DE102006054205A1

DE102006054205A1 - Verwendung von Cytohesin-Inhibitoren zur chemischen Induktion von Langlebigkeit

Info

Publication number: DE102006054205A1
Application number: DE102006054205A
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Famulok; Markus Dipl.-Chem. Hafner; Anton Dr. Schmitz; Bernhard Dr. Fuss; Ingo Dr. Zinke; Michael Prof. Dr. Hoch
Original assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Current assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Priority date: 2006-11-15
Filing date: 2006-11-15
Publication date: 2008-05-29
Also published as: EP2101753A2; WO2008058995A2; US20100048594A1; WO2008058995A3

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF(Insulin-like growth-factor)-Signalweg in Zusammenhang stehen und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und (4) zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen und pathologischen Zustanden, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen, und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.
Verbindungen gemäß der allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und (4) sind aus der Schrift DE 10 2004 055 998 A1 bekannt.
Jede Zellfunktion einschließlich der Zellalterung und des Zelltods wird durch eine Vielzahl von Zellsignalwegen kontrolliert. Auch die Entwicklung einiger Krankheiten ist von der Zellalterung abhängig und die Wahrscheinlichkeit, an Erkrankungen zu sterben, steigt mit zunehmendem Alter an.
Ein weiteres weit verbreitetes Problem, das mit dem heutigen Lebensstil verbunden ist, ist Fettleibigkeit, auch Adipositas genannt. Diese ist ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung vieler chronischer Erkrankungen sowie einiger Krebsarten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die wenigsten einen der Nachteile des Standes der Technik überwinden. Insbesondere bestand die Aufgabe, Mittel zur Verfügung zu stellen, die eine Beeinflussung des Insulin-Signalwegs erlauben.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) wie nachstehend angegeben:
worin:
R ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Alkoxy und/oder ein Strukturelement (A1), (B1), (C1), (D1), (E1), (F1), (G1), (H1), (I1), (J1), (L1), (M1) wie nachstehend angegeben:
worin:
R₄ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl und/oder C1-C10-Alkoxy,
und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.
Es wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine Beeinflussung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs zeigen können. Insbesondere wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen in Mäusen zu einer Insulin-Resistenz, d.h. einer verminderten Aktivität des Insulinsignalwegs, führen können.
Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die Beeinflussung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs und die Insulin-Resistenz auf einer Inhibition der Cytohesine, insbesondere von Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4, durch die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen beruht.
Es wurde überraschend gefunden, dass Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) zu einer chemisch induzierten Langlebigkeit führen können.
Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A1), (B1), (C1), (D1) und/oder (E1) auf. In weiter bevorzugten Ausführungsformen weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens ein Strukturelement ausgewählt aus der Gruppe umfassend (E1), (F1), (G1), (H1), (I1), (J1), (K1), (L1), (M1) und/oder (O1) auf.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Strukturelement R₄ gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, NHCOCHCl₂, Cl, CF₃, und/oder F.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ist, dass die Verbindungen insbesondere auch für die prophylaktische Verwendung verwendbar sind. Hierdurch ergibt sich nicht nur die Möglichkeit die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Behandlung bereits bestehender pathologischer Zustände zu verwenden sondern auch deren prophylaktischer Einsatz in der Vorsorge, beispielsweise von altersbedingten Zellschäden oder Fettleibigkeit.
Unter dem Begriff "prophylaktische Behandlung" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere verstanden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen prophylaktisch verabreicht werden können, beispielsweise bevor altersbedingte Zellschäden auftreten. Insbesondere ist von Vorteil, dass beispielsweise Fettleibigkeit durch eine prophylaktische Behandlung verhindert werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7) und/oder (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin:
R₁ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2), (N2) wie nachstehend angegeben:

R₂ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (I2), (J2), (K2), (L2), (M2), (O2) wie nachstehend angegeben:

R₃ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl und/oder C1-C10-Alkoxy.
