DE102006057724B4 - Mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Enzymen - Google Patents

Abstract

Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß,
b) Beimpfen des Minimalmediums mit einem Pilz,
c) Inkubieren des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1–4, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie
d) Gewinnen des Enzyms, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lipase, Amylase und Protease;
wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden.

Description

• Gebiet der Erfindung
• Die Erfindung betrifft ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms sowie ein Enzym, das durch dieses Verfahren gewonnnen werden kann.
• Hintergrund der Erfindung
• Heute sind etwa 5.000 chemische Reaktionen, die durch Enzyme katalysiert werden, bekannt. Für jede dieser Reaktionen sind mehrere, teilweise über 100 verschiedene Enzyme mit unterschiedlichen Eigenschaften beschrieben worden. Zudem macht die Gentechnik ein ”Protein Engineering” möglich. Trotzdem werden derzeit industriell nur etwa 10 Enzyme, z. B. die Glucose Isomerase, eingesetzt. Es gibt Beispiele für chemische Prozesse, die durch enzymatische Verfahren abgelöst werden könnten, d. h. die Funktionstüchtigkeit wurde im Labor nachgewiesen. Trotzdem erfolgt keine Umsetzung in die Produktion, weil der Preis für das Enzym zu hoch ist. Dies gilt z. B. für die Gleichung bei der Papierherstellung, die mit Laccasen möglich ist, oder für die Umesterung von Polyurethan-Vorstufen, die mit Lipasen erfolgen kann.
• Mit Ausnahme der molekularbiologischen Forschung oder der medizinischen Diagnostik, in der mehr als 100 Enzyme, z. B. Restriktionsendonukleasen, eingesetzt werden, spielt der hohe Preis für die Herstellung und Gewinnung von Enzymen häufig die entscheidende Rolle.
• Durch die heterologe Expression von Genen in etablierten Wirten, z. B. in Bakterien wie Escherichia coli oder Bacillus spec., aber auch in Pilzen, z. B. Pichia pastoris, kann fast jedes Enzym mit hoher Produktivität, d. h. einem hohen Anteil aktivem Protein pro Biomasse, hergestellt werden.
• Die Kosten für die Herstellung sind jedoch hoch, weil alle bisher bekannten Wirte in zuvor sterilisierten Anlagen und Medien kultiviert werden müssen. Die dazu nötige Steriltechnik ist ein Hauptnachteil der meisten herkömmlichen mikrobiellen Verfahren. Manche Verfahren kamen nie zum Einsatz, weil Kontaminationen nicht beherrschbar waren. Ein Beispiel dafür ist die Ethanolproduktion mit Zymomonas mobiles.
• Die DE 101 32 529 A1 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus filamentösen Pilzen (Seite 2, [0010]). Dabei wurde festgestellt, dass das Wachstum filamentöser Pilze beschleunigt wird, wenn die Kupfersulfatkonzentration des Kulturmediums deutlich verringert wird (Seite 1, [0006]).
• Die DE 102 52 245 A1 offenbart ferner ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die aus Hefekulturen der Gattung Zygosaccharomyces isoliert werden.
• Die DE 197 55 960 C1 beschreibt ein Verfahren zum Aufschluss biologischen Materials, das im festen Zustand und in Gegenwart einer festen, denaturierenden Substanz aufgeschlossen wird.
• Die WO 2004/101759 A1 beschreibt eine Nukleinsäure, die ein rekombinantes lipolytisches Enzym kodiert, sowie Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms (Ansprüche 1 und 13). Neben anderen Wirtszellen werden filamentöse Pilze zur rekombinanten Expression des lipolytischen Enzyms verwendet (Seite 16, [0082]).
• Die EP 1 035 776 B1 bezieht sich auf Pilze der Gattung Piriformospora sowie deren Verwendung zur Förderung von Wachstum, Gesundheit und/oder Ernährung von Pflanzen. Sporen werden aus Freilandproben isoliert, die nicht nur mit Bakterien, sondern auch mit Pilzen kontaminiert sind (Seite 6, [0044]). Die isolierten Sporen werden oberflächensterilisiert und auf Minimalmedium kultiviert.
• Steriltechnik bedeutet nicht nur hohe Investitionskosten für Autoklaven und Dampferzeuger sowie temperatur- und druckstabile Behältnisse, Leitungen und Ventile aus Stahl, sondern auch hohe Betriebskosten in Form von Energie sowie Zeit für das Aufheizen und das Abkühlen.
• Wegen dieser hohen Kosten müssen die Raum-Zeit-Ausbeuten durch hohe Wachstumsraten und hohe Endzelldichten maximiert werden. Diese Anforderung zieht eine Kette von Konsequenzen nach sich, die wiederum hohe Kosten verursachen. So werden zunächst komplexe Medien mit teuren Bestandteilen, z. B. Hefeextrakt, eingesetzt. Zum optimalen Gasaustausch müssen weiterhin Rührer bei hoher Geschwindigkeit betrieben werden. Das kostet doppelt Energie, denn es muss ferner gegengekühlt werden. Die komplexen Medien erlauben es zudem nicht, bei rekombinanten Verfahren Komplementationsmarker, z. B. für Aminosäureauxotrophien, einzusetzen. Stattdessen werden, z. B. für die Produktion rekombinanter Enzyme mit Bacillus spec., dominante Marker, d. h. Resistenzgene für Antibiotika eingesetzt. Letztere stellen einen weiteren Kostenfaktor dar. Dabei ist nachteilig, dass der Einsatz von Antibiotika Einschränkungen, z. B. beim Einsatz der Produkte für die Ernährung, verursacht.
• Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms bereitzustellen, das die oben zusammengefassten Nachteile überwindet. Während herkömmliche Verfahren Investitionskosten in zweistelliger Millionenhöhe erfordern, liegen die Kosten zur Durchführung der Er- findung in der Größenordnung eines landwirtschaftlichen Nutzfahrzeugs, wie z. B. eines Traktors. Dadurch wird ein neuer selbständiger Beruf, der ”Enzymwirt”, möglich.
• Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte:
• a) Bereitstellen eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß,
• b) Beimpfen des Minimalmediums mit einem Pilz,
• c) Inkubieren des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1–4, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie
• d) Gewinnen des Enzyms, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lipase, Amylase und Protease; wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden.
• Ferner wird ein Enzym, das durch das erfindungsgemäße Verfahren unmittelbar hergestellt ist, offenbart.
• Kurzbeschreibung der Figuren
• 1 zeigt das Wachstum des Acremonium strictum Isolats AW02 auf einer Agarplatte mit einem Vollmedium aus 10 g/l Glucose und Hefeextrakt, das mit 20 g/l Agar verfestigt wurde. Links ist eine ganze Agarplatte gezeigt, rechts eine Ausschnittvergrößerung des Luftmyzels.
• 2 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme des Acremonium strictum Isolats AW02 nach Anfärbung mit Nile Red. Der hydrophobe Fluoreszenzfarbstoff lagert sich bevorzugt in Lipidtröpfchen ein, die den Zellen möglicherweise als
• 3 zeigt ein Phasenkontrastbild der Kulturbrühe nach 3 Tagen Wachstum bei 34°C und 120 rpm in Minimalmedium mit 50 g/l Glucose. Zu sehen sind überwiegend Sporen.
• 4 zeigt die Lipaseaktivität in einer Kultivierung in einem großen offenen Gefäß. Nach Durchmischung der Kultur mit einem Betonrührer wurde eine Probe entnommen und durch eine French-Press Passage homogenisiert. Das Homogenat wurde in einem kontinuierlichen kolorimetrischen Lipasetest eingesetzt. Dabei wurde die Hydrolyse von para-Nitrophenylpalmitat bei 405 nm gemessen. Eine Einheit (U) entsprach 1 μmol freigesetztem para-Nitrophenol pro Minute.
• 5 zeigt ein einfaches Kultivierungssystem für einen Lipaseproduzenten. Es wurden 100 l wie in Tabelle 4 beschrieben mit 20 g/l Sojabohnenöl hergestellt. Die Kultur wurde durch verdichtete Luft durch eine Fritte gemischt und bei 21°C gehalten. Über einen Zeitraum von 14 Tagen war keine Kontamination mit anderen Mikroorganismen mikroskopisch erkennbar. Jedoch wurde nur langsames Wachstum beobachtet. Nach Ende des Versuchs wurde eine schlammartige Myzelmasse am Boden des Gefäßes festgestellt.
• 6 zeigt ein Gefäß in Form eines großen Gefäßes mit einem Fassungsvermögen von 100 l Kulturmedium. Eine Vorrichtung zum Einleiten von steril filtrierter Luft ist vorgesehen. Ein zweites identisches Gefäß wurde vertikal in sechs Segmente zerschnitten. Diese Segmente dienten der erleichterten Ernte des Biofilms. Nach Animpfen des Mediums mit einer Sporensuspension besiedelte das wachsende Myzel die Oberfläche der Segmente und bildete ein Biofilm. Ca. 90% der Lipaseaktivität konnten durch Entnahme, Abtropfen und Abkratzen der Segmente geerntet werden.
• Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte:
• Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte:
• a) Bereitstellen eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß,
• b) Beimpfen des Minimalmediums mit einem Pilz,
• c) Inkubieren des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1–4, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie
• d) Gewinnen des Enzyms, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lipase, Amylase und Protease;
wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden.
• Wesentlich für die Erfindung ist die Isolierung eines Mikroorganismus, der sich auf nicht sterilisiertem Medium zuverlässig durchsetzt. Als Selektivbedingungen wurden konkrete Konditionen eingestellt. Zunächst wurde ein Minimalmedium mit Nitrat als Stickstoffquelle verwendet. Weiterhin wurde eine Kohlenstoffquelle verwendet, wobei sich emulgiertes pflanzliches Fett als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle als vorteilhaft erwiesen hat. Ferner wurde der Ausgangs pH-Wert auf einen sauren Bereich von 1 bis 4 eingestellt, wobei ein pH-Wert von 3 besonders geeignet war. Eine Inkubationstemperatur von 35°C hat sich ebenfalls als vorteilhaft erwiesen.
• In Schritt c) kann sich der Pilz zunächst sichtbar an der Gefäßwand als Biofilm abscheiden. Wenn der Pilz in einem Schüttel- oder Schikanekolben in Suspensionskultur angezogen wird, trübt sich das Minimalmedium durch das Wachstum des Pilzes. Diese optische, mit bloßem Auge sichtbare Trübung des Mediums ist ebenfalls ein Zeichen, dass der Pilz ausreichend lange angezogen wurde.
• In Schritt d) kann das Enzym aus dem Biofilm oder aus dem Minimalmedium (Kulturbrühe) gewonnen werden.
• Mit einem derart isolierten Mikroorganismus wurde das denkbar einfachste Submersverfahren etabliert, erprobt und für die Herstellung von Lipase verwendet.
• Das Enzym ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Lipase, Amylase und Protease. Diese gehören zu der Klasse der extrazellulären Hydrolasen. Lipasen spalten Triglyzeride in Fettsäuren und Glyzerin, welche dann vom Mikroorganismus in die Zelle aufgenommen werden können. Amylasen spalten alpha-1,4 verknüpfte Glucoseketten. So genannte Endoglucanasen setzen Oligomere frei, während Exoglucanasen in der Regel Maltose abspalten. Auch hier dient der Abbau dazu, dem Mikroorganismus die Aufnahme der Abbauprodukte in den Energie- und Aufbaustoffwechsel zu ermöglichen. Die Protease hydrolysiert schließlich Proteine in Peptide, für die es in Pilzen hocheffiziente Importer gibt. Intrazellulär erfolgt dann die Zerlegung in Aminosäuren und je nach Bedarf der Abbau zu Ketosäuren oder die Aktivierung für die Proteinbiosythese.
