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DE102007004938A1 - Arzneimittel gegen LCT-Vergiftungen - Google Patents

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DE102007004938A1
DE102007004938A1 DE102007004938A DE102007004938A DE102007004938A1 DE 102007004938 A1 DE102007004938 A1 DE 102007004938A1 DE 102007004938 A DE102007004938 A DE 102007004938A DE 102007004938 A DE102007004938 A DE 102007004938A DE 102007004938 A1 DE102007004938 A1 DE 102007004938A1
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Germany
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tcdb
amino acid
protein
acid sequence
trembl
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Withdrawn
Application number
DE102007004938A
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English (en)
Inventor
Jessica Reineke
Stefan Tenzer
Christoph Dr. von Eichel-Streiber
Hansjörg Schild
Maja Rupnik
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Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
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Abstract

Das Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch Large Clostridial Cytotoxins (LCTs), insbesondere Clostridium difficile Toxine A und B (TcdA und TcdB) zeichnet sich dadurch aus, dass es als Wirkstoff wenigstens einen Inhibitor oder Aktivator der autokatalytischen Proteaseaktivität von LCTs (Large Clostridial Cytotoxins) enthält.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch Large Clostridial Cytotoxins (LCTs), insbesondere Clostridium difficile Toxine A und B (TcdA und TcdB), Clostridium sordellii letales Toxin (TcsL) und Clostridium novyi α-Toxin (Tcnα).
  • Clostridium difficile ist ein strikt anaerob wachsender, Sporen bildender, grampositiver Keim, der erst Ende der 70er Jahre als etiologisches Agenz der Antibiotika-assoziierten Diarrhoe und der Pseudomembranösen Kolitis identifiziert wurde. Seit den 90er Jahren wird C. difficile als der bedeutendste Krankenhauskeim der entwickelten Länder angesehen. Als Konsequenz des sich ständig weiter ausbreitenden Einsatzes von Breitbandantibiotika steigt die Inzidenz von C. difficile Infektionen vor allem bei stationär behandelten Patienten weiter stetig an.
  • Für die C. difficile-assozierten Erkrankungen sind die von C. difficile produzierten Exotoxine Toxin A (TcdA) und Toxin B (TcdB) verantwortlich. Es existieren verschiedene Stämme mit unterschiedlicher Virulenz und Toxinproduktion. Ungefähr ein Viertel aller Stämme produziert keine Toxine. Toxinbildende Stämme produzieren fast immer beide Toxine. TcdA ist ein Enterotoxin, das durch zytotoxische Schädigung der Enterozyten die Permeabilität der Darmschleimhaut erhöht und damit eine Diarrhoe auslöst. TcdB ist ein Zytotoxin, das den Elektrolyttransport stört und für Flüssigkeitsverlust und Funktionsstörungen des Darmes verantwortlich ist. Die Toxine TcdA und TcdB gehören zur Gruppe der sogenannten Large Clostridial Cytotoxins (LCTs) und bestehen jeweils aus einer Peptidkette mit drei funktionalen Domänen, nämlich der C-terminalen Domäne, die für das Anbinden des Toxins an die Wirtszellmembran verantwortlich ist, der hydrophoben mittleren Domäne, die für den Translokationsprozess durch die zellulären Membranen (mit) verantwortlich gemacht wird, und die N-terminale Domäne, die eine Glykosyltransferase-Funktion aufweist und die toxische Aktivität des Maleküls vermittelt.
  • Zwar ist der Aufnahmeprozess der Toxine in die Wirtszelle noch nicht vollständig aufgeklärt, es gilt jedoch als Tatsache, dass die Toxine nach dem Anbinden an einen Wirtszellrezeptor per Endozytose in die Wirtszelle gelangen, und dass zur Entfaltung ihrer Toxizität die N-terminale katalytische Domäne abgespalten und in das Cytosol der Wirtszelle befördert wird. Dort glykosiliert die katalytische Domäne spezifisch GTPasen der Rho-Subfamilie (Rho, Rac und Cdc42), welche ihrerseits an einer Fülle von Signaltransduktionskaskaden beteiligt sind, und blockiert auf diese Weise die betreffenden Signaltransduktionsprozesse, was letztendlich zur Disaggregation des Cytoskeletts und zum Zelltod führt.
  • Im Stand der Technik wurde bisher davon ausgegangen, dass die Abspaltung der katalytischen N-terminalen Domäne der Toxin-Peptidketten von TcdA und TcdB und auch anderer "Large Clostridial Toxines" LCT von einer zellulären Protease katalysiert wird (Rupnik et al., 2005 und Pfeiffer et al., 2003). Ein entsprechender Nachweis konnte jedoch nicht erbracht werden.
  • Im Verlauf der Untersuchungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, wurde nun aber überraschend gefunden, dass die Spaltung von TcdA und TcdB ein autokatalytischer Prozess ist, der von Inositolphosphat (IP) initiiert wird, und dass folglich die Toxine von Clostridium difficile neben ihrer katalytischen Funktion der Glykosyltransferase auch noch die Funktion einer Protease zur Selbstspaltung bzw. autokatalytischen Spaltung besitzen.
  • Diese Proteasefunktion wurde als Aspartat-Protease identifiziert. Als katalytisches Zentrum der Proteasefunktion wurde die Proteinregion identifiziert, die die Aminosäuresequenz von Aminosäureposition AS 1653 bis AS 1678 des TcdB gemäß Sequenz Nr P18177 (SwissProt/TrEMBL) umfasst. Das für Aspartat-Proteasen charakteristische Motiv DXG (Rao et al. 1998) liegt an der Aminosäureseposition 1665.
  • Als Inositolphosphat-Bindungsstelle wurde die Proteinregion identifiziert, die die Aminosäuresequenz von Aminosäureposition AS 1517 bis AS 2142 des TcdB-Proteins gemäß Sequenz Nr. P18 177 (SwissProt/TrEMBL) umfasst. Dieses Aminosäuresequenz stellt ein Inosin-5-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) Motiv dar, das sich aus zwei Bereichen, nämlich AS 1517 – AS 1593 und AS 1918 – AS 2142 zusammensetzt, die durch einen 325 Aminosäure langen Proteinabschnitt ohne Sequenzhomologie getrennt sind.
  • Zur Behandlung von Patienten mit C. difficile Infektionen wird zunächst das auslösende Antibiotikum abgesetzt, soweit dies möglich. Die weitere Behandlung erfolgt ausschließlich symptomatisch. Bei länger andauerndem oder schwerwiegendem Krankheitsverlauf, sowie wenn ein Absetzen des auslösenden Antibiotikums aus anderen Gründen nicht möglich ist, wird zur Therapie Metrondiazol oder Vancomycin verabreicht.
