DE102006036373A1

DE102006036373A1 - Arzneimittel gegen LCT-Vergiftungen

Info

Publication number: DE102006036373A1
Application number: DE102006036373A
Authority: DE
Inventors: Jessica Reineke; Stefan Tenzer; Christoph von Dr. Eichel-Streiber; Hansjörg Schild; Maja Rupnik
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2008-02-07
Also published as: CN101516359A; CN101516359B

Abstract

Das Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch Large Clostridial Cytotoxins (LCTs), insbesondere Clostridium difficile Toxine A und B (TcdA und TcdB) zeichnet sich dadurch aus, dass es als Wirkstoff wenigstens einen Inhibitor oder Aktivator der autokatalytischen Proteaseaktivität von LCTs (Large Clostridial Cytotoxins) enthält.

Description

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch Large Clostridial Cytotoxins (LCTs), insbesondere Clostridium difficile Toxine A und B (TcdA und TcdB), Clostridium sordellii letales Toxin (TcsL) und Clostridium novyi α-Toxin (Tcnα).
Clostridium difficile ist ein strikt anaerob wachsender, Sporen bildender, grampositiver Keim, der erst Ende der 70er Jahre als etiologisches Agenz der Antibiotika-assoziierten Diarrhoe und der Pseudomembranösen Kolitis identifiziert wurde. Seit den 90er Jahren wird C. difficile als der bedeutendste Krankenhauskeim der entwickelten Länder angesehen. Als Konsequenz des sich ständig weiter ausbreitenden Einsatzes von Breitbandantibiotika steigt die Inzidenz von C. difficile Infektionen vor allem bei stationär behandelten Patienten weiter stetig an.
Für die C. difficile-assozierten Erkrankungen sind die von C. difficile produzierten Exotoxine Toxin A (TcdA) und Toxin B (TcdB) verantwortlich. Es existieren verschiedene Stämme mit unterschiedlicher Virulenz und Toxinproduktion. Ungefähr ein Viertel aller Stämme produziert keine Toxine. Toxinbildende Stamme produzieren fast immer beide Toxine. TcdA ist ein Enterotoxin, das durch zytotoxische Schädigung der Enterozyten die Permeabilität der Darmschleimhaut erhöht und damit eine Diarrhoe auslöst. TcdB ist ein Zytotoxin, das den Elektrolyttransport stört und für Flüssigkeitsverlust und Funktionsstörungen des Darmes verantwortlich ist. Die Toxine TcdA und TcdB gehören zur Gruppe der sogenannten Large Clostridial Cytotoxins (LCTs) und bestehen jeweils aus einer Peptidkette mit drei funktionalen Domänen, nämlich der C-terminalen Domäne, die für das Anbinden des Toxins an die Wirtszellmembran verantwortlich ist, der hydrophoben mittleren Domäne, die für den Translokationsprozess durch die zellulären Membranen (mit) verantwortlich gemacht wird, und die N-terminale Domäne, die eine Glykosyltransferase-Funktion aufweist und die toxische Aktivität des Moleküls vermittelt.
Zwar ist der Aufnahmeprozess der Toxine in die Wirtszelle noch nicht vollständig aufgeklärt, es gilt jedoch als Tatsache, dass die Toxine nach dem Anbinden an einen Wirtszellrezeptor per Endozytose in die Wirtszelle gelangen, und dass zur Entfaltung ihrer Toxizität die N-terminale katalytische Domäne abgespalten und in das Cytosol der Wirtszelle befördert wird. Dort glykosiliert die katalytische Domäne spezifisch GTPasen der Rho-Subfamilie (Rho, Rac und Cdc42), welche ihrerseits an einer Fülle von Signaltransduktionskaskaden beteiligt sind, und blockiert auf diese Weise die betreffenden Signaltransduktionsprozesse, was letztendlich zur Disaggregation des Cytoskeletts und zum Zelltod führt.
Im Stand der Technik wurde bisher davon ausgegangen, dass die Abspaltung der katalytischen N-terminalen Domäne der Toxin-Peptidketten von TcdA und TcdB und auch anderer "Large Clostridial Toxins" LCT von einer zellulären Protease katalysiert wird (Rupnik et al., 2005 und Pfeiffer et al., 2003). Ein entsprechender Nachweis konnte jedoch nicht erbracht werden.
Im Verlauf der Untersuchungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, wurde nun aber überraschend gefunden, dass die Spaltung von TcdA und TcdB ein autokatalytischer Prozess ist, der von Inositolphosphat (IP) initiiert wird, und dass folglich die Toxine von Clostridium difficile neben ihrer katalytischen Funktion der Glykosyltransferase auch noch die Funktion einer Protease zur Selbstspaltung bzw. autokatalytischen Spaltung besitzen.
Zur Behandlung von Patienten mit C. difficile Infektionen wird zunächst das auslösende Antibiotikum abgesetzt, soweit dies möglich. Die weitere Behandlung erfolgt ausschließlich symptomatisch. Bei langer andauerndem oder schwerwiegendem Krankheitsverlauf, sowie wenn ein Absetzen des auslösenden Antibiotikums aus anderen Gründen nicht möglich ist, wird zur Therapie Metrondiazol oder Vancomycin verabreicht.