Vorzugsweise sind wenigstens eines oder mehrere der Strukturelemente R₁, R₂ und/oder R₃ gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A2), (B2), (C2) und/oder (D2). Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) aufweisen. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) auf. Weiter bevorzugt weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens ein Strukturelement ausgewählt aus der Gruppe umfassend (E2), (F2), (G2), (H2), (I2), (J2), (K2), (L2), (M2) und/oder (O2) auf. Vorzugsweise ist das Strukturelement R₃ der Strukturelemente (E2), (F2), (G2), (H2), (I2), (J2), (K2), (L2), (M2) und/oder (O2) Wasserstoff.
In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7) und/oder (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin:
R₁ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3), (N3) wie nachstehend angegeben:

R₂ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (I3), (J3), (K3), (L3), (M3), (O3) wie nachstehend angegeben:

R₃ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl und/oder C1-C10-Alkoxy.
Bevorzugt sind wenigstens eines oder mehrere der Strukturelemente R₁, R₂ und/oder R₃ der Verbindungen (5), (6), (7) und (8) gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A3), (B3), (C3) und/oder (D3). Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) auf. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) auf. In weiter bevorzugten Ausführungsformen weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens ein Strukturelement ausgewählt aus der Gruppe umfassend (E3), (F3), (G3), (H3), (I3), (J3), (K3), (L3), (M3) und/oder (O3) auf.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind wenigstens ein Strukturelement R, R₁, R₂, R₃ und/oder R₄, vorzugsweise wenigstens ein Strukturelement R der Verbindungen (1), (2), (3) und (4), insbesondere R₃ der Verbindungen (5), (6), (7) und (8), jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend -C1-C5-Alkyloxy, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend -O-Methyl, -O-Ethyl, O-Isopropyl und/oder -O-tert-Butyl. Besonders bevorzugt unter den C1-C5-Alkoxygruppen sind Methoxy- und/oder Ethoxygruppen, ganz besonders bevorzugt sind Methoxygruppen.
Es wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine wesentlich verbesserte Wirkung aufweisen, je kleiner die Alkoxygruppen sind. So wurde überraschend festgestellt, dass eine erheblich Steigerung der Wirksamkeit bei der Verwendung der Verbindungen erzielt werden kann, wenn die Alkoxygruppe R₃, insbesondere der Verbindungen (5), eine C1-C2-Alkoxygruppe ist, und eine weitere Steigerung der Wirksamkeit der Verbindung erzielt werden kann, wenn die Alkoxygruppe R₃ eine Methoxygruppe ist.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen 1,2,4-Triazole ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen gemäß den Formeln (1) und/oder (5). Vorzugsweise ist R₁ der Verbindungen gemäß Formel (5) ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3) oder (N3), R₂ ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (I3), (J3), (K3), (L3), (M3) oder (O3) und/oder R₃ eine C1-C5-Alkoxygruppe, bevorzugt eine Methoxy- oder Ethoxygruppe. Bevorzugt ist R₁ der Verbindungen gemäß Formel (5) ein Strukturelement (A3) oder (B3), R₂ ein Strukturelement (E3), (F3) oder (K3) und/oder R₃ eine eine Methoxy- oder Ethoxygruppe.
In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (22), (23) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Es wurde überraschend gefunden, dass insbesondere 1,2,4-Triazole gemäß der allgemeinen Formeln (1) und/oder (5), insbesondere gemäß Formel (9), eine Insulin-Resistenz hervorrufen und/oder zu einer chemisch induzierten Langlebigkeit führen können.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (12), (14), (20), (21) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen können die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen derivatisiert sein, beispielsweise phosphoryliert, glykosyliert, acetyliert, ubiquitinyliert, farnesyliert, palmitoyliert, geranylgeranyliert und/oder biotinyliert.