  • Die Nachteile der gängigen antimikrobiellen Therapie sind vielfältig. Entscheidend ist hierbei vor allem, daß sich eine Erkrankung, die infolge der Behandlung einer anderen Infektionssituation mit Antibiotika ausgelöst wurde, nicht effektiv mit einer antimikrobiellen Therapie heilen läßt. Hintergrund dafür ist die Tatsache, daß C. difficile im Darm gesunder Menschen nur verhältnismäßig selten vorkommt und sich gegenüber der normalen Darmflora nicht durchsetzen kann. Wird die normale Darmflora durch Antibiotika-Therapie zerstört, kann sich C. difficile durchsetzen und den Darm effektiv besiedeln. Die gegen C. difficile gerichtete Antibiotika-Therapie führt wiederum zur Zerstörung der Darmflora und verhindert damit ursächlich auch das Entstehen einer gesunden Darmflora. Dies erklärt auch die hohe Anzahl an Remissionen, die nach Beendigung der antimikrobiellen Therapie zu beobachten sind. Ein zusätzlicher Nachteil der gängigen Therapie ist das zunehmende Auftreten von multiresistenten C. difficile Stämmen in jüngster Zeit. Damit droht, daß auch die bislang einzige Therapie für C. difficile induzierte Erkrankungen nutzlos wird und die Anzahl an Todesfällen infolge von C. difficile Erkrankungen steigt. Hinzu kommt, daß die zur Behandlung einer C. difficile Infektion nötigen Antibiotika sehr teuer sind und normalerweise nur in begründeten Fällen als Reserveantibiotika eingesetzt werden.
  • Es besteht daher ein dringender Bedarf nach Medikamenten, die zur spezifischen Bekämpfung (Vermeidung, Beseitigung, Linderung) von C. difficile Infektionen geeignet sind, ohne dass das Risiko der Entwicklung von Resistenzen bei den Clostridien oder auch anderen Bakterien besteht, und ohne die natürliche Bakterienflora der betroffenen Patienten – insbesondere deren Darmflora – zu schädigen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines solchen Medikaments.
  • Eine Lösung der genannten Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Arzneimittels der eingangs genannten Art, dass sich dadurch auszeichnet, dass es als Wirkstoff wenigstens einen Inhibitor oder Aktivator der autokatalytischen Proteaseaktivität von LCTs (Large Clostridial Cytotoxins), insbesondere der autokatalytischen Proteaseaktivität von Clostridium difficile Toxin A (TcdA) und/oder Clostridium difficile Toxin B (TcdB) und/oder Clostridium sordellii letales Toxin (TcsL) und/oder Clostridium novyi α-Toxin (Tcnα) enthält.
  • Ist der Wirkstoff ein Inhibitor, so beruht seine antitoxische Wirkung darauf, dass er die Proteaseaktivität des intakten Toxins, insbesondere des TcdB oder TcdA oder TcsL oder Tcnα, hemmt und somit die Abspaltung des cytotoxisch wirksamen Fragments mit Glucosyltranferasefunktion (im Fall von TcdB und TcdA ist das das 63 kDa-Fragment) unterbindet.
  • Geeignete Inhibitoren sind chemische Substanzen, welche die Protease-Aktivität der Toxine inhibieren.
  • Der Begriff "chemische Substanz" bezeichnet in den vorstehenden und nachfolgenden Ausführungen sowohl anorganische als auch organische Verbindungen, Ionen und Peptide oder Proteine.
  • Bevorzugte Inhibitoren sind solche chemischen Substanzen, die die Protease-Aktivität irreversibel inhibieren. Ein Beispiel hierfür ist die Substanz EPNP (1,2-Epoxy-3-(p-Nitrophenoxy)-Propan) vorgeschlagen. Die Substanz reagiert irreversibel mit Aspartatresten im katalytischen Zentrum von Proteasen und inhibiert so die proteolytische Wirkung.
  • Weitere Protease-Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm mit bekannten Methoden (Computer-Modelling, High-Throughput-Screening) leicht identifizieren werden. Beispielsweise kann zur Durchführung eines „High-Troughput-Screenings" ein Peptid synthetisiert werden, dessen Aminosäure-Sequenz der Sequenz der Proteasespaltstelle der LCTs entspricht. Durch Kopplung dieses Peptids z. B. mit dem Farbstoff AMC (7-Amino, 4-Methyl-Cumarin) mit Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, kann eine Sonde generiert werden. Zur Duchführung des „High-Troughput-Screenings" wird anschließend die gelabelte Sonde mit dem Toxin und den Kandidaten-Substanzen zusammengebracht. Wird die Sonde gespalten, so kommt es zu Änderungen im Fluoreszenz-Spektrums. Diese Änderungen sind mit dem Fachmann geläufigen Methoden (Fluoreszenzdetektoren) leicht zu erfassen. Ansätze, in denen keine Änderung des Fluoreszenz-Spektrum zu beobachten sind, enthalten dann potentielle Protease-Inhibitoren.
  • Beispielhaft sei noch ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Aktivierung der autokatalytischen Protease-Aktivität der LCTs beeinflussen, beschrieben. Dazu können das Holotoxin oder auch geeignete Toxinfragmente verwendet werden, die z. B. mit einem Farbstoff gekoppelt sind, dessen Fluoreszenz im ungespaltenen Toxin oder Toxin-Fragment gequencht ist. Durch die autokatalytische Spaltung des Toxins bzw. der Toxinfragmente wird die quenchende Wirkung aufgehoben. Die Änderungen im Fluoreszenz-Spektrum können, wie beschrieben, leicht erfasst werden.
  • Besonders geeignete Inhibitoren sind chemische Substanzen, insbesondere Proteine und hierunter vor allem Antikörper, die die autokatalytische Proteaseaktivität der LCTs hemmen, indem sie mit dem aktive Zentrum der Protease interagieren.
  • Der Begriff "interagieren" bedeutet im vorliegenden Kontext jede Art von Wechselwirkung zwischen den LCTs und einer chemischen Substanz, insbesondere einem Protein und umfasst insbesondere kovalente Bindungen wie z. B. Disulfid-Bindungen und nichtkovalente Bindungen wie z. B. van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen sowie Wasserstoffbrücken-Bindungen.
  • Bevorzugt sind dabei Proteine und hierunter vor allem Antikörper, die mit der TcdB-Proteinregion von AS 1500 bis AS 1800, insbesondere von AS 1653 bis AS 1678 und vor allem mit dem DXG-Motiv an Position 1665 – jeweils gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) oder den hierzu äquivalenten bzw. homologen Proteinregionen von TcdA oder TcsL oder Tcnα interagieren. Bei diesen äquivalenten/homologen Proteinregionen handelt es sich im Fall von TcdA um den Aminosäuresequenzabschnitt von AS 1651 bis AS 1675 gemäß TcdA-Aminosäuresequenz Nr. P16154 (SwissProt/TrEMBL) mit dem DXG–Motiv an Aminosäureposition AS 1662, im Fall von TcsL um den Aminosäuresequenzabschnitt von AS 1654 bis AS 1679 gemäß TcsL-Aminosäuresequenz Nr. Q46342 (SwissProt/TrEMBL) mit dem DXG–Motiv an Aminosäureposition AS 1666, und im Fall von Tcnα um den Aminosäuresequenzabschnitt von AS 1641 bis AS 1665 gemäß Tcnα-Aminosäuresequenz Nr. Q46149 (SwissProt/TrEMBL).
  • Weitere geeignete Inhibitoren sind chemische Substanzen, insbesondere Proteine und hierunter vor allem Antikörper, die die autokatalytische Proteaseaktivität der LCTs hemmen, indem sie die Interaktion des Inositolphosphates mit dem Toxin inhibieren. Indem die IP-Bindung verhindert wird, unterbleibt die proteolytische Spaltung der Toxine.
  • Bevorzugt sind dabei Proteine und hierunter vor allem Antikörper, die mit der TcdB-Proteinregion von AS 1400 bis AS 2300, insbesondere von AS 1517 bis AS 2142 und vor allem von AS 1517 bis AS 1593 oder AS 1918 bis AS 2142 – jeweils gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) – oder mit den hierzu äquivalenten bzw. homologen Proteinregionen der Toxine TcdA oder TcsL oder Tcnα interagieren.
