DE10132529A1

DE10132529A1 - Kulturmedium zur Kultivierung filamentöser Pilze

Info

Publication number: DE10132529A1
Application number: DE10132529A
Authority: DE
Inventors: Astrid Kleen; Andrea Saettler; Johann Buechs; Ali Akguen; Christoph Stoeckmann
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2001-07-09
Filing date: 2001-07-09
Publication date: 2003-01-30
Also published as: WO2003008568A3; AU2002354857A1; WO2003008568A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kulturmedium zur Kultivierung filamentöser Pilze und ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus filamentösen Pilzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kulturmedium zur Kultivierung filamentöser Pilze und ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus filamentösen Pilzen.
Filamentöse Pilze sind biotechnologisch bedeutsame Organismen, die eine Vielzahl unterschiedlicher Enzyme synthetisieren. Problematisch ist allerdings oftmals die Kultivierung der Pilze.
Aus den internationalen Offenlegungsschriften WO-A2-99/49020 und WO-A2- 99/49010 ist die Gewinnung und Reinigung Phenol-oxidierender Enzyme aus Stachybotrys Spezies bekannt. Über die verwendeten Kulturmedien werden jedoch keine näheren Angaben gemacht.
KOROLJOVA-SKOROBOGAT'KO et al. beschreiben in Biotechnol. Appl. Biochem (1998), 28, S. 47-54, die Reinigung und Charakterisierung einer Laccase aus dem filamentösen Pilz Coriolus hirsutus. Das Kulturmedium wird auf S. 48, linke Spalte, unten, detailliert beschrieben. Auf Seite 50, rechte Spalte, oben, finden sich Beispiele für verschiedene Induktoren der Biosynthese von Laccase.
Versuche der Anmelderin ergaben jedoch, dass die für die Kultivierung filamentöser Pilze bislang zur Verfügung stehenden Kulturmedien sowohl hinsichtlich des Wachstums der Pilze, als auch in Bezug auf den Enzymertrag nicht zufriedenstellend sind.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine deutliche Verringerung der Konzentration an CuSO₄.5H₂O gegenüber der von KOROLJOVA- SKOROBOGAT'KO et al. beschreiben Konzentration von 0,25 g/L zu einer Beschleunigung des Wachstums filamentöser Pilze führt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Kulturmedium zur Kultivierung filamentöser Pilze, das

a) etwa 5 bis etwa 20 [g/L] Glucose,
b) etwa 1 bis etwa 6 [g/L] Peptone,
c) etwa 0,006 bis etwa 0,03 [g/L] CuSO₄ enthält.

Vorzugsweise enthält das Kulturmedium

a) etwa 5 bis etwa 20 [g/L] Glucose,
b) etwa 1 bis etwa 6 [g/L] Peptone,
c) etwa 0,006 bis etwa 0,03 [g/L] CuSO₄,
d) etwa 0,01 bis etwa 1,0 [g/L] KH₂PO₄,
e) etwa 0,0003 bis etwa 0,003 [g/L] ZnSO₄,
f) etwa 0,01 bis etwa 0,8 [g/L] K₂HPO₄,
g) etwa 0,00005 bis etwa 0,005 [g/L] FeSO₄,
h) etwa 0,009 bis etwa 0,09 [g/L] MnSO₄ sowie
i) etwa 0,005 bis etwa 0,5 [g/L] MgSO₄.

Besonders bevorzugtermassen enthält das Kulturmedium

a) 7 bis 18 [g/L] Glucose,
b) 2 bis 5 [g/L] Peptone,
c) 0,009 bis 0,022 [g/L] CuSO₄,
d) 0,1 bis 1,0 [g/L] KH₂PO₄,
e) 0,0004 bis 0,002 [g/L] ZnSO₄,
f) 0,02 bis 0,6 [g/L] K₂HPO₄,
g) 0,0001 bis 0,005 [g/L] FeSO₄,
h) 0,02 bis 0,07 [g/L] MnSO₄ sowie
i) 0,01 bis 0,4 [g/L] MgSO₄.

Ganz besonders bevorzugtermassen enthält das Kulturmedium

a) 10 bis 15 [g/L] Glucose,
b) 3 [g/L] Peptone,
c) 0,016 [g/L] CuSO₄,
d) 0,6 [g/L] KH₂PO₄,
e) 0,0006 [g/L] ZnSO₄,
f) 0,04 bis 0,4 [g/L] K₂HPO₄,
g) 0,0003 bis 0,003 [g/L] FeSO₄,
h) 0,04 [g/L] MnSO₄ sowie
i) 0,02 bis 0,2 [g/L] MgSO₄.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn

- das Kupfer(II)sulfat als CuSO₄.5H₂O,
- das Zinksulfat als ZnSO₄.7H₂O,
- das Eisen(II)sulfat als FeSO₄.7H₂O,
- das Mangansulfat als MnSO₄.H₂O und
- das Magnesiumsulfat als MgSO₄.7H₂O

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Kulturmedium zusätzlich eine Verbindung, die die Biosynthese von Enzymen induziert, insbesondere eine der Verbindungen, die in der WO 99/49020, S. 17, Z. 4 bis 11, genannt werden. Auf diese Schrift wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Weitere als Induktoren bevorzugte Verbindungen sind ausgewählt unter:

a) ABTS®
b) 3,4-Xylidin,
c) Huminsäuren,
d) Kaffeesäure,
e) Guajakol,
f) Sinapinsäure,
g) o-Toluidin,
h) chelatisierenden Ligninverbindungen,
i) Syringaldazin und vorzugsweise
j) Benzylalkohol.

