CN104001216B - 利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，该方法包括以下步骤：1）分离SKPs；2)将分离得到的？SKPs移入扩增培养基中进行扩增；3)SKPs的DiI荧光染料标记；4）制备组织工程皮肤，将胶原海绵打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵Co60照射灭菌，SKPs细胞1×105个/20-30uL培养基加于海绵糙面上，进行培养。本发明的组织工程皮肤中的SKPs可分化为平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经组织，分化出的平滑肌细胞、血管内皮细胞可参与构成血管结构，促进创口新生血管形成，从而提高皮肤愈合速度及愈合质量。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程皮肤制备技术领域，尤其是涉及一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法。
背景技术
糖尿病难治性皮肤损伤(如：糖尿病足)是糖尿病常见的慢性并发症之一，是糖尿病患者致残、致死的主要原因。其高发病率、高致残率、难治疗性、高医疗费用等，使得糖尿病患者的生活质量严重下降，给患者及社会带来沉重的经济负担。糖尿病难治性皮肤损伤的临床常规治疗手段包括控制血糖，改善患者的营养状况，改善局部供血，抗感染，促进外周神经的功能恢复，加强护理，清创术，皮肤移植术等，但治疗效果通常欠佳，目前的治疗重点仍是避免截肢。因此必须寻找更为有效的治疗方法。
目前，组织工程化皮肤已经成为一种较完善的组织工程化组织，并初步应用于临床，为皮肤缺损的修复提供了新的方法，但仍存在诸多问题，如：不存在血管、黑色素细胞等组织成分，不能重建皮肤附属器结构，机械性能与正常在体皮肤有较大差距等。
干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞，具有分化为多种组织类型的潜能。近年来，干细胞作为种子细胞治疗糖尿病难治性皮损已成为新的研究热点。研究证明，ESC和MSC均能产生皮肤组织的构成元件，从而参与皮肤创伤的修复过程，这一特点可以弥补组织工程皮肤替代物的缺陷，提高皮肤的修复能力和愈合质量。但由于使用上述细胞所引发的相关伦理道德问题、移植后存在的致癌可能、细胞来源不足等问题的存在，使得临床应用大为受限，我们需要寻找新的种子细胞来避免上述问题。
2001年，Tomaetal.从取自啮齿类动物新生个体及成年个体的皮肤真皮层中，分离获得了皮肤来源的祖细胞(skin-derivedprecursors，SKPs)。近年来的多项研究表明，SKPs是一种新型的、神经脊衍生的多能祖细胞，存在于哺乳动物真皮层中，在体外实验中，最终可产生神经系子代及中胚层子代。目前，具有SKPs性质的细胞也已经从不同年龄和起源的人类皮肤中分离获得，还能够从人类包皮中常规获得。因SKPs具有多潜能性，不论在正常生理更新或是损伤修复时，均可能分化参与构成皮肤真皮层的中胚层成分，包括真皮成纤维细胞、血管平滑肌细胞等。有研究表明，SKPs能够分化为血管平滑肌细胞，可能也具有形成内皮细胞的能力。
运用现有的SKPs应用于皮肤创面后，可分化为血管平滑肌及内皮细胞，从而促进创口新生血管形成，促进创面愈合。然而其愈合速度仍较慢，效果仍不够理想。如何寻找一种能够快速促进创口新生血管大量形成，促进创面快速愈合的方法已成为目前亟待解决的问题，创面快速愈合对糖尿病皮肤损伤进行治疗的临床应用有着重要的意义，还可为DM慢性难愈创面的临床治疗带来极大帮助。
发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种能够快速促进创口新生血管大量形成，促进创面快速愈合的利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，包括以下步骤：
1)、分离SKPs
将皮肤样品放入无菌PB中，显微镜下分离并弃去皮下组织，将表皮及真皮组织剪成小块放入dispase酶中，4℃消化过夜；第二天取出，分离并弃去表皮部分，保留真皮层组织；加入胶原酶37℃消化1h；吹打组织直至单细胞，用40um孔径细胞筛网过滤细胞；用完全培养基培养单细胞，每隔七天换液一次；
2)、SKPs快速扩增
当细胞形成克隆球并中间发暗时进行细胞传代，按1:2的比例进行传代，在扩增培养基中扩增培养；
3)、SKPs的DiI荧光染料标记