Die Nachteile der gängigen antimikrobiellen Therapie sind vielfältig. Entscheidend ist hierbei vor allem, daß sich eine Erkrankung, die infolge der Behandlung einer anderen Infektionssituation mit Antibiotika ausgelöst wurde, nicht effektiv mit einer antimikrobiellen Therapie heilen läßt. Hintergrund dafür ist die Tatsache, daß C. difficile im Darm gesunder Menschen nur verhältnismäßig selten vorkommt und sich gegenüber der normalen Darmflora nicht durchsetzen kann. Wird die normale Darmflora durch Antibiotika-Therapie zerstört, kann sich C. difficile durchsetzen und den Darm effektiv besiedeln. Die gegen C. difficile gerichtete Antibiotika-Therapie führt wiederum zur Zerstörung der Darmflora und verhindert damit ursächlich auch das Entstehen einer gesunden Darmflora. Dies erklärt auch die hohe Anzahl an Remissionen, die nach Beendigung der antimikrobiellen Therapie zu beobachten sind. Ein zusätzlicher Nachteil der gängigen Therapie ist das zunehmende Auftreten von multiresistenten C. difficile Stämmen in jüngster Zeit. Damit droht, daß auch die bislang einzige Therapie für C. difficile induzierte Erkrankungen nutzlos wird und die Anzahl an Todesfällen infolge von C. difficile Erkrankungen steigt. Hinzu kommt, daß die zur Behandlung einer C. difficile Infektion nötigen Antibiotika sehr teuer sind und normalerweise nur in begründeten Fällen als Reserveantibiotika eingesetzt werden.
Es besteht daher ein dringender Bedarf nach Medikamenten, die zur spezifischen Bekämpfung (Vermeidung, Beseitigung, Linderung) von C. difficile Infektionen geeignet sind, ohne dass das Risiko der Entwicklung von Resistenzen bei den Clostridien oder auch anderen Bakterien besteht, und ohne die natürliche Bakterienflora der betroffenen Patienten – insbesondere deren Darmflora – zu schädigen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines solchen Medikaments.
Eine Lösung der genannten Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Arzneimittels der eingangs genannten Art, dass sich dadurch auszeichnet, dass es als Wirkstoff wenigstens einen Inhibitor oder Aktivator der autokatalytischen Proteaseaktivität von LCTs (Large Clostridial Cytotoxins), insbesondere der autokatalytischen Proteaseaktivität von Clostridium difficile Toxin A (TcdA) und/oder Clostridium difficile Toxin B (TcdB) und/oder Clostridium sordellii letales Toxin (TcsL) und/oder Clostridium novyi α-Toxin (Tcnα) enthält.
Ist der Wirkstoff ein Inhibitor, so beruht seine antitoxische Wirkung darauf, dass er die Proteaseaktivität des intakten Toxins, insbesondere des TcdB oder TcdA oder TcsL oder Tcnα, hemmt und somit die Abspaltung des cytotoxisch wirksamen Fragments mit Glucosyltranferasefunktion (im Fall von TcdB und TcdA ist das das 63 kDa-Fragment) unterbindet.
Geeignete Inhibitoren sind chemische Substanzen, welche die Protease-Aktivität der Toxine inhibieren.
Der Begriff "chemische Substanz" bezeichnet in den vorstehenden und nachfolgenden Ausführungen sowohl anorganische als auch organische Verbindungen, Ionen und Peptide oder Proteine.
Bevorzugte Inhibitoren sind solche chemischen Substanzen, die die Protease-Aktivität irreversibel inhibieren. Ein Beispiel hierfür ist die Substanz EPNP (1,2-Epoxy-3-(p-Nitrophenoxy)-Propan) vorgeschlagen. Die Substanz reagiert irreversibel mit Aspartatresten im katalytischen Zentrum von Proteasen und inhibiert so die proteolytische Wirkung.
Weitere Protease-Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm mit bekannten Methoden (Computer-Modelling, High-Throughput-Screening) leicht identifizieren werden. Beispielsweise kann zur Durchführung eines „High-Troughput-Screenings" ein Peptid synthetisiert werden, dessen Aminosäure-Sequenz der Sequenz der Proteasespaltstelle der LCTs entspricht. Durch Kopplung dieses Peptids z.B. mit dem Farbstoff AMC (7-Amino,4-Methyl-Cumarin) mit Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, kann eine Sonde generiert werden. Zur Duchführung des „High-Troughput-Screenings" wird anschließend die gelabelte Sonde mit dem Toxin und den Kandidaten-Substanzen zusammengebracht. Wird die Sonde gespalten, so kommt es zu Änderungen im Fluoreszenz-Spektrums. Diese Änderungen sind mit dem Fachmann geläufigen Methoden (Fluoreszenzdetektoren) leicht zu erfassen. Ansätze, in denen keine Änderung des Fluoreszenz-Spektrum zu beobachten sind, enthalten dann potentielle Protease-Inhibitoren.