  • Ebensogut können auch Antikörper oder andere Proteine generiert werden, die nicht direkt mit der Inositolphosphat-Bindungsstelle, insbesondere den vorgenannten Proteinregionen interagieren, sondern gegen benachbarte Regionen gerichtet sind und die IP-Bindung sterisch behindern und damit die proteolytische Spaltung der Toxine verhindern. Außerdem können Antikörper oder andere Proteine generiert werden, die nicht direkt mit dem DXG-Motiv der Proteasefunktion der LCTs interagieren, sondern durch Bindung in benachbarten Proteinabschnitten die proteolytische Spaltung verhindern.
  • Geeignete Inhibitoren stellen außerdem Strukturanaloge von Inositolphosphat (IP) und insbesondere von Inositolhexaphosphat (IP6) dar, die anstelle von IP und insbesondere von IP6 die Reaktionsbindungsstellen von LCT, insbesondere TcdA und/oder TcdB, und/oder TcsL und/oder Tcnα besetzen können, jedoch nicht die Initiator-Funktion von IP bzw. IP6 besitzen. Diese Strukturanaloge sind somit Antagonisten zu den Agonisten IP (insbesondere IP6) und bewirken ein kompetitive Hemmung der Proteaseaktivität von LCT, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα. Geeignete Strukturanaloga sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten und dem Fachmann geläufigen Testverfahren (Beispiele hierfür sind vorstehend bereits beschriebenen) leicht identifizieren werden.
  • Geeignete Inhibitoren sind außerdem Hemmstoffe für/von Inositolphosphat (Synonyme: Inositolphosphat-Hemmstoff bzw. Inositolphosphat-Inhibtor), das heißt solche Hemmstoffe, die Inositolphosphat und insbesondere Inositolhexaphosphat derart binden oder modifizieren, dass deren Fähigkeit zur Initiierung der Proteaseaktivität von LCT, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα unterbunden ist. Ein Beispiel für solche Substanzen sind zweiwertige Ionen wie Ca2+, die mit IP6 unlösliche Komplexe eingehen. Ähnliche Substanzen sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten und dem Fachmann geläufigen Testverfahren (Beispiele hierfür sind vorstehend bereits beschriebenen) leicht identifizieren werden.
  • Weitere geeignete Inhibitoren sind chemische Substanzen, die die Bildung von Inositolphosphaten im Darmlumen der Patienten (Säugetiere, insbesondere Menschen) oder in den Körperzellen der Patienten (Säugetiere, insbesondere Menschen) unterdrücken oder bereits vorhandenes Inositolphasphat zerstören und so die proteolytische Spaltung der LCTs beim Eindringen in das Zytoplasma verhindern. Bevorzugte Beispiele für eine solche Substanzen sind Lithium, VPA (Valproic acid) oder CBZ (Carbamazepine).
  • Geeignete Aktivatoren sind chemische Substanzen, welche die Protease-Aktivität der Toxine aktivieren.
  • Die antitoxische Wirkung eines Aktivators beruht darauf, dass er die Proteaseaktivität des intakten Toxins, insbesondere des TcdB oder TcdA oder TcsL oder Tcnα initiert, noch bevor das Toxin derart an die Wirtszelle gebunden hat, dass das abgespaltenen Fragment in das Zellinnere (Cytosol) gelangen könnte. Der Aktivator bewirkt folglich eine Abspaltung des cytotoxisch wirksamen Fragments mit Glucosyltranferasefunktion (im Fall von TcdB und TcdA ist das das 63 kDa-Fragment) außerhalb der Wirtszelle. Das cytotoxisch wirksame Fragment kann dann nicht mehr in das Zellinnere gelangen und dort seine cytotoxische Wirkung entfalten.
  • Ein besonders geeigneter Aktivator ist isoliertes (im Unterschied zu cytosolischem) Inositolphosphat (IP), vorzugsweise Inositolhexaphosphat (IP6). Ein Medikament mit diesem Wirkstoff hat den Vorteil, dass im Patientendarm vorhandenes LCT, insbesondere TcdB und/oder TcdA und/oder TcsL und/oder Tcnα, durch das medikamentös zugeführte IP schon im Darm zur Spaltung veranlasst wird, das heißt noch bevor es an Darmzellen oder andere Körperzellen binden und toxisch wirken kann.
  • Ebenso gut eignet sich als Aktivator ein Stoff, der analog IP6 die autokatalytische Proteaseaktivität von LCT, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα, fördert.
  • Solche Stoffe sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten Methoden leicht identifziert werden. Dazu eignet sich zusätzlich auch modifizierte Varianten der vorstehend beschriebenen „High-Troughput-Assays". Dabei werden das Toxin und die potentiellen Aktivator-Substanzen zusammengegeben und im Zeitverlauf auf Veränderungen im Fluoreszenz-Spektrum untersucht. Ansätze, in denen starke Veränderungen in kurzer Zeit auftreten, enthalten geeignete Aktivatoren.
  • Die katalytischen Zentren der Proteasefunktion der LCTs können erfindungsgemäß auch als gezielt verabreichte Antigene (Impfungstoffe) zur Erzeugung einer Immunisierung gegen die Toxine verwendet werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch LCT (= Large Clostridial Cytotoxins), das dadurch gekennzeichnet ist, dass es zur Verabreichung als Vaccine geeignet ist, und dass es die Aminosäuresequenz des katalytischen Zentrums von TcdB und/oder TcdA und/oder TcsL und/oder Tcnα ganz oder Fragmente davon als antigenene Wirkstoff aufweist. Der oder die antigenen Wirkstoff(e) ist/sind vorzugsweise ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Proteinfragmenten:
    • – DXG-Motiv an Position 1665 der TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL),
    • – die Aminosäurepositionen AS 1653 bis AS 1678 der TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL),
    • – die Aminosäurepositionen AS 1500 bis AS 1800 der TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18 177 (SwissProt/TrEMBL),
    • – das DXG-Motiv an Position 1662 der TcdA-Aminosäuresequenz Nr. P16154 (SwissProt/TrEMBL),
    • – die Aminosäurepositionen AS 1651 bis AS 1675 der TcdA-Aminosäuresequenz Nr. P16154 (SwissProt/TrEMBL)
    • – das DXG-Motiv an Position 1666 der TcsL-Aminosäuresequenz Nr. Q46342 (SwissProt/TrEMBL)
    • – die Aminosäurepositionen AS 1654 bis AS 1679 der TcsL-Aminosäuresequenz Nr. Q46342 (SwissProt/TrEMBL),
    • – die Aminosäurepositionen AS 1641 bis AS 1665 der Tcnα-Aminosäuresequenz Nr. Q46149 (SwissProt/TrEMBL).
  • Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen
  • 1: Aufspaltung des TcdB10463 (270 kDa) Holotoxins in die Translokations/Ligandendomäne (207 kDa) und die N-terminale katalytische Domäne (63 kDa) in der SDS-PAGE, durchgeführt mit
    • a: einer Mischung aus Cy3-markiertem TcdB10463 und Schweine-Milzzell-Extrakt (Beispiel 1 A);
    • b: einer Mischung aus Cy3-markiertem TcdB10463 und von Protein befreitem Schweine-Milzzell-Extrakt (Beispiel 1 B);
    • c: einer Mischung aus Cy3-markiertem TcdB10463. und Inositolphosphat;
    • d: einer Mischung aus unmarkiertem TcdB10463. und Inositolphosphat;
    • e: einer Mischung aus unmarkiertem (mittels Affinitätschromatographie gereinigtem) TcdB10463 und Inositolphosphat;
    • a–e jeweils im Anschluß an eine Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde
  • 2: SDS-PAGE einer Mischung von TcdB10463 und/oder IP6, mit oder ohne Vorbehandlung des Toxins mit EPNP;
    • Spur 1: TcdB10463 nach Vorbehandlung mit EPNP und ohne IP6, keine Bande im 63 kDa Bereich nachweisbar;
    • Spur 2: TcdB10463 nach Vorbehandlung mit EPNP und nach Inkubation mit IP6, die typische 63 kD Bande ist nur schwach ausgeprägt;
    • Spur 3: TcdB10463 ohne Vorbehandlung mit EPNP und nach Inkubation mit IP6, es ist eine deutlich ausgeprägte Bande im Molekulargewichtsbereich von 63 kDa erkennbar;
    • Spur 4: TcdB10463 ohne Vorbehandlung mit EPNP und ohne IP6, keine Bande im 63 kDa Bereich nachweisbar.
  • 3: ESI-LCMSMS-Analyse nach tryptischem Verdau des nativen (a) und des EPNP-modifizierten (b) TcdB-Proteins. MS-Survey Scans (großes Bild) und Fragmentation Spektren (Einschub).
  • Alle in den folgenden Beispielen genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt und z. B. in Ausubel et al. (2003) beschrieben.
  • Beispiel 1: Nachweis der autokatalytischen Proteaseaktivität von TcdB
  • Clostridium difficile Toxin B (270 kDa) des Referenzstammes VPI10463, im folgenden kurz TcdB10463 benannt, wurde zunächst mit Cy3 fluoreszenzmarkiert.
  • Hierfür wurden 200–400 μg TcdB10463 (tgcBIOMICS, Mainz, Germany) mit dem Farbstoff Cy3 nach Angaben des Herstellers (Amersham Biosciences) markiert, indem das Toxin zusammen mit dem in Dimethylformamid gelösten Farbstoff für 1 Stunde bei 4°C inkubiert wurde. Ungebundener Farbstoff wurde anschließend mittels Größenausschlußchromatographie (Size Exclusion Chromatographie = SEC) entfernt, wobei 10 mM Tris-HCl pH 8.5 als Laufpuffer diente. Das molare Verhältnis zwischen Farbstoff und Cy3-markiertem TcdB10463 betrug 0.8–1.6. Markiertes TcdB10463 wurde aliquotiert und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
    • (A) Für die Durchführung des im Stand der Technik bekannten "In-vitro-cleavage-assay" (siehe hierzu insbesondere Rupnik et al (2005); auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen) wurde ein auf Raumtemperatur aufgetautes Aliquot Cy3-markiertes TcdB10463 für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Schweine-Milzzell-Extrakt inkubiert.
  • Dieser Schweine-Milzzell-Extrakt wurde wie folgt hergestellt: Frisch gewonnene Schweinemilz wurde in Phosphat Puffer (PBS) aufgenommen und zu einer Einzelzellsuspension zerkleinert. Durch Zugabe von Niedrigsalzpuffer (Low Salt Buffer), – nämlich 150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.6 –, wurden vorhandene Erythrozyten lysiert und somit entfernt. Anschließend wurden die Milzzellen zweimal mit 10 mM Tris-HCl pH 8.5 gewaschen und sofort bei –80°C tiefgefroren. Für den gewünschten Zellextrakt wurde bei Bedarf ein Aliquot dieser tiefgefrorenen Milzzellen in einem Aliquot 10 mM Tris-HCl pH 8.5 aufgetaut und suspensiert und diese Suspension anschließend einer Ultraschallbehandlung unterworfen. Das erhaltene Lysat wurde 1 Stunde bei 200 000 × g und 4°C zentrifugiert und der Überstand für die anstehenden Experimente verwendet.
  • Am Ende der Inkubationsphase wurde die Mischung aus Cy3-markiertem TcdB10463 und Schweine-Milzzell-Extrakt einer SDS-PAGE unterworfen, um die während der Inkubation entstandenen TcdB-Fragmente zu separieren und nachzuweisen. Das Ergebnis dieser SDS-PAGE ist in 1a dargestellt: Es wurden erwartungsgemäß die beiden bekannten und charakteristischen 63 kDa- und 207 kDa-Fragmente des Clostridium difficile Toxins B – hier des TcdB10463 – erhalten.
  • Als Negativ-Kontrollen dienten Aliquots von TcdB10463 ohne Beimischung von Milzzell-Extrakt (siehe 1 "–").
    • (B) In einem Parallelversuch wurde der in (A) beschriebene Milzell-Extrakt vor der Inkubation mit dem Cy3-markierten TcdB10463 von Protein gereinigt. Zu diesem Zweck wurde ein Aliquot des gemäß (A) hergestellten Schweine-Milzzell-Extrakts im Anschluß an die Untraschallbehandlung sechs Phenol-Chloroform-Extraktionen unterworfen, die wie folgt durchgeführt wurden: Schweine-Milzzell-Extrakt wurde mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25/24/1) im Volumenverhältnis 1:1 gemischt. Diese Mischung wurde 10 Minuten bei 1.700 × g, und 4°C zentrifugiert. Die wässrige oberste Schicht wurde in eine frisches Zentrifugengefäß dekantiert und Zentrifugation und Dekantierung noch fünf mal wiederholt. Um auch letzte Reste von Phenol zu entfernen, wurde abschließend eine Chloroform-Exktraktion durchgeführt.
  • Aliquots der auf diese Weise gewonnenen wässrigen und proteinfreien Fraktion des Milzzell-Extraktes wurden im Volumenverhältnis 1:30 (30), 1:100 (100) oder 1:300 (300) mit 10 mM Tris-HCL pH8,5 verdünnt und wie unter (A) beschrieben mit auf Raumtemperatur aufgetauten Aliquots von Cy3-markiertem TcdB10463 gemischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubationsphase wurden diese Mischungen einer SDS-PAGE unterworfen, um die während der Inkubation entstandenen TcdB-Fragmente zu separieren und nachzuweisen. Das Ergebnis dieser SDS-PAGE wurde mit Hilfe des Gel Doc EQ System Image Readers (BIO-RAD München, Deutschland) sichtbar gemacht und ist in 1b dargestellt: Es wurden bei allen Testansätzen die beiden charakteristischen 63 kDa- und 207 kDa-Fragmente von TcdB10463 erhalten. Das zeigt, dass die wässrige und proteinfreie Fraktion des Milzzell-Extraktes nach wie vor die Eigenschaft besitzt bzw. besaß, TcdB10463 in seine beiden charakteristischen Teilfragmente zu spalten.
  • In einem weiteren Parallelversuch wurde der in (A) beschriebene Milzzell-Extrakte mit Hitze (96°C, 30 Minuten) behandelt, bevor er wie in (A) beschrieben mit Cy3-markiertem TcdB10463 inkubiert und der SDS-PAGE unterworfen wurde. Das Ergebnis dieser SDS-PAGE ist ebenfalls in 1b dargestellt: Es wurden wiederum die beiden charakteristischen 63 kDa- und 207 kDa-Fragmente von TcdB10463 erhalten. Das Ergebnis zeigt, dass der hitzeinduzierte Milzzell-Extrakt weiterhin die Eigenschaft besitzt, TcdB10463 in seine charakteristischen Teilfragmente zu spalten.