Die Induktoren werden erfindungsgemäß in einer Menge von 1 nmol/l bis 100 mmol/l, insbesondere von 100 nmol/l bis 20 mmol/l eingesetzt.
ABTS® und Benzylalkohol sind erfindungsgemäß besonders bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ABTS® als Induktor in einer Menge von 0,5 bis 1,5 mmol/l eingesetzt. In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform wird Benzylalkohol in einer Menge von 5 bis 10 mmol/l eingesetzt.
Diese Verbindungen sind besonders geeignet, die Synthese von Oxidoreduktasen, insbesondere von Phenol oxidierenden Enzymen (Phenoloxidasen) zu induzieren. Sollen andere Enzyme verstärkt erhalten werden, können entsprechende andere dem Fachmann bekannte Induktoren dem erfindungsgemäßen Kulturmedium zugesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus filamentösen Pilzen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a) filamentöse Pilze in einem erfindungsgemäßen Kulturmedium kultiviert und
b) die Enzyme aus den kultivierten Pilzen bzw. aus dem Kulturmedium isoliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich mit allen filamentösen Pilzen durchführbar.
Geeignet sind beispielsweise die in der Stammliste der DSMZ (Deutsche Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) aufgeführten Organismen, die im Internet unter der Adresse (http:/ / www.dsmz.de/species/fungi.htm) einsehbar ist.
Erfindungsgemäß geeignet sind zum Beispiel die Pilze folgender Genera:
Absidia, Acremoniella, Acremonium, Actinomucor, Agaricus, Agrocybe, Aleurodiscus, Allomyces, Alternaria, Amanita, Amauroascus, Ambrosiella, Ampelomyces, Amphiporthe, Amylostereum, Anellaria, Anixiella, Anixiopsis, Anthracobia, Antrodia, Antrodiella, Apiocrea, Apiognomonia, Apiosordaria, Aposphaeria, Arachniotus, Armillaria, Arthrinium, Arthrobotrys, Arthroderma, Ascobolus, Ascochyta, Ascocoryne, Ascodesmis, Ascodichaena, Ascoidea, Ascosphaera, Ashbya, Aspergillus, Asterophora, Athelia, Aulographina, Aurantiporus, Aureobasidium, Auricularia, Auxarthron, Basidiobolus, Beauveria, Bipolaris, Bjerkandera, Blakeslea, Blastobotrys, Boletus, Bombardia, Botryobasidium, Botryodiplodia, Botryosphaeria, Botryotinia, Botryotrichum, Botrytis, Brunchorstia, Byssochlamys, Calcarisporium, Caldariomyces, Calocera, Calonectria, Cantharellula, Cenangium, Cenococcum, Centrospora, Cephaloascus, Cephalosporium, Ceratocystiopsis, Ceratocystis, Cercospora, Ceuthospora, Chaetocladium, Chaetomidium, Chaetomium, Chalara, Chalciporus, Choanephora, Chondrostereum, Chrysosporium, Circinella, Cladobotryum, Cladorrhinum, Cladosporium, Claviceps, Climacocystis, Climacodon, Clitocybe, Clitocybula, Clitopilus, Cochliobolus, Coemansia, Cokeromyces, Coleophoma, Colletotrichum, Collybia, Colpoma, Conidiobolus, Coniochaeta, Coniophora, Coniothyrium, Copelandia, Coprinus, Cordana, Cordyceps, Coriolopsis, Coriolus, Corticium, Coryne, Corynespora, Crinipellis, Crucibulum, Cryphonectria, Cryptodiaporthe, Cryptosporiopsis, Cunninghamella, Curvularia, Cyathus, Cylindrocarpon, Cylindrocephalum, Cylindrocladium, Cymatoderma, Cyphellopsis, Cystoderma, Cytospora, Dacrymyces, Dactylaria, Dactylium, Daedalea, Daedaleopsis, Datronia, Delacroixia, Dendryphion, Dermea, Diaporthe, Dichomitus, Dictyopanus, Dictyosporium, Dictyostelium, Didymella, Diheterospora, Diplodia, Dipodascus, Disciotis, Discula, Dispira, Disporotrichum, Donkioporia, Doratomyces, Dothichiza, Dothiorella, Drechslera, Drepanopeziza, Durella, Eladia, Eleutherascus, Embellisia, Emericella, Emericellopsis, Endoconidiophora, Endothia, Entomophthora, Epicoccum, Epidermophyton, Eremascus, Eremothecium, Eupenicillium, Eurasina, Eurotium, Exidia, Exobasidium, Exophiala, Exserohilum, Fennellia, Fennellomyces, Fistulina, Flammulina, Fomes, Fomitopsis, Funalia, Fusarium, Fusicoccum, Fusidium, Gaeumannomyces, Ganoderma, Gelasinospora, Geomyces, Geotrichum, Gerronema, Gibberella, Gilmaniella, Glenospora, Gliocladium, Gloeocystidiellum, Gloeophyllum, Gloeosporium, Glomerella, Gnomonia, Gongronella, Graphium, Gremmeniella, Grifola, Guignardia, Gymnascella, Gymnoascus, Gymnopilus, Gyromitra, Hamigera, Harzia, Hebeloma, Helicostylum, Helminthosporium, Helotium, Hendersonia, Hercospora, Hericium, Heterobasidion, Hirneola, Hohenbuehelia, Hormoconis, Hormodendrum, Humicola, Hyalodendron, Hydnopolyporus, Hydropus, Hygrophoropsis, Hymenochaete, Hymenoscyphus, Hypholoma, Hypochnicium, Hypochnus, Hypocrea, Hypomyces, Hypoxylon, Hypsizygus, Inonotus, Irpex, Isaria, Kabatiella, Kabatina, Kuehneromyces, Laccaria, Lachnellula, Laetiporus, Laricifomes, Laxitextum, Lecythophora, Lentinula, Lentinus, Lentodium, Lenzites, Lepiota, Lepista, Leptographium, Leptoporus, Leptosphaerulina, Leucoagaricus, Leucocoprinus, Leucostoma, Libertella, Limnoperdon, Lophodermium, Lycoperdon, Lyophyllum, Macrohyporia, Macrolepiota, Macrophomina, Malbranchea, Marasmius, Margaritispora, Marsonnina, Martininia, Megacollybia, Melanomma, Melanoporia, Memnoniella, Meripilus, Merismodes, Merulius, Metarhizium, Microascus, Microbotryum, Microdochium, Microsporum, Mitrophora, Monacrosporium, Monascus, Monilia, Moniliella, Monilinia, Monodictys, Monostichella, Morchella, Mortierella, Mucor, Mutinus, Myceliophthora, Mycena, Mycocentrospora, Mycogone, Mycosphaerella, Mycotypha, Myrothecium, Naemacyclus, Naemospora, Naucoria, Nectria, Nematoloma, Nematospora, Neocosmospora, Neohendersonia, Neosartorya, Neurospora, Nigrospora, Nothopanus, Oedocephalum, Oligoporus, Omphalotus, Onnia, Oospora, Ophiostoma, Osmoporus, Oudemanstella, Paecilomyces, Panaeolina, Panaeolus, Panellus, Panus, Papulaspora, Parasitella, Paxillus, Pellicularia, Penicilliopsis, Penicillium, Peniophora, Periconia, Pestalotia, Pestalotiopsis, Petriella, Petromyces, Pezicula, Peziza, Pezizella, Phacidium, Phaeolus, Phallus, Phanerochaete, Phellinus, Phialophora, Phlebia, Phlebiopsis, Pholioata, Pholiota, Pholiotina, Phoma, Phomopsis, Phycomyces, Phytophthora, Pilaira, Pilobolus, Piloderma, Piptocephalis, Piptoporus, Pisolithus, Pithomyces, Plectosphaerella, Pleiochaeta, Pleospora, Pleurotellus, Pleurotus, Plicatura, Podospora, Pollacia, Polyporus, Polysphondylium, Polystictus, Poria, Poronia, Potebniamyces, Preussia, Prototheca, Pseudoarachniotus, Pseudoclitocybe, Pseudohansfordia, Pseudonectria, Pseudozyma, Psilocybe, Ptychogaster, Pullularia, Pycnidiella, Pycnoporus, Pyrenochaeta, Pyricularia, Pythium, Radiomyces, Raffaelea, Ramaria, Ramichloridium, Resinicium, Rhinocladiella, Rhizoctonia, Rhizomucor, Rhizopus, Rhizosphaera, Rutstroemia, Ryparobius, Saprolegnia, Sarcodontia, Schizonella, Schizophyllum, Schizopora, Sclerophoma, Sclerotinia, Sclerotium, Scopulariopsis, Scytalidium, Sepedonium, Septomyxa, Serpula, Setosphaeria, Sibirina, Sistotrema, Sordaria, Sparassis, Sphaerobolus, Spicaria, Spiniger, Spondylocladium, Spongipellis, Spongiporus, Sporormiella, Sporothrix, Sporotrichum, Stachybotrys, Staurophoma, Stemphylium, Stereum, Sterigmatocystis, Stictis, Strasseria, Stromatinia, Stropharia, Stysanus, Suillus, Sydowia, Sympodiophora, Syncephalastrum, Syncleistostroma, Talaromyces, Taphrina, Tapinella, Tephrocybe, Termitomyces, Thamnidium, Thamnostylum, Thanatephorus, Thelebolus, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Thielaviopsis, Thysanophora, Tiarosporella, Tieghemella, Tieghemiomyces, Tilachlidium, Tilletia, Tilletiopsis, Tolypocladium, Torula, Trametes, Tremella, Trichaptum, Trichocladium, Trichoderma, Tricholoma, Trichophyton, Trichosporon, Trichothecium, Trichurus, Tritirachium, Truncatella, Tyromyces, Ulocladium, Urocystis, Ustilago, Valsa, Venturia, Verpa, Verticillium, Volutella, Volvariella, Vuilleminia, Wallemia, Westerdykella, Wojnowicia, Wolfiporia, Xenomeris, Xerocomus, Xerula, Xylaria, Xylogone, Zygorhynchus und Zythia.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignete Pilze sind ausgewählt unter Pilzen der Genera Acremonium, Aspergillus, Coriolus, Coprinus, Pleurotus, Stachybotrys und Fusarium, insbesondere unter Pilzen des Genus Stachybotrys, vorzugsweise unter Pilzen der Species Stachybotrys atra, Stachybotrys aurantia, Stachybotrys bisbyi, Stachybotrys chartarum, Stachybotrys parvispora, Stachybotrys kampalensis, Stachybotrys theobromae, Stachybotrys cylindrospora, Stachybotrys dichroa, Stachybotrys oenanthes und Stachybotrys nilagerica, besonders bevorzugt unter Stachybotrys bisbyi und Stachybotrys chartarum.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Gewinnung von Enzymen geeignet, die ausgewählt sind unter

a) Proteasen,
b) Oxidoreductasen, wie Oxidasen, insbesondere Phenoloxidasen, Peroxidasen, Laccasen, Tyrosinasen;
c) Lipasen und
d) Glycosidasen, wie Amylasen, Cellulasen und Glucanasen.