Beispielhaft sei noch ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Aktivierung der autokatalytischen Protease-Aktivität der LCTs beeinflussen, beschrieben. Dazu können das Holotoxin oder auch geeignete Toxinfragmente verwendet werden, die z.B. mit einem Farbstoff gekoppelt sind, dessen Fluoreszenz im ungespaltenen Toxin oder Toxin-Fragment gequencht ist. Durch die autokatalytische Spaltung des Toxins bzw. der Toxinfragmente wird die quenchende Wirkung aufgehoben. Die Änderungen im Fluoreszenz-Spektrum können, wie beschrieben, leicht erfasst werden.
Geeignete Inhibitoren stellen außerdem Strukturanaloge von Inositolphosphat (IP) und insbesondere von Inositolhexaphosphat (IP6) dar, die anstelle von IP und insbesondere von IP6 die Reaktionsbindungsstellen von LCT, insbesondere TcdA und/oder TcdB, und/oder TcsL und/oder Tcnα besetzen können, jedoch nicht die Initiator-Funktion von IP bzw. IP6 besitzen. Diese Strukturanaloge sind somit Antagonisten zu den Agonisten IP (insbesondere IP6) und bewirken ein kompetitive Hemmung der Proteaseaktivität von LCT, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα. Geeignete Strukturanaloga sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten und dem Fachmann geläufigen Testverfahren (Beispiele hierfür sind vorstehend bereits beschriebenen) leicht identifizieren werden.
Geeignete Inhibitoren sind außerdem Hemmstoffe für/von Inositolphosphat (Synonyme: Inositolphosphat-Hemmstoff bzw. Inositolphosphat-Inhibtor), das heißt solche Hemmstoffe, die Inositolphosphat und insbesondere Inositolhexaphosphat derart binden oder modifizieren, dass deren Fähigkeit zur Initiierung der Proteaseaktivität von LCT, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα unterbunden ist.
Ein Beispiel für solche Substanzen sind zweiwertige Ionen wie Ca²⁺, die mit IP6 unlösliche Komplexe eingehen. Ähnliche Substanzen sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten und dem Fachmann geläufigen Testverfahren (Beispiele hierfür sind vorstehend bereits beschriebenen) leicht identifizieren werden.
Weitere geeignete Inhibitoren sind chemische Substanzen, die die Bildung von Inositolphosphaten im Darmlumen der Patienten (Säugetiere, insbesondere Menschen) oder in den Körperzellen der Patienten (Säugetiere, insbesondere Menschen) unterdrücken oder bereits vorhandenes Inositolphasphat zerstören und so die proteolytische Spaltung der LCTs beim Eindringen in das Zytoplasma verhindern. Bevorzugte Beispiele für eine solche Substanzen sind Lithium, WA(Valproic acid) oder CBZ(Carbamazepine).
Ist der Wirkstoff ein Aktivator, so beruht seine antitoxische Wirkung darauf, dass er die Proteaseaktivität des intakten Toxins, insbesondere des TcdB oder TcdA oder TcsL oder Tcnα initiert, noch bevor das Toxin derart an die Wirtszelle gebunden hat, dass das abgespaltenen Fragment in das Zellinnere (Cytosol) gelangen könnte. Der Aktivator bewirkt folglich eine Abspaltung des cytotoxisch wirksamen Fragments mit Glucosyltranferasefunktion (im Fall von TcdB und TcdA ist das das 63 kDa-Fragment) außerhalb der Wirtszelle. Das cytotoxisch wirksame Fragment kann dann nicht mehr in das Zellinnere gelangen und dort seine cytotoxische Wirkung entfalten.
Ein besonders geeigneter Aktivator ist isoliertes (im Unterschied zu cytosolischem) Inositolphosphat (IP), vorzugsweise Inositolhexaphosphat (IP6).
Ein Medikament mit diesem Wirkstoff hat den Vorteil, dass im Patientendarm vorhandenes LCT, insbesondere TcdB und/oder TcdA und/oder TcsL und/oder Tcnα, durch das medikamentös zugeführte IP schon im Darm zur Spaltung veranlasst wird, das heißt noch bevor es an Darmzellen oder andere Körperzellen binden und toxisch wirken kann.
Ebenso gut eignet sich als Aktivator ein Stoff, der analog IP6 die autokatalytische Proteaseaktivität von LCT, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα, fördert.
Solche Stoffe sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten Methoden leicht identifziert werden. Dazu eignet sich zusätzlich auch modifizierte Varianten der vorstehend beschriebenen „High-Troughput-Assays". Dabei werden das Toxin und die potentiellen Aktivator-Substanzen zusammengegeben und im Zeitverlauf auf Veränderungen im Fluoreszenz-Spektrum untersucht. Ansätze, in denen starke Veränderungen in kurzer Zeit auftreten, enthalten geeignete Aktivatoren.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen
1: Aufspaltung des TcdB₁₀₄₆₃ (270 kDa) Holotoxins in die Translokations/Ligandendomäne (207 kDa) und die N-terminale katalytische Domäne (63 kDa) in der SDS-PAGE, durchgeführt mit

