkulturmedium muss eine Differenzierung der Keratinozyten nicht unterstützen, z. B. durch eine niedrige Calciumkonzentration.
  • Das vorgeschlagene Testkit kann sensibilisierende Substanzen anhand der Erhöhung von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen detektieren. Bevorzugt wird die CD86-Expression auf den Dendritischen Zellen per FACS-Analyse gemessen (verwendeter Antikörper z. B. R-Phycoerythrin mouse anti-human CD86 (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland)). Weiterhin bevorzugt erfolgt für die FACS-Analyse eine Doppelfärbung zur Identifizierung der Zellen, z. B. CD86/CD11c (verwendeter Antikörper z. B. mouse anti-human CD11c:FITC (z. B. von Serotec, Düsseldorf, Deutschland)) oder CD86/HLA-DR (verwendeter Antikörper z. B. FITC- conjugated mouse anti-human HLA-DR (z. B. von BD)) oder CD86/CD1c (z. B. human CD1c-FITC von Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland). Dabei sind Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Detektion sensibilisierender Substanzen deutlich besser als bei bisherigen Assays.
  • Dosis-Wirkungs-Beziehungen bislang ungeprüfter Substanzen können bestimmt und mit bekannten Allergenen verglichen werden, deren Potential z. B. aus LLNA-Assays verifiziert ist. Damit lässt sich die Stärke des sensibilisierenden Potentials einer Testsubstanz in Katagorien bezüglich ihrer Wirkstärke einteilen. Es können effektive Konzentrationen angegeben werden.
  • Eine messbare Reifung der Dendritischen Zellen durch Kontakt mit sensibilisierenden Substanzen erfolgt bereits weit unterhalb irritierender oder toxischer Konzentrationen. Die Viabilität der Dendritischen Zellen kann durch die Färbrate mit 7-AAD (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland) oder Propidiumiodid (z. B. von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) bestimmt werden. Damit kann das Testkit sensibilisierend und irritierend wirkende Konzentrationen einer Substanz differenzieren.
  • Die Zugabe des Cytokins TGF-β bedingt, dass die Dendritischen Zellen im Testkit nicht zu spontaner Reifung neigen.
  • Es besteht kein nennenswerter Einfluss der Zell-Spender auf die Testergebnisse. Es ist nicht notwendig, Spender zu poolen.
  • Da keine Zellen des spezifischen Immunsystems ins Testkit integriert sind, müssen Keratinozyten und Dendritische Zellen, bzw. ihre Vorläufer nicht vom selben Spender stammen.
  • Das Testkit lässt sich aus cryokonservierten Zellen herstellen.
  • Die Kokultur erfolgt serumfrei (z. B. in KGM (PromoCell, Heidelberg, Deutschland)).
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  • Das Verfahren zur Herstellung eines solchen Testkits wird angegeben. Zudem wird ein Anwendungsverfahren angegeben. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne dass sie einschränkend zu verstehen sind.
  • Beispiel für die Herstellung eines Testkits, bestehend aus einer lockeren Kokultur von humanen Keratinozyten und beweglichen humanen Dendritischen Zellen, die aus Vorläuferzellen durch die Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden.