Die Isolierung der Enzyme erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, wie sie beispielsweise in folgenden Literaturstellen, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben wird:
Gulati R, Saxena RK, Gupta R; Fermentation and downstream processing of lipase from Aspergillus terreus; PROCESS BIOCHEM 36 (1-2): 149-155 SEP 2000.
Maheshwari R, Bharadwaj G, Bhat MK; Thermophilic fungi: Their physiology and enzymes; MICROBIOL MOL BIOL R 64 (3): 461-+ SEP 2000.
Dunaevsky YE, Gruban TN, Beliakova GA, et al.; Enzymes secreted by filamentous fungi: Regulation of secretion and purification of an extracellular protease of Trichoderma harzianum; BIOCHEMISTRY-MOSCOW+ 65 (6): 723-727 JUN 2000.
Conesa A, von den Hondel CAMJJ, Punt PJ; Studies on the production of fungal peroxidases in Aspergillus niger; APPL ENVIRON MICROB 66 (7): 3016-3023 JUL 2000.
Dalboge H, Lange L; Using molecular techniques to identify new microbial biocatalysts; TRENDS BIOTECHNOL 16 (6): 265-272 JUN 1998.
Maia MMD, Heasley A, de Morais MMC, et al.; Effect of culture conditions on lipase production by Fusarium solani in batch fermentation; BIORESOURCE TECHNOL 76 (1): 23-27 JAN 2001.
Kawasaki L, Aguirre J; Multiple catalase genes are differentially regulated in Aspergillus nidulans; J BACTERIOL 183 (4): 1434-1440 FEB 2001
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums zur Kultivierung filamentöser Pilze.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der unmittelbaren Verfahrensprodukte aus einem der erfindungsgemäßen Verfahren in Waschmitteln, Reinigungsmitteln, Handwaschmitteln, Handgeschirrspülmitteln, Maschinengeschirrspülmitteln, kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitungen, Haartönungs- und Haarfärbemitteln und Mitteln zum Färben oder Bleichen von Textilien, Pulpe, Papier, Pelzen, Fellen oder Leder.
Weitere, voneinander unabhängige Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Waschmittel, Reinigungsmittel, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen, Haartönungs- und Haarfärbemittel und Mittel zum Färben oder Bleichen von Textilien, Pulpe, Papier, Pelzen, Fellen oder Leder, enthaltend unmittelbare Verfahrensprodukte aus einem der erfindungsgemäßen Verfahren.
In dem erfindungsgemäß bevorzugten Fall eines Haartönungs- oder Haarfärbemittels handelt es sich bei dem unmittelbaren Verfahrensprodukt vorzugsweise um eine Phenoloxidase.
Das Enzym kann in das Färbemittel selbst eingearbeitet werden; bevorzugt wird es aber getrennt von den Farbstoffvorprodukten konfektioniert und erst unmittelbar vor der Anwendung dem Färbemittel zugegeben.
Das Enzym wird bevorzugt in einer Menge von 0,001-1 Gew.-%, bezogen auf die Proteinmenge des Enzyms und das gesamte Färbemittel, eingesetzt.
Hinsichtlich der in den erfindungsgemäßen Färbemitteln eingesetzten Farbstoffvorprodukte unterliegt die vorliegende Erfindung keinerlei Einschränkungen. Die erfindungsgemäßen Färbemittel können als Farbstoffvorprodukte

- Oxidationsfarbstoffvorprodukte vom Entwickler- und/oder Kuppler-Typ, und
- Vorstufen naturanaloger Farbstoffe, wie Indol- und Indolin-Derivate, sowie Mischungen von Vertretern dieser Gruppen enthalten.

Als Entwicklerkomponenten werden üblicherweise primäre aromatische Amine mit einer weiteren, in para- oder ortho-Position befindlichen, freien oder substituierten Hydroxy- oder Aminogruppe, Diaminopyridinderivate, heterocyclische Hydrazone, 4-Aminopyrazolderivate sowie 2,4,5,6-Tetraaminopyrimidin und dessen Derivate eingesetzt.
Es kann erfindungsgemäß bevorzugt sein, als Entwicklerkomponente ein p- Phenylendiaminderivat oder eines seiner physiologisch verträglichen Salze einzusetzen. Besonders bevorzugt sind p-Phenylendiaminderivate der Formel (I)

wobei

- G¹ steht für ein Wasserstoffatom, ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Monohydroxyalkylradikal, ein C₂- bis C₄-Polyhydroxyalkylradikal, ein (C₁- bis C₄)-Alkoxy-(C₁- bis C₄)-alkylradikal, ein 4'-Aminophenylradikal oder ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, das mit einer stickstoffhaltigen Gruppe, einem Phenyl- oder einem 4'-Aminophenylrest substituiert ist;
- G² steht für ein Wasserstoffatom, ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Monohydroxyalkylradikal, ein C₂- bis C₄-Polyhydroxyalkylradikal, ein (C₁- bis C₄)-Alkoxy-(C₁- bis C₄)-alkylradikal oder ein C₁- bis C₄- Alkylradikal, das mit einer stickstoffhaltigen Gruppe substituiert ist;
- G³ steht für ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, wie ein Chlor-, Brom, Jod- oder Fluoratom, ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Monohydroxyalkylradikal, ein C₁- bis C₄-Hydroxyalkoxyradikal, ein C₁- bis C₄-Acetylaminoalkoxyradikal, ein C₁- bis C₄- Mesylaminoalkoxyradikal oder ein C₁- bis C₄-Carbamoylaminoalkoxyradikal;
- G⁴ steht für ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder ein C₁- bis C₄- Alkylradikal oder
- wenn G³ und G⁴ in ortho-Stellung zueinander stehen, können sie gemeinsam eine verbrückende α,ω-Alkylendioxogruppe, wie beispielsweise einen Ethylendioxygruppe bilden.

Beispiele für die als Substituenten in den erfindungsgemäßen Verbindungen genannten, C₁- bis C₄-Alkylradikale sind die Gruppen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl und Butyl. Ethyl und Methyl sind bevorzugte Alkylradikale. Erfindungsgemäß bevorzugte C₁- bis C₄-Alkoxyradikale sind beispielsweise eine Methoxy- oder eine Ethoxygruppe. Weiterhin können als bevorzugte Beispiele für eine C₁- bis C₄-Hydroxyalkylgruppe eine Hydroxymethyl-, eine 2- Hydroxyethyl-, eine 3-Hydroxypropyl- oder eine 4-Hydroxybutylgruppe genannt werden. Eine 2-Hydroxyalkylgruppe ist besonders bevorzugt. Beispiele für Halogenatome sind erfindungsgemäß F-, Cl- oder Br-Atome, Cl-Atome sind ganz besonders bevorzugt. Die weiteren verwendeten Begriffe leiten sich erfindungsgemäß von den hier gegebenen Definitionen ab. Beispiele für stickstoffhaltige Gruppen der Formel (II) sind insbesondere die Aminogruppen, C₁- bis C₄- Monoalkylaminogruppen, C₁- bis C₄-Dialkylaminogruppen, C₁- bis C₄- Trialkylammoniumgruppen, C₁- bis C₄-Monohydroxyalkylaminogruppen, Imidazolinium und Ammonium.
Besonders bevorzugte p-Phenylendiamine der Formel (I) sind ausgewählt aus p-Phenylendiamin, p-Toluylendiamin, 2-Chlor-p-phenylendiamin, 2,3-Dimethyl- p-phenylendiamin, 2,6-Dimethyl-p-phenylendiamin, 2,6-Diethyl-p- phenylendiamin, 2,5-Dimethyl-p-phenylendiamin, N,N-Dimethyl-p- phenylendiamin, N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, N,N-Dipropyl-p- phenylendiamin, 4-Amino-3-methyl-(N,N-diethyl)-anilin, N,N-bis-(β- Hydroxyethyl)-p-phenylendiamin, 4-N,N-bis-(β-Hydroxyethyl)amino-2- methylanilin, 4-N,N-bis-(β-Hydroxyethyl)amino-2-chloranilin, 2-(β-Hydroxyethyl)- p-phenylendiamin, 2-Fluor-p-phenylendiamin, 2-Isopropyl-p-phenylendiamin, N- (β-Hydroxypropyl)-p-phenylendiamin, 2-Hydroxymethyl-p-phenylendiamin, N,N- Dimethyl-3-methyl-p-phenylendiamin, N,N-(Ethyl,-β-hydroxyethyl)-p- phenylendiamin, N-(β,γ-Dihydroxypropyl)-p-phenylendiamin, N-(4'- Aminophenyl)-p-phenylendiamin, N-Phenyl-p-phenylendiamin, 2-(β- Hydroxyethyloxy)-p-phenylendiamin, 2-(β-Acetylaminoethyloxy)-p- phenylendiamin, N-(β-Methoxyethyl)-p-phenylendiamin und 5,8-Diaminobenzo- 1,4-dioxan sowie ihren physiologisch verträglichen Salzen.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte p-Phenylendiaminderivate der Formel (I) sind p-Phenylendiamin, p-Toluylendiamin, 2-(β-Hydroxyethyl)-p- phenylendiamin und N,N-Bis-(β-hydroxyethyl)-p-phenylendiamin.
Es kann erfindungsgemäß weiterhin bevorzugt sein, als Entwicklerkomponente Verbindungen einzusetzen, die mindestens zwei aromatische Kerne enthalten, die mit Amino- und/oder Hydroxylgruppen substituiert sind.
Unter den zweikernigen Entwicklerkomponenten, die in den Färbezusammensetzungen gemäß der Erfindung verwendet werden können, kann man insbesondere die Verbindungen nennen, die der folgenden Formel (II) entsprechen, sowie ihre physiologisch verträglichen Salze:

wobei:

- Z¹ und Z² stehen unabhängig voneinander für ein Hydroxyl- oder NH₂- Radikal, das
- gegebenenfalls durch ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, durch ein C₁- bis C₄- Hydroxyalkylradikal und/oder durch eine Verbrückung Y substituiert ist,
- die Verbrückung Y steht für eine Alkylengruppe mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen,
- wie beispielsweise eine lineare oder verzweigte Alkylenkette oder einen Alkylenring, die von einer oder mehreren stickstoffhaltigen Gruppen und/oder einem oder mehreren Heteroatomen wie Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatomen unterbrochen oder beendet sein kann und eventuell durch ein oder mehrere Hydroxyl- oder C₁- bis C₈-Alkoxyradikale substituiert sein kann,
- G⁵ und G⁶ stehen unabhängig voneinander für ein Wasserstoff- oder Halogenatom,
- ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Monohydroxyalkylradikal, ein C₂- bis C₄- Polyhydroxyalkylradikal, ein C₁- bis C₄-Aminoalkylradikal oder eine direkte Verbindung zur Verbrückung Y,
- G⁷, G⁸, G⁹, G¹⁰, G¹¹ und G¹² stehen unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine direkte Bindung zur Verbrückung Y oder ein C₁- bis C₄- Alkylradikal,
mit der Maßgabe, dass die Verbindungen der Formel (II) nur eine Verbrückung Y pro Molekül enthalten.