细胞悬液37℃培养箱中孵育5min后，与中浓度为3ug/mlDiI荧光染料孵育8min；后用PBS洗3次，清除多余染料，重悬于生理盐水中，细胞计数备用，移植前细胞4℃保存；
4)、制备组织工程皮肤
胶原海绵预处理打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵，放入o.o1MPBS中，排气；Co60照射灭菌，照射量20K；超净台内铺板，紫外照射0.5h；每孔300ul培养基，37℃培养箱中过夜；将海绵转移至另一孔板中；细胞1×105个/20—30uL培养基加于海绵糙面；37℃培养箱中孵育4h，细胞贴壁；4h后，培养基200—300uL/孔加入，37℃培养箱中孵育；1天后，换液一次，从海绵边缘吸液，接种细胞3天后移植。
优选的是，所述皮肤样品为表皮及真皮组织。
优选的是，所述皮肤样品为新生C57乳鼠背部皮肤。
优选的是，其中所述步骤1)的培养条件为37℃培养箱中培养。
优选的是，其中所述步骤2)中，所述扩增培养基为完全培养基；培养条件为37℃培养箱。
优选的是，其中所述步骤4)中，所述铺板方式为48孔板，糙面向上，糙面上铺细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的组织工程皮肤促进血管生长的数量为control组的2.95倍，是collagen组的1.68倍，其能够快速促进创口新生血管大量形成，促进创面快速愈合。其是糖尿病皮肤损伤进行治疗的有效手段，是DM慢性难愈创面的临床治疗的最佳选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明制备出的组织工程皮肤；
图2为本发明试验1各实验组伤口愈合的比对图；
图3为采用IPP6.0图像分析软件计算得出的各试验组伤口的收缩率图：
图4为镜下观察各试验组7天时的伤口愈合图；
图5为镜下观察各试验组14天时的伤口愈合图；
图6为skps+collagen组Nestin免疫荧光SKPs存活染色图；
图7为skps+collagen组vWF新生血管染色图；
图8为skps+collagen组SMA平滑肌细胞染色图；
图9为skps+collagen组tubulin神经细胞染色图；
图10为skps+collagen组SMA+nestin新生血管与平滑肌细胞染色图；
图11为skps+collagen组vWF+nestin新生血管染色图；
图12为各处理组14天时SMA新生血管染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
1、SKPs的分离鉴定、标记
新生C57乳鼠断颈处死，背部去毛，剪下背部皮肤，放入无菌PBS中。
体式显微镜下分离并弃去皮下组织，将表皮及真皮组织剪成小块放入dispase酶中，4℃消化过夜；第二天取出，分离并弃去表皮部分，保留真皮层组织；加入胶原酶37℃消化1h；吹打组织直至单细胞，用40um孔径细胞筛网过滤细胞；用完全培养基培养单细胞，每隔七天换液一次，该步骤的培养条件为37℃培养箱中培养。
2、SKPs快速扩增
当细胞形成克隆球并中间发暗时进行细胞传代，按1:2的比例进行传代，在完全培养基中进行；培养条件为37℃培养箱。
3、SKPs的标记
细胞悬液37℃培养箱中孵育5min后，与终浓度为3ug/mlDiI荧光染料孵育8min。后用PBS洗3次，清除多余染料，重悬于生理盐水中，细胞计数备用，移植前细胞4℃保存。
4、制备组织工程皮肤
(1)胶原海绵预处理
a、大小：打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵，放入o.o1MPBS中，排气；
b、Co60照射灭菌，照射量20K，(天津市物理研究所)。
(2)胶原海绵铺板
a、超净台内铺板(48孔板，糙面向上，糙面上铺细胞)紫外照射0.5h；
b、每孔300ul培养基，37℃培养箱中过夜。
(3)胶原海绵铺细胞
a、将海绵转移至另一48孔板中；
b、细胞1×105个/20—30uL培养基加于海绵糙面；
c、37℃培养箱中孵育4h，细胞贴壁；
d、4h后，培养基200—300uL/孔加入，37℃培养箱中孵育；
e、1天后，换液一次，从海绵边缘吸液，尽量不干扰细胞贴壁；
f、接种细胞3天后移植，组织工程皮肤见图1。
组成工程皮肤样品的制作处理
1、轻漂洗：37℃预热的PBS中轻柔漂洗联合培养物2--3min×3次。
2、固定
(1)2.5％戊二醛37℃培养箱中2h。
(2)换一次2.5％戊二醛后，2.5％戊二醛中4℃过夜。
3、梯度酒精脱水
4、自然晾干4h后，抽真空2h。备用。
对实施例1制备的组织工程皮肤中存活细胞的数量及活性观察(MTT法)
