DE68905183T2

DE68905183T2 - Verfahren und zusammensetzungen fuer die behandlung von infektionen bei saeugetieren durch verwendung von arzneimitteln mit einem gehalt an hymenopteragift, eiweissartigen oder polypeptidkomponenten hiervon, oder analogen solcher eiweissartigen oder polypeptidkomponenten.

Info

Publication number: DE68905183T2
Application number: DE1989605183
Authority: DE
Inventors: W Benton; Henning Lowenstein; M Mulfinger
Original assignee: VESPA LAB Inc
Current assignee: VESPA LAB Inc
Priority date: 1989-04-13
Filing date: 1989-04-17
Publication date: 1993-08-12
Anticipated expiration: 2009-04-18
Also published as: NO905375L; DE68905183D1; NO905375D0

Description

Einleitung

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von gewissen sekundären Wirkstoffen, die von der Natur abgeleitet sind und ebenso von synthetischen Analogen davon, für die Verbesserung der Wirksamkeit von anderen primären chemotherapeutischen Mitteln, welche gegen bakterielle, virale und krebsartige Infektionen nützlich sind, und insbesondere für die Wirksamkeit von antibiotischen Mitteln. Die Identität der antibakteriellen anticarcinogenen Mitteln und insbesondere antibiotischen Mitteln und die Aktivitäten und die therapeutische Verwendung dieser Materialien sind wohl bekannt. Die sekundären Mittel, welche in der Erfindung für die Erhöhung der Aktivität dieser primären antiinfektiösen Mittel verwendet werden sind ebenso per se bekannt und sind in einigen Fällen in der Medizin verwendet worden, jedoch wurde ihre Fähigkeit der Verbesserung der Aktivität von antibakteriellen, antiviralen und anticarcinogenen Wirkstoffen und insbesondere antibiotischen Mitteln vorher nicht erkannt. Einige der sekundären Mittel, welche in der Erfindung verwendet werden, werden in erster Linie vom Tiergift von Arten der Gattung Hymenoptera erhalten, welche Bienen, Hummeln, Wespen, Hornissen und Feuerameisen umfassen.

Kurze Darstellung der Erfindung

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass das Hymenoptera Gift, welches aus aktiven proteinhaltigen oder Polypeptidkomponenten von solchen Tiergiften isoliert wurde und Analoge solcher proteinhaltiger oder Polypeptidkomponenten die Aktivität von antibakteriellen, antiviralen und anticarcinogenen Wirkstoffen und insbesondere antibiotischen Wirkstoffen erhöhen oder potenzieren
Die vorliegende Erfindung ging aus der Arbeit hervor, welche in einer Dissertation der Veterinärwissenschaft durch Lorraine Smith Mulfinger beschrieben wurde und den Titel "synergistische Aktivität des Honigbienengiftes mit Antibiotika" trägt, welche der "Graduate School Department of Veterinary Science of the Pennsylvania State University vorgelegt wurde. Verweise auf frühere Arbeiten von anderen wurden abgekürzt, da die vollständigen Peferenzen in der Bibliographie der Mulfinger Dissertation und am Ende dieser Anmeldung angegeben sind.

Hintergrund und Stand der Technik

Die Verwendung von antibakteriellen, antiviralen carcinostatischen und anticarcinogenen Substanzen ist, obschon im Fachgebiet weitgehend bekannt, immer noch ein Gegenstand von intensiven fortlaufenden Forschungsarbeiten, von welchen viele neben der Entdeckung von neuen Wirkstoffen, auf die Entdeckung von Mitteln für die Verbesserung der Aktivität von bekannten Mitteln gerichtet sind.
Tatsächlich wurden gewisse Substanzen, welche vom Bienengift abgeleitet sind, studiert, und sie haben sich als nützlich für gewisse spezifische pharmakologische Anwendungen erwiesen. Beispielsweise beschreibt US-Patent 4 444 753, erteilt am 24. April 1984, eine Zusammensetzung, welche eine Komponente enthält, die durch Deproteinisierung eines Extraktes aus einem Giftbeutel von Bienen erhalten wurde. Dieses Produkt besitzt eine immuno-stimulierende Aktivität, eine carcinostatische Aktivität, eine Wirkung der Erhöhung der antibakteriellen Aktivität einer antibakteriellen Substanz und eine erhöhende Wirkung auf die carcinostatische Aktivität von einer carcinostatischen Substanz. Die Erfindung, welche in diesem Patent offenbart ist, ist auf carcinostatische, immuno-stimulierende und antibakterielle Mittel gerichtet, welche die beschriebene Zusammensetzung enthalten. Während diese Erfindung in ihrem Zweck der vorliegenden Erfindung ähnlich ist, unterscheidet sie sich darin, dass der Bienenextrakt durch seine Deproteinisierung geändert wird, so dass sie negativ ist in der Biuret Reaktion und in der Sulfosalicynsäure-Reaktion.
Das US-Patent 4 370 316, welches am 25. Januar 1993 den gleichen Erfindern wie im oben erwähnten Patent erteilt wurde, beansprucht ebenfalls ein Verfahren für die Behandlung eines Wirtstiers, das eine verminderte Immunität besitzt, durch Verabreichung einer wirksamen Menge des deproteinisierten Extraktes aus einem Giftbeutel der Biene.
Während demnach antibakterielle, antivirale und anticarcinogene Substanzen wohlbekannt sind, ist es ebenfalls bekannt, dass ein deproteinisierter Extrakt aus dem Giftbeutel einer Biene gewisse nützliche Wirksamkeiten aufweist, einschliesslich einer antibakteriellen Aktivität, einer Aktivität zur Stimulation der antibakteriellen Aktivität und der immuno-stimulierender Aktivität, wurde vorher nicht erkannt, dass proteinhaltige Hymenopteragifte, proteinhaltige oder Polypeptidextrakte davon und Analoge von solchen proteinhaltigen oder Polypeptidkomponenten einen Verstärkungseffekt auf im wesentlichen alle antibakteriellen, antiviralen carcinostatischen und anticarcinogenen Mittel besitzen. Solche Verbesserer der Aktivität von solchen primären Antiinfektionsmitteln erhöht nicht nur die Wirksamkeit von Dosierungen solcher Mittel, welche allein wirksam sind, sondern kann ebenfalls kleine Dosierungen solcher Mittel wirksam machen, welche allein unwirksam waren.
Wie oben bemerkt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Hymenopteragift, proteinhaltiger oder Polypeptidkomponenten davon und Analoge solcher polypetinhaltiger oder Polypeptidkomponenten zur Verbesserung der Aktivität von antiinfektiösen therapeutischen Mitteln im allgemeinen. Zur Vereinfachung der Beschreibung der Erfindung wird sie jedoch nachstehend nur zum Zwecke der Erläuterung bei der Verwendung des Honigbienengiftes oder ihres proteinhaltigen Extraktes Melittin für die Verbesserung der Aktivität von Antibiotika bei der Kontrolle von bakteriellen, viralen und krebsartigen Infektionen diskutiert. Das Honigbienengift (HBV) wurde ausgewählt, da es leicht erhältlich ist. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass das Gift von anderen Hymenoptera und proteinhaltige oder Polypeptidkomponenten davon, ebenso wie Analoge davon ebenfalls für die Erfindung in verschiedenen Graden nützlich sind. Aehnliche antiinfektiöse Mittel, welche von Antibiotika verschieden sind, können ebenfalls erfindungsgemäss bei der Behandlung von Infektionen verwendet werden, für welche sie vorher verwendet wurden, wobei ihr Effekt jedoch erhöht wird, wenn sie in Kombination mit-proteinhaltigen Hymenopteramitteln zum Einsatz gelangen.
Als weiterer Hintergrund wird darauf hingewiesen, dass dem Honigbienengift eine vielzahl von nützlichen Aktivitäten zugeschrieben werden. Einige dieser Aktivitäten sind wissenschaftlich dokumentiert, während andere lediglich auf empirischen Daten und der Folklore beruhen. Die antibakterielle in vitro Aktivität des Honigbienengiftes ist gut dokumentiert (Schmidt-Lange, 1951; Ortel und Markwardt, 1955; Fennel et alia, 1968), es wurden jedoch wenige Anstrengungen unternommen, um diese Aktivität einer praktischen Verwendung zuzuführen. In der vorliegenden Erfindung zeigten die Daten von verschiedenen empirischen Versuchen, dass die antibakterielle Aktivität des Honigbienengiftes einen signifikanten in vivo Effekt in Gegenwart von Antibiotika besitzen dürfte. Auf Basis dieser Beobachtungen wurden Versuche vorbereitet, um die Wechselwirkungen vom Honigbienengift mit Antibiotika unter Verwendung von in vitro Versuchen zu studieren, wobei die beiden Komponenten ohne die beitragenden Effekte der natürlichen Immunantworten des Wirtstieres ausgewertet wurden.
in dieser Studie wurden drei Bakterienstämme zuerst gegen drei verschiedene Antibiotika getestet, wobei separate schachbrett-Titrationen von Honigbienengift mit jedem Antibiotikum durchgeführt wurden. Repräsentative von drei Hauptgruppen von Antibiotika (Penicillinen, Aminoglycosiden und Polymyxinen) wurden ausgewählt und getestet um zu bestimmen, ob das Honigbienengift die antibakterielle Wirksamkeit des ausgewählten Antibiotikums verbessern könnte. Ein Antibiotikum von einer vierten Hauptgruppe wurde wie unten beschrieben, später studiert. Wurde einmal eine Synergie auf einem Schachbrett demonstriert, wurde eine weitere Betrachtung unter Verwendung eines vereinfachten Verfahrens durchgeführt. Zwei automatisierte Testplatten für den minimalen Hemmkonzentrationstest (MIC), wo die Empfindlichkeit von elf Antibiotika simultan titriert wurde, wurden parallel mit Bakterienkulturen inokuliert, mit und ohne nicht-inhibierenden Dosen des Honigbienengifts (HBV). Acht gram-positive und vier gram-negative Organismen wurden getestet, wobei dieses System in einem Versuch verwendet wurde, um Klassen von Antibiotikas zu finden, welche jeweils eine Synergie mit dem HBV zeigten und um das Spektrum der synergistischen Wirkung dieser Kombinationen gegen verschiedene Bakteriengruppen zu bestimmen.
Zusätzlich zum Testen des gesamten Honigbienengiftes, wurde das Gift durch Grössenexklusionschromatographie fraktioniert. Jeder der vier Fraktionen wurde getestet um zu bestimmen, ob eine spezifische Komponente für die antibakterielle Aktivität verantwortlich war und ebenfalls synergistisch in einem antibakteriellen Test wirkte. Es wurde gezeigt, dass die Fraktion, welche Melittin enthielt, was vorher als antibakterielles Element des Honigbienengiftes festgestellt wurde (Fennel et alia, 1968), in seiner gereinigten Form aktiv ist und synergistisch wirksam ist in einer Grössenordnung, welche gleich gross ist wie das gesamte Honigbienengift.
Im weiteren wurde die Aktivität von verschiedenen Analogen der aktiven Komponenten von Hymenopteragiften bestimmt und mit derjenigen von Melittin verglichen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist ein Diagramm der Aminosäureseguenz von Nelittin;
Figur 2 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden, nach der Inokulation, was die antibakterielle Aktivität des Honigbienengiftes (HBV) auf S. aureus zeigt;
Figur 3 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Ampicillin und HBV gegen S. aureus;
Figur 4 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Kanamycin und HBV gegen S. aureus;
Figur 5 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen die Stunden nach der Inokulation mit Polymyxin B und HBV gegen S. aureus;
Figur 6 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Ampicillin und KBV gegen E. coli;
Figur 7 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Kanamycin und HBV gegen E. coli;
Figur 8 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Kanamycin und HBV gegen E. coli;
Figur 9 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Polymyxin B und HBV gegen E. coli;
Figur 10 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Ampicillin und HBV gegen Kanamycin-resistenten S. aureus;
Figur 11 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Kanamycin und HBV gegen Kanamycin-resistenten S. aureus;
Figur 12 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Polymyxin B und HBV gegen Kanamycin-resistenten S. aureus;
Figur 13 zeigt die Elektrophoreseresultate von 50ug Melittin Protein;
Figur 14 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation, wobei die antibakteriellen Aktivitäten von Melittin/HBV gegen S. aureus dargestellt sind;
Figur 15 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Melittin/HBV und Kanamycin gegen S. aureus;
Figur 16 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Rifampicin und HBV gegen S. aureus;
Figur 17 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Rifampicin und HBV gegen Ps. aeruginosa;
Figur 18 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Polymyxin B und Hummelgift gegen E. coli;
Figur 19 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Polymyxin B und Wespengift gegen E. coli;
Figur 20 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Polymyxin B und Hornissengift gegen E. coli;
Figur 21 ist eine graphische Darstellung von log 10 Bakterien/ml Blut gegen die Behandlung eines einzelnen Behandlungsmodelles von Septikämie (Polymyxin B und Melittin Wechselwirkungen);
Figur 22 ist eine graphische Darstellung von log 10 Bakterien/ml Blut gegen die Behandlung mit wiederholten Behandlungsmodellen von Septikämie (Polymyxin B und Melittin Wechselwirkungen);
Figur 23 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation mit Melittin/Analogen und Polymyxin B gegen E. coli;
Figur 24 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation, wobei die relative Wirksamkeit von Melittin und Analogen gezeigt ist;
Figur 25 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden nach der Inokulation, wobei die relativen Aktivitäten von Melittin und Analogen gezeigt ist; und
Figur 26 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte gegen Stunden, nach der Inokulation, wobei die relativen Aktivitäten von Nelittin und Analogen gezeigt wird.