Die in Formel (II) verwendeten Substituenten sind erfindungsgemäß analog zu den obigen Ausführungen definiert.
Bevorzugte zweikernige Entwicklerkomponenten der Formel (II) sind insbesondere: N,N'-bis-(β-Hydroxyethyl)-N,N'-bis-(4'-Aminophenyl)-1,3-diaminopropanol, N,N'-bis-(β-Hydroxyethyl)-N,N'-bis-(4'-aminophenyl)-ethylendiamin, N,N'-bis-(4-Aminophenyl)-tetramethylendiamin, N,N'-bis-(β-Hydroxyethyl)-N,N'- bis-(4-aminophenyl)-tetramethylendiamin, N,N'-bis-(4-Methyl-aminophenyl)- tetramethylendiamin, N,N'-bis-(Ethyl)-N,N'-bis(4'-amino-3'-methylphenyl)- ethylendiamin, 1,8-bis-(2,5-Diaminophenoxy)-3,5-dioxaoktan, Bis-(2-hydroxy-5- aminophenyl)-methan, 1,4-Bis-(4-aminophenyl)-diazacycloheptan und 1,10- Bis-(2,5-diaminophenyl)-1,4,7,10-tetraoxadecan und ihre physiologisch verträglichen Salze.
Ganz besonders bevorzugte zweikernige Entwicklerkomponenten der Formel (II) sind N,N'-bis-(β-Hydroxyethyl)-N,N'-bis-(4'-aminophenyl)-1,3-diaminopropanol, Bis-(2-hydroxy-5-aminophenyl)-methan, N,N'-Bis-(4-aminophenyl)- 1,4-diazacycloheptan und 1,10-Bis-(2,5-diaminophenyl)-1,4,7,10-tetraoxadecan oder eines ihrer physiologisch verträglichen Salze.
Weiterhin kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, als Entwicklerkomponente ein p-Aminophenolderivat oder eines seiner physiologisch verträglichen Salze einzusetzen. Besonders bevorzugt sind p-Aminophenolderivate der Formel (III)

wobei:

- G¹³ steht für ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, ein C₁- bis C₄- Alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Monohydroxyalkylradikal, ein (C₁- bis C₄)-Alkoxy- (C₁- bis C₄)-alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Aminoalkylradikal, ein Hydroxy-(C₁- bis C₄)-alkylaminoradikal, ein C₁- bis C₄-Hydroxyalkoxyradikal, ein C₁- bis C₄-Hydroxyalkyl-(C₁- bis C₄)-aminoalkylradikal oder ein (Di-C₁- bis C₄- Alkylamino)-(C₁- bis C₄)-alkylradikal, und
- G¹⁴ steht für ein Wasserstoff- oder Halogenatom, ein C₁- bis C₄- Alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Monohydroxyalkylradikal, ein C₂- bis C₄- Polyhydroxyalkylradikal, ein (C₁- bis C₄)-Alkoxy-(C₁- bis C₄)-alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Aminoalkylradikal oder ein C₁- bis C₄-Cyanoalkylradikal,
- G¹⁵ steht für Wasserstoff, ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, ein C₁- bis C₄- Monohydroxyalkylradikal, ein C₂- bis C₄-Polyhydroxyalkylradikal, ein Phenylradikal oder ein Benzylradikal, und
- G¹⁶ steht für Wasserstoff oder ein Halogenatom.

Die in Formel (III) verwendeten Substituenten sind erfindungsgemäß analog zu den obigen Ausführungen definiert.
Bevorzugte p-Aminophenole der Formel (III) sind insbesondere p-Aminophenol, N-Methyl-p-Aminophenol, 4-Amino-3-methyl-phenol, 4-Amino-3-fluorphenol, 2- Hydroxymethylamino-4-amino-phenol, 4-Amino-3-hydroxymethylphenol, 4- Amino-2-(2-hydroxyethoxy)-phenol, 4-Amino-2-methylphenol, 4-Amino-2- hydroxymethylphenol, 4-Amino-2-methoxymethyl-phenol, 4-Amino-2- aminomethylphenol, 4-Amino-2-(β-hydroxyethyl-aminomethyl)-phenol, 4-Amino- 2-fluorophenol, 4-Amino-2-chlorphenol, 2,6-Dichlor-4-aminophenol, 4-Amino-2- ((diethylamino)methyl)phenol sowie ihre physiologisch verträglichen Salze.
Ganz besonders bevorzugte Verbindungen der Formel (III) sind p-Aminophenol, 4-Amino-3-methylphenol, 4-Amino-2-chlorphenol, 4-Amino-2,6-dichlorphenol, 4- Amino-2-aminomethylphenol und 4-Amino-2-((diethylamino)methyl)phenol.
Ferner kann die Entwicklerkomponente ausgewählt sein aus o-Aminophenol und seinen Derivaten, wie beispielsweise 2-Amino-4-methylphenol oder 2- Amino-4-chlorphenol.
Weiterhin kann die Entwicklerkomponente ausgewählt sein aus heterocyclischen Entwicklerkomponenten, wie beispielsweise den Pyridin-, Pyrimidin-, Pyrazol-, Pyrazol-Pyrimidin-Derivaten und ihren physiologisch verträglichen Salzen.
Bevorzugte Pyridin-Derivate sind insbesondere die Verbindungen, die in den Patenten GB 1 026 978 und GB 1 153 196 beschrieben werden, wie 2,5-Diamino-pyridin, 2-(4-Methoxyphenyl)amino-3-amino-pyridin, 2,3-Diamino-6-methoxy-pyridin, 2- (β-Methoxyethyl)amino-3-amino-6-methoxy-pyridin und 3,4-Diamino-pyridin.
Bevorzugte Pyrimidin-Derivate sind insbesondere die Verbindungen, die im deutschen Patent DE 23 59 399, der japanischen Offenlegungsschrift JP-A2- 02/019576 oder in der Offenlegungsschrift WO 96/15765 beschrieben werden, wie 2,4,5,6-Tetraaminopyrimidin, 4-Hydroxy-2,5,6-triaminopyrimidin, 2-Hydroxy- 4,5,6-triaminopyrimidin, 2-Dimethylamino-4,5,6-triaminopyrimidin, 2,4- Dihydroxy-5,6-diaminopyrimidin und 2,5,6-Triaminopyrimidin.
Bevorzugte Pyrazol-Derivate sind insbesondere die Verbindungen, die in den Patenten
DE 38 43 892, DE 41 33 957 und Offenlegungsschriften WO 94/08969, WO 94/08970,
EP 0 740 931 und DE 195 43 988 beschrieben werden, wie 4,5-Diamino-1- methylpyrazol, 4,5-Diamino-1-(β-hydroxyethyl)-pyrazol, 3,4-Diaminopyrazol, 4,5-Diamino-1-(4'-chlorobenzyl)-pyrazol, 4,5-Diamino-1,3-dimethylpyrazol, 4,5- Diamino-3-methyl-1-phenylpyrazol, 4,5-Diamino-1-methyl-3-phenylpyrazol, 4- Amino-1,3-dimethyl-5-hydrazinopyrazol, 1-Benzyl-4,5-diamino-3-methylpyrazol, 4,5-Diamino-3-tert.-butyl-1-methylpyrazol, 4,5-Diamino-1-tert.-butyl-3- methylpyrazol, 4,5-Diamino-1-(β-hydroxyethyl)-3-methylpyrazol, 4,5-Diamino-1- ethyl-3-methylpyrazol, 4,5-Diamino-1-ethyl-3-(4'-methoxyphenyl)-pyrazol, 4,5- Diamino-1-ethyl-3-hydroxymethylpyrazol, 4,5-Diamino-3-hydroxymethyl-1- methylpyrazol, 4,5-Diamino-3-hydroxymethyl-1-isopropylpyrazol, 4,5-Diamino-3- methyl-1-isopropylpyrazol, 4-Amino-5-(2'-aminoethyl)amino-1,3- dimethylpyrazol, 3,4,5-Triaminopyrazol, 1-Methyl-3,4,5-triaminopyrazol, 3,5- Diamino-1-methyl-4-methylaminopyrazol und 3,5-Diamino-4(β- hydroxyethyl)amino-1-methylpyrazol.
Bevorzugte Pyrazol-Pyrimidin-Derivate sind insbesondere die Derivate des Pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin der folgenden Formel (IV) und dessen tautomeren Formen, sofern ein tautomerisches Gleichgewicht besteht:

wobei:

- G¹⁷, G¹⁸, G¹⁹ und G²⁰ unabhängig voneinander stehen für ein Wasserstoffatom, ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, ein Aryl-Radikal, ein C₁- bis C₄- Hydroxyalkylradikal, ein C₂- bis C₄-Polyhydroxyalkylradikal, ein (C₁- bis C₄)-Alkoxy-(C₁- bis C₄)-alkylradikal, ein C₁- bis C₄-Aminoalkylradikal, das gegebenenfalls durch ein Acetyl-Ureid- oder Sulfonyl-Radikal geschützt sein kann, ein (C₁- bis C₄)-Alkylamino-(C₁- bis C₄)-alkylradikal, ein Di- [(C₁- bis C₄)-alkyl]-(C₁- bis C₄)-aminoalkylradikal, wobei die Dialkyl- Radikale gegebenenfalls einen Kohlenstoffzyklus oder einen Heterozyklus mit 5 oder 6 Kettengliedern bilden, ein C₁- bis C₄-Hydroxyalkyl- oder ein Di-(C₁- bis C₄)-[Hydroxyalkyl]-(C₁- bis C₄)-aminoalkylradikal,
- die X-Radikale stehen unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, ein C₁- bis C₄-Alkylradikal, ein Aryl-Radikal, ein C₁- bis C₄- Hydroxyalkyladikal, ein C₂- bis C₄- Polyhydroxyalkylradikal, ein C₁- bis C₄-Aminoalkylradikal, ein (C₁- bis C₄)-Alkylamino-(C₁- bis C₄)-alkylradikal, ein Di-[(C₁- bis C₄)alkyl]-(C₁- bis C₄)-aminoalkylradikal, wobei die Dialkyl-Radikale gegebenenfalls einen Kohlenstoffzyklus oder einen Heterozyklus mit 5 oder 6 Kettengliedern bilden, ein C₁- bis C₄-Hydroxyalkyl- oder ein Di-(C₁- bis C₄-hydroxyalkyl)-aminoalkylradikal, ein Aminoradikal, ein C₁- bis C₄-Alkyl- oder Di-(C₁- bis C₄-hydroxyalkyl)-aminoradikal, ein Halogenatom, eine Carboxylsäuregruppe oder eine Sulfonsäuregruppe,
- i hat den Wert 0, 1, 2 oder 3,
- p hat den Wert 0 oder 1,
- q hat den Wert 0 oder 1 und
- n hat den Wert 0 oder 1,

- die Summe aus p + q ungleich 0 ist,
- wenn p + q gleich 2 ist, n den Wert 0 hat, und die Gruppen N¹⁷G¹⁸ und NG¹⁹G²⁰ belegen die Positionen (2, 3); (5, 6); (6, 7); (3, 5) oder (3, 7);
- wenn p + q gleich 1 ist, n den Wert 1 hat, und die Gruppen NG¹⁷G¹⁸ (oder NG¹⁹G²⁰) und die Gruppe OH belegen die Positionen (2, 3); (5, 6); (6, 7); (3, 5) oder (3, 7);

Die in Formel (IV) verwendeten Substituenten sind erfindungsgemäß analog zu den obigen Ausführungen definiert.
Wenn das Pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin der obenstehenden Formel (IV) eine Hydroxygruppe an einer der Positionen 2, 5 oder 7 des Ringsystems enthält, besteht ein tautomeres Gleichgewicht, das zum Beispiel im folgenden Schema dargestellt wird:
Unter den Pyrazol-[1,5-a]-pyrimidinen der obenstehenden Formel (IV) kann man insbesondere nennen:

- Pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3,7-diamin;
- 2,5-Dimethyl pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3,7-diamin;
- Pyrazol-(1,5-a]-pyrimidin-3,5-diamin;
- 2,7-Dimethyl pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3,5-diamin;
- 3-Amino pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-7-ol;
- 3-Amino pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-5-ol;
- 2-(3-Amino pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-7-ylamino)-ethanol;
- 2-(7-Amino pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3-ylamino)-ethanol;
- 2-[(3-Amino pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-7-yl)-(2-hydroxy-ethyl)-amino]- ethanol;
- 2-[(7-Amino pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3-yl)-(2-hydroxy-ethyl)-amino]- ethanol;
- 5,6-Dimethyl pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3,7-diamin;
- 2,6-Dimethyl pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3,7-diamin;
- 2,5,N7,N7-Tetramethyl pyrazol-[1,5-a]-pyrimidin-3,7-diamin;

Die Pyrazol-[1,5-a]-pyrimidine der obenstehenden Formel (IV) können wie in der Literatur beschrieben durch Zyklisierung ausgehend von einem Aminopyrazol oder von Hydrazin hergestellt werden.
Als Kupplerkomponenten werden in der Regel m-Phenylendiaminderivate, Naphthole, Resorcin und Resorcinderivate, Pyrazolone und m-Aminophenolderivate verwendet. Als Kupplersubstanzen eignen sich insbesondere 1- Naphthol, 1,5-, 2,7- und 1,7-Dihydroxynaphthalin, 5-Amino-2-methylphenol, m- Aminophenol, Resorcin, Resorcinmonomethylether, m-Phenylendiamin, 1-Phenyl-3-methyl-pyrazolon-5, 2,4-Dichlor-3-aminophenol, 1,3-Bis-(2,4-diaminophenoxy)-propan, 2-Chlor-resorcin, 4-Chlor-resorcin, 2-Chlor-6-methyl-3-aminophenol, 2-Amino-3-hydroxypyridin, 2-Methylresorcin, 5-Methylresorcin und 2- Methyl-4-chlor-5-aminophenol.
Erfindungsgemäß bevorzugte Kupplerkomponenten sind:

- m-Aminophenol und dessen Derivate wie beispielsweise 5-Amino-2- methylphenol, 3-Amino-2-chlor-6-methylphenol, 2-Hydroxy-4- aminophenoxyethanol, 2,6-Dimethyl-3-aminophenol, 3-Trifluoroacetylamino- 2-chlor-6-methylphenol, 5-Amino-4-chlor-2-methylphenol, 5-Amino-4- methoxy-2-methylphenol, 5-(2'-Hydroxyethyl)-amino-2-methylphenol, 3- (Diethylamino)-phenol, N-Cyclopentyl-3-aminophenol, 1,3-Dihydroxy-5- (methylamino)-benzol, 3-(Ethylamino)-4-methylphenol und 2,4-Dichlor-3- aminophenol,
- o-Aminophenol und dessen Derivate,
- m-Diaminobenzol und dessen Derivate wie beispielsweise 2,4- Diaminophenoxyethanol, 1,3-Bis-(2,4-diaminophenoxy)-propan, 1-Methoxy- 2-amino-4-(2'-hydroxyethylamino)benzol, 1,3-Bis-(2,4-diaminophenyl)- propan, 2,6-Bis-(2-hydroxyethylamino)-1-methylbenzol und 1-Amino-3-bis- (2'-hydroxyethyl)-aminobenzol,
- o-Diaminobenzol und dessen Derivate wie beispielsweise 3,4- Diaminobenzoesäure und 2,3-Diamino-1-methylbenzol,
- Di- beziehungsweise Trihydroxybenzolderivate wie beispielsweise Resorcin, Resorcinmonomethylether, 2-Methylresorcin, 5-Methylresorcin, 2,5- Dimethylresorcin, 2-Chlorresorcin, 4-Chlorresorcin, Pyrogallol und 1,2,4- Trihydroxybenzol,
- Pyridinderivate wie beispielsweise 2,6-Dihydroxypyridin, 2-Amino-3- hydroxypyridin, 2-Amino-5-chlor-3-hydroxypyridin, 3-Amino-2-methylamino- 6-methoxypyridin, 2,6-Dihydroxy-3,4-dimethylpyridin, 2,6-Dihydroxy-4- methylpyridin, 2,6-Diaminopyridin, 2,3-Diamino-6-methoxypyridin und 3,5- Diamino-2,6-dimethoxypyridin,
- Naphthalinderivate wie beispielsweise 1-Naphthol, 2-Methyl-1-naphthol, 2- Hydroxymethyl-1-naphthol, 2-Hydroxyethyl-1-naphthol, 1,5- Dihydroxynaphthalin, 1,6-Dihydroxynaphthalin, 1,7-Dihydroxynaphthalin, 1,8-Dihydroxynaphthalin, 2,7-Dihydroxynaphthalin und 2,3- Dihydroxynaphthalin,
- Morpholinderivate wie beispielsweise 6-Hydroxybenzomorpholin und 6- Amino-benzomorpholin,
- Chinoxalinderivate wie beispielsweise 6-Methyl-1,2,3,4-tetrahydrochinoxalin,
- Pyrazolderivate wie beispielsweise 1-Phenyl-3-methylpyrazol-5-on,
- Indolderivate wie beispielsweise 4-Hydroxyindol, 6-Hydroxyindol und 7- Hydroxyindol,
- Pyrimidinderivate, wie beispielsweise 4,6-Diaminopyrimidin, 4-Amino-2,6- dihydroxypyrimidin, 2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 2,4,6- Trihydroxypyrimidin, 2-Amino-4-methylpyrimidin, 2-Amino-4-hydroxy-6- methylpyrimidin und 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, oder
- Methylendioxybenzolderivate wie beispielsweise 1-Hydroxy-3,4- methylendioxybenzol, 1-Amino-3,4-methylendioxybenzol und 1-(2'- Hydroxyethyl)-amino-3,4-methylendioxybenzol,