• Es ist weiterhin vorteilhaft für die Herstellung von Lipase als Kohlenstoffquelle ein Fett, insbesondere pflanzliche Triglyzeride, wie beispielsweise Sojaöl, Sonnenblumenöl oder Rapsöl zu verwenden. Nur wenige Organismen können diese als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Sojaöl hat den besonderen Vorteil, dass nur wenige Pilze dieses Fett schnell und wirksam als einzige Kohlenstoffquelle verwerten können. Damit wirkt das Sojaöl auch als Selektionsmittel, um das Wachstum von anderen, ungewünschten Mikroorganismen zu begrenzen. Für die Herstellung von Amylase eignet sich als Kohlenstoffquelle insbesondere Stärke. Um ein Proteaseenzym zu bilden kann insbesondere Gelatine verwendet werden.
• Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, als Stickstoffquelle Nitrat zu verwenden. Nitrat ist kostengünstig und schließt Mikroorganismen als Kontaminanten des Verfahrens aus, die Nitrat nicht reduzieren können.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Minimalmedium, bezogen auf einen Liter Wasser
  0,5 bis 10 g KNO₃
  0,5 bis 5 g KH₂PO₄
  0,2 bis 0,75 g MgSO₄ × 7H₂O
  0,2 bis 0,75 g FeSO₄ × 7H₂O
  0,2 bis 0,75 g ZnSO₄ × 5H₂O
  0,01 bis 0,05 g CuSO₄ × 5H₂O
  0,01 bis 0,05 g MnCl₂ × 4H₂O und
  5 bis 100 ml Sojaöl.
• Am meisten bevorzugt umfasst das Minimalmedium, bezogen auf einen Liter Wasser
  ca. 1,5 g KNO₃
  ca. 1,5 g KH₂PO₄
  ca. 0,5 g MgSO₄ × 7H₂O
  ca. 0,5 g FeSO₄ × 7H₂O
  ca. 0,5 g ZnSO₄ × 5H₂O
  ca. 0,02 g CuSO₄ × 5H₂O
  ca. 0,02 g MnCl₂ × 4H₂O und
  ca. 18 ml Sojaöl.
• Um über das Wasser keine, das Wachstum hemmenden Substanzen einzutragen, muss entionisiertes Wasser verwendet werden.
• Es ist weiterhin bevorzugt, den Pilz für die Enzymproduktion aus der Gruppe bestehend aus Deuteromyceten und Anamorphen der Ascomyceten auszuwählen.
• Als besonders geeignet erscheinen die Pilze Acremonium strictum, Aspergillus spec., Botrytis cinerea oder Trichoderma spec.
• Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei saurem pH-Wert zwischen ca. pH 1 und pH 4 durchgeführt. Ein Ausgangs pH-Wert von 3 hat sich für die Herstellung von Lipase auf der Basis von Sojaöl als besonders vorteilhaft erwiesen. Wenn insbesondere der Pilz Aspergillus nidulans zur Herstellung von Lipase verwendet wird, könnte sich ein noch niedrigerer pH-Wert von ca. 2,5 als besonders geeignet erweisen.
• Weil der Pilz in einem Minimalmedium auf Mineralsalzbasis und einer erst zu hydrolysierenden Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, hat sich gezeigt, dass die Inkubationszeit bis zu 14 Tage dauern kann.
• Die Enzymproduktion kann deutlich gesteigert werden wenn das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur zwischen 20°C und 45°C, vorzugsweise bei 20°C bis 35°C, weiter bevorzugt bei ca. 21°C durchgeführt wird. Besonders bevorzugt ist ein Temperaturbereich über Raumtemperatur, am besten bei ca. 35°C.
• Nachdem die Enzymproduktion durch die Pilze bevorzugt im aeroben Milieu stattfindet, ist es in einer weiteren Ausführungsform bevorzugt das Minimalmedium zu belüften. Besonders geeignet hierfür ist die Belüftung über einen Sterilfilter und eine Fritte.
• Obwohl das Verfahren weitestgehend bei nicht sterilen Bedingungen und damit extrem kostengünstig durchgeführt werden kann, hat es sich als vorteilhaft erwiesen für die Inokulumkultur, mit der das Minimalmedium beimpft wird, sterile Be dingungen zu verwenden. Damit wird sichergestellt, dass das Minimalmedium mit einer reinen Pilzkultur beimpft wird, die nicht durch Bakterien oder andere unerwünschte Mikroorganismen kontaminiert ist.
• Um die Gewinnung des Enzyms aus dem erfindungsgemäßen Verfahren zu vereinfachen, werden in den Kessel bzw. das große Gefäß leicht zu entnehmende und leicht zu reinigende Segmente mit großer Oberfläche eingeführt, auf denen der Pilz als Biofilm aufwächst und dann leicht aus der Kultur geerntet und weiter verarbeitet werden kann. Bevorzugt werden deshalb solche Pilze eingesetzt, bei denen die gewünschten Hydrolasen nicht frei diffundierbar, sondern Zell-assoziiert vorliegen.
• Das Volumen des Minimalmediums beträgt vorzugsweise 1 Liter bis 3.500 m³. Besonders geeignet ist ein Volumen von ca. 100 Liter. Im einfachsten Fall kann als Kulturgefäß ein großes Gefäß bzw. ein Kessel oder eine Tonne verwendet werden, das mit einer Sporensuspension beimpft wird.
• Des Weiteren wird ein Enzym, vorzugsweise eine Lipase, Amylase oder Protease, die durch das erfindungsgemäße Verfahren unmittelbar hergestellt ist, offenbart.
• Bevorzugte Ausführungsformen und detaillierte Beispiele Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung näher dar. Sie sind exemplarisch angegeben und sollen den Schutzbereich der Erfindung nicht beschränken.
• Beispiel 1
• Isolierung eines geeigneten Mikroorganismus
• Aus verschiedenen Komposthaufen wurden Proben auf Agarplatten mit folgender Medienzusammensetzung ausgestrichen.