  • 1. Vorbereitende Arbeiten
  • 1.1 Selektion und Cryokonservierung primärer humaner Keratinozyten
  • Normale menschliche Hautproben sind mit der Erlaubnis lokaler Ethikkomitees als übrigbleibendes Material nach chirurgischen Eingriffen, wie einer Mammareduktion, erhältlich. Alle Arbeiten erfolgen unter sterilen Bedingungen. Die Haut wird in Streifen geschnitten und 18 Stunden lang bei 4°C in einem Medium inkubiert, das 3 RMB units Dispase I (z. B. von Roche, Mannheim, Deutschland) in PBS (z. B. von Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland) enthält. Danach lässt sich die Dermis abziehen. Die epidermalen Streifen werden 15 Minuten lang bei 37°C in einer Lösung inkubiert, die 0.25% Trypsin (z. B. von Biochrom, Berlin, Deutschland) und 0.01% DNase (z. B. von Roche, Mannheim, Deutschland) in PBS enthält. Dabei zerfällt die Epidermis in eine Einzelzellsuspension, die durch ein 40 μM Zellsieb (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland) passagiert und anschließend dreimal mit PBS gewaschen wird. Die Keratinozyten werden dann in einem serumfreien Zellkulturmedium wie KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) resuspendiert und auf Zellkulturflaschen ausgesät, die für adherierende Säugetierzellen geeignet sind (z. B. Costar Cell Culture Flask, von Corning Incorporated, Schiphol-Rijk, Niederlande). Die Dichte wird auf 2–5 × 105 Zellen/cm2 (Durchmesser > 8 μm) eingestellt, und die Zellkulturflaschen werden in einem Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am Tag nach der Aussaat und danach an jedem zweiten Tag werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit frischem Medium versorgt. Etwa 8 Tage nach der Aussaat erfolgt bei erfolgreicher Bildung von Keratinozyteninseln eine Selektion durch „Antrypsinieren". Die Zellen werden 3 Minuten lang bei Raumtemperatur 1 × Trypsin (Biochrom, Berlin, Deutschland) ausgesetzt, wodurch nur kräftig haftende, viable Zellen nicht abschwimmen. Nach Stoppen der Trypsinaktivität und Waschen mit PBS werden die selektierten Zellen bis zur Konfluenz weiterkultiviert. Die Ernte der Zellen erfolgt durch Ablösen von den Zellkuturflaschen durch Inkubation mit 1× Trypsin für 15 Minuten bei 37°C. Dann wird 5% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (z. B. von Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland) in PBS zugegeben. Nach zweimaligem Waschen in PBS werden die Zellen in hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum mit 10% DMSO (z. B. Hybrimax von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer Dichte von etwa 6 × 106 Zellen > 8 μm/ml resuspendiert, 1 ml-weise portioniert, langsam in einer Cryobox (z. B. in einem Cryo 1°C Freezing Container von Nalgene (Batavia, IL, USA)) auf –80°C heruntergekühlt und dann in flüssigem Stickstoff cryokonserviert. Jede Charge wird einem Endotoxintest unterzogen, bevorzugt dem Limulus amoebocyte lysate Test (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA).
  • 1.2 Cryokonservierung humaner Monozyten
  • Humane Monozyten werden bevorzugt aus Leukozytenkonzentrat (buffy coat, z. B. von DRK-Blutspendediensten, Deutschland) isoliert, können aber auch aus Vollblut gereinigt werden. Das Konzentrat wird 1:2 mit PBS verdünnt, und es wird eine Ficoll-(z. B. von Biochrom, Berlin, Deutschland)Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Die Leukozytenfraktion wird entnommen und solange mit PBS gewaschen, bis die Überstände klar sind. Anschließend werden aus den Leukozyten die Monozyten bevorzugt durch magnetisches Sortieren (MACS) weiter aufgereinigt. Bevorzugt werden hier das Oberflächenantigen CD14 nach Herstellerprotokoll (CD14 MicroBeads, human (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland)) oder das human Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi) benutzt. Die isolierten CD14+-Monozyten werden in fötalem Kälberserum (z. B. von Gibco) mit 10% DMSO (z. B. Hybrimax von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer Dichte von 2–3 × 10 Zellen > 8 μm/ml resuspendiert und cyryokonserviert wie oben für die Keratinozyten beschrieben. Jede Charge wird einem Endotoxintest unterzogen, bevorzugt dem Limulus amoebocyte lysate test (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA).
  • 1.3. Cryokonservierung humaner Leukozyten
  • Alternativ werden Monozyten über ihre im Vergleich zu anderen Leukozyten stärkere Adhärenz an Zellkulturschalen und an Keratinozyten angereichert. Für diese spätere Anwendung werden nach der Dichtegradientenzentrifugation die gewaschenen Leukozyten (PBMC) ohne weitere Aufreinigung cryokonserviert wie oben beschrieben.
  • 2. Aussaat des Testkits
  • 2.1. Aussaat der cryokonservierten Keratinozyten
  • Cryokonservierte Keratinocyten, beschrieben in 1.1, werden in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut und mehrfach in PBS gewaschen. Danach werden die Keratinozyten in ein serumfreies Zellkulturmedium überführt. Vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) benutzt. Die Zelldichte wird so gewählt, dass sich nach der Aussaat 2–6 × 104 Zellen > 8 μm/cm2 in der Testschale (z. B. Costar Cell Culture Cluster, von Corning Incorporated, Schiphol-Rijk, Niederlande) befinden. Die Zellkulturen werden am nächsten Tag mit PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium versorgt. Die Kultivierung erfolgt solange bis die heranwachsenden Keratinozyteninseln die Fläche der Testschale halb bedecken (halbkonfluent). Dies wird innerhalb von 2–4 Tagen erreicht.