Besonders bevorzugte Kupplerkomponenten sind 1-Naphthol, 1,5-, 2,7- und 1,7-Dihydroxynaphthalin, 3-Aminophenol, 5-Amino-2-methylphenol, 2-Amino-3- hydroxypyridin, Resorcin, 4-Chlorresorcin, 2-Chlor-6-methyl-3-aminophenol, 2- Methylresorcin, 5-Methylresorcin, 2,5-Dimethylresorcin und 2,6-Dihydroxy-3,4- dimethylpyridin.
Es ist nicht erforderlich, dass die Oxidationsfarbstoffvorprodukte oder die direktziehenden Farbstoffe jeweils einheitliche Verbindungen darstellen. Vielmehr können in den erfindungsgemäßen Haarfärbemitteln, bedingt durch die Herstellungsverfahren für die einzelnen Farbstoffe, in untergeordneten Mengen noch weitere Komponenten enthalten sein, soweit diese nicht das Färbeergebnis nachteilig beeinflussen oder aus anderen Gründen, z. B. toxikologischen, ausgeschlossen werden müssen.
Bezüglich der in den erfindungsgemäßen Haarfärbe- und -tönungsmitteln einsetzbaren Farbstoffe wird weiterhin ausdrücklich auf die Monographie Ch. Zviak, The Science of Hair Care, Kapitel 7 (Seiten 248-250; direktziehende Farbstoffe) sowie Kapitel 8, Seiten 264-267; Oxidationsfarbstoffvorprodukte), erschienen als Band 7 der Reihe "Dermatology" (Hrg.: Ch., Culnan und H. Maibach), Verlag Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 1986, sowie das "Europäische Inventar der Kosmetik-Rohstoffe", herausgegeben von der Europäischen Gemeinschaft, erhältlich in Diskettenform vom Bundesverband Deutscher Industrie- und Handelsunternehmen für Arzneimittel, Reformwaren und Körperpflegemittel e. V., Mannheim, Bezug genommen.
Die Oxidationsfarbstoffvorprodukte sind in den erfindungsgemäßen Mitteln bevorzugt in Mengen von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte Mittel, enthalten.
Als Vorstufen naturanaloger Farbstoffe werden bevorzugt solche Indole und Indoline eingesetzt, die mindestens eine Hydroxy- oder Aminogruppe, bevorzugt als Substituent am Sechsring, aufweisen. Diese Gruppen können weitere Substituenten tragen, z. B. in Form einer Veretherung oder Veresterung der Hydroxygruppe oder eine Alkylierung der Aminogruppe.
Besonders gut als Vorstufen naturanaloger Haarfarbstoffe geeignet sind Derivate des 5,6-Dihydroxyindolins der Formel (Va),

in der unabhängig voneinander

- R¹ steht für Wasserstoff, eine C₁-C₄-Alkylgruppe oder eine C₁-C₄ -Hydroxyalkylgruppe,
- R² steht für Wasserstoff oder eine -COOH-Gruppe, wobei die -COOH- Gruppe auch als Salz mit einem physiologisch verträglichen Kation vorliegen kann,
- R³ steht für Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkylgruppe,
- R⁴ steht für Wasserstoff, eine C₁-C₄-Alkylgruppe oder eine Gruppe -CO-R⁶, in der R⁶ steht für eine C₁-C₄-Alkylgruppe, und
- R⁵ steht für eine der unter R⁴ genannten Gruppen,

Besonders bevorzugte Derivate des Indolins sind das 5,6-Dihydroxyindolin, N- Methyl-5,6-dihydroxyindolin, N-Ethyl-5,6-dihydroxyindolin, N-Propyl-5,6- dihydroxyindolin,
N-Butyl-5,6-dihydroxyindolin, 5,6-Dihydroxyindolin-2-carbonsäure sowie das 6- Hydroxyindolin, das 6-Aminoindolin und das 4-Aminoindolin.
Besonders hervorzuheben sind innerhalb dieser Gruppe N-Methyl-5,6- dihydroxyindolin, N-Ethyl-5,6-dihydroxyindolin, N-Propyl-5,6-dihydroxyindolin, N-Butyl-5,6-dihydroxyindolin und insbesondere das 5,6-Dihydroxyindolin.
Als Vorstufen naturanaloger Haarfarbstoffe hervorragend geeignet sind weiterhin Derivate des 5,6-Dihydroxyindols der Formel (Vb),

in der unabhängig voneinander

- R¹ steht für Wasserstoff, eine C₁-C₄-Alkylgruppe oder eine C₁-C₄ -Hydroxyalkylgruppe,
- R² steht für Wasserstoff oder eine -COOH-Gruppe, wobei die -COOH- Gruppe auch als Salz mit einem physiologisch verträglichen Kation vorliegen kann,
- R³ steht für Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkylgruppe,
- R⁴ steht für Wasserstoff, eine C₁-C₄-Alkylgruppe oder eine Gruppe -CO-R⁶, in der R⁶ steht für eine C₁-C₄-Alkylgruppe, und
- R⁵ steht für eine der unter R⁴ genannten Gruppen,
- sowie physiologisch verträgliche Salze dieser Verbindungen mit einer organischen oder anorganischen Säure.

Besonders bevorzugte Derivate des Indols sind 5,6-Dihydroxyindol, N-Methyl- 5,6-dihydroxyindol, N-Ethyl-5,6-dihydroxyindol, N-Propyl-5,6-dihydroxyindol, N- Butyl-5,6-dihydroxyindol, 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäure, 6-Hydroxyindol, 6- Aminoindol und 4-Aminoindol.
Innerhalb dieser Gruppe hervorzuheben sind N-Methyl-5,6-dihydroxyindol, N- Ethyl-5,6-dihydroxyindol, N-Propyl-5,6-dihydroxyindol, N-Butyl-5,6- dihydroxyindol sowie insbesondere das 5,6-Dihydroxyindol.
Die Indolin- und Indol-Derivate können in den im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Färbemitteln sowohl als freie Basen als auch in Form ihrer physiologisch verträglichen Salze mit anorganischen oder organischen Säuren, z. B. der Hydrochloride, der Sulfate und Hydrobromide, eingesetzt werden. Die Indol- oder Indolin-Derivate sind in diesen üblicherweise in Mengen von 0,05-10 Gew.-%, vorzugsweise 0,2-5 Gew.-% enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, das Indolin- oder Indolderivat in Haarfärbemitteln in Kombination mit mindestens einer Aminosäure oder einem Oligopeptid einzusetzen. Die Aminosäure ist vorteilhafterweise eine α-Aminosäure ist; ganz besonders bevorzugte α- Aminosäuren sind Arginin, Ornithin, Lysin und Histidin, insbesondere Arginin.
Neben den Farbstoffvorprodukten können die erfindungsgemäßen Färbemittel zur weiteren Nuancierung direktziehende Farbstoffe enthalten. Diese sind üblicherweise ausgewählt aus Nitrophenylendiamine, Nitroaminophenole, Azofarbstoffe, Anthrachinone oder Indophenole. Bevorzugte direktziehende Farbstoffe sind die unter den internationalen Bezeichnungen bzw. Handelsnamen HC Yellow 2, HC Yellow 4, HC Yellow 5, HC Yellow 6, Basic Yellow 57, HC Orange 1, Disperse Orange 3, HC Red 1, HC Red 3, HC Red 13, HC Red BN, Basic Red 76, HC Blue 2, HC Blue 12, Disperse Blue 3, Basic Blue 7, Basic Blue 26, Basic Blue 99, HC Violet 1, Disperse Violet 1, Disperse Violet 4, Basic Violet 2, Basic Violet 14, Acid Violet 43, Disperse Black 9, Acid Black 52, Basic Brown 16 und Basic Brown 17 bekannten Verbindungen sowie 1,4-Bis-(β- hydroxyethyl)-amino-2-nitrobenzol, 3-Nitro-4-(β-hydroxyethyl)-aminophenol, 4- Amino-2-nitrodiphenylamin-2'-carbonsäure, 6-Nitro-1,2,3,4-tetrahydrochinoxalin, 2-Hydroxy-1,4-naphthochinon, Hydroxyethyl-2-nitro-toluidin, Pikraminsäure, 2- Amino-6-chloro-4-nitrophenol, 4-Ethylamino-3-nitrobenzoesäure und 2-Chloro- 6-ethylamino-1-hydroxy-4-nitrobenzol. Die erfindungsgemäßen Mittel gemäß dieser Ausführungsform enthalten die direktziehenden Farbstoffe bevorzugt in einer Menge von 0,01 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das gesamte Färbemittel.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Zubereitungen auch in der Natur vorkommende Farbstoffe wie beispielsweise Henna rot, Henna neutral, Henna schwarz, Kamillenblüte, Sandelholz, schwarzen Tee, Faulbaumrinde, Salbei, Blauholz, Krappwurzel, Catechu, Sedre und Alkannawurzel enthalten.
Neben dem erfindungsgemäß gewonnenen Enzymsystem können die erfindungsgemäßen Färbemittel auch weitere Enzyme, wie beispielsweise Laccasen, Peroxidasen oder Oxidasen mit ihren jeweiligen Substraten enthalten. Bevorzugte Oxidasen sind beispielsweise Cholin-Oxidase, Glucose-Oxidase, Alkohol-Oxidase, Pyruvat-Oxidase, Oxalat-Oxidase, Cholesterin-Oxidase, Uricase, Lactat-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Pyranose-Oxidase, Glycerin-Oxidase sowie Galactose-Oxidase. Im Rahmen dieser Ausführungsform besonders bevorzugt sind Mittel, die neben dem Phenol oxidierenden Enzym weiterhin Uricase, Glucose-Oxidase und/oder Xanthin-Oxidase sowie deren jeweilige Substrate enthalten.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Färbemittel können die Farbstoffvorprodukte in einen geeigneten wasserhaltigen Träger eingearbeitet werden. Zum Zwecke der Haarfärbung sind solche Träger z. B. Cremes, Emulsionen, Gele oder auch tensidhaltige schäumende Lösungen, z. B. Shampoos, Schaumaerosole oder andere Zubereitungen, die für die Anwendung auf dem Haar geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen Färbemittel können weiterhin alle für solche Zubereitungen bekannten Wirk-, Zusatz- und Hilfsstoffe enthalten. In vielen Fällen enthalten die Färbemittel mindestens ein Tensid, wobei prinzipiell sowohl anionische als auch zwitterionische, ampholytische, nichtionische und kationische Tenside geeignet sind. Der Fachmann kann einen eventuellen Einfluß der verschiedenen Tenside auf die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzymsystems gegebenenfalls durch einfache Vorversuche überprüfen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in den Mitteln zur Färbung keratinischer Fasern eine Kombination aus anionischen und nichtionischen Tensiden oder eine Kombination aus anionischen und amphoteren Tensiden eingesetzt.
Es hat sich aber in Einzelfällen als vorteilhaft erwiesen, die Tenside aus amphoteren oder nichtionischen Tensiden auszuwählen, da diese in der Regel den erfindungsgemäßen Färbeprozeß weniger beeinflussen.