Zusammensetzung von Giften

Insektengifte sind heterogene Nischungen von biochemischen Verbindungen. Die meisten Gifte enthalten mehr als 90% Protein. Toxine und Enzyme machen diesen Proteinteil aus und sind die Ursache von direkten Zellschäden. Während viele Enzyme wie Phospholipase A2, Säureposphatase und Hyaluronidase in den meisten Giften enthalten sind, sind Toxine und andere biologisch wirksame Peptide in Tiergiften hoch artspezifisch.
Giftproduzierende Insekten gehören alle zur Insektengattung der Hymenoptera. Wie in Schlangengiften, sind enzymatische Aktivitäten wie von Phospholipase A2, Hyaluronidase und Säurephosphatase in allen Insektengiften vorhanden. Die Toxin- und Peptidkomponenten jedoch varieren von Art zu Art. (Tu, 1977b)
Das Gift der italienischen Honigbiene (Apis mellifera) ist das meiststudierte Insektengift. Die Hauptkomponente des Honigbienengiftes ist Melittin. Dieses Peptid hat ein Molekulargewicht von 2'847 Dalton und umfasst ungefähr 50% der Gift-Trockensubstanz. Ein zweites Peptid, Apimin, ist in einem Anteil von ungefähr 5 % des Giftes vorhanden und verschiedene andere Peptide sind in Spuren vorhanden. (Hberman, 1972)
Die Gifte von anderen Hymenoptera enthalten Peptide, welche biologische Eigenschaften besitzen, die ähnlich sind wie diejenigen von Melittin. Beispiele von solchen Peptiden sind Bombolitine I-V vom Hummel, Megabombus pensylvanicus, Mastoporan von Wespen, Hornissen und Gelbhornissen und Crabolin von europäischen Hornissen. Ein gemeinsames Merkmal dieser Peptide ist ihre amphiphile Natur. Diese Peptide wurden einer Sequenzanalyse unterworfen und ihre Strukturen sind wohlbekannt. (A. Argiolas und J.J. Pisano, 1985)

Die antibakterielle Aktivität des Honigbienengiftes

Die bakterizide Aktivität des Honigbienengiftes wurde erstmals 1941 durch W. Schmidt-Lange (1941) dokumentiert. Er testet E. Coli und Staphylokokken und fand bei beiden ihre Empfindlichkeit auf das Honigbienengift. Zusätzlich bemerkte er, dass die minimale Hemmdosis des Honigbienengiftes für E. coli viel höher war als dasjenige für Staphylokokken.
Nicht vor dem Ablauf von weiteren 10 Jahren untersuchten Brangi und Pavan (1951) verschiedene Extraktionsverfahren zur Isolierung der antibakteriellen Aktivität des Honigbienengifts. Sie fanden, dass die Aktivität sowohl im Wasser wie auch Acetonextrakten des Giftes vorhanden war. Sie zeigten ebenfalls, dass die Aktivität ebenfalls beim Erwärmen auf 100ºC während 15 Minuten stabil war.
1955 publizierten Ortel und Markwardt (1955) die Resultate einer Untersuchung der Veränderlichkeit der Empfindlichkeit von verschiedenen Bakterien auf die antibakterielle Aktivität des Honigbienengiftes. Es wurden 196 Bakterienstämme getestet. Die Resultate zeigten, dass die Toleranz des Honigbienengiftes viel grösser ist bei gram-negativen Organismen als bei gramositiven Organismen. Die Bereiche für bakterizide Konzentrationen wurden für gram-positive Bakterien als 12,5 bis 25 ug/ml und für gram-negative Bakterien 1 bis 10 mg/ml geschildert. Die bakterizide Aktivität wird gleichzeitig mit den roten Blutkörperchen in der "direkten hämolytischen Fraktion" gereinigt. Der Name "Melittin" wurde der aktiven Komponente dieser Fraktion noch nicht zugeordnet.
1963 publizierten Benton et alia einen Biotest auf Honigbienengift. Die bakteriostatische Aktivität des Giftes wurde quantitativ durch einen radialen Diffusionstest bestimmt, worin Zonen der Wachstumshemmung gemessen wurden, welche durch serielle Giftverdünnungen in einem Bakteriumswachstumsrasen verursacht wurden. Diese Tests wurden vorgeschlagen um die biologische Aktivität des Honigbienengiftes zu standardisieren, welches für den in vivo-Gebrauch vorgesehen ist. (Gegenwärtig ist die Allergien-Desensibilisierung die einzige in vivo-Honigbienengiftbehandlung, welche durch die Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten bewilligt ist.) Der Artikel testet ebenfalls die Wärmestabilität der Aktivität des Honigbienengiftes und hat herausgefunden, dass sie sterilisationsverfahren standhalten kann (121ºC währen 15 Minuten) (Benton et al. 1963)

Melittinisolierung und Aktivitäten

Das Honigbienengift besetzt verschiedene pharmakologisch aktive Verbindungen. Die Verbindung, welche als grösster Anteil im Gift enthalten ist, ist Melittin, ein Polypetid, welches ein Molekulargewicht von 2'847 Dalton besitzt, welches direkt als Hämolysin von roten Blutzellen wirkt. Andere aktive Komponenten umfassen Phospholipase A2, Histamin, Dopamin, Noradrenalin, Apaamin, und Hyaluronidase (Haberman, 1972).

Antibakterielle Aktivität von Melittin

Fennel, Shipman und Cole (1968) reinigten Melittin durch eine Sephadex G-50 Chromatographie und zeigten, dass die Melittinfraktion eine "potente antibakterielle Aktivität" besass. Sie testeten 30 zufällige Bakterienstämme (einschliesslich verschiedene Streptokokken, Staphylokokken und Enterobakterienstämme), wobei sie die Aktivität von gereinigtem Melittin mit Vollbienengift verglichen. Sie stellten fest, dass ein Stamm von S. aureus, ein penicillinresistentes Isolat, keine Verminderung der Empfindlichkeit gegen Melittin zeigte.
Obschon Melittin als antibakterieller Faktor des Honigbienengiftes beschrieben wurde, wurde keine Schilderungen seiner in vivo Aktivität gefunden. Es wurde durch Mollay und Kreil (1974) bemerkt, dass Wechselwirkungen zwischen Melittin und Lecithin die Phospholipaseaktivität von Honigbienengift auf Lecithin erhöhte. Es ist vorher jedoch nicht erkannt worden, dass Melittin die Aktivität von Antibiotika erhöht.
Haberman und Jentsch (1967) haben Melittin gereinigt und die Aminosäuresequenz publiziert. Sie fanden, das Melittin in zwei natürlichen Formen existiert, welche sich nur durch eine Formylsubstitution am N-Terminus unterscheiden (Figur 1).

Analoge von Protein- uund Polypeptidkomponenten von Hymenopteragiften

Es wurden folgende Analoge von Melittin hergestellt. Nr. des Analogen Zusammensetzungen Melittin Mastoporan
Die Analogen wurden durch konventionelle Peptidsynthese hergestellt, wie z.B. beschrieben bei M. Bodanszky: "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984.
Als Beispiel wird die Peptidsynthese des Analogen Nr. 4, nämlich Melittin (1-20) -Lys-Arg-Lys-Arg-Gly-Gly-NH&sub2; nun im einzelnen beschrieben.
Ein derivatisiertes Harz, wie ein Polydimethylacrylamidgel, welches kommerziell unter dem Warennamen PEPSYN KA erhältlich ist, wird mit (Fmocly)&sub2;O behandelt, wobei Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl ist, welches als temporäre Schutzgruppe dient. Die Reaktion, welche in Gegenwart von 4-Dimethylaminopyridin als Katalysator durchgeführt wird, führt zur Bildung des Esters Fmoc-Gly-O-Harz.
Der Ester wird in Gegenwart von 20% Piperidin in DMF deblockiert, wobei H-Gly-O-Harz gebildet wird.
Das deblockierte Produkt wird dann mit einem aktivierten Ester der Formel
Fmoc-Gly-OPfp
aktiviert, worin Pfp Pentafluorphenyl ist, wobei
Fmoc-Gly-Gly-O-Harz
gebildet wird.
Die verbleibenden 24 Aminosäuren werden mit dem Reaktionsprodukt gekuppelt, welches in 24 ähnlichen Deblockierungs- und Kupplungszyklen mit aktiven Estern gebildet wird.
Das somit gebildete Produkt wird mit 20% Piperidin in DMF deblockiert und das gebildete Melittin wird vom Harz in Gegenwart von TFA (Trifluoressigsäure) und eines Spülmittels, wie Wasser, abgespalten.

Antibiotika

Antibiotika können funktionell in vier Gruppen auf Basis der aktiven Zentren der Antibiotika (Volk, 1978a) eingeteilt werden. zielstrukturen der vier Gruppen sind die Zellwand, die Zellmembrane und die Proteinsynthesevorrichtung und die Nukleinsäurereplikationsvorrichtung. Wegen der Komplexizität des Synergietests wurden zum Testen vier Antibiotika ausgewählt, eines jeder der vorgenannten Gruppen. Die ausgewählten Antibiotika waren Ampicillin, Kanamycin, Polymyxin B und Rifampicin. Jedes besitzt eine verschiedene Art der Wirkung auf procaryontische Zellen.

Ampicillin

Ampicillin gehört zur Gruppe von Antibiotika, welche die Zellwandstruktur beeinträchtigen. Diese Antibiotika sind alle penicillinderivate, wobei jedes den funktionellen ß-Lactamring enthält. Kollektiv als β-Lactamgruppe bekannt, blockieren diese Antibiotika die Zellwandsynthese, indem sie das Transpeptidaseenzym hemmen, welches die Pentaglycinbrücken des Peptidoglycans vernetzt, wobei durch ihre Gegenwart nur aktiv wachsende Zellen beeinträchtigt werden.
Ampicillin ist ein semi-synthetisches Derivat von Penicillin. Der Syntheseschritt bei der Ampicillinynthese fügt eine Aminogruppe zum α-Kohlenstoff des Penicillin G. Dies verleiht eine β-Lactamase-Resistenz (der prädominante penicillinresistenzfaktor von Bakterien) was Ampicillin ein weiteres Wirkspektrum unter den Bakterien gibt als Penicillin (Volk, 1978b).

Kanamycin

Kanamycin ist ein Aminoglyciosid. Diese Gruppe von Antibiotika blockiert Proteinsynthesen. Mitglieder dieser Gruppe finden die 30 Ribosome von Bakterien und sterischen Blöcken zur Bindung von Aminoacyl-tRNA oder hemmen die Verlagerung der wachsenden Peptidkette an das aktive ribosomale Zentrum (Volk, 1979c). Da die Proteinsynthese für viele regulatorische Zellfunktionen erforderlich ist, sind Aminoglykoside wirksam für Bakterien in jeder aktiven oder stationären Wachstumsphase

Polymyxin B

Poloymyxin B ist ein zyklisches aliphatisches Peptid. Wegen den kombinierten hydrophilen und hydrophoben Eigenschaften weist Polymyxin B eine detergensrtige Wirkung auf, welche nicht erfordert, dass das Zellwachstum wirksam ist. Wie beim Melittin, geht Polymyxin B mit den Membranen eine Wechselwirkung ein, wobei kleine hydrophile Poren in den hydorphoben Bereichen der Membranen entstehen. Bei gram-negativen Organismen, welche eine dicke Lipopolysaccaridschicht besitzen, welche als selektive durchlässige Barrieren wirken, ist Polymyxin B wirksam bei der Zerstörung von osmotischen Gradienten. Demzufolge ist Polymyxin B sehr wirksam gegen gram-negative Organismen, während es nur minimal wirksam gegen gram-positive Organismen ist. (Sebek, 1979). Während Melittin Membranenporen ähnlich wie Polymyxin B bilden kann, ist Melittin aktiver gegen gram-positive Organismen, womit die Wirkung von Melittin nicht vollständig analog wie diejenige von Polymyxin B sein kann.

Rifampicin

Rifampicin ist ein Antibiotikum aus der Gruppe, welche auf der Stufe der Nukleinsäuresynthese wirkt, welches die Beispiele von Antibiotika der vier Hauptgruppen, auf welche oben Bezug genommen wird, vervollständigt.

Synergiestudien

Ein Rückblick von Artikeln, welche eine Synergie zwischen Antibiotika und anderen Verbindungen in bakteriellen Systemen untersuchen, zeigt, dass alle Forscher im wesentlichen die gleiche grundlegende Betrachtungsweise verwendeten. Das bakterielle Wachstum wurde in Brühenkulturen mit und ohne jede Verbindung separat verfolgt und dann mit beiden Verbindungen zusammen. Um die synergistische Wirkung im Gegensatz zu einem additiven Effekt zu beweisen, würde mindestens eine der verwendeten Verbindungen auf der Stufe, wo sie allein verwendet wird, eine minimale Wachstumshemmung zeigen. Mit einer verhältnismässig inaktiven Verbindung würde demzufolge jede zunehmende Aktivität der zweiten Verbindung bei ihrer Gegenwart das Resultat von synergistischen Wechselwirkungen darstellen (Moellering at alia, 1971; Carrizosa und Levison, 1981; und Cynamon und Palmer, 1983) Auf diesen Anordnungstyps wurden die Versuche der vorliegenden Erfindung begründet.

Materialien und Methoden

Materialien

Honigbienen-(Apis melifera)Gift wurde durch die Vespa Laboratorien, Spring Mills, Pennsylvania, geliefert.
Bakterienstämme wurden durch die veterinärwissenschaftliche Abteilung der Pennsylvania State University geliefert. S. aureus #140A ist ein Feldisolat von einem Fall von boviner Mastitis. E. coli #G1880E wurde aus der systematischen Sammlung des E. coli Referenzzentrums ausgewählt. Ein Kanamycinesistenter Stamm von S. aureus wurde durch ein natürliches Selektionsverfahren, wie nachstehend beschrieben, isoliert.
Antibiotika wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri) erworben und die Aktivitätseinheiten wurden auf ihre Analysen bezogen.
Tryptische Sojabasen (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) wurden zur Stützung des Bakterienwachstums sowohl in einer Brühe wie auch auf Agar verwendet.
Sephadex R G-50 wurde von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, bezogen.
Minimale Hemmkonzentrationstests (MIC) von Antibiotika mit und ohne Honigbienengift wurden durch die mikrobiologische Abteilung des Allegheny General Hospital, Pittsburgh, Pennsylvania, durchgeführt, wobei das Sensititre TM Testsystem verwendet wurde, welches durch die Gibco Laboratories, Lawrence, Massachusetts, vertrieben wird.