  • 2.2 Aussaat der cryokonservierten Monozyten
  • Cryokonservierte Monozyten, beschrieben in 1.2, werden in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut und mehrfach in PBS gewaschen. Danach werden die Monozyten in ein serumfreies Zellkulturmedium überführt, das für sie und für Keratinozyten gleichzeitig geeignet ist. Vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) benutzt. Die Testschale, die bereits halbkonfluent adherierende Keratinozyten, wie in 2.1 beschrieben, enthält, wird mit PBS gewaschen, und dann wird die Flüssigkeit abgesaugt. Auf die Keratinozyten werden die Monozyten ausgesät. Die Zelldichte der Monozyten wird so gewählt, dass sich nach der Aussaat 2–5 × 105 Zellen der Monozytenpräparation > 8 μm/cm2 zusätzlich zu den Keratinozyten in der Testschale befinden. Die Monozyten adherieren zunächst an das Plastikmaterial und an die Keratinozyten, lösen sich aber nach einigen Stunden größtenteils wieder ab. Es entsteht eine Kokultur aus adhärenten Kerationzyten, auf denen locker Monozyten aufliegen. Die Viabilität der Monozyten wird durch die Keratinozyten aufrecht erhalten.
  • 2.3 Aussaat cryokonservierter Leukozyten
  • Alternativ zu 2.2 können, nachdem in der Testschale die Keratinozyten gewaschen sind und die Flüssigkeit abgesaugt ist, cryokonservierte Leukozyten, wie in 1.3 beschrieben, nach Auftauen, Waschen und Aufnahme ins Zellkulturmedium (vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell) benutzt) auf die Keratinozyten ausgesät werden. Hierbei werden Zelldichten der Leukozyten so gewählt, dass in der Zellkulturschale Leukozytendichten von 1–2 × 106 Zellen > 8 μm/cm2 vorliegen. Nach 2–3 Stunden werden Zellen, die nicht an das Plastikmaterial oder an die Keratinozyten haften, mit 37°C warmer Zellkulturmedium abgespült und abgesaugt. Anschließend wird frisches Zellkulturmedium zugegeben.
  • 3. Generierung Dendritischer Zellen
  • 2–3 Stunden nach der Aussaat der Monozyten auf die Kerationozytenkulturen, wie in 2.2 beschrieben, bzw. nach dem Abspülen nicht-adhärenter Leukozyten, wie in 2.3 beschrieben, werden die rekombinanten humanen Cytokine IL-4 ad 100 ng/ml (z. B von Immuntools, Friesoythe, Deutschland), GM-CSF ad 100 ng/ml (z. B. von Immuntools) und TGF-β1 ad 10 ng/ml (z. B. von R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) zugegeben. Am Tag 2 und am Tag 4 der Kokultur werden GM-CSF ad 100 ng/ml und TGF-β1 ad 10 ng/ml zugegeben. Am Tag 5–6 ist die Kokultur als Testkit benutzbar.