  KNO3	1,5 g
  Agar	20 g
  H2O, deionisiert	ad 1 Liter
  pH-Wert:	3

• Das Sojaöl wurde vor dem Gießen der Platten emulgiert. Anfangs wurde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Temperatur schrittweise bis 35°C erhöht. Beim Überimpfen auf neue Platten wurden makroskopisch verschiedene Kolonien getrennt. Der auf diese Weise isolierte Mikroorganismus wurde als AW02 bezeichnet und von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig als Acremonium strictum bestimmt.
• Das Myzel von Acremonium strictum wurde als sehr zart beschrieben. Der Hyphendurchmesser betrug etwa 1–1,5 μm. Die Konidienträger waren kurz und selten. Die Phialiden waren einfach, nicht chromophil, seitlich an undifferenzierten Hyphen angeordnet, bis zu 25 μm lang und kamen meist direkt am Luftmyzel vor. Die Konidien waren zylindrisch/ellipsoid mit einer Größe von ca. 4–5 × 1,6 μm, und sie waren in einem schleimigen Körbchen angeordnet. Es konnten keine Chlamydosporen nachgewiesen werden.
• Acremonium strictum wurde in der wissenschaftlichen Literatur als Lipaseproduzent beschrieben. Okeke und Okolo, (1990), Biotechnology Letters 12:747-750 verwendeten jedoch zur Anzucht ein Vollmedium mit 10 g/l Pepton. In dieser Veröffentlichung wird auch die Durchführung eines Standard Lipase Assays beschrieben. Die Lipaseaktivität konnte durch ein Titrationsverfahren gemessen werden. Das Assay Gemisch enthielt 5 ml einer Enzymlösung und 5 ml Citrat/Na₂HPO₄ Puffer (pH 7,5) mit 0,05 mol/l CaCl₂ und 3% (v/v) Tween 80. Die Reaktion wurde unter Rühren bei 35°C für 30 min durchgeführt. Sie wurde durch die Zugabe von 10 ml Aceton/Ethanol Gemisch (1:1, v/v) beendet. Die Menge der freigesetzten Fettsäuren wurde mit 0,05 mol/l KOH unter Verwendung von 0,3 ml 1% Phenolphthalein Lösung als einem Indikator titriert. Eine für 3 min aufgekoch te Enzymlösung wurde als eine Kontrolle verwendet. Mit diesem Test konnten z. B. nach Wachstum auf Xylose über 400 U/ml Lipaseaktivität gemessen werden.
• Laut Gentechnik-Sicherheitsverordnung gehört Acremonium strictum zur geringsten Risikogruppe 1. Dazu zählen Organismen, die sich durch experimentell erwiesene und langfristig sichere Anwendung auszeichnen, also keine Gefahr für Mensch, Tier oder für die Umwelt darstellen.
• Der Mikroorganismus Acremonium strictum AW02 wuchs mit weißem Substrat- und Luftmyzel auf Vollmediumplatten mit Glucose als Kohlenstoffquelle (1). Unter dem Mikroskop zeigte AW02 filamentöse Zellen mit auffälligen Tröpfchen. Diese ließen sich mit dem Fluoreszenzfarbstoff Nile Red anfärben (2). Dies deutet auf eine intrazelluläre Speicherung von Triglyceriden hin. AW02 war in der Lage in Submerskultur auf Mineralsalzmedium Biomasse zu bilden. Das beste Wachstum wurde mit Sojaöl, das Geringste mit Glycerin als Kohlenstoffquelle gemessen. Maximal wurden aus 5 g/l Substrat 3 g/l Biomasse gewonnen (vgl. Tabelle 1).
• Tabelle 1
• Dargestellt ist das Wachstum von Acremonium strictum Isolat AW02 auf Minimalmedium mit je 5 g/l verschiedener Kohlenstoffquellen. Dazu wurden Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml mit 50 ml Medium mit je 10 Sporen beimpft. Nach drei bis fünf Tagen bei 34°C und 120 rpm wurde das Myzel durch Zentrifugation oder Filtration geerntet und lyophilisiert.