    • (C) In einer weiteren Versuchsreihe wurde Cy3-markiertes TcdB10463 und unmarkiertes TcdB10463 allein (d. h. ohne Beimischung von Milzzell-Extrakt) mit verschiedenen Inositolphosphaten für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die jeweiligen Mischungen anschließend einer SDS-PAGE unterworfen. Das Ergebnis dieser Untersuchungen ist in Tabelle 1 und den 1c–e dargestellt. Es lieferte die überraschenden Kernaussagen, dass die proteolytische Spaltung von TcdB10463 allein durch eine chemische Substanz wie IP initiierbar ist, und dass es sich bei dieser proteolytischen Spaltung folglich um einen autokatalytischen Prozess des Toxin-Proteins handelt.
  • Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass eine Reihe von Inositolphosphaten die autokatalytische Spaltung von TcdB10463 initieren können. Inositolhexaphosphat (IP6) ruft unter den getesteten Inositolphosphaten die stärkste Spaltungsaktivität hervor, und das heißt, IP6 besitzt die höchste Initiatoraktivität (siehe auch 1c–e).
  • Strukturanaloga oder andere den Inositolphosphaten verwandte Substanzen, die eine Initiatoraktivität besitzen, sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten Methoden (z. B. Computer-Modelling) leicht ermittelt werden. Beispielsweise können auch die vorstehend beschriebenen "High-Troughput-Assays" verwendet werden.
  • Die Austestung unterschiedlicher Konzentrationen an IP6 im Inkubationsversuch mit TcdB10463 zeigt (siehe 1c und 1d), daß zur Spaltung von fluoreszenzmarkiertem Toxin B eine IP-Konzentrationen von 10 μM (1c) ausreichend ist, während zur Spaltung von unmarkiertem (und erst in der SDS-PAGE durch Zinkfärbung (Zinc Stain and Destain Kit, Biorad, Hercules, USA) sichtbar gemachtem) Toxin B noch niedrigere Konzentrationen bis zu 1 μM (1d) genügen.
  • Analoge Experimente wurden auch mit den LCTs TcdA10463, TcsL von C. sordellii und Tcnα durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß Inositolphosphate aktivierend auf die autokatalytische Spaltung alter untersuchter Toxine der LCT-Familie wirken.
    • (D) Um auszuschließen, dass das in den Versuchen eingesetzte, aus Kulturüberstand von C. difficile aufgereinigte TcdB10463 mit Proteasen kontaminiert war, wurde ein Kontrollversuch mit speziell gereinigtem TcdB10463 durchgeführt. Diese Reinigung des TcdB10463 erfolgte mittels Affinitätschromatographie unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers 2CV (DSM ACC 2321) wie folgt: 7 mg des TcdB spezifischen monoklonalen Antikörper 2CV (ProteinG-gereinigter Überstand einer serumfreien Hybridoma-Kultur) wurde an eine HiTrap NHS Sepharose Säule (kommerziell erhältlich bei GE Healthcare, Freiburg, FRG) gekoppelt. Kopplung und Elution wurden gemäß Herstellerangaben durchgeführt. Die fertige Säule wurde mit ca. 4 mg TcdB10463 beschickt und ungebundene Proteine durch dreimaliges Waschen mit 50 mM Tris/HCl, pH 7.0; 125 mM NaCl entfernt. Die Elution erfolgte in einem Schritt mit 0.1 M Triethanolamin-HCl pH11. Das Toxin eluierte in drei 4 ml Fraktionen mit Konzentrationen zwischen 450–185 μg/ml Das eluierte Toxin wurde sofort mit 1M Tris-HCl pH 7.5 im Volumenverhältnis 1/10 neutralisiert, was dadurch gewährleistet war, daß diese Neutralisierungslösung bereits vor dem Start der Elution in den Auffangröhrchen für die Fraktionen vorgelegt worden war. Anschließend wurde die Abwesenheit von kontaminierenden Proteinen durch SDS-PAGE und nachfolgende Zinkfärbung nachgewiesen (siehe 1e "–").
  • Der Kontrollversuch bestand aus der Inkubation von derart gereinigtem unmarkiertem TcdB10463 mit IP6 und nachfolgender SDS-PAGE und Nachweis des Toxins oder der Toxinfragmente mittels Zinkfärbung. Das Ergebnis dieses Versuchs ist in 1e dargestellt und zeigt die vollständige Aufspaltung des Holotoxins in die beiden bekannten Fragmente 63 kDa und 207 kDa.
  • Beispiel 2: Inaktivierung von TcdB-10463 durch Inkubation mit einem Protease-Inhibitor
  • TcdB10463 wurde wie in Beispiel 1 (D) beschrieben mittels Affinitätschromatographie unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers 2CV gereinigt und anschließend entweder (i) mit dem Protease-Inhibitor EPNP (10 mM 1,2-Epoxy-3-(p-Nitrophenoxy)-Propan) oder (ii) – als Kontrolle – mit Puffer (50 mM HEPES, 1M NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) 60 Minuten bei Raumtemperatur vorbehandelt.
  • Anschließend wurde ein in-vitro-Cleavage-Assay analog Beispiel 1 (A) durchgeführt. Die Testansätze umfaßten jeweils ein Volumen von 10 μl, und enthielten jeweils 50–100 ng unmarkiertes TcdB10463, 100 μM IP6 und 10 mM Tris-HCl pH 8.5. Diese Testansätze wurden im Anschluß an die Inkubation (1 h bei Raumtemperatur) einer SDS-PAGE (10%) unterworfen und die Toxine und Toxinfragmente anschließend mittels Zinkfärbung sichtbar gemacht.
  • 2 zeigt das Ergebnis dieses Experimentes: Die Inkubation von TcdB10463 allein mit IP6 (Spur 3) zeigt eine deutlich ausgeprägte Bande im Molekulargewichtsbereich von 63 kDa. Wenn das Toxin vorher mit EPNP vorbehandelt wird (Spur 2), ist die typische 63 kD Bande nur schwach ausgeprägt. Dieser Befund zeigt, dass durch die Zugabe von EPNP die proteolytische Aktivität (Protease-Aktivität) des TcdB10463 nahezu vollständig gehemmt ist.
  • Das mit EPNP vorbehandelte Toxin wurde außerdem im CHO-Test nach Moos et al. (2000) auf seine Restaktivität (zytotoxische Wirkung) hin untersucht.
  • Der CHO-Test wurde wie folgt durchgeführt: In einer 96well-Mikrotiterplatte wurden CHO-Zellen (= Chinese-Hamster-Ovarialcells) ausgesät (5000 Zellen/well) und 16 Stunden unter Standardbedingungen (5% CO2, 37°C, DMEM F12 ergänzt mit 2 mM L-Glutamine, 5% FCS) inkubiert. Anschließend wurden die Toxine nach stufenweiser Verdünnung in Wachstumsmedium zu den Zellen gegeben. Verdünnungstufen zwischen 100 und 10–8 wurden ausgetestet. Die Zellen wurden 3 Stunden unter Standardbedingungen inkubiert. Anschließend wurde der Anteil an abgerundeten Zellen mikroskopisch bestimmt, indem mehrere repräsentative Ausschnitte des Wells photographiert und die ausgestreckten, sowie die abgerundeten Zellen ausgezählt wurden. (Siehe auch Moos et al., Meth Enzymol. 2000, 325: 114–125. Auf den Inhalt dieser Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen.)