Bevorzugte Derivate sind biotinylierte Verbindung, besonders bevorzugt ist beispielsweise Verbindung (24) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze
Ein Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen kann dadurch verwirklicht werden, dass diese eine inhibitorische Wirkung auf Cytohesin-abhängige Signalkaskaden des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs ausüben können.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können beispielsweise in vivo in der Maus und in der Fliege zeigen, dass eine Insulin-Resistenz bewirkt werden kann. Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können weiterhin in in vitro-Experimenten in humanen Leberzellen zeigen, dass diese ebenfalls eine Insulin-Resistenz entwickeln können. Eine Insulin-Resistenz kann zu einer Erhöhung der Lebensdauer bzw. Langlebigkeit führen und es ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten in der Therapie von altersbedingten Erkrankungen.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, dass diese im Rahmen einer therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung eine chemisch induzierte Langlebigkeit erlauben können. Unter dem Begriff einer „chemisch induzierten Langlebigkeit" wird im Rahmen dieser Erfindung verstanden, dass durch die Verabreichung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen die Lebensdauer eines Organismus und/oder eines Gewebes oder Organs verlängert werden kann. Eine Verlängerung der Lebensdauer eines Organismus und/oder eines Gewebes oder Organs kann vorteilhafter Weise dadurch erzielt werden, dass eine erfindungsgemäß verwendbare Verbindung verabreicht wird, ohne dass ein medizinischer Eingriff oder eine genetische Veränderung des Organismus notwendig ist, eine Langlebigkeit also chemisch insbesondere durch Verabreichen einer Substanz induziert werden kann.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ermöglichen vorteilhafter Weise eine Beeinflussung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs, und eine Verwendung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen.
Die Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs wird durch eine Vielzahl von Hormonen und Botenstoffen beeinflusst, die in einem komplexen Gleichgewicht stehen. Eine gestörte Regulation kann zu vielfältigen Erkrankungen führen, beispielsweise zu Fettleibigkeit. Vorzugsweise handelt es sich tun Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Störung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen, insbesondere um Erkrankungen und pathologischen Zustände, die durch eine Erhöhung des Insulin- und/oder IGF-Signallings verursacht werden. In bevorzugten Ausführungsformen könne die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine Inhibierung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs bewirken.
Bevorzugt behandelbare Erkrankungen und pathologische Zustände, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-Signalwegs in Zusammenhang stehen, sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fettleibigkeit, Zellalterung, alterungsbedingte Zellschäden, insbesondere in Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, alterungsbedingte pathologische Zustände von Leber- und/oder Bauchspeicheldrüsen-Zellen, alterungsbedingte Funktionsstörungen, beispielsweise eine verminderte Regenerationsfähigkeit von Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, Zellstress, insbesondere oxidativer Stress, insbesondere durch erhöhte Verstoffwechselung von Zucker ausgelöster Stress, und/oder Apoptose, insbesondere β-Zell-Apoptose.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann eine Verwendung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Verlängerung des Lebensalters von Tieren, beispielsweise Säugetieren, insbesondere bei Menschen führen.
Eine chemisch induzierte Verlängerung des Lebens oder des Lebensalters ist ein ganz besonderer Vorteil, der durch die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Verfügung gestellt werden kann.
Vorteilhafter Weise können die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine nur geringe oder vernachlässigbare Toxizität bei der Verabreichung aufweisen. Dies ermöglicht beispielsweise eine langfristige Verabreichung. Dies ermöglicht auch eine prophylaktische Verabreichung, insbesondere an Menschen.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind entsprechend üblichen Methoden verabreichbar. Bevorzugt ist eine orale oder parenterale Verabreichung, besonders bevorzugt ist eine orale Verabreichung. In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen für die orale oder intravenöse Verabreichung formuliert. Bevorzugte Hilfsstoffe und/oder Lösemittel sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend DMSO (Dimethylsulfoxid), Glycerol und/oder Öl. Vorzugsweise sind Lösemittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend DMSO und/oder Pflanzenöl, insbesondere Olivenöl. Ein Vorteil der Verwendung von Öl, beispielsweise Olivenöl, liegt darin, dass eine Verbesserung der Verträglichkeit zur Verfügung gestellt werden kann.