Verfahren

Isolierung von Kanamycin-resistenten Mutanten

S. aureus wurde in 5 ml tryptischer Sojabrühe (TSB) über Nacht mit einer ungefähren Dichte von 10&sup9; kolonienbildenden Einheiten/ml gezüchtet. 0,1 ml der Ueber-Nacht-Kulturen wurde auf eine Platte von Trypticase-Sojaagar (TSA), welche 39 ug/Kanamycin enthielt, aufgetragen und während 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Kolonien, welche innerhalb von 48 Stunden erschienen, wurden auf einer zweiten TSA-Platte, die mit 39 ug/Kanamycin ergänzt wurde, subkultiviert.

Schachbrett-Titrationstest auf Synergie

Bakterienkulturen wurden zu diesem Test vorbereitet, indem jeder Stamm während dem logarithmischen Waschstum in TSB eingefroren wurden. Zu diesem Zweck wurde eine 5 ml Ueber-Nacht-Kultur verwendet um 200 ml TSB in einem 500 ml Erlenmeyerkolben zu inokulieren. Die Kultur wurde bei 37ºC unter konstantem Rühren inkubiert und die optische Dichte (OD) bei 600 nm wurde stündlich abgelesen. Sobald die Kultur die mid-log Phase erreichte (ungefähr bei 0.55 OD Einheiten) wurden 5 ml Aliquote in 16 x 100 mm Schraubverschlussröhrchen transferiert. Alle Kulturen wurden eingefroren und bei -20ºC aufbewahrt. E. coli erforderte eine Glycerinzugabe zum Medium bis zu einer Endkonzentration von 20ºC, um das Einfrieren zu überleben. Dies wurde erreicht, indem 1 ml steriles Glycerin mit 4 ml der log-Phasenkultur unmittelbar vor dem Einfrieren vermischt wurden. Um einen Test zu beginnen, wurde ein Röhrchen einer gefrorenen Kultur in einem Becherglas mit Wasser bei Zimmertemperatur aufgetaut. Die aufgetaute Kultur wurde zu 175 ml TSB in einem 500 ml Erlenmeyerkolben zugegeben, gerührt und die OD&sub6;&sub6;&sub0; unmittelbar gemessen und als "Zeit Null" aufgezeichnet. Der Kolben wurde dann bei 37ºC unter konstantem Rühren während 2 Stunden inkubiert, nach welcher Zeit die OD&sub6;&sub6;&sub0; wiederum gemessen und aufgezeichnet wurde, die Kultur wurde in 16 x 100 mm Schraubverschlussreagenzgläser aufgeteilt, welche durch Versetzen mit den spezifischen Aliquoten des Honigbienengiftes (HBV) und dem nachstehend beschriebenen Antibiotikum vorbereitet waren.
Vorratslösungen von HBV und Antibiotika wurden in destilliertem Wasser hergestellt, filtersterilisiert und bei -20ºC in 5 ml Aliquoten in Konzentrationen aufbewahrt, welche das Doppelte der für das Schachbrett-Titrationssystem erforderlichen Konzentration ausmachte. Die gefrorenen Vorratskonzentrationen, welche für jede Bakterienart erforderlich waren, sind in Tabelle 1 angegeben. Die Konzentration, welche für jedes Bakterium verwendet wurde, basierte auf Vorversuchen, in welchen die Antibiotika allein zur Bestimmung der minimalen Hemmbereiche jedes Antibiotikums für jeden Mikroorganismus verwendet wurden.
Für jeden Test wurde eine Ampulle Antibiotikum und eine Ampulle HBV bei Zimmertemperatur aufgetaut und mit einem äquivalenten Volumen von 2 x TSB verdünnt und dann seriell zweimal in eine normale Stärke DSB verdünnt, um vier Giftkonzentrationen und vier Antibiotikumkonzentrationen zu erhalten. Fünfundsiebzig Schraubverschlussreagenzröhrchen wurden nummeriert und so angeordnet, dass sie dem Schachbrettmuster, welches in Tabelle 2 dargestellt ist, entsprachen. TSB, Antibiotikum und HBV wurden dann gemäss der in Tabelle 3 gezeigten Anordnung verteilt. Die Röhrchen, welche als OO und O bezeichnet wurden, enthielten 2,5 ml TSB und dienten als OD-Blindproben und Sterilitätskontrollröhrchen. Die Röhrchen 1-75, von welchen jedes ein Totalvolumen von 5 ul enthielt, wurden mit 2 ml der oben beschriebenen Zweistundenkultur inokuliert [Anmerkung: Die HBV und/oder Antibiotikum Endkonzentration in jedem Röhrchen betrug einen Zehntel der Konzentration, welche zum 200 ul Aliquot zugefügt wurde (vergleiche Tabelle 3).] Jedes Röhrchen wurde sofort verschlossen und gedreht. Nachdem alle Röhrchen inkubiert waren, wurden sie in horizontale Gestelle gestellt, welche sich auf einer Schaukelplattform bei 37ºC befanden. Das Wachstum jedes Röhrchens wurde individuell bei 4, 6, 8, 12 und 24 Stunden durch Bestimmung der optischen Dichte jedes Röhrchens bei 660 nm verfolgt.

Die minimalen Hemmkonzentrationstests mit HBV

Das mikrobiologische Laboratorium des Allegheny General Hospitals, welches in der Lage ist, automatisierte MIC Tests durchzuführen, wurde kontaktiert um einen Testversuch an 12 klinischen bakteriellen Isolaten durchzuführen. Die Anpassung des automatischen MIC Tests umfasste folgende Einschränkungen: (1) Jeder Versuch konnte nur einen Dosierungsgrad HBV testen, und (2) der Effekt des HBV allein konnte nur als hemmend oder nicht hemmend bestimmt werden. Die Synergie von HBV mit 11 Antibiotika in diesem System wurde ausgewertet, indem zwei Versuche verglichen wurden, welche simultan mit und ohne vorhandenes HBV durchgeführt wurden. Die für jede Art verwendete HBV-Dosis wurde auf Basis des Schachbrett- Titrationstests als nicht hemmende Dosis angenommen.

Melittin Reinigung

Sephadex R G-50 Gel für die Gelfiltration wurde während 24 Stunden bei Zimmertemperatur in β-Alanin-Essigsäurepuffer (BAAB), pH 4,3 (Guralnick et alia, 1986) aufgequollen und dann bei fünf Grad Celsius über Nacht äquilibriert. Es wurde in eine 2,5 x 60 cm Säule aufgefüllt und mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1.0 ml/h äquilibriert. 100 mg HBV wurden in 5 ml BAAB Puffer, welcher 20 % Saccharose enthielt, rekonstituiert. Das HBV wurde auf die Säule aufgetragen und mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1 ml/h eluiert. Die Eluate wurden bei einer Absorbtion von 280 nm überwacht. Die Fraktionen, welche den Haupt Peak enthielten, wurden gepoolt, ein aliquoter Anteil wurde durch den Lowry Protein Test (Lowry, 1951) getestet und der Rest wurde gefriergetrocknet.
Die Identifikation der Melittinfraktion beruhte auf der relativen Mobilität und der Quantifizierung von Banden, welche in Polyacrylamidgeltrennungen bei jeder Fraktion auftraten (Benton, 1965). Das Melittin wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese ebenfalls auf Reinheit getestet. Die Elektrophorese wurde durch Guralnick et alia beschrieben (1986) durchgeführt. Die gefriergetrockneten Fraktionen wurden in zwei mg/ml Elektrophoreseprobenpuffer rekonstituiert und 50 ul Proben wurden pro Probeloch auf das Gel aufgetragen.

Vollgift-Aequivalenz von Melittin

Die Menge der äquivalenten Melittinfraktion gegen seinen Anteil in Voll-Honigbienengift wurde durch Quantifikation von individuellen Banden bestimmt in elektrophoretisierten Proben von Vollgift und der Melittinfraktion. 20, 40, 60, 80 und 100 ug Proben von Voll-Honigbienengift wurden durch Elektrophorese aufgetrennt, mit Coomassie - Brilliantblau-Perchlorsäurefarbe gefärbt und mit einem Densitometer abgetastet. Es wurde eine Standardkurve erstellt, in welcher der Spitzenbereich der Melittinbande der Vollgiftproben der Proteinmenge der aufgetragenen Probe gegenübergestellt ist. Sechs 40 ug Proben des gereinigten Melittins wurden simultan getestet und es wurde mittels der Standardkurve ihre Aequivalenz im Honigbienengift getestet. Dieses Verfahren ist im einzelnen durch Mulfinger et alia beschrieben (1986).

Test von Melittin auf synergistische Aktivität

Zum Vergleich der antibakteriellen Aktivität von Voll-Honigbienengift und der Melittinfraktion wurden die vorherigen schachbrett-Titrationsresultate durchgesehen und das Testsystem wurde derart ausgewählt, dass die HBV Dosiswirkungen leicht allein und in Kombination mit einem Antibiotikum betrachtet werden konnten. Da Staphylokokken gegen HBV allein bei den verwendeten Konzentrationen in den obigen Schachbretttests empfindlich sind, und da Kanamycin eine gute synergistische Wirkung mit HBV zeigte, wurde dieses System ausgewählt um die antibakteriellen Aktivitäten von Voll-HBV und Melittin zu vergleichen. Die Dosis jeder in dieser Analyse verwendeten Komponente war 2 ug/ml HBV und 2.5 ug/ml Kanamycin. Diese Dosen lagen in einem Bereich der bakteriellen Reaktivität, worin die Wirkungen von kleinen Dosenänderungen reproduzierbar und leicht messbar waren. Die äquivalente Dosis der Melittinfraktion für 2,0 ug/ml HBV betrug 1,6 ug/ml. Jeder Versuch wurde in parallelen dreifachen Proben der Melittinfraktion und von Voll-Honigbienengift und ohne Kanamyzingegenwart getestet um die äquivalente Aktivität zu prüfen.

Statistische Analyse

Jedes Schachbrettexperiment wurde fünfmal wiederholt. Die Mittelwerte der fünf Wiederholungen für jede Bakterien-Antibiotikumkombination wurden zu jedem Zeitpunkt auf signifikante Unterschiede getestet, wobei ein Waller-Duncan K-ratio T Test verwendet wurde und die Kurvenfamilien wurden für den Synergietest ausgewählt. Eine Kurvenfamilie, bestand aus einer Versuchskontrollkurve bestand (Bakterienwachstum ohne Antibiotikum- oder HBV-Gegenwart) einer Antibiotikumkontrollkurve (Bakterienwachstum mit Antibiotikum, jedoch ohne HBV-Gegenwart), einer Giftkontrollkurve (Bakterienwachstum mit HBV, jedoch ohne Antibiotikumgegenwart) und einer Wechselwirkungskurve (Wachstum mit Antibiotikum- und HBV-Gegenwart). Familien, in welchen die Antibiotikumkontrollkurven und die Giftkontrollkurven kleine mittlere OD-Abnahmen bezüglich der Prüfkontrollkurve zeigten, und welche ebenso grosse OD-Abnahmen in der Wechselwirkungskurve bezüglich der Prüfkontrollkurve zeigten, wurden auf Synergie gebtestet.
Ein synergistischer Effekt zwischen Verbindungen kann von einem additiven Effekt der Verbindungen differenziert werden, da der additive Effekt voraussagbar ist. Additive Effekte können vorausgesagt werden, indem die individuellen Effekte der beiden Verbindungen summiert werden, wobei jeder grössere Effekt eine synergistische Wechselwirkung angeben würde. Es wurde eine Gleichung erstellt, welche die OD-Ablesungen für eine additive Wechselwirkung zwischen HBV und einem Antibiotikum vorbestimmen konnte. Vergleiche die oben angegebene Mulfinger Disseratation (1987) Seiten 23-25.

Resultate

Schachbrett-Titrationsversuche

Es wurden drei Bakterienstämme gegen jedes der drei Antibiotika in Kombination mit Honigbienengift getestet. Diese neun Kombinationen von Bakterien, Antibiotika und HBV wurden analysiert, indem der Schachbrettest verwendet wurde, wobei 25 Behandlungen (Antibiotikum und HBV-Kombinationen) für jede Bakterium- Antibiotikumkombination vorgesehen waren. Jedes Schachbrettexperiment umfasste dreifache Proben für jede Behandlung und wurde fünfmal wiederholt. Die Daten der Dreifachproben, welche in fünf Experimenten wiederholt wurden, wurden gemittelt und der Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Zeitpunkt jeder Behandlung ist im Anhang angegeben. Für jede Bakterium-Antibiotikum Kombination wurden die mittleren OD Werte für jede Antibiotikum/HBV Behandlung zu jedem Zeitpunkt in absteigender Reihenfolge angeordnet und gemäss den signifikanten Unterschieden gruppiert, wobei der Waller- Duncan K-ratio T Test verwendet wurde. Von den Waller- Duncan Profilen wurden Familien von vier Kurven, wie in den "statistischen Analysen" beschrieben, zum Nachweis der Synergie verglichen. Die Kurvenfamilien zeigten die grössten OD Unterschiede zwischen Wechselwirkungskurven und der niedersten der Prüfkurve, die Antibiotikakontrollkurve und die Giftkontrollkurve wurden für jeden Testpunkt aufgezeichnet und auf Synergie getestet, wobei die im obigen Abschnitt "statistische Analyse" erwähnte Gleichung verwendet wurde. Für jede Kurvenfamilie wird, wenn die Abschätzung von (-X+A+V-AV) für einen Zeitpunkt signifikant grösser als Null ist, bei einem 95%igen Vertrauensgrad (d.h., wenn Synergie angegeben wird) der Zeitpunkt auf der Wechselwirkungskurve durch ein hochgestelltes "s" beim Quadrat, welches diesen Zeitpunkt darstellt, angegeben (Figuren 2-11).