  • Die Ergebnisse dieses CHO-Tests zeigen, daß das mit EPNP vorbehandelte TcdB10463 eine wesentlich schwächere zytotoxische Aktivität aufweist als das unbehandelte TcdB10463 (vgl. Tabelle 2). Da die inhibierende Wirkung von EPNP bekanntermaßen darauf beruht, daß EPNP mit katalytischen Aspartatresten in kovalente Wechselwirkungen tritt und dadurch eine irreversible Inaktivierung der Protease herbeiführt (Salto et al. 1994), zeigen die Ergebnisse des vorliegenden Versuchs, dass die Hemmung der TcdB10463-Aktivität auf der Hemmung einer Protease-Aktivität dieses Toxinmoleküls beruht.
  • Das hier beschriebene Experiment mit EPNP belegt, daß die toxische Wirkung von TcdB-0463 und anderer LCTs durch Vorbehandlung der Toxine mit einem geeigneten Protease-Inhibitor signifikant reduziert wird.
  • EPNP stellt eine Modellstubstanz für einen kovalenten Inhibitor der LCTs dar. Weitere vergleichbar kovalent wirkende oder kompetitiv hemmende Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt oder können von diesem mit bekannten Methoden, beispielsweise mit den bereits beschriebenen "High-Troughput-Assays" ermittelt werden.
  • Beispiel 3: Inaktivierung der zytotoxischen Wirkung von TcdB10463 durch extrazelluläre Aktivierung der Protease-Aktivität mit IP6
  • TcdB10463 wurde wie in Beispiel 1 (C) beschrieben mit 100 μM IP6 inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde das durch die Protease-Aktivität abgespaltene kleinere, 63 kDa Fragment des Toxinproteins abgetrennt, indem der Ansatz über Microcon-Röhrchen (Millipore, Ausschlußgröße 100 kD) aufgereinigt wurde. Dieses 63kDa Fragment von TcdB10463 wurde anschließend in dem in Beispiel 2 beschriebenen CHO-Test nach Moos et al. (2000) auf Abrundung der Zellen untersucht. Dabei wurde das Protein unverdünnt und in Verdünnungstufen zu den Zellen gegeben.
  • Es zeigte sich in diesem Versuch, daß das 63 kDa-Fragment, welches die Glucosyltransferasefunktion von TcdB10463 aufweist, unter den gegebenen Bedingungen alleine nicht in der Lage ist/war, eine zytotoxische Wirkung hervorzurufen. Weder in verdünntem noch in unverdünntem Zustand konnte eine Abrundung der Zellen (infolge einer Glukosilierung spezifischer GTPasen der Rho-Subfamilie, daraus resultierender Blockierung von Signaltransduktionsprozessen und daraus resultierender Disaggregation des Cytoskeletts) beobachtet werden. Dieser Befund, dass das mittels autokatalyse generierte Toxinfragment extrazellulär inaktiv ist, bestätigt die Ergebnisse von Pfeifer et al. (2003) und Rupnik et al (2005), die zeigen, dass die abgespaltene katalytische Domäne von TcdB10463 nicht in eukaryonte Zellen aufgenommen wird und daher im Zellmedium inaktiv ist. (Während in diesen Arbeiten jedoch eine autokatalytische Aktivität der LCTs explizit ausgeschlossen wird [Pfeiffer et al., 2003] bzw. über eine zelluläre Protease zur Aktivierung der LCTs spekuliert wird [Rupnik et al., 2005], zeigen die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gewonnenen Versuchsergebnisse erstmals, dass das N-tenninale Toxinfragment autokatalytisch abgespalten wird.) Die zytotoxische Wirkung von TcdB10463 und anderen LCTs kann folglich dadurch gehemmt werden, dass die proteolytische Spaltung der Toxine bereits vor Eindringen der Toxine in die Zellen induziert wird.
  • Beispiel 4: Nachweis des aktiven Zentrums der Protease von TcdB
  • EPNP-inaktiviertes (vergl. Beispiel 2) und unbehandeltes TcdB10463 wurden mittels SDS-Gel aufgetrennt und mit Zinkfärbung dargestellt. Anschließend wurden die den Proteinen entsprechenden Banden ausgeschnitten und in kleine Stücke zerteilt. Diese wurde entfärbt und getrocknet, anschließend in 2 mM DTT reduziert und mit 20 mM Iodacetamid alkyliert. Nach dem Waschen und erneuten Trocknen der Gelfragmente wurden diese mit Trypsin über Nacht bei 37°C verdaut. Die resultierenden Peptide wurden anschließend über HPLC (NanoAcquity ultraperformance Liquid Chromatography, Waters, Milford, USA) aufgetrennt. Dazu wurden 2 μl der Proben auf eine reverse-phase Säule (NanoEase BEH C18 (75 μm × 10 cm) von Waters, Milford, USA) in 2% mobile Phase B-Puffer (0,1% Ameisensäure in Acetonitril) aufgetragen. Mobile Phase A-Puffer enthielt 0,1% Ameisensäure in H2O. Anschließend wurden die Fragmente durch einen Gradienten von 3–40% mobile Phase B-Puffer (90 min bei 300 nl/min) von der Säule eluiert.
  • Die eluierten Fragmente wurden anschließend massenspektrometrisch untersucht. Dazu wurde ein Q-Tof Premier Massenspektrometer der Firma Waters verwendet. Das Gerät wurde mit einer [Glu-1]-Fibrinogenpeptid-Lösung (500 fmol/μl bei 300 nl/min) über den Referenz-Sprayer der NanoLockSpray-Quelle (Waters) kalibiert. Zur Analyse der Ergebnisse wurde die MassLnyx4.1 Software (Waters) verwendet.
  • Die Analyse der Ergebnisse zeigt, dass sich das unbehandelte TcdB von dem EPNP-behandelten Toxin nur in einem tryptischen Fragment unterscheidet (3). Dieses Fragment umfasst die Aminosäuren AS 1653 bis 1678 des TcdB-Proteins gemäß TcdB- Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) mit dem für Aspartat Proteasen charakteristischen DXG-Motiv an Position 1665.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenz AS 1653 bis AS 1678 des katalytischen Zentrums von TcdB mit den entsprechenden katalytischen Zentren und Proteinregionen der Toxine TcdA, TcsL und Tcnα zeigt, dass die Region hoch konserviert ist (siehe Tab. 3).
  • Der Fachmann kann daher mit bekannten Methoden Antikörper oder andere Proteine generieren, die spezifisch mit dem aktiven Zentrum der Protease-Domäne der Toxine interagieren und somit beispielsweise die autokatalytische Spaltung der LCTs verhindern. Ebensogut können auch Antikörper oder Proteine generiert werden, die nicht direkt das aktive Zentrum blockieren, sondern gegen benachbarte Regionen gerichtet sind und somit die autoproteolytische Spaltung der Toxin sterisch behindern.