  Kohlenstoffquelle	Trockengewicht [g/l]
  	Messwerte	Mittelwerte ± Standardabweichung
  Glycerin	0,130
  	0,104	0,1 ± 0,0
  	0,094
  Glucose	0,996
  	1,238	1,3 ± 0,3
  	1,642
  Saccharose	1,342
  	0,564	1,6 ± 0,9
  	2,830
  Sojaöl	0,152
  	2,594	1,9 ± 1,3
  	3,096

• Der isolierte Pilz zeigte in Submerskultur eine massive Sporulation. In 500 ml Schüttelkolbenkultur wurden 10⁸ Sporen pro ml gebildet (vgl. Tabelle 2). Die Sporen erschienen im Phasenkontrastmikroskop einzellig, zeigten meist zwei auffällige intrazelluläre Partikel und waren etwa 10 μm groß (3).
• Tabelle 2
• Dargestellt ist die Sporulation von Acremonium strictum Isolat AW02 auf Minimalmedium bei verschiedenen Glucosekonzentrationen. In sechs 500 ml Schikane kolben wurden je 50 ml Medium beimpft und drei Tage bei 34°C inkubiert. Die Sporen wurden in der Thoma-Kammer gezählt.

  Glucosekonzentration	Sporen [ml] Einzelwerte	Mittelwerte	Standardabweichung
  10 g/l	4,60E + 08
  	3,30E + 08	3,95E + 08	6,50E + 07
  20 g/l	3,40E + 08
  	5,10E + 08	4,25E + 08	8,50E + 07
  50 g/l	7,50E + 08
  	7,70E + 08	7,60E + 08	1,00E + 07

• Beispiel 2:
• Etablierung eines einfachen Verfahrens zur Herstellung einer Lipase
• Zur Herstellung eines Inokulums wurde der Pilz in sterilem Minimalmedium mit 20 g/l Glucose und einem Start pH 3 bei 34°C inkubiert. Nach vier Tagen Inkubation von 100 ml in einem 500 ml Kolben mit Schikanen war das Myzel komplett zu Sporen zerfallen. Die Sporen waren mit 30% Glycerin bei –20°C lagerfähig. Mit diesen Sporen wurde ein 200 Liter Gefäß mit 100 Liter Minimalmedium beimpft. Weder das Gefäß noch das Medium wurden sterilisiert. Verlauf:

  Tag 1	Animpfen mit 100 ml aussporulierter Vorkultur Minimalmedium mit 5 g/l Sojaöl, pH 3, Raumtemperatur, 1 × am Tag mit Bohrmaschine und Betonrührer durchmischt Begasung 14 l/min Druckluft über einen 0,2 μm Membranfilter
  Tag 4	Makroskopisch: sehr geringe Mediumtrübung Mikroskopisch: vereinzelte Myzelfäden
  Tag 5	Makroskopisch: Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar Mikroskopisch: Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar
  Tag 6	Makroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar, kleine Myzelkugeln Mikroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar
  Tag 7	Makroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar Mikroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar, Sporenbildung
  Tag 8	Makroskopisch: Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar, Myzel gleichmäßig im ganzen Medium verteilt Mikroskopisch: sehr viele Sporen

• Vom vierten Tag an war in mechanisch homogenisierten Proben Lipaseaktivität messbar. Maximal wurde eine Freisetzung von 125 μmol/l/min Nitrophenol aus einem Palmitinsäureester gemessen (4).
• Um die Lokalisation der Lipase-Aktivität zu untersuchen, wurden am achten Tag 40 ml Kulturbrühe zentrifugiert. Im Überstand waren 24 U/l messbar. Das Pellet wurde in 5 ml Wasser resuspendiert und homogenisiert. Darin wurden 700 U/l Lipase-Aktivität gemessen. Weil dadurch das Volumen auf ein Achtel reduziert wurde, bedeutet dies, dass der überwiegende Teil der Aktivität zellassoziiert vorlag.
• Von 500 ml Öl, die für 100 l Medium eingesetzt worden waren, konnten nach Abbruch am achten Tag noch 460 ml als leichtere Phase von der Kulturbrühenoberfläche abgeschöpft werden.
• Beispiel 3:
• Einfluss des Mediums auf die Lipaseproduktion
• Es konnte gezeigt werden, dass sich Änderungen der Kohlenstoff- und Energiequelle oder der Salzkonzentrationen deutlich auf Wachstum und die Produktion von Lipaseaktivität auswirken. Auf den Einsatz von entionisiertem Wasser konnte nicht verzichtet werden. Mit Leitungswasser wuchs der Acremonium strictum praktisch nicht. Der Einsatz von Glucose führte nur zu ganz geringen Lipaseaktivitäten.
• Obwohl die Lipaseaktivität nach dem Standard Literatur Lipase Assay (Okeke und Okolo, supra) gemessen werden kann, wurde ein neuer kontinuierlicher Lipase Assay gemäß Kabaoglu mit einem konstanten pH-Wert von 8,0 etabliert, in dem Desoxycholat gegen Triton X-100 ausgetauscht war. Die Verlässlichkeit des Assays wurde anhand von vier kommerziell erhältlichen Lipasen (vgl. Tabelle 3) überprüft, und es wurde eine gute Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers erhalten.
• Tabelle 3
• Überprüfung des Assays durch die Analyse von vier kommerziell erhältlichen Lipasen. Der Assay wurde mit 100 μl reiner Enzymlösung durchgeführt.