a: einer Mischung aus Cy3-markiertem TcdB₁₀₄₆₃ und Schweine-Milzzell-Extrakt (Beispiel 1 A);
b: einer Mischung aus Cy3-markiertem TcdB₁₀₄₆₃ und von Protein befreitem Schweine-Milzzell-Extrakt (Beispiel 1 B);
c: einer Mischung aus Cy3-markiertem TcdB₁₀₄₆₃ und Inositolphosphat;
d: einer Mischung aus unmarkiertem TcdB₁₀₄₆₃ und Inositolphosphat;
e: einer Mischung aus unmarkiertem (mittels Affinitätschromatographie gereinigtem) TcdB₁₀₄₆₃ und Inositolphosphat;
a–e jeweils im Anschluß an eine Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde

2: SDS-PAGE einer Mischung von TcdB₁₀₄₆₃ und/oder IP6, mit oder ohne Vorbehandiung des Toxins mit EPNP;

Spur 1: TcdB₁₀₄₆₃ nach Vorbehandlung mit EPNP und ohne IP6, keine Bande im 63 kDa Bereich nachweisbar;
Spur 2: TcdB₁₀₄₆₃ nach Vorbehandlung mit EPNP und nach Inkubation mit IP6, die typische 63 kD Bande ist nur schwach ausgeprägt;
Spur 3: TcdB₁₀₄₆₃ ohne Vorbehandlung mit EPNP und nach Inkubation mit IP6, es ist eine deutlich ausgeprägte Bande im Molekulargewichtsbereich von 63 kDa erkennbar;
Spur 4: TcdB₁₀₄₆₃ ohne Vorbehandlung mit EPNP und ohne IP6, keine Bande im 63 kDa Bereich nachweisbar.

Alle in den folgenden Beispielen genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt und z.B. in Ausubel et al. (2003) beschrieben.
Beispiel 1: Nachweis der autokatalytischen Proteaseaktivität von TcdB
Clostridium difficile Toxin B (270 kDa) des Referenzstammes VPI10463, im folgenden kurz TcdB₁₀₄₆₃ benannt, wurde zunächst mit Cy3 fluoreszenzmarkiert. Hierfür wurden 200–400 μg TcdB₁₀₄₆₃ (tgcBIOMICS, Mainz, Germany) mit dem Farbstoff Cy3 nach Angaben des Herstellers (Amersham Biosciences) markiert, indem das Toxin zusammen mit dem in Dimethylformamid gelösten Farbstoff für 1 Stunde bei 4°C inkubiert wurde. Ungebundener Farbstoff wurde anschließend mittels Größenausschlußchromatographie (Size Exclusion Chromatographie = SEC) entfernt, wobei 10 mM Tris-HCl pH 8.5 als Laufpuffer diente. Das molare Verhältnis zwischen Farbstoff und Cy3-markiertem TcdB₁₀₄₆₃ betrug 0.8–1.6. Markiertes TcdB₁₀₄₆₃ wurde aliquotiert und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

(A) Für die Durchführung des im Stand der Technik bekannten "In-vitro-cleavage-assay" (siehe hierzu insbesondere Rupnik et al (2005); auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen) wurde ein auf Raumtemperatur aufgetautes Aliquot Cy3-markiertes TcdB₁₀₄₆₃ für 1Stunde bei Raumtemperatur mit Schweine-Milzzell-Extrakt inkubiert.