1、5mg/mlMTT25ul分别加入联合培养物中，37℃培养箱孵育4h。
2、显色：移液器吸走上清，用灭菌剪子将海绵剪为4瓣，每孔避光加入300ulDMSO，用移液器轻轻打匀。振荡器上震荡15min，全程注意避光。
3、比色：每孔取50ul转移入新的96孔板中，测OD值(波长：490nm)。
4、每个时间点(移植后1、3、5天)分别测3次，每次每组测三个样，取平均值。
鉴定结论
1、细胞的分离。本实验借鉴了Tomaetal.的方法，将皮肤消化成单细胞后，使用无血清培养基培养。分离效率很高，保持了细胞的祖细胞状态。通过文献比对，可以证明，当下大多数关于毛囊干细胞文献所分离出的nestin阳性细胞与此种方法分离出的细胞为同源细胞，均来自神经脊。
2、细胞的体外扩增及传代。这种细胞在无血清的条件下增长缓慢，充分维持其祖细胞特征。当细胞加入不同浓度血清的培养基之后，其增值相应增加，分化也相应开始。
3、细胞的分化鉴定。在细胞的生长过程中撤去生长因子，并加入血清，细胞能进行多向的分化，如神经，脂肪，平滑肌等，分化效率与时间根据不同的分化方向而不同，毛囊干细胞最容易的分化方向是平滑肌细胞与神经细胞。
4、进行了细胞祖细胞与旁分泌能力的鉴定工作。该细胞表达nestin，这是神经祖细胞的标记，nanog与OCT3/4为胚胎干细胞的标记，SDF-1与bFGF的表达证明其具有旁分泌的能力。
试验1：C57小鼠T2DM皮肤损伤模型的建立
(1)麻醉：4％水合氯醛350mg/kg腹腔注射于C57小鼠T2DM模型。
(2)备皮、固定、消毒：去除小鼠背部鼠毛，腹面向下固定于手术操作台上，背部皮肤消毒。
(3)建立皮损模型：于小鼠背部正中线上，用手术剪剪一直径为8mm的圆形皮肤损伤，损伤厚度达皮肤全层，前后各一。
(4)移植：设置三组移植处理组，各处理组给予不同处理。control组：自然愈合；collagen组：移植胶原海绵；skps-collagen组：移植本发明的组织工程皮肤。
(5)固定海绵：用7/0线缝合固定胶原海绵于小鼠皮肤创口处。注意海绵与创口暴露组织的良好对合。
(6)术后：无菌敷贴覆盖。所有小鼠单笼喂养，自由进食高脂高糖饲料，自由饮水。
试验1创面修复的结果
1、创口愈合大体外观
全部创口均无感染，创口由创口边缘向创口中心逐渐收缩，图2展示了control组、collagen组以及collagen+skps组0天、7天以及14天时创口的愈合情况。
1)control组：创面皮肤收缩缓慢，痂皮菲薄，痂皮下肉芽组织生长缓慢，色泽暗红，质脆，外力下极易破损，愈合质量差。伤后14天，创面基本愈合，由皮肤愈合瘢痕较明显，痂皮明显残留。
2)collagen组：创面皮肤收缩快，痂皮下可见薄层肉芽组织，色泽暗红。伤后14天，创面基本愈合，留有少量痂皮。
3)collagen+skps组：创面皮肤收缩快，痂皮下肉芽组织生长较为牢固，色泽较红润，创面干燥，新生皮肤平整，皮肤愈合瘢痕明显较小。伤后14天，创面愈合，部分痂皮完全脱落。
2、伤口愈合速度
肉眼观察：移植7天内，collagen、skps-collagen组伤口收缩均快于control组。
经IPP6.0图像分析软件计算(图3)，移植后7天时，各组伤口收缩率具有明显差异(p＜0.01)，7天时伤口收缩率：skps-collagen组＞collagen组＞control组。14天时，各组伤口收缩率无差异，伤口均基本闭合。
3、镜下观察伤口愈合质量(×100倍视野拼图)
7天时(图4)，创口肉芽组织形成，上皮由创口边缘向创口中央增生，创口底部及创口缘大量新生血管形成；control组可见肉芽组织形成菲薄，创口底部新生血管形成。与control组相比，collagen组及collagen+skps组创口处新生组织形成更为丰满，肉芽组织形成佳，创口底部及窗口边缘可见大量新生血管形成，炎细胞侵润，组织结构更为完整。
14天时(图5)，各组创口新生组织结构完整。相比之下，control组肉芽形成缓慢，结构菲薄，结构完整性差。
4、本发明的组织工程皮肤向平滑肌、内皮、神经分化，促进新生血管形成分析；
skps+collagen组Nestin免疫荧光SKPs存活染色图(图6)：7天时skps+collagen组免疫荧光染色，在创口底部及创口缘可见DiI阳性细胞与nestin阳性细胞重合，说明组织中存在移植细胞来源的SKPs存活，且保持有神经祖细胞的标记。
skps+collagen组vWF新生血管染色图(图7)：在创口底部及创口缘DiI阳性细胞与vWF阳性细胞重合。说明组织中存在移植SKPs来源的细胞存活，且表达内皮细胞的标记。可证明移植的SKPs分化为内皮细胞，参与了新生血管的形成，参与组织修复。