Beispiele, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.
Material und Methoden
Zellkultur
Humanen HepG2-Zellen (ECACC) wurden in EMEM Medium (Cambrex) unter Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum kultiviert. 10⁵ Zellen wurden in 2 ml Medium in 6 well-Platten ausgesäht und bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ für 1 bis 3 Tage kultiviert, bevor sie für Experimente benutzt wurden.
Mäuse
Verwendet wurden C57BL/6 Mäuse (Charles River Laboratories), die unter Einhaltung eines 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus in einer pathogenfreien Tieranlage gehalten wurden. Die Tiere erhielten ein Standardmaus-Futter (19% Protein, 3,3% Fett, 41,3% Kohlenhydrate; ssniff Spezialdiäten GmbH) ad libitum. Verwendet wurden männliche Tiere im Alter zwischen 8 und 12 Wochen.
Fliegen
Verwendet wurden Drosophila Fliegen (Stamm # 6326 aus der öffentlichen Bloomington Stammsammlung, Genotyp. white¹¹¹⁸, URL http://flybase.org/.bin/fbidq.html?FBst0006326 die in Gruppen von 20 Fliegen mit einem Verhältnis Männchen zu Weibchen von 1 : 1 bei 25°C auf Standard-Fliegenfutter (0,53 % (w/v) Fadenagar (Firma „Gewürzmühle Brecht"); 1,1 % (w/v) Bierhefe (Firma „Gewürzmühle Brecht"); 5,43 % (w/v) Maismehl; 6,6 % (v/v) Zuckerrübensirup (Grafschafter); 0,13 % (w/v) Nipagin (Methyl-4-Hydroxybenoat Natriumsalz, Firma Merck); 1,3 % (v/v) Ethanol (Firma Roth), 0,3 % DMSO (Roth) gehalten wurden. Für die Versuche wurden adulte Fliegen null bis vier Stunden nach Schlüpfen aus der Puppe verwendet; die Tiere erhielten jeden dritten Tag neues Futter.
Beispiel 1
Untersuchungen der Transkription von IGFBP1 (Insulin-like Growth Factor Einding Protein) zur Beeinflussung des Insulin-Signalwegs durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in Leberzellen
Humanen HepG2-Zellen (ECACC) wurde für 24 Stunden Serum aus dem Medium entfernt, die Zellen wurden für weitere 12 Stunde mit Konzentrationen von 1,5625 μM, 3,125 μM, 6,25 μM, 12,5 μM, 25 μM oder 50 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) und mit 10 nM Insulin inkubiert. Kontrollzellen erhielten DMSO in entsprechender Konzentration wie die behandelten Zellen.
Gesamt-RNA wurde mittels des Absolutely RNA-Kit (Stratagene) isoliert und die cDNA mittels reverser Transkription von 2 μg RNA mittels des High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) nach Angaben des Herstellers hergestellt. Quantitative PCR wurde in 10 μl Ansätzen in einem iQ5-Cycler (BioRad) mittels des TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) unter Verwendung genspezifischer Primer (Applied Biosystems) gemäß den Herstellervorgaben durchgeführt. Die Daten wurden auf die β2-Mikroglobulinexpression normalisiert.
Es konnte festgestellt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) die Insulin-abhängige Hemmung der Transkription von IGFBP1 (Insulin-like Growth Factor Einding Protein), eines prototypischen Insulin-regulierten Gens, nahezu vollständig blockieren konnte. So erreichte die durch 10 nM Insulin deutlich reduzierte Expression in Anwesenheit von 12,5 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) nahezu den Wert der unbehandelten Zellen.