S. aureus

S. aureus ist empfindlich auf Honigbienengift allein in kleinen Konzentrationen. Es ist demzufolge wichtig, die maximale Honigbienengiftdosis zu finden, für welche keine Wirkungen ausgeübt werden. Diese Konzentration betrug ungefähr 2 ug/ml. Demzufolge waren für alle Antibiotikum/HBV-Kombinationen mit S. aureus die Giftdosen für das Schachbrett-Titrationssystem 0, 2, 4, 8 und 16 ug/ml (Tabellen A-1 bis A-3). Die Figur 2 demonstriert die Effekte dieser Dosen von Honigbienengift, wenn es allein als antibakterielle Verbindung verwendet wird.

S. aureaus gegen Ampicillin/HBV

Die Endkonzentrationen von Ampicillin in den Röhrchen des Schachbrettsystem waren 0, 0.05, 0.1, 0.2 und 0.4 ug/ml. Figur 3 zeigt die Resultate der Ampicillin/HBV-Kombination, wobei 2 ug/ml HBV und 0.05 ug/ml Ampicillin verwendet wurden. Es wurde keine Synergie bei den Zeitpunkten 4 oder 6 Stunden festgestellt; sowohl bei den Zeitpunkten 8 und 12 Stunden ist jedoch offensichtlich, dass die Wechselwirkungskurve viel kleiner ist als man aus der Summe der Wirkungen, welche durch Ampicillin und HBV allein verursacht werden, voraussagen könnte. Die statistische Analyse zeigt, dass in beiden Zeitpunkten die Summierung (-X+A+V-AV) signifikant grösser als Null ist.

S. aureus gegen Kanamycin/HBV

Die Endkonzentrationen von Kanamycin, welche für den Test von S. aureus im Schachbrettsystem ausgewählt wurden, waren 0, 1.25, 2.50, 5.0 und 10.0 ug/ml (Tabelle A-2) . Figur 4 zeigt die Kurvenfamilie, welche den grössten Kontrast zwischen den Kontroll- und Wechselwirkungskurven zeigt. Im Experiment wird die Synergie erstmals in der Nähe des Zeitpunktes 6 Stunden demonstrierbar und ist klar bei 8 Stunden Inkubation sichtbar. Bei 12 Stunden scheinen die Kulturen ausserhalb der Wirkung der kombinierten Dosis zu sein und der synergistische Effekt ist verloren, da das Wachstum durch andere Faktoren (Nährstoffe) im Medium limitiert wird. (Diese Wachstumsbegrenzung wird durch die Kontrollkurve gezeigt). Trotz der 12 Stunden-Wachstumsbeschränkung zeigt die statistische Analyse der Daten bei 6, 8 und 12 Stunden eine synergistische Wechselwirkung zwischen Kanamycin und HBV in diesem Test.

S. aureus gegen Polymixin B/HBV.

Die Endkonzentrationen von Polymyxin B in diesen Experimenten waren 0, 313, 624, 1250 und 2500 U/ml (Tabelle A). Synergie wurde beobachtet bei 4 ug/HBV und 625 U/ml Polymyxin B (Figur 5). Sowohl bei 8 wie auch bei 12 Stunden Inkubation wird durch die Wechselwirkungskurve Synergie demonstriert.

E. coli.

Das Honigbienengift war allein nicht hemmend gegen E. coli in Mengen, welche für die Demonstation von Synergie erforderlich sind (Tabellen A4-A6), die Toxizität war demzufolge nicht der limitierende Faktor für das HBV im Schachbrettest mit E. coli. Experimentelle Bedingungen limitierten jedoch die obere HBV-Konzentration bei ungefähr 40 ug/ml; grössere Konzentrationen als diese verursachten eine Ausfällung der Komponeneten des Mediums. Demzufolge waren die finalen HBV-Konzentrationen, welche in den Schachbretttests mit E. coli verwendet wurden 0, 5, 10, 20 und 40 ug/ml

E. coli gegen Ampicillin/HBV.

Die finalen, für die Verwendung bei der E. coli Schachbrett- Titration verwendeten Ampicillin-Konzentration betrugen 0.5, 1, 2 und 4 ug/ml (Tabelle A-4). Die Synergie war weniger dramatisch in allen ausgewerteten Kurvenfamilien als in jedem der obigen Experimente. Ein Synergiebeweis bestand nur in der 40 ug/ml HBV-1 ug/ml Amplicillin-Kombination und nur am Zeitpunkt 6 Stunden (Figur 6).

E. coli gegen Kanamycin/HBV.

Die finalen, für den Schachbrettest ausgewählten Kanamycin-Konzentrationen waren 0, 5, 10, 20 und 40 ug/ml (Tabelle A-5). Figur 7 zeigt die Wirkungen des Honigbienengiftes mit einer minimalen effektiven Dosis Kanamycin. In dieser Situation zeigt nur der 8 Stunden Zeitpunkt Synergie. Ungeachtet der HBV-Dosis konnte keine Synergie in anderen Kombinationen von HBV mit niederen Kanamycin- Dosen beobachtet werden.
Figur 8 zeigt eine höhere Dosis von Kanamycin mit HBV auf E. coli. Hier ist die Synergie statistisch an allen Zeitpunkten nach zwei Stunden bewiesen.

E. coli gegen Polymyxin B/HBV.

Die Endkonzentrationen von Polymyxin B bei den Schachbrett- Titrationen waren 0, 1.5, 3, 6 und 12 U/ml (Tabelle A-6). Die Kombination von 3U/ml Polymyxin B und 5 ug/ml HBV ergaben die dramatischste Illustration von Synergie (Figur 9). Synergie ist an allen Punkten offensichtlich während der Behandlung und die Unterschiede zwischen den beobachteten und den vorausgesagten Werten sind gross.

Kanamycin resistenter S. aureus

Ein kanamycinresistenter S. aureus, welcher durch die Selektion von spontanen Mutanten erhalten wurde, wurde zur Auswertung des Effektes von HBV auf drogenresistente Bakterien getestet. Ein Kanamycinresistenter S. aureus war wünschenswert, da etwas Synergie bei diesem Organismus für alle Antibiotika beobachtet werden kann und da die synergistischen Effekte mit Kanamycin am leichtesten gesehen werden können.
Es wurden keine Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen HBV bei den resistenten Stämmen gefunden, wobei die Giftkonzentrationen in den Schachbrettversuchen die gleichen waren wie für den Ausgangsstamm, 0, 2, 4, 8 und 16 ug/ml (Tabellen A-7 bis A-9). Es wurde bemerkt, dass unter identischen Bedingungen die resistenten Stämme eine langsamere Wachstumsrate aufwiesen als die ursprünglichen Stämme, demzufolge ist ein Vergleich der optischen Dichten zwischen Versuchen an zwei verschiedenen Stämmen nicht von Bedeutung.

Kanamycinresistente S. aureus gegen Ampicillin/HBV.

Die Endkonzentrationen der in diesem Schachbrettversuch verwendeten Ampicillin-Konzentrationen waren die gleichen wie für den ursprünglichen S. aureus, 0, 0.05, 0.1, 0.2 und 0.4 ug/ml (Tabelle A-7). Entweder wegen der langsameren Wachstumsgeschwindigkeit oder dem Widerstandfaktor waren die Effekte, welche mit diesem Stamm beobachtet werden konnten nicht vollständig analog wie diejenigen des Elternstammes. Der beste Beweis für die Synergie wurde bei höheren Ampicillin- Konzentrationen als für die ursprünglichen Stämme beobachtet. Wegen der langsameren Wachstumsgeschwindigkeit wurde eine längere Wachstumsperiode in Betracht gezogen. Die Figur 10 zeigt die Wechselwirkung von 2 ug/ml HBV und 0.4 ug/ml Ampicillin. Die statistische Auswertung der Daten zeigt Synergie bei den Zeitpunkten 8, 12 und 24 Stunden.

Kanamycinresistenter S. aureus gegen Kanamycin/HBV

Die Dosierung des für die Reduktion der Wachstumsgeschwindigkeit von Kanamycinresistenten Stämmen von S. aureus erforderliche Kanamycin-Dosis war ungefähr viermal höher als die für den ursprünglichen Stamm erforderliche Dosis. Der Schachbrettversuch lag im Bereich des Kanamycinresistenten S. aureus und war 0, 5, 10, 20 und 40 ug/ml Kanamycin (Tabelle A-8). Wiederum machte es die langsame Wachstumsgeschwindigkeit erforderlich, eine längere Wachstumsperiode in Betracht zu ziehen. Die Kombination von 8 ug/ml Honigbienengift und 10 ug/ml Kanamycin ist in Figur 11 dargestellt. Obschon die verwendete Kanamycin-Dosis zweimal so hoch ist wie die erforderliche Dosis für den ursprünglichen S. aureus, bleibt es in Gegenwart des Honigbienengiftes zweimal so lange wirksam. Synergie wurde nur nach 12 Stunden beobachtet und wurde nur am Zeitpunkt 24 Stunden als signifikant nachgewiesen.

Kanamycinresistenter S. aureus gegen Polymyxin B/HBV.

Es war interessant festzustellen, dass dieser Mutant, welcher für eine verbesserte Resistenz gegen Kanamycin ausgewählt wurde, empfindlicher gegen Polymyxin B wurde als der Ursprungsstamm. Polymyxin B-Dosen, die für den Schachbrettversuch verwendet wurden waren 0, 12.5, 25, 50 und 100 U/ml (Tabelle A-9), während der Polymyxin B-Dosisbereich, welcher für den Test des ursprünglichen Stammes verwendet wurde, zwischen 312 und 2'500 U/ml lag. Figur 12 zeigt kanamycinresistente S. aureus gegen 50 U/ml Polymyxin B und 4 ug/ml HBV. Es wurde Synergie am Zeitpunkt 12 gezeigt.

MIC Tests von Antibiotika mit und ohne HBV

Die Resultate einer Voruntersuchung auf die Wirkung HBV auf die MIC von Antibiotika gegen 8 grampositive Bakterien und 4 gram-negative Bakterien sind in Tabelle 4, bzw. Tabelle 5 gezeigt. Trotz den offensichtlichen Unzulänglichkeiten des Testsystems konnten in den Resultaten der Uebersichtsversuche definitive Tendenzen festgestellt werden. Es bestand eine starke Annahme von Synergie, wo die Beobachtungen innerhalb eines einfachen eines MIC-Versuches zeigten, dass identische Dosen HBV einige MIC beeinflussen, während andere nicht beeinflusst wurden. In Tabellen 4 und 5 wurde ein (+) verwendet um eine Abnahme einer mehr als zweifachen Verdünnung der MIC eines Antibiotikums in Gegenwart von HBV zu zeigen. Ein (-) gibt keinen Unterschied an oder nur eine Variation eines einzelnen Verdünnungsschrittes (beurteilt als Variation des Testes) bei der MIC in Gegenwart von HBV an.
Tabelle 4 zeigt die Resultate von verschiedenen gram-positiven Organismen. Die Resultate geben an, dass Tendenzen innerhalb der geprüften Arten vorlagen. Z.B. scheint S. aureus eine Synergie mit allen Antibiotikum/HBV Kombinationen zu zeigen, während S. epidermidis konsistente synergistische Resultate nur mit der Kombination Cephalothin/HBV zeigte und sporadische Resultate mit anderen Antibiotikum/HBV- Kombinationen. Der eine Streptococcus faecalis Stamm, welcher getestet wurde, reflektierte keine der gleichen synergistischen Tendenzen, welche durch die beiden Staphylococcen Organismen gezeigt wurden. Die Daten in Tabelle 5 listen die Resultate von vier E. coli Stämmen im MIC Testsystem auf. Definitve Muster von Synergie konnten mit jedem der β-Lactam Antibiotikum (Ampicillin, Carbenicillin und Piperacillin) im MIC Testsystem festgestellt werden. Ebenfalls wurden die MIC der Aminonglycoside Gentimicin und Amikacin in jedem Fall mit Ausnahme von einem vermindert. Die MIC von Cefoxitin wurde ebenfalls durch HBV in allen E. coli Tests herabgesetzt.

Melittin Reinigung und Test Chromatographie des Honigbienengiftes

Die Reinigung von Melittin auf Sephadex G-50 gab gut definierte, Basislinien-aufgelöste Peaks. Das Leervolumen war 100 ml und die eluierte Melittinfraktion lag zwischen 100 und 230 ml nach dem Leervolumen. Ungefähr 65 mg der ursprünglichen 100 ml Probe wurde in den Fraktionen 200 bis 230 gefunden. Diese Fraktionen wurden gepoolt und auf Reinheit durch eine Polyacrylamid Gel-Elektrophorese getestet. Figur 13 zeigt die elektrophoretischen Resultate von 100 ug Protein der gepoolten Fraktionen 200 bis 230. Der Vergleich der relativen Mobilität dieser Banden zu den relativen Mobilitäten der elektrophoretisch getrennten HBV-Komponenten, identifizierten Melittin als einzige Komponente der Fraktionen 200-230, welche in dieser Trennung nachweisbar war.

Test von Melittin auf antibakterielle Aktivität

Aequivalente Dosen von Melittin und Voll- Honigbienengift wurden bezüglich der antibakteriellen Aktivität in Kombination mit und ohne Antibiotikum (Tabelle A-10) getestet. Da S. aureu auf HBV mit den verwendeten Konzentrationen in den obigen Tests empfindlich war, wurde dieser Organismus ausgewählt, um die Aktivität der Melittinfraktionen zu testen. Kanamycin wurde zur Auswertung der synergistischen Aktivität der Fraktion ausgewählt, da die Wechselwirkungskurve, welche beim obigen Testen von S. aureus gegen dieses Antibiotikum mit HBV beobachtet wurde, die HBV Synergie in allen Zeitpunkten widerspiegelte.