  Hersteller	Bezeichnung	angegebene Aktivität [U/ml]	nachgewiesene Aktivität [U/ml]
  Novostab	K 311305i	12.000	12.928
  Novarenko	K 311307ik	20.000	18.808
  Novarenko	K 311307i	5.000	5.885
  	Saulich	-	1,140*

• * in [U/mg]
• Ferner wurden der Einfluss von Sojabohnenöl oder Glucose in Minimalmedium auf die extrazelluläre Lipaseaktivität untersucht. Die höchste Aktivität (~90 U/l) im Kulturüberstand wurde mit 10 g/l Sojabohnenöl nachgewiesen. Die geringste Aktivität (~1 U/l) wurde beim Wachstum auf Glucose gefunden (vgl. Tabelle 4).
• Tabelle 4
• Lipaseaktivität in Kulturüberständen. Der Stamm AW02 wurde in Minimalmedium mit 1,5 g KNO₃, 0,5 g MgSO₄ × 7H₂O, 1,5 g KH₂PO₄, 0,5 mg FeSO₄ × 7H₂O, 0,5 mg ZnSO₄ × 7H₂O, 0,02 mg CuSO₄ × 5H₂O und 0,02 mg MnCl₂, gelöst in 1 l destilliertem Wasser, kultiviert. Sojabohnenöl oder Glucose wurden in verschiedenen Konzentrationen als die einzige Kohlenstoffquelle eingesetzt. Das Experiment wurde als Doppelbestimmung in zwei unabhängigen Schüttelkolben durchgeführt. Die Kulturen wurden bei 32°C und 120 rpm inkubiert, und der Assay wurde wie folgt durchgeführt:
  Für die Lipasebestimmung wurden 2 ml Probe aus jeder Kultur entnommen, 15 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, und der Überstand wurde für den Assay verwendet. Ein Substratgemisch A/B (1:9, v/v) wurde durch Emulgieren der Lösung A (30 mg p-Nitrophenylpalmitat, gelöst in 10 ml Isopropanol) in Lösung B (0,8 g Triton X-100, 0,1 g Gummi arabicum in 100 ml 100 mmol/l Tris-HCl pH 8,0) hergestellt. 900 μl des Gemisches A/B wurden mit 100 μl Enzymlösung inkubiert, und die Aktivität wurde über einen Zeitraum von 240 sek. bei 405 nm und 30°C bestimmt. Als Negativkontrolle wurde durch Hitze inaktiviertes Enzym (10 min, 95°C) gemessen. Die Werte, die als ”n. n.” in der Tabelle angegeben sind, waren nicht nachweisbar. Die Grenze für dieses Messverfahren betrug < 1 U/l.

  	Aktivität [U/l]
  	Tag 5	Tag 6	Tag 7	Tag 8	Tag 11
  10 g/l Sojabohnenöl	88	14	n. n.	1	n. n.
  	68	15	n. n.	1	n. n.
  20 g/l Sojabohnenöl	5	n. n.	n. n.	1	n. n.
  	9	4	31	n. n.	5
  50 g/l Sojabohnenöl	14	10	6	4	2
  	28	7	n. n.	n. n.	5
  20 g/l Glucose	1	n. n.	n. n.	n. n.	n. n.
  	1	n. n.	n. n.	n. n.	n. n.

• Nach der Ernte wurde zum Kulturüberstand und im mechanisch homogenisierten Myzel Lipaseaktivität bestimmt. Im Myzel fand sich eine 100-fach erhöhte Aktivität im Vergleich zu Kulturüberstand. Dies bedeutet, dass die Lipase Zell-assoziiert vorlag.
• Tabelle 5
• Bestimmung der Lipaseaktivität mit homogenisiertem Myzel nach einem Kultivierungszeitraum von 11 Tagen. 15 ml Kulturlösung wurden filtriert, das Myzel wurde geerntet und in 1,5 ml Assay Puffer (Lösung B) suspendiert. Das Myzel wurde anschließend durch eine French Press Passage homogenisiert und 20 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. 100 μl Überstand wurden wie oben beschrieben untersucht.

  	Aktivität [U/l]
  	Kulturüberstand	French Press Aufschluss des Myzels	Kulturbrühe (berechnet)
  10 g/l Sojabohnenöl	n. n.*	838	84
  	n. n.	995	99
  20 g/l Sojabohnenöl	n. n.	338	34
  	5	192	19

• * n. n. = nicht nachweisbar
• Nach 5 Tagen des Wachstums wurde eine vollständige Transformation des Myzels in Sporen beobachtet nachdem die Glucose verbraucht war. Es wurden mindestens 10⁸ Sporen pro 100 ml gebildet.
• Weiterhin wurde eine 100 l Kultur begonnen. Obwohl sie unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wurde, wurde keine Kontamination mit anderen Mikroorganismen beobachtet. Nach 5 Tagen des Wachstums wurden 11 U/l und nach 6 Tagen des Wachstums 7 U/l in dem Kulturüberstand nachgewiesen. Die Kulturvorrichtung ist schematisch in 5 gezeigt. Zu sehen ist ein Kulturgefäß mit einem Fassungsvermögen von mindestens 100 l. Das Kulturgefäß wird mit Mineralsalzlösung in deionisiertem Wasser bestückt. Gezeigt ist ferner eine Vorrichtung zur Einleitung von Druckluft, die über einen sterilen Luftfilter in die Fritte des Gefäßes gelangt. So konnte die Kultur optimal belüftet werden.
• Ein erster Ansatz, um die Kulturbedingungen zu optimieren, begann bei einer Lipaseaktivität von 5.700 U/l im Kulturhomogenat nach 7 Tagen Wachstum auf 10 g/l Sojabohnenöl. Eine Verringerung des Sojabohnenöls auf 5 g/l zeigte einen Anstieg in der Aktivität auf 6.200 U/l, und eine Verdopplung der Salzkonzentration zeigte einen Anstieg der Aktivität auf ~9.000 U/l (vgl. Tabelle 6). Keines oder sehr verringertes Wachstum wurde beobachtet, wenn Leitungswasser anstelle von destilliertem Wasser verwendet wurde. In Leitungswasser konnte keine Lipaseaktivität nachgewiesen werden.
• Tabelle 6
• Bestimmung von Lipaseaktivität in homogenisierter Kultur. Aus zwei verschiedenen Schüttelkolben wurden jeweils 3 ml Kultur entnommen, und das Myzel wurde durch Ultraturrax Behandlung für 1 Minute homogenisiert. 100 μl wurden wie oben beschrieben untersucht.