Beispiel 2
Untersuchungen der Phosphorylierung von Akt und FoxO1A zur Beeinflussung des Insulin-Signalwegs durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in Leberzellen
Die Expression von IGFBP1 (Insulin-like Growth Factor Einding Protein) wird durch Insulin mittels der forkhead box-Transkriptionsfaktoren O1A (FoxO1A) und O3A (FoxO3A) kontrolliert. Nach Insulin-Stimulation wird die Proteinkinase B/Akt (PKB/Akt) in Abhängigkeit von der Phosphoinositid-3-kinase (PI3K) durch Phosphorylierung aktiviert gelangt in den Nukleus wo sie den Transkriptionsfaktor O1A (FoxO1A) phosphoryliert, welches zu einer Verminderung der Genexpression von beispielsweise IGFBP1 führt.
Humanen HepG2-Zellen (ECACC) wurde für 90 Minuten Serum aus dem Medium entfernt, die Zellen wurden für weitere 60 Minuten mit 5 μM, 10 μM und 15 μM der Verbindung gemäß der Formel (9), 200 nM Wortmannin oder DMSO (Dimethylsulfoxid) entsprechender Konzentration inkubiert bevor die Zellen 10 Minuten mit 100 nM Insulin stimuliert wurden. Anschließend wurden die Zellen in Lysepuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 1 mM Natriumvanadat, 1 % Triton X-100) und Proteaseinhibitormix HP (Serva) lysiert.
Normalisierte Mengen an Protein wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Für den Proteinnachweis mittels Immunoblotting wurde ein Antikörper gegen das phosphorylierte Protein Akt, pAkt (Thr308) (Cell Signalling) verwendet. Die Visualisierung erfolgte durch das Enhanced Chemielumineszenz System (Millipore) mittels einer VersaDoc 5000 CCD Kamera (BioRad) und die Intensität der Banden wurde mit der Software QuantityOne (BioRad) quantifiziert.
Es konnte festgestellt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) die Insulin-abhängige Phosphorylierung beider Proteine Akt und FoxO1A konzentrationsabhängig inhibierte. So führte die Applikation von 10 μM zu einer 50prozentigen Reduktion der Phosphorylierung von Akt verglichen mit der Phosphorylierung nach Insulin-Stimulation, während 15 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) zu einer Reduktion der Phosphorylierung von Akt auf ca. 25% der Phosphorylierung nach Insulin-Stimulation führte.
Diese Beispiele zeigen, dass die Inhibition der Cytohesine durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in menschlichen Leberzellen zu einer Inhibition des Insulin-Signalwegs im Sinne einer Insulin-Resistenz führt.
Beispiel 3
Untersuchungen zur Erzeugung einer Insulin-Resistenz durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in vivo in der Maus
Eine Gruppe von 6 C57BL/6 Mäusen erhielt für 3 Tage mit 0,9 μmol/g der Verbindung gemäß der Formel (9) vermischtes Standardmaus-Futter, während eine Kontrollgruppe von 6 Tieren Standardmaus-Futter erhielten. Anschließend wurden den Tieren intraperitoneal 100 μl physiologische Kochsalzlösung (Kontrollgruppe) bzw. Kochsalzlösung mit 40 μg rekombinantem humanem Insulin (Sigma) injiziert. Nach 10 Minuten wurden die Mäuse anästhetisiert, die Leber wurde entnommen und in Lysepuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM (3-Glycerophosphat, 1 mM Natriumvanadat, 1 % Triton X-100) und Proteaseinhibitormix HP (Serva) lysiert.
Gesamt-RNA aus jeweils 15 mg Mausleber wurde mittels des Absolutely RNA-Kit (Stratagene) isoliert und die cDNA mittels reverser Transkription von 2 μg RNA mittels des High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) nach Angaben des Herstellers hergestellt. Quantitative PCR wurde in 10 μl Ansätzen in einem iQ5-Cycler (BioRad) mittels des TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) unter Verwendung von Primern (Applied Biosystems) gegen 1gfbp1, Fbp2, Pck1, Pck2, G6pc, Hk2, Pklr, Gck, Gckr nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Daten wurden auf die β2-Mikroglobulinexpression normalisiert.