  • Beispiel 5: Inhibition der TcdB-Wirkung durch Antikörper infolge Immunisierung mit inaktiviertem TcdB
  • Um einen Schutz gegen die zytotoxischen Effekte des TcdB zu induzieren, wurden folgende TcdB-Präparationen hergestellt und zur Immunisierung in Kaninchen eingesetzt:
    • Präparation A: TcdB, inaktiviert mit Formalin
    • Präparation B: TcdB, inaktiviert mit EPNP (vergl. Beispiel 2)
    • Präparation C: TcdB-Fragment AS1601-1716 (DSG-Motiv)
    • Präparation D: TcdB-Fragment AS1508-1601 (Teil des Inosin-bindenden Motiv)
    • Präparation E: TcdB-Fragmente AS1508-2157 (DSG-Motiv und gesamtes Inosin-bindendes Motiv)
  • Die TcdB-Fragmente wurden mit dem Fachmann bekannten Methoden im Plasmid pET-19 (Novagen) exprimiert und über den angehängten His-Tag gereinigt. Anschließend wurde der His-Tag mittels Enterokinase-Verdau abgespalten. Die Reinheit des Proteins wurde im SDS-Gel überprüft (Daten nicht gezeigt)
  • Zur Immunisierung wurden Kaninchen mit dem Antigen zunächst grundimmunisiert und nachfolgend mehreren Boosterimmunisierungen unterworfen. Aus dem Blut der Kaninchen wurden schließlich polyklonale Antiseren erhalten.
  • Um die neutralisierende Wirkung der polyklonalen Antiseren zu überprüfen, wurde zunächst TcdB mit polyklonalem Antiserum vorbehandelt (Verdünnungsstufe 1:100) und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die neutralisierende Wirkung der Antiseren wie in Beispiel 2 beschrieben anhand des CHO-Tests überprüft. Das Maß für die neutralisierende Wirkung der Seren war, wie lange die Zellen vor der zytotoxischen Wirkung des TcdB geschützt waren.
  • Die mit Präparation A immunisierten Kaninchen wiesen nur einen geringen Antikörper-Titer auf (vergl. Tab. 4), zudem wirkte das Serum dieser Kaninchen nicht neutralisierend. Dieser Befund entspricht den dem Fachmann bekannten Ergebnissen von Immunisierungsversuchen mit formalisierten LCTs.
  • Die Tiere, die mit Präparation B immunisiert wurden, entwickelten zwar einen deutlichen Titer (ausverdünnbar bis 1:1500), allerdings wies auch dieses Antiserum keine neutralisierende Wirkung im CHO-Test auf (Tab. 4).
  • Die Kaninchen, die mit den Präparationen C bis E immunisiert worden waren, wiesen ebenfalls einen Antikörper-Titer auf, und zudem zeigten ihre polyklonalen Seren im CHO-Test eine deutlich neutralisierende Wirkung (Tab. 4). Das polyklonale Serum, das durch Immuniserung mit Präparation E generiert wurde, wies dabei die besten neutralisierenden Eigenschaften auf.
  • Die Seren, die durch seperate Immunisierung mit den Präparationen C und D hergestellt wurden, zeigten demgegenüber eine geringere neutralisierende Wirkungen.
  • Der Erfolg der Immunisierung mit Fragment D, welches einen Teil der Inositol-bindende Region umfasst, beweist, dass es sich bei diesem Abschnitt der LCTs um eine für die Aktivierung der Toxine wichtige Region handelt. Die Bindung des IP6 in diesem Toxin- Abschnitt führt zur Aktivierung der autokatalytischen Protease-Aktivität und somit auch zur Aktivierung der LCTs
  • Die neutralisierende Wirkung der Region um das DSG-Motif beweist, dass Antikörper, die gegen das aktive Zentrum der Protease gerichtet sind, die proteolytische Aktivität inhibieren können. Mit solchen Antikörpern kann somit auch in vivo ein Schutz vor den toxischen Effekten der LCTs erreicht werden.
  • Bei der Immunisierung mit Präparation E wurden nur die beiden Fragmente der erfolgreichen Präparationen C und D zusammen eingesetzt worden. Der Erfolg der Immunisierung mit beiden TcdB-Fragmenten beruht darauf, dass in den Tieren Antikörper induziert werden, die sowohl gegen das aktive Zentrum der Protease gerichtet sind, als auch solche Antikörper, die an die Inositol-Phosphat-bindende Region binden. Die Wirkung des Antiserums beruht also darauf, dass erstmals spezifische Antikörper induziert werden konnten, die gezielt die Aktivierung des Toxins verhindern.
  • Für die natürliche Aufnahme der LCTs in ihre Zielzellen ist die autokatalytische Spaltung der Toxine wichtig, da nur so das N-terminale, die eigentliche toxische Aktivität vermittelnde Fragment in den Zielzellen freigesetzt wird. Die Bindung spezifischer Antikörper in der Umgebung des DSG-Motifs der Aspartat-Protease und der Inositol-Phosphat-Bindungsstelle verhindert die autokatalytische Spaltung der Toxine. In Patienten kann somit durch Einsatz von Toxin-Fragmenten, die für die autokatalytische Spaltung der LCTs notwendig sind, eine wirksame Immunisierung gegen LCTs erreicht werden.
  • Literatur:
    • Ausubel, F. M. et al.: "Current Protocols in Molecular Biology" (2003), John Wiley and Sons. Inc.
    • Rupnik et al. (2005) "Characterization of the cleavage site and function of resulting cleavage fragments after limited proteolysis of Clostridium difficile toxin B(TcdB) by host cells." Mikrobiol 151, 199–208.
    • Moos et al. (2000) "Purification and evaluation of large clostridial cytotoxins that inhibit small GTPases of Rho and Ras subfamilies" Meth Enzymol. 325: 114–125.
    • Pfeifer et al. (2003) "Cellular Uptake of Clostridium difficile toxins B" J. Biol. Chem. 278: 44535–41.
    • Rao et al. (1998) "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases" Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 597–635.
    • Salto et al. (1994) "In vitro characterization of nonpeptide irreversible inhibitors of HIV proteases", J. Biol. Chem. 269: 10691–8.
    • Tang (1971) "Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate-like Epoxides", J. Biol. Chem. 246: 4510–17.
  • Tabelle 1: Autokatalytische Spaltung von TcdB10463 unter Zugabe definierter Inositolphosphate
    IP Konzentration
    1 mM 100 μM 10 μM
    1,5 - - -
    1,4 - - -
    4,5 - - -
    1,4,5 - - -
    2,3,5 - - -
    1,3,5 - - -
    1,3,5,6 - - -
    1,2,3,4,6 - - -
    1,3,4 + - -
    1,3,4,5 + - -
    3,4,6 + - -
    1,2,3,4 + - -
    1,2,3,4,5 + - -
    1,2,3,5,6 + + -
    1,3,4,5,6 + + -
    3,4,5,6 + + -
    2,3,4,5,6 + + -
    1,4,5,6 + + -
    1,2,3,4,5,6 + + +
    Tabelle 2: Zellabrundung (in %) von CHO-Zellen nach Inkubation mit TcdB10463 – mit oder ohne EPNP-Vorbehandlung
    Verdünnung Abgerundete Zellen [%] nach 3 h
    TcdB-10463 TcdB-10463 + EPNP
    10–3 100% 100%
    10–4 100% 100%
    10–5 100% 50%
    10–6 100% 10%
    10–7 10% < 5%
    10–8 < 5% < 5%
    Tabelle 3: Vergleich der Aminosäuresequenz AS 1653 bis AS 1678 des katalytischen Zentrums der Proteasefunktion von TcdB mit den entsprechenden katalytischen Zentren und Proteinregionen der Toxine TcdA, TcsL und Tcnα.