  	Aktivität [U/l]
  	Tag 2	Tag 3	Tag 4	Tag 7
  Destilliertes Wasser, 10 g/l Sojabohnenöl, 1 × Salz	1	18	148	5.705
  	8	17	143	1.410
  Destilliertes Wasser, 5 g/l Sojabohnenöl, 1 × Salz	62	275	2.445	6.206
  	23	119	1.668	6.286
  Destilliertes Wasser, 10 g/l Sojabohnenöl, 2 × Salz	23	8	11	n. n.
  	24	118	834	8.958
  Leitungswasser, 10 g/l Sojabohnenöl, 2 × Salz	8	10	4	11
  	n. n.*	1	6	3
  Leitungswasser, 10 g/l Sojabohnenöl, 1 × Salz	n. n.	n. n.	7	n. n.
  	n. n.	n. n.	2	n. n.

• * n. n. = nicht nachweisbar
• Beispiel 4
• Lipaseaktivität im Biofilm
• Es konnte ferner gezeigt werden, dass sich Acremonium strictum AW02 als Biofilm an der Oberfläche von Plastiksegmenten, die in ein Gefäß eingehängt wurden, absetzt, wenn nicht gerührt wird, sondern nur die aufsteigenden Luftblasen für Konvektion sorgen. Über 99% der Enzymaktivität wurde im homogenisierten Biofilm gemessen. Der Verzicht auf das Rühren erspart die Filtration oder Zentrifugation für die Zellernte.
• Ziel dieses Versuchs war es, die Lipaseaktivität von Acremonium strictum (Stamm AW02) in einer 100 l Kultur zu charakterisieren. Insbesondere sollten die Fragen untersucht werden, ob die Lipase zellgebunden ist oder frei diffundiert, falls die Lipase zellgebunden ist, ob sie entfernt werden kann und welche Temperaturtoleranz die Lipase aufweist.
• Für diesen Versuch wurden zwei Gefäße (vgl. 6) verwendet. In 6 ist ein Gefäß mit den Maßen 84 cm × 42 cm gezeigt. Es besitzt ein Fassungsvermögen von mindestens 100 l. Gezeigt ist ferner eine Vorrichtung zur Einleitung von steriler Luft, mit welcher die Zellkultur belüftet werden kann. Eines der Gefäße wurde vertikal in sechs Segmente zerschnitten. Drei dieser Segmente wurden in das erste Gefäß über den Rand eingehängt. Über diese Segmente konnte der sich auf der Oberfläche bildende Biofilm einfach aus dem Medium herausgehoben und von der Oberfläche abgekratzt werden.
• Das Medium wurde mit einer Sporensuspension (100 ml, 10¹⁰ Sporen) inokuliert. Acremonium strictum AW02 wuchs unter aeroben Bedingungen in 100 l Minimalmedium mit 1,5 g/l KNO₃, 0,5 g/l MgSO₄ × 7H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 0,5 mg/l FeSO₄ × 7H₂O, 0,5 mg/l ZnSO₄ × 7H₂O, 0,05 mg/l CuSO₄ × 5H₂O und 0,02 mg/l MnCl₂.
• Acremonium strictum AW02 wuchs als ein weißer Biofilm auf der Oberfläche der Segmente des Gefäßes. Die Hyphen, die in den Biofilm eingebettet sind, waren nach einer Anfärbung mit Kongorot sichtbar.
• Nach dem Wachstum wurde der Biofilm geerntet. Nach Suspension und Zentrifugation wurde sowohl mit dem Überstand als auch mit dem Pellet, welches resuspendiert und per French Press homogenisiert wurde, ein Lipase Aktivitätstest durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass im Überstand nahezu keine Lipaseaktivität nachweisbar war, wohingegen eine gegenüber dem Überstand ca. 40-fach gesteigerte Lipaseaktivität in der Suspension nach der French Press nachweisbar war. Dies zeigte, dass die Lipase an dem Biofilm bzw. zellgebunden ist. Zur Be stimmung der Verteilung der Lipaseaktivität in dem Biofilm und der Kulturflüssigkeit wurde 1/6 (23,7 g) des Biofilms aus dem 100 l Gefäß geerntet. Davon wurden 1,5 g resuspendiert, durch eine French Press Passage homogenisiert und darin eine Lipaseaktivität von 280 U/l gemessen. Ferner wurden 22,2 g lyophilisiert, was zu einem Trockengewicht von 3,2 g führte. Hiervon wurden 0,2 g resuspendiert, was zu einer Lipaseaktivität von 920 U/l führte. Parallel wurden 200 ml Kulturmedium aus dem 100 l Gefäß entnommen, auf 20 ml durch Ultrafiltration konzentriert und einem Lipase Assay unterzogen. Dieser Lipase Aktivitätstest führte lediglich zu 2 U/l. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Ultrafiltration nur zu einem schwachen Anstieg in der Aktivität des Kulturmediums führte, was anzeigte, dass die Lipase nur geringfügig freigesetzt wird.
• Zur Bestimmung der schwachen Freisetzung der Lipaseaktivität aus dem Biofilm wurde eine Behandlung mit wiederholtem Scheren oder Glucanase Behandlung verwendet. Ein Teil des Biofilms wurde mit β-1,3-Glucanasegemisch (Glucanex) für 60 min bei 32°C inkubiert. Der Versuch die Matrix des Biofilms und/oder die Zellwand enzymatisch zu degradieren zeigte eine schwache Freisetzung der Lipaseaktivität in den Überstand. Ein anderer Teil des Biofilms wurde resuspendiert und mit einem Ultraturrax für 1 min, 2 min und weitere 10 min behandelt. Nach jeder Behandlung wurden die Suspension und der Überstand hinsichtlich Lipaseaktivität gemessen. Die Lipaseaktivität wurde nur geringfügig aus dem Überstand freigesetzt. Aufgrund des Aktivitätsverlustes vermuten die Erfinder, dass die Biofilm gebundene Lipase durch die Ultraturrax Behandlung zerstört wird.
• Ferner wurde nachgewiesen, dass die Lipase eine breite Temperaturtoleranz zeigte. Der Biofilm wurde mittels French Press Passage homogenisiert und dieses Homogenisat direkt für den Stabilitätstest engesetzt. Es folgte eine Inkubation bei einer Temperatur von 30 bis 65°C, jeweils in 5er Temperaturschritten für 60 min. Das Material wurde gefriergetrocknet, und es wurde ein Lipase Aktivitätstest durchgeführt. Die Stabilität der Lipaseaktivität wurde durch eine Stunde Vorinkubation bei Temperaturen zwischen 30°C und 65°C und anschließenden Aktivitäts test gemessen. Zwischen 30°C und 45°C wurde kein signifikanter Aktivitätsverlust festgestellt. Nach einer Stunde bei 50°C fiel die Restaktivität auf 50%.
• Zusammenfassend konnte deshalb festgestellt werden, dass Acremonium strictum wirksam als ein Biofilm in einem Gefäß unter nicht sterilen Bedingungen angezogen werden kann. 99,4% der Lipaseaktivität war an den Biofilm gebunden. Es wurde eine schwache Lipase Aktivitätsfreisetzung nach mechanischem Scheren oder Glucanase Behandlung beobachtet. Die Lipaseaktivität war nach Lagerung bei –20°C als auch nach Inkubation für 60 min bei 40°C stabil.
• Abschließend sei angemerkt, dass sämtlichen Merkmalen, die in den Anmeldungsunterlagen und insbesondere in den abhängigen Ansprüchen genannt sind, trotz dem vorgenommenen formalen Rückbezug auf einen oder mehrere bestimmte Ansprüche, auch einzeln oder in beliebiger Kombination eigenständiger Schutz zukommen soll.
• Referenzliste
• Okeke und Okolo, (1990), „The Effect of Cultural Conditions an the Production of Lipase by Acremonium strictum”, Biotechnology Letters 12:747-750
• Kabaoglu F (2005) Studien zur Optimierung der rekombinanten Genexpression in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris, Dissertation, Universität Konstanz, Fachbereich Biologie.
• DE 101 32 529 A
• DE 102 52 245 A1
• DE 197 55 960 C1
• WO 2004/101759 A1
• EP 1035 776 B1