Abbildungen

Abb. 1 gibt den Verlauf der Sauerstofftransferrate (OTR) für S. bisbyi in erfindungsgemäßem Stachybotrys Minimalmedium (SMM) und in Minimalmedium nach KOROLJOVA-Protokoll unter Zugabe von 1 mL/L Benzylalkohol wieder.
Abb. 2 gibt die zu Abb. 1 zugehörigen Verläufe der Phenoloxidaseaktivitäten für S. bisbyi in SMM (0 und 0,025 g/L Kupfersulfat) und in Minimalmedium nach KOROLJOVA-Protokoll unter Zugabe von 1 ml/L Benzylalkohol an.
Abb. 3 gibt den Vergleich der Phenoloxidase-Produktion in SMM unter variierten Benzylalkohol-Zusätzen (0 ml/L, 1 ml/L, 5 ml/L) wider.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:

1. Produktion von Phenoloxidase durch Stachybotrys bisbyi

Als Enzymbildner wurde Stachybotrys bisbyi eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Stachybotrys Minimalmedium hatte folgende Zusammensetzung:

die sich von der durch KOROLJOVA-SKOROBOGAT'KO et al. (1998) beschriebenen Zusammensetzung folgendermaßen unterscheidet:

a) Die CuSO₄.5H₂O - Konzentration beträgt 0,025 g pro Liter Medium (0,25 g/L nach KOROLJOVA-SKOROBOGAT'KO et al.),
b) Das erfindungsgemäße Stachybotrys Minimalmedium (SMM) enthält 1 mL/L Benzylalkohol (das Medium nach KOROLJOVA- SKOROBOGAT'KO et al. enthält keinen Benzylalkohol) und
c) Der pH des Mediums beträgt 5,6 (6,0 nach KOROLJOVA- SKOROBOGAT'KO et al.).

Abb. 1 gibt den Verlauf der Sauerstofftransferrate (OTR) für S. bisbyi in erfindungsgemäßem Stachybotrys Minimalmedium (SMM) und in Minimalmedium nach KOROLJOVA-Protokoll unter Zugabe von 1 mL/L Benzylalkohol wieder. Die Sauerstofftransferrate (OTR) beschreibt die pro Kulturvolumen und Zeit aus dem Gasraum in die Flüssigkeit übertretende Sauerstoffmenge. Dieser Wert zeigt die Atmungsaktivität bzw. die biologische Aktivität einer mikrobiellen Kultur zu einem bestimmten Zeitpunkt an. Die Kultivierungstemperatur betrug 26°C, die Inokulationsdichte 10⁴ Sporen pro ml.

Reduktion der Kupfersulfatkonzentration

Das Minimalmedium nach KOROLJOVA-Protokoll enthält 0,25 g/L Kupfersulfat. SMM enthält 0,025 g/L Kupfersulfat.
Ein weiterer SMM-Ansatz wurde ohne Kupfersulfat (0 g/L) geführt.
Durch die Reduktion der Kupfersulfat-Konzentration in SMM auf 0 bzw 0,025 g/L konnte das Wachstum für Stachybotrys bibsyi um 48 h beschleunigt werden und die maximale Atmungsrate ca. ein Viertel angehoben werden (z. B. von 0,0015 mol/L/h auf 0,002 mol/L/h).
Die aus dem Verlauf der Sauerstofftransferrate abgeleitete maximale spezifische Wachstumsrate beträgt in Minimalmedium nach Koroljova-Protokoll (0,25 g/L Kupfersulfat) ca. 0,05 1/h. In SMM-Medium (0 g/L und 0,025 g/L Kupfersulfat) wurde sie auf ca. 0,1 1/h gesteigert.
Die nach KOROLJOVA-SKOROBOGAT'KO et al. (1998) eingesetzte Kupfersulfat-Konzentrationen von 0,25 g/L wirkte anscheinend inhibierend oder toxisch.
Abb. 2 gibt die zu Abb. 1 zugehörigen Verläufe der Phenoloxidaseaktivitäten für S. bisbyi in SMM (0 und 0,025 g/L Kupfersulfat) und in Minimalmedium nach KOROLJOVA-Protokoll unter Zugabe von 1 ml/L Benzylalkohol an.
Die Phenoloxidase-Produktion in SMM mit 0,025 g/L Kupfersulfat wurde gegenüber dem Minimalmedium nach Koroljova um 96 h beschleunigt und in SMM wurde die maximale Aktivität von 7 U [ΔE₄₂₀/min] gemessen.
Im gleichen Kultivierungszeitraum wurde in Minimalmedium nach Koroljova- Protokoll mit 1 mL/L Benzylalkohol nur eine Aktivität von 2 U [ΔE₄₂₀/min] gemessen.
In SMM-Medium ohne Kupfersulfat wurde eine Phenoloxidaseaktivität von nur 0,3 U [ΔE₄₂₀/min] gemessen.
Eine geringe Kupfersulfatzugabe ist für die Phenoloxidaseproduktion anscheinend essentiell.

Induktorwirkung des Benzylalkohol

Abb. 3 gibt den Vergleich der Phenoloxidase-Produktion in SMM unter variierten Benzylalkohol-Zusätzen (0 ml/L, 1 ml/L, 5 ml/L) wider.
Unter den untersuchten Benzylalkohol-Konzentrationen wurde bei 1 ml/L Benzylalkohol die maximale Aktivität von 6 U [ΔE₄₂₀/min] gemessen.
Ohne Benzylalkohol nach KOROLJOVA wurden geringere maximale Aktivitäten von 3 U [ΔE₄₂₀/min] gemessen.
Beim Einsatz von 5 ml/L Benzylalkohol blieb das Wachstum aufgrund einer anscheinend toxischen Wirkung des Benzylalkohols vollständig aus.

Inokulation

Stachybotrys spec. bildet auf Kartoffel-Dextrose-Agar nach Inkubation bei 26°C nach vier Wochen Konidiosporen aus. Durch Suspendierung in einer NaCl- Lösung (0,9 g/L) wurde eine Konidiosporenstammlösung hergestellt. Die Inokulation erfolgte mit einem Titer von 10⁴ Sporen/mL Hauptkulturvolumen.

Kultivierungstemperatur

Bei einer Kultivierungstemperatur von 26°C wurden unter Medienoptimierten Bedingungen (s. o.) durchgängig reproduzierbare maximale Phenoloxidase- Aktivitäten von 9 U [ΔE₄₂₀/min] gemessen.
Bei 18°C, 22°C und 30°C variierten die gemessenen maximalen Aktivitäten zwischen 0 und 9 U [ΔE₄₂₀/min]. Bei 18°C und 22°C wurde gleichzeitig ein verringertes Wachstum festgestellt.

Ernte des Kulturüberstandes

Die Kultivierungsdauer betrug ca. zwei Wochen. Die maximale Phenoloxidase- Aktivität wurde nach 10 ± 2 Tage detektiert. Zur Ernte der Phenoloxidase wurde die Kulturbrühe abzentrifugiert und der Überstand auf Phenoloxidase-Aktivität analysiert.