    Figure 00250001
    Tabelle 4: Beginn der Zellabrundung (in h) von CHO-Zellen nach Inkubation mit TcdB, das mit polyklonalem Antiserum vorbehandelt worden war.
    Präparation Antikörper-Titer Beginn der Zellabrundung nach
    A 1:100 1,5 h
    B 1:1500 3 h
    C 1:750 12–15 h
    D 1:500 9–12 h
    E 1:1000 > 24 h
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Rupnik et al., 2005 und Pfeiffer et al., 2003 [0005]
    • - Rao et al. 1998 [0007]
    • - Ausubel et al. (2003) [0039]
    • - "In-vitro-cleavage-assay" (siehe hierzu insbesondere Rupnik et al (2005) [0041]
    • - CHO-Test nach Moos et al. (2000) auf seine Restaktivität (zytotoxische Wirkung) [0055]
    • - Siehe auch Moos et al., Meth Enzymol. 2000, 325: 114–125. Auf den Inhalt dieser Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen. [0056]
    • - Salto et al. 1994 [0057]
    • - CHO-Test nach Moos et al. (2000) [0060]
    • - Pfeifer et al. (2003) und Rupnik et al (2005) [0061]
    • - Pfeiffer et al., 2003 [0061]
    • - Rupnik et al., 2005 [0061]
    • - Ausubel, F. M. et al.: "Current Protocols in Molecular Biology" (2003), John Wiley and Sons. Inc. [0078]
    • - Rupnik et al. (2005) "Characterization of the cleavage site and function of resulting cleavage fragments after limited proteolysis of Clostridium difficile toxin B(TcdB) by host cells." Mikrobiol 151, 199–208. [0078]
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    • - Pfeifer et al. (2003) "Cellular Uptake of Clostridium difficile toxins B" J. Biol. Chem. 278: 44535–41. [0078]
    • - Rao et al. (1998) "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases" Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 597–635. [0078]
    • - Salto et al. (1994) "In vitro characterization of nonpeptide irreversible inhibitors of HIV proteases", J. Biol. Chem. 269: 10691–8. [0078]
    • - Tang (1971) "Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate-like Epoxides", J. Biol. Chem. 246: 4510–17. [0078]

Claims (20)

  1. Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch LCT (= Large Clostridial Cytotoxins), dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff wenigstens einen Inhibitor oder Aktivator der Proteaseaktivität von LCT (Large Clostridial Cytotoxins) enthält.
  2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ein Inhibitor oder Aktivator der Proteaseaktivität von Clostridium difficile Toxin A (TcdA) und/oder Clostrdium difficile Toxin B (TcdB) und/oder Clostridium sordellii letales Toxin (TcsL) und/oder Clostridium novyi α-Toxin (Tcnα) ist.
  3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor 1,2-Epoxy-3-(p-Nitrophenoxy)-Propan (EPNP) ist.
  4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivator ein Inositolphosphat, vorzugsweise Inositolhexaphosphat (IP6) ist.
  5. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Hemmstoff ein kompetitv hemmendes Strukturanalogon von Inositolphosphat, vorzugsweise Inositolhexaphosphat (IP6) ist.
  6. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivator ein Stoff ist, der analog IP6 die (autokatalytische) Proteaseaktivität von LCTs, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα fördert.
  7. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine chemische Substanz ist, die zur Reduzierung der Inositolphosphat-Konzentration im Darmlumen von Säugetieren, insbesondere Menschen, geeignet ist.
  8. Arzneinttel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine chemische Substanz ist, die zur Reduzierung der Inositolphosphat-Konzentration in Säugetierzellen, insbesondere humanen Zellen, geeignet ist.
  9. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit dem aktive Zentrum der Protease in der TcdB-Proteinregion von AS 1500 bis AS 1800 gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  10. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit der TcdB-Proteinregion von AS 1653 bis AS 1678 gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18 177 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  11. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit dem DXG-Motiv an der Aminosäureposition AS 1665 des TcdB-Proteins gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  12. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit der TcdA-Proteinregion von AS 1651 bis AS 1675 gemäß TcdA-Aminosäuresequenz Nr. P16154 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  13. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit dem DXG–Motiv an Aminosäureposition AS 1662 des TcdA-Proteins gemäß TcdA-Aminosäuresequenz Nr. P16154 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  14. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit der TcsL-Proteinregion von AS 1654 bis AS 1679 gemäß TcsL-Aminosäuresequenz Nr Q46342 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  15. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit dem DXG–Motiv an Aminosäureposition AS 1666 des TcsL-Proteins gemäß TcsL-Aminosäuresequenz Nr. Q46342 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  16. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit der Tcnα-Proteinregion von AS 1641 bis AS 1665 gemäß Tcnα-Aminosäuresequenz Nr Q46149 (SwissProt/TrEMBL) interagiert.
  17. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit der TcdB-Proteinregion von AS 1400 bis AS 2300 gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) oder mit der hierzu äquivalenten bzw. homologen Proteinregionen von TcdA oder TcsL oder Tcnα interagiert.
  18. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit der TcdB-Proteinregion von AS 1517 bis AS 2142 gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18 177 (SwissProt/TrEMBL) oder mit der hierzu äquivalenten bzw. homologen Proteinregionen von TcdA oder TcsL oder Tcnα interagiert.
  19. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine chemische Substanz, insbesondere ein Protein, weiter insbesondere ein Antikörper ist, die/das/der mit der TcdB-Proteinregion von AS 1517 bis AS 1593 oder von AS 1918 bis AS 2142 gemäß TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) oder mit einer hierzu äquivalenten bzw. homologen Proteinregionen von TcdA oder TcsL oder Tcnα interagiert.
  20. Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch LCT (= Large Clostridial Cytotoxins), dadurch gekennzeichnet, dass es (1.) zur Verabreichung als Vaccine geeignet ist und (2.) als antigenen Wirkstoff – (a) dasjenige TcdB-Proteinfragment der TcdB-Aminosäuresequenz Nr. P18177 (SwissProt/TrEMBL) enthält, das wenigstens das DXG-Motiv an Position 1665, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von Aminosäurepositionen AS 1653 bis AS 1678 und weiter vorzugsweise die Aminosäuresequenz von Aminosäurepositionen AS 1500 bis AS 1800 umfasst, – und/oder (b) dasjenige TcdA-Proteinfragment der TcdA-Aminosäuresequenz Nr. P16154 (SwissProt/TrEMBL) enthält, das wenigstens das DXG-Motiv an Position 1662, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von Aminosäurepositionen AS 1651 bis AS 1675 umfasst, – und/oder (c) dasjenige TcsL-Proteinfragment der TcsL-Aminosäuresequenz Nr. Q46342 (SwissProt/TrEMBL) enthält, das wenigstens das DXG-Motiv an Position 1666, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von Aminosäurepositionen AS 1654 bis AS 1679 umfasst, – und/oder (d) dasjenige Tcnα-Proteinfragment der Tcnα-Aminosäuresequenz Nr. Q46149 (SwissProt/TrEMBL) enthält, das wenigstens die Aminosäuresequenz von Aminosäurepositionen AS 1641 bis AS 1665 umfasst.
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