Dieser Schweine-Milzzell-Extrakt wurde wie folgt hergestellt: Frisch gewonnene Schweinemilz wurde in Phosphat Puffer (PBS) aufgenommen und zu einer Einzelzellsuspension zerkleinert. Durch Zugabe von Niedrigsalzpuffer (Low Salt Buffer), – nämlich 150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA, pH 7.6 –, wurden vorhandene Erythrozyten lysiert und somit entfernt. Anschließend wurden die Milzzellen zweimal mit 10 mM Tris-HCl pH 8.5 gewaschen und sofort bei –80°C tiefgefroren. Für den gewünschten Zellextrakt wurde bei Bedarf ein Aliquot dieser tiefgefrorenen Milzzellen in einem Aliquot 10 mM Tris-HCl pH 8.5 aufgetaut und suspensiert und diese Suspension anschließend einer Ultraschallbehandlung unterworfen. Das erhaltene Lysat wurde 1 Stunde bei 200 000 × g und 4°C zentrifugiert und der Überstand für die anstehenden Experimente verwendet.
Am Ende der Inkubationsphase wurde die Mischung aus Cy3-markiertem TcdB10463 und Schweine-Milzzelt-Extrakt einer SDS-PAGE unterworfen, um die während der Inkubation entstandenen TcdB-Fragmente zu separieren und nachzuweisen. Das Ergebnis dieser SDS-PAGE ist in 1a dargestellt: Es wurden erwartungsgemäß die beiden bekannten und charakteristischen 63 kDa- und 207 kDa-Fragmente des Clostridium difficile Toxins B – hier des TcdB₁₀₄₆₃ – erhalten.
Als Negativ-Kontrollen dienten Aliquots von TcdB₁₀₄₆₃ ohne Beimischung von Milzzell-Extrakt (siehe 1 "-").

(B) In einem Parallelversuch wurde der in (A) beschriebene Milzell-Extrakt vor der Inkubation mit dem Cy3-markierten TcdB₁₀₄₆₃ von Protein gereinigt. Zu diesem Zweck wurde ein Aliquot des gemäß (A) hergestellten Schweine-Milzzell-Extrakts im Anschluß an die Untraschallbehandlung sechs Phenol-Chloroform-Extraktionen unterworfen, die wie folgt durchgeführt wurden: Schweine-Milzzell-Extrakt wurde mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25/24/1) im Volumenverhältnis 1:1 gemischt. Diese Mischung wurde 10 Minuten bei 1.700 × g, und 4°C zentrifugiert. Die wässrige oberste Schicht wurde in eine frisches Zentrifugengefäß dekantiert und Zentrifugation und Dekantierung noch fünf mal wiederholt. Um auch letzte Reste von Phenol zu entfernen, wurde abschließend eine Chloroform-Exktraktion durchgeführt.

Aliquots der auf diese Weise gewonnenen wässrigen und proteinfreien Fraktion des Milzzell-Extraktes wurden im Volumenverhältnis 1:30 (30), 1:100 (100) oder 1:300 (300) mit 10 mM Tris-HCL pH 8,5 verdünnt und wie unter (A) beschrieben mit auf Raumtemperatur aufgetauten Aliquots von Cy3-markiertem TcdB₁₀₄₆₃ gemischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubationsphase wurden diese Mischungen einer SDS-PAGE unterworfen, um die während der Inkubation entstandenen TcdB-Fragmente zu separieren und nachzuweisen. Das Ergebnis dieser SDS-PAGE wurde mit Hilfe des Gel Doc EQ System Image Readers (BIO-RAD München, Deutschland) sichtbar gemacht und ist in 1b dargestellt: Es wurden bei allen Testansätzen die beiden charakteristischen 63 kDa- und 207 kDa-Fragmente von TcdB₁₀₄₆₃ erhalten. Das zeigt, dass die wässrige und proteinfreie Fraktion des Milzzell-Extraktes nach wie vor die Eigenschaft besitzt bzw. besaß, TcdB₁₀₄₆₃ in seine beiden charakteristischen Teilfragmente zu spalten.
In einem weiteren Parallelversuch wurde der in (A) beschriebene Milzzell-Extrakte mit Hitze (96°C, 30 Minuten) behandelt, bevor er wie in (A) beschrieben mit Cy3-markiertem TcdB₁₀₄₆₃ inkubiert und der SDS-PAGE unterworfen wurde. Das Ergebnis dieser SDS-PAGE ist ebenfalls in 1b dargestellt: Es wurden wiederum die beiden charakteristischen 63 kDa- und 207 kDa-Fragmente von TcdB₁₀₄₆₃ erhalten. Das Ergebnis zeigt, dass der hitzeinduzierte Milzzell-Extrakt weiterhin die Eigenschaft besitzt, TcdB₁₀₄₆₃ in seine charakteristischen Teilfragmente zu spalten.

(C) In einer weiteren Versuchsreihe wurde Cy3-markiertes TcdB₁₀₄₆₃ und unmarkiertes TcdB₁₀₄₆₃ allein (d.h. ohne Beimischung von Milzzell-Extrakt) mit verschiedenen Inositolphosphaten für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die jeweiligen Mischungen anschließend einer SDS-PAGE unterworfen. Das Ergebnis dieser Untersuchungen ist in Tabelle 1 und den 1c–e dargestellt. Es lieferte die überraschenden Kernaussagen, dass die proteolytische Spaltung von TcdB₁₀₄₆₃ allein durch eine chemische Substanz wie IP initiierbar ist, und dass es sich bei dieser proteolytischen Spaltung folglich um einen autokatalytischen Prozess des Toxin-Proteins handelt.