Claims (15)

1. Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß, b) Beimpfen des Minimalmediums mit einem Pilz, c) Inkubieren des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1–4, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie d) Gewinnen des Enzyms, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lipase, Amylase und Protease; wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffquelle ein Fett, Polysaccharide oder Proteine ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fett vorzugsweise ein pflanzliches Triglyzerid, weiter bevorzugt Sojaöl ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Stickstoffquelle Nitrat ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Minimalmedium, bezogen auf einen Liter Wasser 0,5 bis 10 g KNO₃ 0,5 bis 5 g KH₂PO₄ 0,2 bis 0,75 g MgSO₄ × 7H₂O 0,2 bis 0,75 g FeSO₄ × 7H₂O 0,2 bis 0,75 g ZnSO₄ × 5H₂O 0,01 bis 0,05 g CuSO₄ × 5H₂O 0,01 bis 0,05 g MnCl₂ × 4H₂O und 5 bis 100 ml Sojaöl enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Minimalmedium, bezogen auf einen Liter Wasser ca. 1,5 g KNO₃ ca. 1,5 g KH₂PO₄ ca. 0,5 g MgSO₄ × 7H₂O ca. 0,5 g FeSO₄ × 7H₂O ca. 0,5 g ZnSO₄ × 5H₂O ca. 0,02 g CuSO₄ × 5H₂O ca. 0,02 g MnCl₂ × 4H₂O und ca. 18 ml Sojaöl enthält.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Pilz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Deuteromyceten und Anamorphen der Ascomyceten.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Pilz Acremonium strictum, Aspergillus spec., Botrytis cinerea oder Trichoderma spec. ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert 3 ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubationszeit 3 bis 14 Tage beträgt.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es bei einer Temperatur zwischen 20°C und 45°C, vorzugsweise bei 20°C bis 35°C, weiter bevorzugt bei ca. 21°C durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Minimalmedium über einen Sterilfilter belüftet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Minimalmedium mit einem Reinkultur-Inokulum beimpft wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Pilz von einem Trägermaterial geerntet wird, das in das Minimalmedium eingetaucht wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Volumen des Minimalmediums 1 Liter bis 3.500 m³, vorzugsweise ca. 100 Liter beträgt.