Antibakterielle Aktivität von Melittin.

Die Resultate von Melittin gegen Voll-HBV sind in der Tabelle 14 dargestellt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der antibakteriellen Aktivität des Voll-HBV und der Melittinfraktion beobachtet. Für jeden Zeitpunkt, welcher in Figur 14 dargestellt ist, sind die optischen Dichten der HBV-Kurve und der Melittinkurve statistisch gleich.

Die synergistische Aktivität von Melittin mit Kanamycin.

Figur 15 vergleicht die antibakteriellen Aktivitäten von äquivalenten Dosen der Melittinfraktion und Voll-HBV-Gift in Kombination mit gleichen Kanamycin-Dosen. Keine der optischen Dichten an irgendeinem Zeitpunkt der beiden Kurven sind signifikant verschieden. Ueberdies ist bei Nichtbeachtung von statistischen Auswertungen die Wechselwirkungskurve, welche die Melittinfraktion repräsentiert, tatsächlich in allen Zeitpunkten etwas tiefer, als die Wechselwirkungskurve, welche das HBV repräsentiert. Demzufolge würden, wenn die Zeitpunkte auf beiden Kurven als wahre Mittel angenommen würden, die Schlussfolgerung sein, dass die Melittinfraktion tatsächlich aktiver ist als Voll-HBV.

Interpretation der Schachbrett-Testresultate

Die Resultate der Schachbrett-Tests demonstrieren klar eine Synergie zwischen Antibiotika und Honigbienengift. Figur 2 erläutert die Effekte von verschiedenen Dosen von Honigbienengift auf S. aureus ohne Antibiotika. Es kann in dieser Figur festgestellt werden, dass die Zugabe von hohen Dosen Gift, wie 8 oder 16 ug/ml zu den wachsenden Kulturen tatsächlich die optische Dichte der Kultur verminderte. Diese Angabe einer Zelllysis ist der Beweis, dass das Honigbienengift tatsächlich bakterizid ist. Die Mechanismen dieser bakteriziden Aktivität und ihr Beitrag zur festgestellten Synergie mit Antibiotika ist nicht bekannt. Die verschiedenen Resultate der Schachbrett- Titrationstests zeigen, dass mehrere verschiedenen synergistische Mechanismen in diesen Experimenten funktionieren können.
Es können die Fragen bezüglich der grossen Standardabweichungen gestellt werden, welche an verschiedenen Zeitpunkten in den Datentabellen festgestellt werden können. Die Variabilität beruht im allgemeinen auf der scharfen Steigerung der Wachstumsrate, wenn die Bakterien in der log-Phase sind. Zeitpunkte, welche in der mid-log Phase genommen werden, besitzen eine viel grössere Differenz in der optischen Dichte bezogen auf die Zeit, als in Zeitpunkten, welche während einer langsameren Wachstumsperiode aufgenommen wurden. Demzufolge können unkontrollierbare kleine Abweichungen bei den Probenahmeintervallen grössere Abweichungen in der Ablesung der optischen Dichte verursachen, bei Zeitpunkten, während dem logarithmischen Wachstum. Da Kulturen während der log-Phase in verschiedene Behandlungsgruppen aufgeteilt werden, werden die Variationen noch stärker zwischen den Experimenten festgestellt. Dieser Fehlertyp wird jedoch im statistischen Auswertungsverfahren in Betracht gezogen. Bei der Verwendung einer grossen Anzahl (15) wurden die Schätzungsbereiche für die Mittelwerte der Zeitpunkte schmal genug gemacht um die Unterschiede dieser Mittelwerte statistisch auszuwerten.
Obschon Melittin nur ursprünglich als synergistische Komponente von HBV in Kombination mit einem Antibiotikum mit einem Bakterienstamm zum Zwecke der Disskusion möglicher Mechanismen getestet wurde, muss angenommen werden, dass Melittin die synergistische Honigbienenkomponente in jeder der getesteten bakteriell antibiotischen-HBV-Kombinationen ist.

Scheinbare zunehmende Dosierung

In den meisten Fällen scheint das Honigbienengift die ursprüngliche Wirksamkeit des Antibiotikums zu verstärken, was durch eine zunehmende Fähigkeit der Verminderung des Bakterienwachstumsgrades unmittelbar nach der Zugabe der beiden Komponenten angezeigt wird. Diese Art der Zusammenwirkung war am besten demonstrierbar mit E. coli gegen HBV und Polymyxin B (Figur 9). Zum ersten Zeitpunkt nach der Zugabe ist Synergie sichtbar und sie wird solange fortgesetzt, bis die Kultur die log-Phase durchschritten hat. Diese Resultate führen zum Schluss, dass niedere nicht wirksame Antibiotikadosen durch die Zugabe von HBV wirksam gemacht werden können.
Der oben beschriebene Verstärkungseffekt der Dosierung ist die Synergieart, welche in den meisten getesteten Versuchskombinationen gesehen wurde. Diese Art von Wirkung könnte durch die Wirkung von Melittin durch mehrere verschiedene Mechanismen erklärt werden: (1) Aenderung der Lösungseigenschaften der Moleküle des Antibiotikums, (2) Erhöhung der Permeabilität der Bakterienmembrane und (3) Erhöhung der Wirksamkeit der Antibiotikummoleküle an ihren aktiven Zentren.

Geänderte Lösungseigenschaften des Antibiotikums.

Das Melittin könnte die antibiotische Wirksamkeit erhöhen, indem es leichter in dies Bakterienzelle transportiert wird. Die direkte Wechselwirkung von Melittin mit Antibiotikummolekülen, welche die Moleküle weniger polar oder hydrophober macht, könnte den passiven Transport durch die bakteriellen Membranen erlauben. Die amphiphatische Natur und die Basizität von Melittin macht es zu einem möglichen Kandidat für eine solche Funktion und fügt die Plausibilität dieses Mechanismus zu. Diese Art von Mechanismus könnte ähnlich sein wie diejenige, welche die Diffusion von Kaliumionen mit Valinomycin erleichtert.

Verbesserte Membranenpermeabilität.

Die scheinbare Dosierung eines Antibiotikums könnte ebenfalls erhöht werden, indem die Permeabilitätsbarrieren des Bakteriums vermindert werden.
Obschon diese Rolle als wegbildendes Peptid leicht gestützt werden könnte, kann es nicht die einzige Funktion von Melittin sein, welche in die antibakterielle Synergie involviert wird. Der erhöhte Transport durch die Membranen kann nicht erklären, warum Melittin allein wirksamer auf gram-positive Organismen ist, welche eine verminderte Membranbarriere besitzen.

Verbesserte antibiotische spezifische Aktivität.

Ein dritter möglicher Mechanismus für die synergistischen Wechselwirkungen schlägt die direkte Wechselwirkung von Melittin und dem Antibiotikum vor, um das Antibiotikum wirksamen zu machen, wenn es einmal das aktive Zentrum erreicht hat. Ein spezifischeres Beispiel ist eine mögliche Wechselwirkung mit Kanamycin. Wenn Kanamycin einmal das 30S Ribosom erreicht hat, kann ein Melittin-Kanamycin-Komplex eine höhere Affinität für das aktive Zentrum aufweisen als das ungefundene Kanamycin (letztendlich ist Melittin ein basisches Molekül wie Nukleinsäuren) oder der Melittin-Kanamycin-Komplex kann wirksamer bei der sterischen Blockierung der Transfer-RNA des Ribosoms sein, einfach wegen der Grösse des Komplexes.

Erhöhtes aktives Leben von Antibiotika

In verschiedenen Fällen war es schwierig, eine Zunahme der Wirksamkeit von Antibiotika durch die Zugabe von Honigbienengift (Melittin) nachzuweisen, bis spät in der Wachstumsperiode. In diesen Fällen schien es, dass Melittin eine Zunahme der Wirkung des Effektes des Antibiotikums bewirkte. Dieser Effekt konnte mit dem kanamycinresistenten S. aureus, welcher mit Kanamycin/HBV behandelt wurde, nicht festgestellt werden. In Figur 9 ist eine verhältnismässig hohe HBV-Dosis gezeigt, die Gründe dafür liegen darin, dass keine Synergie bei tieferen Dosen gesehen werden konnte. Demzufolge-zeigten, obschon es in Figur 9 schwierig ist Synergie bei früheren Zeitpunkten wegen der Wirkungslosigkeit von HBV allein auszumachen, tiefere Dosen von HBV keine Synergie mit Kanamycin an diesen früheren Zeitpunkten. Ein synergistischer Effekt wird jedoch am 24 Stunden Zeitpunkt festgestellt. Zwei Erklärungen für diese Art eines aufgeschobenen Effektes werden vorgeschlagen: (1) Eliminierung von resistenten Mutanten oder (2) Ausdehnung der Halbwertszeit des Antibiotikums.

Abnehmende Wahrscheinlichkeit für die Selektion von resistenten Stämmen.

Wenn sowohl das Honigbienengift als auch das Antibiotikum in einer bakteriellen Kultur in bakteristatischen Dosen vorhanden ist, ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein resistentes Bakterium die kombinierte Behandlung überleben wird, gleich dem Produkt der Wahrscheinlichkeiten, dass eines existieren würde und beide Behandlungen überleben würde. Dies würde als verschobener synergistischer Effekt in Erscheinung treten, so wie viele Generationen von Mutanten erforderlich wären, um sich in einem durch OD-Ablesungen nachweisbaren Grad zu multiplizieren. Die Mutantenselektion würde als sporadisches Vorkommen von drastisch höheren OD-Ablesungen unter Replikatproben vorkommen, was durch die Standardabweichung der Behandlung widergespiegelt würde. Z.B, wenn die Wirkungen einer HBV-Behandlung allein am kanamycinresistenten S. aureus mit Kanamycin ausgewertet wurde, betrug die mittlere OD des 12 Stunden Punktes auf der Giftkontrollkurve 0.65 mit einer Standardabweichung von 0.51 (Tabelle A-8), was auf stark verschiedene Ablesungen an diesem Zeitpunkt hinwies. Dezufolge könnte es möglich sein, dass der synergistische Effekt, welcher hier am 24 Stunden Punkt festgestellt wurde, das Resultat einer Unterdrückung der HBV-giftresistenten Mutanten ist.

Zunehmende Antibiotikastabilität.

Ein möglicher Mechanismus eines Schutzes des Antibiotikums vor Zersetzung kann nicht ausgeschlossen werden. Eine gewöhnliche Technik zur Erhöhung der Wirksamkeit von Antibiotika ist die strukturelle Aenderung des Antibiotikums, um es in Lösung stabiler oder resistenter gegen enzymatische Angriffe zu machen. Diesen Arten von Aenderungen wurde bei vielen Derivaten der Penicillinfamilie der Antibiotika Rechnung getragen. Beispielsweise besitzt Penicillin V eine Phenoxymethylsubstitution, was eine sterische Hinderung bewirkt, welche den β-Lactamring des Antibiotikum vor einem enzymatischen Angriff schützt (Volk, 1978c) . Solche Substitutionen können ebenfalls dieses Ende des Moleküls vor einer Cyklisierung mit dem Lactamring schützen, was das Molekül widerstandsfähiger gegen saure Hydrolysen macht. Diese Arten von Aenderungen könnten einen synergistischen Effekt bewirken, welcher nur bei bakteriostatischen Dosen nachweisbar ist, da das Antibiotikum ursprünglich nicht wirksamer sein könnte und die verlängerte Lebensspanne des Antibiotikums wäre nur nachweisbar, wenn die bakterielle Kultur nicht eine durch die Nahrung begrenzte OD zu dieser Zeit erreichen würde. Wenn jedoch das HBV eine solche Aenderung verursachen könnte, müssten beständigere Resultate bei den Wiederholungsproben erwartet werden.

Auswertung des MIC-Tests

Der Schachbrett-Titrationsversuch, welcher zum Testen der HBV/Antibiotikumsynergie entwickelt wurde, war zeitintensiv um ihn in einer breiten Untersuchung der Wirkung von HBV auf verschiedene Antibiotika und verschiedene Bakterien anzuwenden. Eine solche Untersuchung war jedoch erforderlich um die Tendenzen unter den antibiotischen Klassen gegen die Synergie mit HBV festzustellen, ebenso um das Empfindlichkeitsspektrum unter den Bakterienarten gegen spezifische synergistische Kombinationen von Antibiotika und HBV zu bestimmen. Die Modifikation der automatisierten MIC-Tests wurde vorgenommen um diese Art von Untersuchungen zu erleichtern.
Wegen der Begrenzungen des automatischen MIC-Tests war die Auswertung der Resultate etwas empirisch. Die Resultate können nicht als synergistisch im Gegensatz zu additiven Wechselwirkungen nachgewiesen werden, da der Effekt von HBV allein nur als hemmend oder nicht hemmend aufgezeichnet wurde (schwach hemmende Dosen von HBV wären als nicht hemmend aufgezeichnet worden, wobei eine Zunahme der MIC tatsächlich das Resultat eines additiven Effektes sein könnte). In den meisten Tests zeigten jedoch nur gewisse Antibiotika eine abnehmende MIC, was darauf hinweist, dass die HBV- Dosis nicht additiv war. Demzufolge sollte bei Stützung der Resultate des Schachbrett-Titrationssystems die Verwendung dieser MIC-Tests in zuverlässiger Weise darauf hinweisen, welche Antibiotikum/HBV-Kombinationen das grösste Potential für spezifische Gruppen von Bakterien aufweisen. In dieser Hinsicht wird die MIC für die direkte künftige Forschung verwendet.