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass eine Reihe von Inositolphosphaten die autokatalytische Spaltung von TcdB₁₀₄₆₃ initieren können. Inositolhexaphosphat (IP₆) ruft unter den getesteten Inositolphosphaten die stärkste Spaltungsaktivität hervor, und das heißt, IP6 besitzt die höchste Initiatoraktivität (siehe auch 1c–e).
Strukturanaloga oder andere den Inositolphosphaten verwandte Substanzen, die eine Initiatoraktivität besitzen, sind dem Fachmann bekannt oder können mit bekannten Methoden (z.B. Computer-Modelling) leicht ermittelt werden. Beispielsweise können auch die vorstehend beschriebenen "High-Troughput-Assays" verwendet werden.
Die Austestung unterschiedlicher Konzentrationen an IP₆ im Inkubationsversuch mit TcdB₁₀₄₆₃ zeigt (siehe 1c und 1d), daß zur Spaltung von fluoreszenzmarkiertem Toxin B eine IP-Konzentrationen von 10 μM (c) ausreichend ist, während zur Spaltung von unmarkiertem (und erst in der SDS-PAGE durch Zinkfärbung (Zinc Stain and Destain Kit, Biorad, Hercules, USA) sichtbar gemachtem) Toxin B noch niedrigere Konzentrationen bis zu 1 μM (1d) genügen.
Analoge Experimente wurden auch mit den LCTs TcdB₁₀₄₆₃, TcsL von C. sordellii und Tcnα durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß Inositolphosphate aktivierend auf die autokatalytische Spaltung aller untersuchter Toxine der LCT-Familie wirken.

(D) Um auszuschließen, dass das in den Versuchen eingesetzte, aus Kulturüberstand von C. difficile aufgereinigte TcdB₁₀₄₆₃ mit Proteasen kontaminiert war, wurde ein Kontrollversuch mit speziell gereinigtem TcdB₁₀₄₆₃ durchgeführt. Diese Reinigung des TcdB₁₀₄₆₃ erfolgte mittels Affinitätschromatographie unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers 2CV (DSM ACC 2321) wie folgt: 7 mg des TcdB spezifischen monoklonalen Antikörper 2CV (ProteinG-gereinigter Überstand einer serumfreien Hybridoma-Kultur) wurde an eine HiTrap NHS Sepharose Säule (kommerziell erhältlich bei GE Healthcare, Freiburg, FRG) gekoppelt. Kopplung und Flution wurden gemäß Herstellerangaben durchgeführt. Die fertige Säule wurde mit ca. 4 mg TcdB₁₀₄₆₃ beschickt und ungebundene Proteine durch dreimaliges Waschen mit 50 mM Tris/HCl, pH 7.0; 125 mM NaCl entfernt. Die Flution erfolgte in einem Schritt mit 0.1 M Triethanolamin-HCl pH11. Das Toxin eluierte in drei 4 ml Fraktionen mit Konzentrationen zwischen 450–185 μg/ml Das eluierte Toxin wurde sofort mit 1M Tris-HCl pH 7.5 im Volumenverhältnis 1/10 neutralisiert, was dadurch gewährleistet war, daß diese Neutralisierungslösung bereits vor dem Start der Flution in den Auffangröhrchen für die Fraktionen vorgelegt worden war. Anschließend wurde die Abwesenheit von kontaminierenden Proteinen durch SDS-PAGE und nachfolgende Zinkfärbung nachgewiesen (siehe 1e "-").