  • Anwendungsbeispiel
  • Bestimmung der Konzentration, bei der eine Testsubstanz im Testkit eine halbmaximale Reifung der Dendritischen Zellen induziert
  • Ein Testkit wird in einer 12-Loch Testschale (Costar Cell Culture Cluster von Corning Inc.) mit Zellen wie im Herstellungsverfahren in 1.1 und 1.2 beschrieben nach Herstellungsverfahren 2.1 und 2.2 hergestellt. Die zu testende Substanz wird in einem geeigneten Lösungsmittel (wie Wasser, DMSO, Ethanol, Ölgemische) in maximal möglicher Konzentration gelöst. Den Vertiefungen der Testschale mit den Kokulturen wird zu jeweils 2 ml Zellkulturmedium KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell) die Testsubstanz in einer Verdünnungsreihe zugegeben. Dabei wird die Testsubstanz vor Zugabe zum Testkit so verdünnt, dass in den Kokulturen gleiche Endkonzentrationen des Lösungsmittels vorliegen. Es werden jeweils Doppelwerte angelegt. Das Testkit wird nach Zugabe der Testsubstanz 24 Stunden lang in einem Brutschrank inkubiert. Danach werden die nicht-adhärenten Zellen mit dem Zellkulturmedium abgezogen und in FACS-Röhrchen überführt (5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube, BD Falcon, Heidelberg, Deutschland). Nach einer Zentrifugation (330 rpm, 4 min., 20°C) werden für mögliche spätere ELISA-Assays die Medien abgenommen, ihr exaktes Volumen bestimmt und bei –80°C gelagert. Die Zellen werden 2× in PBS gewaschen, und jede Probe wird in zwei Aliquote aufgeteilt. Je eins der Aliquote wird mit je 5 μl der Antikörperlösungen CD11c:FITC (von Serotec) und CD86-PE (von BD) für die FACS-Analyse gefärbt. Das jeweils zweite Aliquot wird mit 20 μl 7-AAD (Cell Viability Solution von BD) gefärbt. Es werden nur Proben mit mehr als 85% vitalen Zellen hinsichtlich ihrer CD86-Expression ausgewertet. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) für CD86 werden für CD11c-positive Zellen bestimmt. Die MFI-Werte der Testsubstanz-Proben werden durch den MFI-Mittelwert der Lösungsmittel-Proben dividiert. Die resultierenden Faktoren werden gegen die Konzentration der Testsubstanz aufgetragen, und aus der Kurve wird die Konzentration der Testsubstanz bestimmt, die zu halbmaximaler Erhöhung der MFI-Werte für CD86 führt. Nach Durchführung unabhängiger Tests unter Verwendung von Zellen, die von jeweils 3 verschiedenen Spender für die Keratinozyten und für die Monozyten stammen, ergibt sich die Konzentration, die eine mittlere halbmaximale CD86-MFI-Erhöhung bewirkt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (18)

  1. In-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kokultur humaner Keratinozyten und humaner Monozyten enthält.
  2. Testkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten während der Kokultur mittels der Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β zu Dendritischen Zellen generiert werden.
  3. Testkit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kokultivierten Dendritischen Zellen locker auf den adhärenten Keratinozyten aufliegen oder im Zellkulturmedium schwimmen.
  4. Testkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinozyten während der Kokultur aktiviert werden.
  5. Testkit nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass außer einem für die Kultivierung von Säugerzellen geeignetem Plastikmaterial keine weiteren Täger, wie Kollagen/Fibroblastenschichten, eingesetzt werden.
  6. Testkit nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Zellkulturmedium eine Differenzierung der Keratinozyten nicht unterstützen muss.
  7. Testkit nach einem der Ansprüche 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass sensibilisierende Substanzen anhand einer erhöhten Expression von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen, bevorzugt von CD86, detektiert werden können.
  8. Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Testkits zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass in einem für die Kultur von Säugerzellen geeignetem Plastikmaterial humane Keratinozyten und humane Monozyten kokultiviert werden.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinozyten cryokonserviert gewesen sein können.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass bevorzugt Keratinozyten eingesetzt werden, die während ihrer ersten Kultivierung durch Antrypsinieren hinsichtlich starker Adhärenz an Plastikmaterial selektiert wurden.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten nach erfolgter Adhäsion der Keratinozyten zugefügt werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten bereits vor dem Einfügen in die Kokultur durch magnetisches Sortieren aus Vollblut oder Lymphozytenkonzentrat angereichert wurden oder alternativ, dass die Monozyten erst in der Kokultur angereichert wurden, indem aus einer ausgesäten Leukozytenfraktion Zellen selektiert wurden, die stärker an die Plastikoberfläche des Zellkulturmaterials oder an die bereits enthaltenen Keratinozyten haften.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisch angereicherten Monozyten und die Leukozytenfraktion cryokonserviert gewesen sein können.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8–13, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Zugabe der Monozyten die Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF–β zugegeben werden, so dass die Monozyten zu Dendritischen Zellen differenzieren und die Keratinozyten aktiviert werden.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kokultur nach erfolgter Differenzierung der Monozyten zu Dendritischen Zellen als Testkit benutzt werden kann.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8–15, dadurch gekennzeichnet, dass serumfreie Zellkulturmedien benutzt werden können.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 8–15, dadurch gekennzeichnet, dass Kerationozyten und Monozyten nicht vom selben Spender stammen müssen.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 8–15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen nicht von verschiedenen Spender gepoolt werden müssen.
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