Identifikation der aktiven Honigbienengiftkomponente

Obschon die Resultate dieser Studien vorschlagen, dass die synergistischen Aktivitäten des Honigbienengiftes vollständig in der Melittinfraktion enthalten sind, sollten diese Resultate vorsichtig interpretiert werden. Es ist möglich, dass kleine Peptide oder nicht färbende (Coomassie-Blau) Verbindungen mit dem Melittin in der Chromatographie co-migrieren, wegen den ionischen und hydrophoben Wechselwirkungen mit den Melittinmolekülen. Melittin wandert als Aggregat, welches fünfmal das normale Molekulargewicht aufweist, sowohl in der nativen Polyacrylamid Gel-Elektrophorese wie auch in der Sephade Gelchromatographie (Haberman, 1972). Diese kleinen Micellen könnten kleinere hydrophobe Verbindungen durch die Chromatographie tragen. Analysen zum Nachweis solcher Kontaminationstypen in der Melittinfraktion sind ebenfalls eingeschlossen und werden im Kapitel 6 diskutiert.
Wie oben angemerkt, wurden zusätzliche Tests durchgeführt um zu zeigen, dass HBV ebenfalls wirksam ist zur Erhöhung der Aktivität der vierten Antibiotikagruppe, auf welche oben Bezug genommen wird, welche durch Rifampicin repräsentiert wird. Die Daten sind in den Tabellen 6, 7 und in den Figuren 16, 17, dargestellt.
Die Aktivität des Hymenopteragiftes und andere als HBV wurden ebenfalls bestimmt für das Hummelgift, das Wespengift und das Hornissengift (bald faced hornet venom) wie in den Tabellen 8, 9 und in den Figuren 18 und 20 angegeben.
Es wurden ebenfalls einige der oben erwähnten Analoge getestet, um ihre relativen Aktivitäten bezüglich des nativen Melittins zu bestimmen. Die relative Aktivität wird wie folgt berechnet:
Melittin-Dosis/Analogendosis, welche erforderlich ist um die äquivalente Synergie mit Polymyxin B zu zeigen x 100
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 10 dargestellt.
Es scheint, dass Analoge, in welchen das NH&sub2;- terminale Ende vorwiegend aus basischen Aminosäuren besteht, aktiver sind als Analoge, welche ein NH&sub2;-terminales Ende besitzen und vorwiegend aus neutralen und/oder sauren Aminosäuren bestehen.

In vivo Experiment

Einführung

In vivo Experimente zeigen, dass Melittin, das Hauptpeptid des Honigbienengiftes, die Wirksamkeit eines geprüften Antibiotikums, Polymyxin B, erhöht. Als Krankheitsmodell wurde die bakterielle Sepsis in Mäusen entwickelt. Für die Experimente werden Aktivitäten von Polymycin B und Melittin separat und in Kombination gegen eine E. coli-septikämie in zwei grundlegenden Versuchssätzen verglichen. Bei beiden Versuchanordnungen ist eine synergistische Wechselwirkung zwischen Melittin und Polymyxin B offensichtlich und wird statistisch durch einen Gegensatz der Behandlungsmittel in jeder Unterschiedsanalyse bestätigt. Demzufolge wird die Fähigkeit von Melittin, die Wirksamkeit von Polymyxin B zu verbessern und in vivo eine antibakterielle Aktivität zu erhalten, klar demonstriert. Zahlreiche Zitate der oben im Abschnitt mit dem Titel Hintergrund und Stand der Technik zitierten Literatur, umfassen die Verwendung des Honigbienengiftes und insbesondere Melittin als antimikrobielles Mittel. Diese Literaturzitate demonstrieren jedoch nur die in vitro Wirksamkeit des Honigbienengiftes oder von Melittin.
Verschiedene andere Systeme haben ebenfalls Gebrauch von Melittin als künstliches Mittel zur Störung von verschiedenen Immunantworten in in vitro- Isolatsystemen gemacht. Goodman et al. (1984) schilderte die B Zellenaktivierung durch Melittin in vitro. Zwei weitere Berichte einer von Kondo und Kanai (1986) und einer von Kondo (1986), beschreiben die in vitro Verwendung von Melittin zur Stimulation der bakteriziden Aktivität von aus Phagozyten isolierten Membranen sowohl von Mäusen wie auch von Meerschweinchen. Letztlich beschreibt eine Publikation (Somerfield et al. 1986), welche sich auf die Wirkung des Honigbienengiftes auf das Immunsystem bezieht, die Hemmung der Neutrophil O Produktion durch Melittin. Somerfield et al. schlagen eine Rolle für Melittin als entzündungshemmendes Mittel vor. Diese Aktivität würde am wahrscheinlichsten die antibakterielle Verteidigung in vivo anregen.
Trotz der wesentlichen Menge von Forschungsarbeiten mit Melittin konnte bisher noch nicht demonstriert werden, dass Melittin in vivo gegen infektiöse Organismen aktiv ist. Wichtig ist, dass niemand den Bedarf für, oder den Nutzen der Wechselwirkung von Melittin vorgeschlagen hat. Die hier geschilderten Resultate demonstrieren die günstigen Wechselwirkungen zwischen Melittin und Polymyxin B, wenn sie in vivo zur Behandlung von Mäusen verwendet werden, welche unter einer bakteriellen Blutvergiftung leiden, welche durch E. coli bewirkt wurde.

Material und Methode

Weibliche Swiss CD-1 Mäuse (Charles River) wurden mit einem Gewicht von 18 bis 20 Gramm erhalten. Die Mäuse wurden bei 77 +/-1 Grad Fahreinheit und 30-45% relativen Feuchtigkeit mit einer täglichen Lichtperiode von 12 Stunden gehalten. Nach dem Eintreffen wurde jede Mäuselieferung während einer zwei Wochen-Akklimatisierungsperiode vor ihrem Gebrauch im Experiment gehalten.
Polymyxin B (Sigma Chemical Company) wurde in Pulverform mit einer Aktivität von 7900 Einheiten/mg eingekauft. Es wurde eine Vorratslösung von 0.1 mg/ml in 0.85% NaCl hergestellt und auf -20ºC in 5 ml Aliquoten bis zu ihrem Gebrauch eingefroren.
Das Honigbienengift (HBV) wurde durch die Vespa Laboratories, Inc., Spring Mills, PA, zur Verfügung gestellt.Das HBV war die Quelle für Melittin, welches unter Verwendung der Gelfiltration, wie sie oben für die in vitro Experimente beschrieben ist, isoliert wurde. Melittin wurde quantitativ durch den Lowry Proteintest (Lowry et al. 1951) quantitativ gewonnen und dann gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Melittin wurde in 0.85% NaCl auf eine Konzentration von 0.1 mg/ml rekonstituiert und auf -20ºC in 1.5 ml Aliquotenanteile bis zum weiteren Gebrauch eingefroren.
Der E. coli Stamm Nr. #G1108E wurde vom E. coli Referenzzentrum der Pennsylvania State University, Uiversity Park, PA. erhalten. Eine über Nacht-5.0 ml- Trypticase Sojabrühenkultur wurde zur Inokulation von 800 ml frischer Trypticase Sojabrühe verwendet. Die Kultur wurde über Nacht unter schwachem Schütteln vermehrt. 200 ml steriles Glycerin wurde zur Kultur zugegeben und wurde dann unter Rühren aseptisch in 5.0 ml Aliquoteanteile verteilt. Diese Aliquoten wurden gefroren und bei -20ºC aufbewahrt. Nach dem Auftauen enthielt jedes Aliquot (+/-3) x 10&sup8; lebensfähige Bakterien/ml. Die Kultur wurde dann 1:400 mit Trypticase Sojabrühe, welche 2.5% gastrisches Mucin (Sigma Chemical Company) enthielt vor der Inokulation verdünnt.
Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von 0.25 ml der 1:400 Verdünnung der Bakterien (ungefähr 500'000 lebensfähgie Bakterien), welche in Trypticase Sojabrühe mit 2.5 % Mucin suspendiert waren, infiziert.
Vor der Injektion wurden Polymyxin B und Melittin aufgetaut, filtersterilisiert und zweckmässigerweise mit 0.85% NaCl verdünnt, auf solche Weise, dass die erforderliche Dosis in 0.2 ml Lösung enthalten war. 30 Minuten nach der Infektion wurde dieses Volumen dann den Mäusen durch subcutane Injektion in die Hautfalte an der Nackenbasis verabreicht. Die Hautfalte wird zwischen Daumen und Zeigfinger bei einem grundlegenden bewegungseinschränkenden Griff gebildet.
Die Bakterienniveaus im Blut wurden aus Blutproben bestimmt, welche durch eine aseptische Herzpunktuation erhalten wurden. Nach der Herzpunktuation wurde die Nadel von der heparinbeschichteten Spritze entfernt und 0.2 ml Blut wurde in ein Röhrchen, welches 0.2 ml 0.85 % NaCl enthielt, gegeben und gut gemischt. Alle Proben wurden auf Eis aufbewart bis zur Auftragung. Je zwei Verteilungsplatten für alle Proben mit zweckmässigen Verdünnungen wurden mit Trypticaseojaagar vorbereitet und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Alle Platten, welche weniger als 400 Kolonien enthielten, wurden gezählt und aufgezeichnet.

Resultate

In der ersten experimentellen Anordnung wurden 4 zufällige Gruppen von 4 Mäusen mit E. coli wie oben beschrieben inokuliert. 30 Minuten später wurden die vier Mäuse jeder Gruppe je mit 0.2 ml 0.85 % NaCl Lösung behandelt, welches eines des Folgenden entielt: 1) 0.85 % NaCl allein ("keine Behandlung"); 2) 2.0 ug Polymyxin B; 3) 50 ng Melittin; oder 4) 2.0 ug Polymyxin B + 50 ng Melittin. Einundzwanzig Stunden nach der ursprünglichen Inokulation wurden Blutproben genommen und die Bakterienzahl pro ml Blut wurde berechnet, indem die Resultate der zweifachen Plattenzahlen der entsprechenden Blutverdünnung (Tabelle A-11) gemittelt wurden. Dieses Experiment wurde dreifach durchgeführt und die mittlere Bakterienzahl pro ml Blut wurde für jede der vier Behandlungen verglichen (Figur 21). Ein p-Wert von 0.0015 für den Behandlungseffekt in einer Zweiweg-Varianz (angepasst an ungleiche Probengrössen) gab einen signifikanten Unterschied bei mindestens einer der Behandlungsmittel an. Der mehrfache Mittelvergleich nach Tukey zeigte, dass das einzige Mittel, welches signifikant verschieden war, das Mittel der Gruppe war, welches die Kombination von 2 ug Polymyxin B und 50 ng Melittin erhielt. Der Vergleich der Summe der Aktivitäten, welche durch Melittin und Polymyxin individuell verwendet erhalten wurden, mit ihrer Aktivität, wenn sie in Kombination verwendet wurde, bestätigte durch einen Gegensatz in der Unterschiedsanalyse, dass die Wechselwirkung tatsächlich synergistisch war (p-Wert = 0.0493).
Eine zweite Versuchsanordnung testete den Effekt von wiederholten Behandlungen. Wiederum wurden vier Gruppen, welche vier Mäuse enthielten, mit E. coli inokuliert und 30 Minuten später den gleichen vier Behandlungen unterzogen: 1) 0.85 % NaCl allein ("keine Behandlung"); 2) 2.0 ug Polymyxin B; 3) 50 ng melittin; oder 4) 2.0 ug Polymyxin B + 50 ng Melittin. Achzehn Stunden nach der ursprünglichen Infektion wurde jede Maus wiederum mit dem gleichen E. coli Inokulum herausgefordert und 30 Minuten später der gleichen Antibiotikum/Mellitin-Behandlung unterzogen. Fünf Stunden später (23 Stunden nach der ursprünglichen Infektion) wurden Blutproben von jeder Maus aufgetragen um die Bakterienzahl im Blut festzustellen. Diese Experiment wurde fünfmal wiederholt und die Resultate (Tabelle A-12) wurden durche eine Varianzanalyse ausgewertet. Diese Analysen zeigten, dass ein signifikanter Unterschied (p-Wert = 0.001) in mindestens einer Behandlung vorhanden war. Der mehrfache Mittelvergleich nach Tukey zeigte, dass wiederholte Polymyxin B Behandlungen eine signifikante Abnahme der Bakterienzahl pro Milliliter Blut bewirkten. Wichtiger noch zeigte der Vergleich nach Tukey, dass die Bakterienzahlen im Blut der Tiere, welche mit Polymyxin B plus Melittin behandelt wurden, signifikant kleiner waren als die Anzahl im Blut von Tieren, welche nur mit Polymyxin B oder Melittin behandelt wurden (vergleiche Figur 22). Ein Gegensatz innerhalb der Varianzanalyse weist auf einen hohen Vertrauensgrad für die Synergie dieser beiden Verbindungen hin (p-Wert = 0.0007).

Folgerungen

Die obigen Experimente zeigen klar eine synergistische Wechselwirkungen zwischen dem Antibiotikum Polymyxin B und Melittin. Es ist hochgradig wahrscheinlich, das Melittin die therapeutischen Effekte von anderen pharmazeutischen Mitteln wegen seiner antimikrobiellen Eigenschaften und seiner Eigenschaft der Erhöhung der Membranpermeabilität erhöht.
Den Resultaten des ersten Versuchssatzes (Figur 21) fehlte der statistische Nachweis für den Effekt von Melittin allein, jedoch Vergleiche der absoluten Mittel führen zur Folgerung der positiven Effekte mit der Melittinbehandlung allein. Den Resultaten des zweiten Versuchsatzes (Figur 22) fehlte wiederum ein signifikanter Unterschied für die Behandlung mit Melittin allein. Ein Vergleich der absoluten Behandlungsmittel führt zum Schluss eines negativen Effektes von Melittin allein. In Erinnerung, dass die Mäuse im zweiten Versuchsatz doppelte Melittin-Dosen erhielten, führt dies zum Schluss, dass die höheren Melittindosen, wenn sie ohne Antibiotika verwendet wurden, den infektiösen Prozess verschlimmern könnten. Frühere Versuche mit höheren Melittin-Dosen verifizieren diese Annahme. Es ist wahrscheinlich, dass die gesundheitsschädliche Aktivität vorhanden ist, wenn Melittin allein verwendet wird. Es ist wichtig, dass die effektive Verwendung von Melittin zur Behandlung von Infektionen in einer Literauturrecherche nicht gefunden wurde. Antibiotika kontern offensichtlich die negativen Effekte von Melittin und machen demzufolge die kombinierte Therapie zu einer signifikanten Entwicklung.