Der Kontrollversuch bestand aus der Inkubation von derart gereinigtem unmarkiertem TcdB₁₀₄₆₃ mit IP₆ und nachfolgender SDS-PAGE und Nachweis des Toxins oder der Toxinfragmente mittels Zinkfärbung. Das Ergebnis dieses Versuchs ist in 1e dargestellt und zeigt die vollständige Aufspaltung des Holotoxins in die beiden bekannten Fragmente 63 kDa und 207 kDa.
Beispiel 2: Inaktivierung von TcdB-10463 durch Inkubation mit einem Protease-Inhibitor
TcdB₁₀₄₆₃ wurde wie in Beispiel 1 (D) beschrieben mittels Affinitätschromatographie unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers 2CV gereinigt und anschließend entweder (i) mit dem Protease-Inhibitor EPNP (10 mM 1,2-Epoxy-3-(p-Nitrophenoxy)-Propan) oder (ii) – als Kontrolle – mit Puffer (50 mM HEPES, 1M NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) 60 Minuten bei Raumtemperatur vorbehandelt.
Anschließend wurde ein in-vitro-Cleavage-Assay analog Beispiel 1 (A) durchgeführt. Die Testansätze umfaßten jeweils ein Volumen von 10 μl, und enthielten jeweils 50–100 ng unmarkiertes TcdB₁₀₄₆₃, 100 μM IP6 und 10 mM Tris-HCl pH 8.5. Diese Testansätze wurden im Anschluß an die Inkubation (1 h bei Raumtemperatur) einer SDS-PAGE (10%) unterworfen und die Toxine und Toxinfragmente anschließend mittels Zinkfärbung sichtbar gemacht.
2 zeigt das Ergebnis dieses Experimentes: Die Inkubation von TcdB₁₀₄₆₃ allein mit IP6 (Spur 3) zeigt eine deutlich ausgeprägte Bande im Molekulargewichtsbereich von 63 kDa. Wenn das Toxin vorher mit EPNP vorbehandelt wird (Spur 2), ist die typische 63 kD) Bande nur schwach ausgeprägt. Dieser Befund zeigt, dass durch die Zugabe von EPNP die proteolytische Aktivität (Protease-Aktivität) des TcdB₁₀₄₆₃ nahezu vollständig gehemmt ist.
Das mit EPNP vorbehandelte Toxin wurde außerdem im CHO-Test nach Moos et al. (2000) auf seine Restaktivität (zytotoxische Wirkung) hin untersucht.
Der CHO-Test wurde wie folgt durchgeführt: In einer 96well-Mikrotiterplatte wurden CHO-Zellen (= Chinese-Hamster-Ovarialcells) ausgesät (5000 Zellen/well) und 16 Stunden unter Standardbedingungen (5% CO₂, 37°C, DMEM F12 ergänzt mit 2 mM L-Glutamine, 5% FCS) inkubiert. Anschließend wurden die Toxine nach stufenweiser Verdünnung in Wachstumsmedium zu den Zellen gegeben. Verdünnungstufen zwischen 10⁰ und 10^-8 wurden ausgetestet. Die Zellen wurden 3 Stunden unter Standardbedingungen inkubiert. Anschließend wurde der Anteil an abgerundeten Zellen mikroskopisch bestimmt, indem mehrere repräsentative Ausschnitte des Wells photographiert und die ausgestreckten, sowie die abgerundeten Zellen ausgezählt wurden. (Siehe auch Moos et al., Meth Enzymol. 2000, 325: 114–125. Auf den Inhalt dieser Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen.)
Die Ergebnisse dieses CHO-Tests zeigen, daß das mit EPNP vorbehandelte TcdB₁₀₄₆₃ eine wesentlich schwächere zytotoxische Aktivität aufweist als das unbehandelte TcdB₁₀₄₆₃ (vgl. Tabelle 2). Da die inhibierende Wirkung von EPNP bekanntermaßen darauf beruht, daß EPNP mit katalytischen Aspartatresten in kovalente Wechselwirkungen tritt und dadurch eine irreversible Inaktivierung der Protease herbeiführt (Salto et al. 1994), zeigen die Ergebnisse des vorliegenden Versuchs, dass die Hemmung der TcdB₁₀₄₆₃-Aktivität auf der Hemmung einer Protease-Aktivität dieses Toxinmoleküls beruht.
Das hier beschriebene Experiment mit EPNP belegt, daß die toxische Wirkung von TcdB₁₀₄₆₃ und anderer LCTs durch Vorbehandlung der Toxine mit einem geeigneten Protease-Inhibitor signifikant reduziert wird.
EPNP stellt eine Modellstubstanz für einen kovalenten Inhibitor der LCTs dar. Weitere vergleichbar kovalent wirkende oder kompetitiv hemmende Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt oder können von diesem mit bekannten Methoden, beispielsweise mit den bereits beschriebenen "High-Troughput-Assays" ermittelt werden.
Beispiel 3: Inaktivierung der zytotoxischen Wirkung von TcdB₁₀₄₆₃ durch extrazelluläre Aktivierung der Protease-Aktivität mit IP6
TcdB₁₀₄₆₃ wurde wie in Beispiel 1 (C) beschrieben mit 100 μM IP6 inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde das durch die Protease-Aktivität abgespaltene kleinere, 63 kDa Fragment des Toxinproteins abgetrennt, indem der Ansatz über Microcon-Röhrchen (Millipore, Ausschlußgröße 100 kD) aufgereinigt wurde. Dieses 63 kDa Fragment von TcdB₁₀₄₆₃ wurde anschließend in dem in Beispiel 2 beschriebenen CHO-Test nach Moos et al. (2000) auf Abrundung der Zellen untersucht. Dabei wurde das Protein unverdünnt und in Verdünnungstufen zu den Zellen gegeben.
Es zeigte sich in diesem Versuch, daß das 63 kDa-Fragment, welches die Glucosyltransferasefunktion von TcdB₁₀₄₆₃ aufweist, unter den gegebenen Bedingungen alleine nicht in der Lage ist/war, eine zytotoxische Wirkung hervorzurufen. Weder in verdünntem noch in unverdünntem Zustand konnte eine Abrundung der Zellen (infolge einer Glukosilierung spezifischer GTPasen der Rho-Subfamilie, daraus resultierender Blockierung von Signaltransduktionsprozessen und daraus resultierender Disaggregation des Cytoskeletts) beobachtet werden. Dieser Befund, dass das mittels autokatalyse generierte Toxinfragment extrazellulär inaktiv ist, bestätigt die Ergebnisse von Pfeifer et al. (2003) und Rupnik et al (2005), die zeigen, dass die abgespaltene katalytische Domäne von TcdB₁₀₄₆₃ nicht in eukaryonte Zellen aufgenommen wird und daher im Zellmedium inaktiv ist. (Während in diesen Arbeiten jedoch eine autokatalytische Aktivität der LCTs explizit ausgeschlossen wird [Pfeiffer et al., 2003] bzw. über eine zelluläre Protease zur Aktivierung der LCTs spekuliert wird [Rupnik et al., 2005], zeigen die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gewonnenen Versuchsergebnisse erstmals, dass das N-terminale Toxinfragment autokatalytisch abgespalten wird.)
Die zytotoxische Wirkung von TcdB₁₀₄₆₃ und anderen LCTs kann folglich dadurch gehemmt werden, dass die proteolytische Spaltung der Toxine bereits vor Eindringen der Toxine in die Zellen induziert wird.
Literatur:

Ausubel, F.M. et al.: "Current Protocols in Molecular Biology" (2003), John Wiley and Sons. Inc.
Rupnik et al. (2005) "Characterization of the cleavage site and function of resulting cleavage fragments after limited proteolysis of Clostridium difficile toxin B(TcdB) by host cells." Mikrobiol 151, 199–208.
Moos et al. (2000) "Purification and evaluation of large clostridial cytotoxins that inhibit small GTPases of Rho and Ras subfamilies" Meth Enzymol. 325: 114–125.
Pfeifer et al. (2003) "Cellular Uptake of Clostridium difficile toxins B" J. Biol. Chem. 278: 44535–41.
Salto et al. (1994) "In vitro characterization of nonpeptide irreversible inhibitors of HIV proteases", J. Biol. Chem. 269: 10691–8.
Tang (1971)" Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate-like Epoxides", J. Biol. Chem. 246: 4510–17.

Tabelle 1: Autokatalytische Spaltung von TcdB₁₀₄₆₃ unter Zugabe definierter Inositolphosphate

IP	Konzentration
IP	1 mM	100 μM	10 μM
1,5			-
1,4			-
4,5			-
1,4,5			-
2,3,5			-
1,3,5			-
1,3,5,6			-
1,2,3,4,6			-
1,3,4	+		-
1,3,4,5	+		-
3,4,6	+		-
1,2,3,4	+		-
1,2,3,4,5	+		-
1,2,3,5,6	+	+	-
1,3,4,5,6	+	+	-
3,4,5,6	+	+	-
2,3,4,5,6	+	+	-
1,4,5,6	+	+	-
1,2,3,4,5,6	+	+	+

Tabelle 2: Zellabrundung (in %) von CHO-Zellen nach Inkubation mit TcdB₁₀₄₆₃ – mit oder ohne EPNP-Vorbehandlung

Verdünnung	Abgerundete Zellen [%] nach 3 h
Verdünnung	TcdB-10463	TcdB-10463 + EPNP
10^-3	100%	100%
10^-4	100%	100%
10^-5	100%	50%
10^-6	100%	10%
10^-7	10%	< 5%
10^-8	< 5%	< 5%

Claims

Arzneimittel zur Vermeidung oder Linderung einer Vergiftung durch LCT (= Large Clostridial Cytotoxins), dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff wenigstens einen Inhibitor oder Aktivator der Proteaseaktivität von LCT (Large Clostridial Cytotoxins) enthält.
Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ein Inhibitor oder Aktivator der Proteaseaktivität von Clostridium difficile Toxin A (TcdA) und/oder Clostridium difficile Toxin B (TcdB) und/oder Clostridium sordellii letales Toxin (TcsL) und/oder Clostridium novyi α-Toxin (Tcnα) ist.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor 1,2-Epoxy-3-(p-Nitrophenoxy)-Propan (EPNP) ist.
Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivator ein Inositolphosphat, vorzugsweise Inositolhexaphosphat (IP6) ist.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Hemmstoff ein kompetitv hemmendes Strukturanalogon von Inositolphosphat, vorzugsweise Inositolhexaphosphat (IP6) ist.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivator ein Stoff ist, der analog IP6 die (autokatalytische) Proteaseaktivität von LCTs, insbesondere von TcdA und/oder TcdB und/oder TcsL und/oder Tcnα fördert.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine chemische Substanz ist, die zur Reduzierung der Inositolphosphat-Konzentration im Darmlumen von Säugetieren, insbesondere Menschen, geeignet ist.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine chemische Substanz ist, die zur Reduzierung der Inositolphosphat-Konzentration in Säugetierzellen, insbesondere humanen Zellen, geeignet ist.