skps+collagen组SMA平滑肌细胞染色图(图8)：在创口底部及创口缘DiI阳性细胞SMA阳性细胞重合。说明组织中存在移植SKPs来源的细胞存活，且表达平滑肌细胞的标记，参与形成管状结构。可证明移植的SKPs分化为平滑肌细胞，参与了新生血管的形成，参与组织修复。
skps+collagen组tubulin神经细胞染色图(图9)：创口缘易见DiI阳性细胞与tubulin阳性细胞重合。说明组织中存在移植SKPs来源的细胞存活，且表达神经细胞的标记。可证明移植的SKPs分化为神经组织，参与了新生神经组织的形成。
skps+collagen组SMA+nestin新生血管与平滑肌细胞染色图(图10)：在创口底部及创口缘易见nestin阳性细胞与SMA阳性细胞重合，nestin为SKPs标记之一，nestin阳性细胞表达平滑肌细胞标记，参与了新生血管的形成。
skps+collagen组vWF+nestin新生血管染色图(图11)：在创口底部及创口缘易见nestin阳性细胞与vWF阳性细胞重合，nestin为SKPs标记之一，nestin阳性细胞表达内皮细胞标记，参与了新生血管的形成。
5、损伤区血管数量计算
据SMA染色结果(图12)，计数移植后14天后，创口区域内血管数量。结果：skps-collagen组血管数量多于control组，具有统计学意义(p＜0.05)。创口区域内血管数量：skps-collagen组＞collagen组＞control组。skps-collagen联合移植促进了新生血管形成，从而促进皮肤创口愈合，各试验组血管数量见下表。
| 分组 | control | collagen | skps-collagen |
| 14天血管数量 | 21.07±4.99 | 39.82±0.14 | 62.07±0.11 |
试验表面，本发明的组织工程皮肤促进血管生长的数量为control组的2.95倍，是collagen组的1.68倍，其能够快速促进创口新生血管大量形成，促进创面快速愈合。其是糖尿病皮肤损伤进行治疗的有效手段，是DM慢性难愈创面的临床治疗的最佳选择。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，包括以下步骤：
1)、分离SKPs
将皮肤样品放入无菌PBS中，显微镜下分离并弃去皮下组织，将表皮及真皮组织剪成小块放入dispase酶中，4℃消化过夜；第二天取出，分离并弃去表皮部分，保留真皮层组织；加入胶原酶37℃消化1h；吹打组织直至单细胞，用40um孔径细胞筛网过滤细胞；用完全培养基培养单细胞，每隔七天换液一次；
2)、SKPs快速扩增
当细胞形成克隆球并中间发暗时进行细胞传代，按1:2的比例进行传代，在扩增培养基中扩增培养；
3)、SKPs的DiI荧光染料标记
细胞悬液37℃培养箱中孵育5min后，与中浓度为3ug/mlDiI荧光染料孵育8min；后用PBS洗3次，清除多余染料，重悬于生理盐水中，细胞计数备用，移植前细胞4℃保存；
4)、制备组织工程皮肤
胶原海绵预处理打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵，放入0.01MPBS中，排气；Co60照射灭菌，照射量20K；超净台内铺板，紫外照射0.5h；每孔300ul培养基，37℃培养箱中过夜；将海绵转移至另一孔板中；细胞1×105个/20—30uL培养基加于海绵糙面；37℃培养箱中孵育4h，细胞贴壁；4h后，培养基200—300uL/孔加入，37℃培养箱中孵育；1天后，换液一次，从海绵边缘吸液，接种细胞3天后移植；
步骤1)中所述皮肤样品为表皮及真皮组织。
2.如权利要求1所述一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，其特征是所述皮肤样品为新生C57乳鼠背部皮肤。
3.如权利要求1所述一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，其特征是步骤1)所述的培养条件为37℃培养箱中培养。
4.如权利要求1所述一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，其特征是步骤2)中，所述扩增培养基为完全培养基；培养条件为37℃培养箱。
5.如权利要求1所述一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，其特征是步骤4)中，所述铺板方式为48孔板，糙面向上，糙面上铺细胞。
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