Antibiotische Synergie demonstriert mit einem synthetischen Melittinanalogen

Die Synergie, welche zwischen Antibiotika und Melittin festgestellt wurde, kann erzielt werden, indem Melittin durch synthetische Peptidanaloge ersetzt wird. Solche Analoge wurden zu diesem Zweck entwickelt und synthetisiert. Bei Paralleltesten mit natürlichem Melittin wird eine äquivalente antibiotische Verbesserung erzielt.

Einleitung

Das Analoge 6, mit der nachstehend angeführten Struktur
wurde vorgängig in vitro auf Synergie mit Polymyxin B gegen E. coli getestet. Dieses Peptid variert von Melittin bei den Aminosäuren 22 und 24 (unterstrichen) wo die Arginine mit Lysinen ersetzt wurde. Bei der Verwendung in der vorerwähnten Tests zeigte es eine dem natürlichen Melittin äquivalente Aktivität.

Materialien und Methoden

Melittin wurden von Voll-Honigbienengift (Vespa Laboratories, Inc.) durch Gelchromatographie isoliert, durch den Lowry-Protein Test quantifiziert und gefriergetrocknet aufbewahrt. Für diese Tests wurde lyophilisiertes Melittin auf 0.4 mg/ml mit destilliertem Wasser rekonstituiert, filtersterilisiert und in 4.0 ml Aliquoten bei -20ºC aufbewahrt bis zum Gebrauch.
Das Analoge Nr. 6 wurde von Dr. Torben Saermark synthetisiert (Proteinlabor, Universität von Kopenhagen, Sigurdsgade 34, DK-2200 Kopenhagen N, Dänemark) . Es wurde bestimmt, dass es besser war als 98% rein auf Basis des Elutionsprofils einer Hochdruckflüssigchromatographie auf einer C18 Säule, wobei ein 0-80 % Acetonitrilgradient in 0.1% Trifluoracetat verwendet wurde. Das Peptid wurde in lyophilisierter Form erhalten und wurde auf ungefähr 0.2 mg/ml in 0.85 % NaCl rekonstituiert, filtersterilisiert und in 0.5 ml Aliquoten bei -20ºC aufbewahrt, bevor es gebraucht wurde.
Polymyxin B (Sigma Chemical Company) mit einer spezifischen Aktivität von 7900 Einheiten/mg wurde auf 240 Einheiten/ml destilliertem Wasser rekonstituiert, filtersterilisiert und in 4.0 ml Aliquoten bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Der E. Coli Stamm #G1108E wurde von der Pennsylvania State University E. Coli Reference Center (105 Henning Building, University Park, Pennylvania, 16802) erhalten. Die Inokulum wurden aus einer Kultur hergestellt, welche in Trypticase Sojabrühe zur mid-log Phase gezüchtet wurde. Steriles Glycerin wurde zugefügt um eine Endkonzentration von 20 % herzustellen und die Kultur wurde verteilt und in 5.0 ml Aliquoten bis -20ºC eingefroren bis zum Gebrauch.
Ein Schachbrett-Titrationssynergietest wurde durchgeführt, wobei natürliches Melittin und Analag #6 parallel mit Polymyxin B gegen E. coli getestet wurde. Aequivalente Dosen des natürlichen Melittins und des Analogen #6 basierten auf einem Lowry Proteintest, welcher simultan mit Aliquoten von jedem nach der letzten Filtration durchgeführt wurden. Beide Peptide wurden im Synergietest bei Endkonzentrationen im Medium von 5 ug/ml und 10 ug/ml getestet. Das Polymyxin B wurde in finalen Mediumskonzentrationen von 3 Einheiten/ml und 6 Einheiten/ml gegen beide Konzentrationen von beiden Peptiden gesteste.

Resultate

Die Synergie wurde am besten sowohl mit dem natürlichen Melittin als auch mit dem analogen #6 nachgewiesen, wenn sie bei 10 ug/ml gegen #6 Einheiten/ml Polymyxin getestet wurden (Tabelle 11). Unter diesen Bedingungen (vergleiche Figur 23) wurden die Daten jedes Peptides statistisch auf synergistische Aktivitäten an jedem Zeitpunkt analysiert. Unter Verwendung von statistischen Gegensätzen wurden die mittleren Aktivitäten jedes Peptides allein und Polymyxin B allein mit der Aktivität der entsprechenden Peptid-Polymyxin B- Kombination verglichen. Synergie wurde nachgewiesen bei den Zeitpunkten bei 4, 6 und 8 Stunden, sowohl für Melittin und das Analoge #6 (p-Werte = 0.0001).
Zusätzlich wurden die Synergiekurven für Melittin (10 ug Melittin + 6 Einheiten Polymyxin B) und das Analoge #6 (10 ug Analog #6 + 6 Einheiten Polymyxin B) bei jedem Zeitpunkt auf verschiedene Aktivitätsstufen verglichen. Zu keinem Zeitpunkt konnte zwischen den beiden Kurven ein signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Folgerungen

Die Resultate zeigen, dass das Analoge #6 ein synthetisches Melittinanaloges, eine sehr ähnliche Aktivität besitzt wie Melittin bezüglich der Kapazität der Verbesserung von Polymyxin B. Obschon der Zeitpunkt bei 12 Stunden zum Schluss führt, dass das Analoge #6 eine leicht bessere Aktivität mit Polymyxin B aufweist als Melittin, ist dieser Aktivitätsunterschied minimal im Hinblick auf die verwendeten Mengenunterschiede in den untersuchten Peptiden. Durch Vergleich des Synergieunterschiedes, welcher durch 10 ug Melittin gegen 10 ug Analog #6 erzeugt wurde, zum Synergieunterschied, welcher durch 10 ug Melittin gegen 5 ug Melittin (Tabelle 11) erzeugt wurde, wurde festgestellt, dass der Unterschied zwischen den spezifischen Aktivitäten von Melittin gegen Analog #6 weniger als 10% betrug. Diese Forschungsarbeiten zeigten, dass es möglich ist, Melittinanaloge mit synergistischen Fähigkeiten zu synthetisieren, welche gleich oder besser als Melittin sind.

Synergistische antibakterielle Aktivität von Melittin und Polymyxin B: Relative Aktivitäten von Melittinanalogen

Die Synergie, welche zwischen Antibiotika und Melittin festgestellt wurde, kann ebenfalls erzielt werden, indem Melittin entweder durch synthetische Analoge oder chemische modifizierte Derivate des natürlichen Peptides ersetzt wird. Synethisches Melittin, fünf synthetische Peptidanaloge und eine chemische Modifikation des natürlichen Melittin wurden durch synergistische Wechselwirkung mit Polymyxin B bezüglich der Wachstumshemmung von E. coli getestet. Ihre relativen Aktivitäten wurden mit denjenigen von Melittin von natürlichem Honigbienengift verglichen. Jedes Peptid demonstrierte eine synergistische Wechselwirkung mit Polymyxin B. Die spezifischen Aktivitäten unterschieden sich jedoch signifikant. Verschiedene Analoge zeigten eine synergistische Aktivität, welche derjenigen von natürlichem Melittin überlegen war.

Einführung

Zwei Typen von Melittinanalogen, synthetische peptide und eine chemische Modifikation von natürlichem Melittin wurden in vitro auf Synergie mit Polymyxin B in einem antibakteriellen Aktivitätstest getestet. Die synthetischen Analogen umfassen eine Gruppen von synthetischen Peptiden, wovon sich sämtliche von den 26 Aminosäuren der Melittinsequenz durch zwei oder mehrere Reste unterscheiden. Die chemische Modifikation von Melittin, NPS-Melittin, besteht aus einem Ansetzen einer -Nitrophenylsulfenylgruppe zur Nummer 19 des Tryptophanrests von natürlichem Melittin. Die Aktivität jedes dieser Analogen wurde mit den Aktivitäten von natürlichem und synthetischem Melittin verglichen. Während jedes dieser Analoge in vitro eine gewisse synthetische Wechselwirkung mit Polymyxin B zeigte, waren signifikante Unterschiede in den Peptidaktivitäten offensichtlich. Diese Unterschiede definieren die Schlüsseleigenschaften des Melittininoleküles in seiner Rolle als Verstärkungsmittel für die Polymyxin B-Aktivität.

Materialien und Methoden

Natürliches Melittin wurde aus Voll-Honigbienengift (Vespa Laboratories, Inc.) durch Gelfiltrationschromatographie isoliert, durch den Lowry-Proteintest quantifiziert und gefriergetrocknet aufbewahrt. Für diese Tests wurde gefriergetrocknetes Melittin auf 0.34 mg/ml mit destilliertem Wasser rekonstituiert, filtersterilisiert und in 4.0 ml Aliquoten bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.
NPS-Melittin wurde aus natürlichem Melittin durch Umsetzen des Peptides mit -Nitrophenylsulfenylchlorid (NPS-Cl) synthetisiert, wie es für Adrenocorticotropin durch Ramachandran et al. beschrieben wurde. Das Peptid wurde aus einer Lösung mit Ethylacetat ausgefällt, in 0.1 N Essigsäure resuspendiert und dann durch eine Sephadex G-10 (LKB-Pharmacia, Piscataway N.J.) Säule durchtreten gelassen um die verbleibenden NPS-Cl Salze zu entfernen. Eine Bestimmung der Molekularabsorbtion des Derivates bei 365 nm zeigte, dass mehr als 95 % des Melittin modifiziert wurden.
Das synthetische Melittin wurde von Peninsula Laboratories, Belmont, Ca. bezogen. Eine 0.5 mg Probe wurde auf 0.3 mg/ml in 0.85% Salzlösung auf Basis eines Lowry-Protein Versuches rekonstituiert. Diese Probe wurde bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Synthetische Analoge wurden durch Dr. Torben Seamark (Proteinlabor Universität von Kopenhagen, Sigurdsgade 34, DK-2200 Kopenhaben N, Dänemark) synthetisiert. Jedes Analage wurde auf die Reinheit getestet und wurde als besser als 98 % rein befunden, auf Basis des Elutionsprofiles der Chromatographie aus einer C-18 Säule, wobei ein 0-100 % Acetonitril-Gradient verwendet wurde. Jedes Peptid wurde in lyophilisierter Form erhalten und wurde auf ungefähr 1,0 mg/ml in 0.85 % NaCl rekonstituiert, filtersterilisiert und in 1.8 ml Aliquoten bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt. Jede Peptidlösung wurde durch den Lowryroteintest vor dem Gebrauch quantitativ bestimmt. Die Lowry-Resultate stimmten gut mit den Konzentrationsabschätzungen auf Basis des Trockengewichtes des Peptides überein.
Polymyxin B (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) mit einer spezifischen Aktivität von 7'900 Einheiten/mg wurde auf 240 Einheiten/mg in 0.85 % Kochsalz rekonstituiert, filtersterilisiert und in 4.0 ml Aliquoten bie -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.
E. coli G1108E wurde vom Pennsylvania State University E. coli Reference Center (105 Henning Building, University Park, Pa. 16802) erhalten. Die Inokula wurden von einer Kultur erhalten, welche in Trypticase Sojabohnenbrühe bis zur mid-log Phase gezüchtet wurde. Das sterile Glycerin wurde zur Kultur zu einer Endkonzentration von 20% zugegeben und in 5.0 ml Aliquote verteilt und bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt. Ein Schachbrett-Titrationssynergietest wurde durchgeführt, um jedes Peptid mit Polymyxin B gegen E. coli parallel mit Melittin zu testen. Aequivalente Dosen von natürlichem Melittin und jedem Analogen basierten auf dem Lowry-Proteintest, welcher mit Aliquoten jedes Peptides nach einer letzten Filtration der Vorratslösung durchgeführt wird. Alle Peptide wurden durch den Synergietest mit Endkonzentrationen im Medium von 5 ug/ml getestet. Die Konzentration von Polymyxin B im Medium aller Tests betrug 6 Einheiten/ml