2. Analyse der Phenoloxidase-Aktivität

Die Analyse der Phenoloxidase-Aktivität erfolgte durch Oxidation von ABTS® (Diammonium-Salz der 2,2'-Azino-bis-(3-ethyl-2,3-dihydro-1,3-benzthiazol-6- sulfonsäure)) als Chromogen für die enzymat. Analyse. sowie durch Messung der Extinktionsänderung bei 420 nm im Photometer nach folgendem Protokoll:

- 1,5 ml 120 mM NaOAc (wasserlöslich) (pH auf 5 einstellen, z. B. mit 1 N NaOH)
- 0,2 ml 4,5 mM ABTS®
- 0,3 ml Probe (Kulturüberstand bei 12000 rpm 5 min, abzentrifugiert)
- kurz durchmischen
- kontinuierliche Messung der optischen Dichte (OD), z. B. in einem Uvikon- Spektrophotometer bei 420 nm über 2 min. (50 scanning rate pro min.) direkt nach Zugabe des Überstandes.

Hierbei entspricht 1 U der Extinktionsänderung/min um 1 Einheit (1 OD) bei 420 nm.

3. Bioreaktor und Schüttelbedingungen

Die Kultivierung erfolgte in geschüttelten Erlenmeyerkolben (Nominalvolumen 250 mL) Die Schüttelbedingungen waren folgende:

- Rotationsschüttler, Schüttelkreisdurchmesser 50 mm
- Füllvolumen 30 mL
- Schüttelfrequenz 150 Upm

Die gewählten Schüttelbedingungen gewährleisteten eine unlimitierte Sauerstoffversorgung.
Durch die Verwendung hydrophobisierter Kolben konnte die Reproduzierbarkeit der Pilzmorphologie gesteigert werden. In diesen Kolben bildeten sich durchgängig Pellets mit einem Durchmesser von ca. 1-5 mm aus.
Unter Verwendung hydrophober Kolben wurden stärkere maximale Atmungsraten und ein schnelleres Anwachsen als in unbehandelten Kolben beobachtet. Desweiteren konnte mit hydrophoben Kolben auch eine reproduzierbare maximale Phenoloxidase-Bildung gewährleistet werden.
Zur Überprüfung des Einflusses der Glasoberfläche auf das Kulturverhalten der Stachybotrys-Stämme wurde die Glasinnenwand der Schüttelkolben hydrophobisiert. Für die Hydrophobisierung wurde wie folgt vorgegangen:
Zur Aktivierung des Glases für die Hydrophobisierung müssen die Kolben vorab hydrophilisiert werden.

a) Anleitung zum Hydrophilisieren

Die Kolben werden zu zwei Drittel ihres Nominalvolumens mit 20% (v/v) Salpetersäure gefüllt und auf die Heizplatte eines Magnetrührers gestellt. Ein Rührfisch sorgt für eine ausreichende Durchmischung. Die Kolben werden mit Wattestopfen verschlossen. Die Kolben werden unter dem Sieden der Salpetersäure ca. 45 min ausgekocht. Nach dem Abkühlen werden sie ca. 5 min gründlich mit vollentionisiertem Wasser gespült.

b) Anleitung zum Hydrophobisieren

Das Silanisierungsreagenz Dichlormethylsilan (SIGMA) wird zu 5% (w/v) in Toluol gelöst. Die hydrophilisierten Kolben (siehe oben) werden zu etwa einem Drittel ihres Nominalvolumens gefüllt und ca. 5 Minuten kräftig unter dem Abzug geschüttelt, so dass die gesamte Wandung mit einem Flüssigkeitsfilm benetzt wird. Die Kolben werden dann entleert (nicht mit Wasser gespült!) und 24 h unter dem Abzug luftgetrocknet. Danach werden die Kolben 5 min mit vollentionisiertem Wasser gespült und separat von anderen Glasgegenständen im Trockenschrank getrocknet.

Claims

1. Kulturmedium zur Kultivierung filamentöser Pilze, enthaltend

a) etwa 5 bis etwa 20 [g/L] Glucose,

b) etwa 1 bis etwa 6 [g/L] Peptone sowie

c) etwa 0,006 bis etwa 0,03 [g/L] CuSO₄.

2. Kulturmedium nach Anspruch 1, enthaltend

a) etwa 5 bis etwa 20 [g/L] Glucose,

b) etwa 1 bis etwa 6 [g/L] Peptone,

c) etwa 0,006 bis etwa 0,03 [g/L] CuSO₄,

d) etwa 0,01 bis etwa 1,0 [g/L] KH₂PO₄,

e) etwa 0,0003 bis etwa 0,003 [g/L] ZnSO₄,

f) etwa 0,01 bis etwa 0,8 [g/L] K₂HPO₄,

g) etwa 0,00005 bis etwa 0,005 [g/L] FeSO₄,

h) etwa 0,009 bis etwa 0,09 [g/L] MnSO₄ sowie

i) etwa 0,005 bis etwa 0,5 [g/L] MgSO₄.

3. Kulturmedium nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend

a) 7 bis 18 [g/L] Glucose,

b) 2 bis 5 [g/L] Peptone,

c) 0,009 bis 0,022 [g/L] CuSO₄,

d) 0,1 bis 1,0 [g/L] KH₂PO₄,

e) 0,0004 bis 0,002 [g/L] ZnSO₄,

f) 0,02 bis 0,6 [g/L] K₂HPO₄,

g) 0,0001 bis 0,005 [g/L] FeSO₄,

h) 0,02 bis 0,07 [g/L] MnSO₄ sowie

i) 0,01 bis 0,4 [g/L] MgSO₄.

4. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend

a) 10 bis 15 [g/L] Glucose,

b) 3 [g/L] Peptone,

c) 0,016 [g/L] CuSO₄,

d) 0,6 [g/L] KH₂PO₄,

e) 0,0006 [g/L] ZnSO₄,

f) 0,04 bis 0,4 [g/L] K₂HPO₄,

g) 0,0003 bis 0,003 [g/L] FeSO₄,

h) 0,04 [g/L] MnSO₄ sowie

i) 0,02 bis 0,2 [g/L] MgSO₄.

5. Kulturmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend zusätzlich eine Verbindung, die die Biosynthese von Enzymen induziert, insbesondere eine Verbindung, die ausgewählt ist unter:

a) ABTS®

b) 3,4-Xylidin,

c) Huminsäuren,

d) Kaffeesäure,

e) Guajakol,

f) Sinapinsäure,

g) o-Toluidin,

h) chelatisierenden Ligninverbindungen,

i) Syringaldazin und vorzugsweise

j) Benzylalkohol.

6. Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus filamentösen Pilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) filamentöse Pilze in einem Kulturmedium nach einem vorhergehenden Ansprüche kultiviert und

b) die Enzyme aus den kultivierten Pilzen bzw. aus dem Kulturmedium isoliert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die filamentösen Pilze ausgewählt sind unter Pilzen der Genera Acremonium, Aspergillus, Coriolus, Coprinus, Pleurotus, Stachybotrys und Fusarium, insbesondere unter Pilzen des Genus Stachybotrys; vorzugsweise unter Pilzen der Species Stachybotrys atra, Stachybotrys aurantia, Stachybotrys bisbyi Stachybotrys chartarum, Stachybotrys parvispora, Stachybotrys kampalensis, Stachybotrys theobromae, Stachybotrys cylindrospora, Stachybotrys dichroa, Stachybotrys oenanthes und Stachybotrys nilagerica; besonders bevorzugt unter Stachybotrys bisbyi und Stachybotrys chartarum.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme ausgewählt sind unter

a) Proteasen,

b) Oxidoreductasen, wie Oxidasen, insbesondere Phenoloxidasen, Peroxidasen, Laccasen, Tyrosinasen;

c) Lipasen und

d) Glycosidasen, wie Amylasen, Cellulasen und Glucanasen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung der filamentösen Pilze in einem hydrophobisierten Kulturgefäß, vorzugsweise in einem hydrophobisierten gläsernen Gefäß, insbesondere einem hydrophobisierten Glaskolben vornimmt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass

a) man als filamentöse Pilze solche der Species Stachybotrys bisbyi einsetzt, und

b) es sich bei dem zu gewinnenden Enzym um eine Phenoloxidase handelt, und

c) man die Kultivierung der Pilze bei einer Temperatur von 26°C vornimmt.

11. Verwendung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Kultivierung filamentöser Pilze.

12. Verwendung der unmittelbaren Verfahrensprodukte aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10 in Waschmitteln, Reinigungsmitteln, Handwaschmitteln, Handgeschirrspülmitteln, Maschinengeschirrspülmitteln, kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitungen, Haartönungs- und Haarfärbemitteln und Mitteln zum Färben oder Bleichen von Textilien, Pulpe, Papier, Pelzen, Fellen oder Leder.

13. Waschmittel, Reinigungsmittel, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen, Haartönungs- und Haarfärbemittel und Mittel zum Färben oder Bleichen von Textilien, Pulpe, Papier, Pelzen, Fellen oder Leder, enthaltend unmittelbare Verfahrensprodukte aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10.