Resultate

Tabelle 12 zeigt die Aminosäulesequenzen von synthetischen Melittinanalogen. Für jede synthetische Analoge waren die ersten zwanzig N-terminalen Aminosäuren die gleichen wie bei natürlichem Melittin. Aenderungen kamen in den sechs C-terminalen Aminosäuren vor, und wurden durch Fettdruck gekennzeichnet.
Tabelle 13 enthält die Ablesungen der Wachstumskurve für jede der getesteten Verbindung auf synergistische Wechselwirkung mit Polymyxin B. Der Wert für jeden Zeitpunkt stellt der mittlere und der Standardfehler des Mittels von sechs Proben dar. Die "Kontroll"-Kurve stellt das Wachstum der Kultur ohne Polymyxin B- oder Peptidzugabe dar. Die Wirkung jedes Peptides allein auf die Kultur ist in der Tabelle nicht eingeschlossen. Diese Peptide besitzen jedoch, wie Melittin, keine Wirkung auf das Wachstum von E. coli, wenn sie allein mit 10 ug/ml oder weniger verwendet wurden. Demzufolge ist die "Kontrolle" ebenfalls eine Repräsentation der Kultur, wenn sie mit jedem Peptid allein behandelt wurde.
Wenn die Wachstumskurve von bakteriellen Kulturen, die nur mit Polymyxin B (6 Einheiten/ml) behandelt wurden, mit der Kurve von Kulturen verglichen wird, welche mit Polymyxin B Plus Melittin (5 ug/ml) behandelt wurde, wird eine erhöhte antibakterielle Aktivität gezeigt, wie eine Zunahme der erforderlichen Zeit, damit die Kultur die Behandlung überwindet und zur Erreichung des log-Phasenwachstums (Figur 24). Da die Behandlung der Kultur mit Melittin allein mit 5 ug/ml eine Wachstumskurve produzieren würde, welche im wesentlichen die "Kontroll"-Kurve überlagern würde, ist eine Zeitzunahme, welche für die Kultur erforderlich ist um der Polymyxid B-Hemmung zu entweichen und die mid-log-Phase in Gegenwart des Peptides zu erreichen, der Beweis für die synergistische Aktivität des Peptides. Demzufolge ist eine Verschiebung der Wachstumskurve, welche Polymyxin B mit Peptid präsentiert, nach rechts der Kurve, die die Behandlung mit Polymyxid B allein darstellt, der Beweis für die Synergie.
Das Verhältnis von Polymyxiden B zu Melittin zu Bakterien in diesen Versuchen wurde so festgelegt, um eine minimale Synergie zu erzeugen, damit die erhöhte Aktivität der Peptidanaloge offensichtlich wird. Solche Zunahmen sind ersichtlich in Figur 24, sowohl für synthetisches Melittin wie auch für NPS-Melittin. Alle Peptide wiesen gleiche Konzentrationen auf und wurden durch den Lowry-Test bestimmt.
Aehnliche Wachstumskurven, welche die synergistischen Aktivitäten von synthetischen Melittinanalogen mit Polymyxin B bestimmen, sind in Figur 25 gezeigt.
Um die Unterschiede der Melittin/Analogensynergie mit Polymyxin B klarer darzustellen, wurden die Figuren 24 und 25 verwendet um die zusätzlich abgelaufene Zeit zu berechnen, bis jede Wachstumskurve die mid-log Phase erreichte, aufgrund der Addition von Melittin oder Analogen, im Vergleich mit der Behandlung mit Polymyxin B allein. Diese Werte sind in einem Balkendiagramm in Figur 26 dargestellt. Ein Tukey Bereichstest wurde mit den Daten in Tabelle 13 durchgeführt, um die erhaltenen Ablesungen bei jedem Zeitpunkt zwischen den verschiedenen Behandlungen zu vergleichen. Die Peptide wurden dann in Abhängigkeit ihrer Fähigkeit wesentlich verschiedene Stufen der Wachstumshemmung (α = 0.05) für mindestens die Zeitpunkte einer Wachstumskurve zu zeigen, gruppiert. Diese Gruppierungen wurden durch verschiedene Markierungen in Figur 26 bezeichnet.

Folgerungen

Diese Resultate zeigen, dass eine Anzahl von Melittinanalogen erhalten werden kann sowohl durch Aminosäuresubstitutionen als auch durch chemische Modifikationen. Diese Typen von Modifikationen können entweder die peptidbezogene synergistische Aktivität erhöhen oder vermindern. Auf Basis von Figur 26 können die relativen in vitro Aktivitäten von Melittin und seinen Analogen in aufsteigender Ordnung wie folgt angegeben werden:
1 Analog #7 A
2 natürliches Melittin B
3 NPS-Melittin C
4 Analog #6 C
5 synthetisches Melittin C
6 Analog #2 C
7 Analog #4 D
8 Analog #4 D
Peptide mit signifikant verschiedenen (α = 0.05) synergistischen Aktivitäten auf der 5 ug/ml Stufe werden durch Buchstabengruppen bezeichnet.
Es sollte beachtet werden, dass der Parameter, welcher für die Erstellung der Wirkungskraft verwendet wurde, die Zeit bis zur mid-log Phase der Kultur verschiebt, stöchiometrisch mit der Menge des Peptides nur über einen engen Bereich von Melittinzunahme zunimmt. Da die Grenzen des linearen Bereiches für jedes Analoge nicht äquivalent sein können, können die hier dargelegten Daten nur zur Bestimmung der relativen Wirkungsordnung dieser Peptide bei vorgegebenen Konzentrationen verwendet werden und können nicht verwendet werden, um quantitative Unterschiede abzuschätzen. Diese Wirkungsordnung lässt jedoch nicht den Schluss zu, dass die synergistische Aktivität der Peptide auf der Anzahl und der Exposition von positiv geladenen Seitenketten an Aminosäuren in der C-terminalen Region beruht.
Obschon die relative Wirksamkeit dieser Melittinanalogen in vitro festgestellt wurde, können in vivo wesentliche Unterschiede vorkommen. In vivo Parameter, wie die Absorbtion und die Freigabe vom Wirt, kann diese Wirkungsordnung beim praktischen Gebrauch signifikant ändern. Nebeneffekte müssen ebenfalls berücksichtigt werden. Während die adrenocorticotrope Aktivität von Melittin gut dokumentiert ist, kann NPS-Melittin eine kleinere adrenale Aktivität als das natürliche Melittin aufweisen, da das NPS-Derivat von Adrenocorticotropin (ACTH) eine hundert mal kleinere lipolytische Aktivität induziert als unmodifiziertes ACTH. Aus diesen Gründen soll jedes, der in dieser Studie umfassten Analogen für die in vivo Auswertung in Betracht gezogen werden. Tabelle 1 Konzentrationen der gegen drei verschiedene Bakterien getesteten Antibiotika- und Bienengiftvorratslösungen Organismus Gift Ampicillin Kanamycin Polymixin E. coli S, aureus S. aureuskana Tabelle 2 Darstellung und Verteilung von Bienengift und Antibiotika in einer Titration, Schachbrett- Titrationstes Antibiotikum-Verdünnungen Kontrolle BIENENGIFT VERDUENNUNGEN a = Zähler, Verdünnungsgrad der HBV-Vorratslösung b = Nenner, Verdünnungsgrad der Antibiotikum-Vorratslösung c = Testposition in einer aufeinanderfolgenden Anordnung von 75 Reagens-Röhrchen Tabelle 3 Inhalt und Verteilung jedes Komponenten des Schachbrett-Titrationstests Röhrchen Nr. Antibiotikum Gift Bakterien Tabelle 4 Wirkung von 4 ug/ml HBV auf die MIC von elf Antibiotika von 8 gram-positiven Organismen Penicillin Methicillin Ampicillin Cephalothin Gentamicin Kanamycin Erythromycin Chloramphenicol Clindamycin Tetracycline Vancomycin 1 - Gruppe "A" = 2 S. aureus-Stämme 2 - Gruppe "B" = 5 S. epidermidis-Stämme 3 - Gruppe "C" = ein S. faecalis-Stamm 4 - QC = S. aureus-Stamm, der für die routinemässige Qualitätskontrolle zur Prüfung dieses Test-Systemes dient. 5 - Ein (-) bedeutet eine MIC-Abnahme von weniger als 2 Verdünnungsschritten 6 - Ein (+) bedeutet eine MIC-Abnahme von zwei oder mehr Verdünnungsschritten Tabelle 5 Wirkung von 4 ug/ml HBV auf die MIC von 11 Antibiotika auf 4 E. coli-Stämme E. coli-Stamm Ampicillin Carbenicillin Piperacillin Cephalothin Cefoxitin Cefamandole Moxalactam Amikacin Gentimicin Chloramphenicol Tobramycin 1 - QC ist ein E. coli-Stamm, der für die routinemässige Qualitätskontrolle zur Prüfung dieses Test-Systems dient. 2 - Ein (+) bedeutet eine MIC-Abnahme von 2 oder mehr Verdünnungsschritten 3 - Ein (-) bedeutet eine MIC-Abnahme von weniger als 2 Verdünnungsschritten Tabelle 6 Staphyloccus aureus Rifampicin=.01ug/ml or .001ug/ml Honigbienengift =4ug/ml Stunden nach Inokulation Kontrolle Mittel Rifampicin ug/ml Mittel Gift ug/ml Mittel Tabelle 7 Pseudomonas aeruginosa Rifampicin=10ug/ml or 20ug/ml Honigbienengift =40ug/ml Stunden nach Inokulation Kontrolle Mittel Venom ug/ml Mittel Rifampicin ug/ml Mittel Tabelle 8 Escherichia coli Polymyxin B=6.25Units/ml und 3.125Units/ml Hummelgift =5ug/ml und 20ug/ml (Megabombus pennsylvanicus) Stunden nach Inokulation Kontrolle Mittel BB Venom ug/ml Mittel Tabelle 9 Escherichia coli Polymyxin B =3.125 Vespengift =5ug/ml (Vespula germanica) Hornissengift =5ug/ml (Dolichovespula maculata) Stunden nach Inokulation Kontrolle Mittel Tabelle 10 Relative Aktivität von Analogen von Protein- oder Polypeptidkomponenten des Hymenoptera Gifts Analoges Nr. Relative Aktivität Tabelle 11 Mittlere optische Dichten (OD&sub6;&sub6;&sub0;) von Bakterien- Kulturen gegen Zeit und Behandlung Kontrolle Mellittin - ug Analog ug Polymyxin B - Einheiten Poly B - 6 U + Mel - 10 ug Tabelle 12 Sequenz von synthetischen Melittin-Analogen natürliches Melittin Analoges * Fettgedruckte Aminosäuren stellen Aenderungen von der nativen Melittin-Sequenz dar. Tabelle 13 Optische Dichten (OD&sub6;&sub6;&sub0;) von bakteriellen Kulturen für Behandlungen gegen Zeit Stunden nach Kultur-Inokulation Kontrolle Polymyxin B Melittin + Pol B Synthetic + Pol B Analog + Pol B Tabelle A-1 Resultate des Schachbrett-Tests von Ampicillin und Bienengift gegen S. aureus. Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-1 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-1 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-2 Schachbrett-Test-Resultate von Kanamycin und Bienengift gegen S. aureus. Zeit Mittel A&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-2 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-2 (Fortsetzung) Zeit Mittel A&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-3 Schachbrett-Testresultate von Polymyxin B und Bienengift gegen E. coli Zeit Mittel A&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-3 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-3 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-4 Schachbrett-Testresultate von Ampicillin und Bienengift gegen E. coli Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-4 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-4 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-5 Schachbrett-Testresultate von Kanamycin und Bienengift gegen E.coli. Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-5 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-5 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-6 Schachbrett-Testresultate von Polymyxin B und Bienengift gegen E. coli. Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-6 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-6 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-7 Schachbrett-Testresuitate von Ampicillin und Bienengift gegen Kanamycin-resistenten S. aureus. Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-7 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-7 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-8 Schachbrett-Testresultate von Kanamycin und Bienengift gegen Kanamycin-resisten S.aureus. Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-8 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-8 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-9 Schachbrett-Testresultate von Polymyxin B und Bienengift gegen Kanamycin-resistenten S. aureus. Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-9 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-9 (Fortsetzung) Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-10 Resultate von äquivalenten Dosen von Melittin und Voll-Bienengift mit und ohne Kanamycin an S.aureus. Zeit MittelA&sub6;&sub6;&sub0; Tabelle A-11 Grobe DAten für das einfache Behandlungsmodell Log10 Bakterien/ml Blut Behandlung Maus elittin olymyxin B * keine Ablesung wegen ungeeigneter Blutprobe. Tabelle A-12 Grobe Daten für das wiederholte Behandlungsmodell Log10 Bakterien/ml Blut Behandlung Maus keine Behandlung Mellitin Polymyxin

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Claims

1. Zusammensetzung zur Behandlung von Infektionen bei Säugetieren, enthaltend ein erstes antibiotisches, gegen die Infektion wirksames Mittel und ein zweites Mittel, das aus mindestens einem Hymenoptera-Gift, mindestens einer aktiven Eiweiß-Komponente eines Hymenoptera-Gifts, mindestens einer Polypeptid-Komponente eines Hymenoptera-Gifts, mindestens einem ähnlichen oder einem chemisch veränderten Derivat von einer aktiven Eiweiß-Komponente eines Hymenoptera-Gifts, mindestens einem ähnlichen oder einem chemisch veränderten Derivat von einer Polypeptid-Komponente eines Hymenoptera-Gifts oder Mischungen davon besteht, wobei das zweite Mittel eine positive Biuret-Reaktion zeigt und wobei die Verhältnisse zwischen dem ersten, antibiotischen Mittel und dem zweiten Mittel so gewählt sind, daß das zweite Mittel die Aktivität des ersten, antibiotischen Mittels verstärkt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das erste, antibiotische Mittel ein Antibiotikum aus der Gruppe Ampicillin, Kanamycin, Polymyxin B oder Rifampicin besteht.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, in der das zweite Mitel aus Honigbienen- Gift, Hummel-Gift, Wespen-Gift, Gift der ? Hornisse, aktiven Eiweiß-Komponenten von mindestens einem dieser Gifte, aktiven Polypeptid-Komponenten von mindestens einem dieser Gifte, ähnlichen oder chemisch veränderten Derivaten von Melittin, Bombilitin, Mastoporan und Crabolin oder Mischungen davon besteht.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, in der das erste, antibiotische Mittel Ampicillin, Kanamycin, Polymyxin B oder Rifampicin und das zweite Mittel Honigbienen- Gift, Melittin, ähnliche oder chemisch veränderte Derivate von Melittin, Mastoporan, ähnliche oder chemisch veränderte Derivate von Mastoporan oder Mischungen davon enthält.

5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in der das erste, antibiotische Mittel Ampicillin, Kanamycin, Polymyxin B oder Rifampicin enthält und das zweite Mittel Honigbienen-Gift oder Melittin ist.

Dosierungseinheit zur Behandlung einer Infektion bei einem Säugetier, die eine effektive Dosierung eines Medikaments in der Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.