Untersucht wurde die Expression verschiedener Gene, die über den P13K-abhängigen Pfad des Insulin-Rezeptor-Signalwegs gesteuert werden, das FoxO-regulierte Modellgen Igfbp1, Pyruvatcarboxykinase 1 and 2 (Pck1, Pck2), Fructose-1,6-bisphosphatase 2 (Fbp2), und Glucose-6-phosphatase (G6pc) die an die Glukoneogenese beteiligt sind wie auch der glycolytischen Enzyme Glucokinase (Gck), deren Regulator (Gckr), Leberpyruvatkinase (Pklr) und Hexokinase 2 (Hk2).
Weiterhin wurden normalisierte Mengen an Protein mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose-Membranen transferiert mittels Immunoblotting über einen Antikörper gegen das phosphorylierte Protein Akt, pAkt (Thr308) (Cell Signalling) dieses nachgewiesen. Die Visualisierung und Auswertung erfolgte wie in Beispiel 2 angegeben.
Es konnte festgestellt werden, dass die Expression der untersuchten durch Insulin unterdrückten glukoneogenetischen Gene durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) erhöht wurde, während die Expression der durch Insulin induzierten glykolytischen Gene statistisch signifikant verringert wurde. In Übereinstimmung zu diesem Ergebnis wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch Insulin stimulierte Phosphorylierung das Proteins Akt durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) um ca. 40 % inhibert wurde.
Dies zeigt, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) in vivo eine hepatische Insulin-Resistenz hervorruft.
Beispiel 4
Untersuchungen zur Erzeugung einer Insulin-Resistenz durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in vivo in Fliegen
Drei Gruppen von 100 Drosophila Larven erhielten 10 mg der Verbindung gemäß der Formel (9) vermischt mit 1 g autoklavierter und pulverisierter Aufzucht-Hefe (Brewferm) während drei Kontrollgruppen von 100 Tieren die unversetzte Aufzucht-Hefe erhielten. Dieses Futter wurde auf wassergetränkten Filtern (Macherey-Nagel) für 3 Tage bei 25°C verabreicht.
Es wurden jeweils mehr als 10 Tiere der Gruppe gründlich mit Wasser gewaschen, in Lysepuffer (NucleoSpin RNA II kit, Macherey & Nagel) verbracht und 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit (Ultra-Turrax T25basic) homogenisiert. Die Gesamt-RNA wurde mittels des NucleoSpin RNA II Kits (Macherey & Nagel, einschließlich DNase I-Behandlung auf der Säule) isoliert.
cDNA wurde aus jeweils 500 ng Gesamt-RNA mittels des QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben einschließlich DNasel-Behandlung hergestellt. PCR wurde in Ansätzen mit einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt (iQ5 Real-Time PCR Detection System, BioRad). Die Ansätze enthielten 1 μl des cDNA-Ansatzes, jeweils 200 nM und 3'- und 5'-Primer (Metabion) 12,5 μl 2x iQ5 SYBR Green Supermix (BioRad).
Das verwendete PCR-Programm umfasste 40 Zyklen mit den folgenden Schritten: 15 Sekunden Denaturieren bei 95 °C, 30 Sekunden Annalen bei 59 °C und 30 Sekunden Extension bei 72 °C. Die Auswertung erfolgte mittels der iQ5 Optical System Software (Version 1.1.1442.OCR, BioRad). Als Referenzgene dienten Actin 5C (Act5C, act) und das ribosomale Protein L32 (RpL32, rp49).
Es konnte festgestellt werden, dass die Expression der untersuchten durch Insulin reprimierten Gene InR (Insulinrezeptor) und 4E-BP, eines Translationsrepressors, durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) im falle von 4E-BP auf mehr als das vierfache und im Fall von InR auf mehr als das doppelte erhöht wurde.
Beispiel 5
Untersuchungen der Phosphorylierung von Akt durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in der Drosophila S2 Schneiderzelllinie
10⁶ Drosophila S2 Zellen (Schneider, 1972. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353) wurden in Zellkulturmedium (Firma PAN) mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Streptomycin, Penicillin (Gibco) in 35 mm Zellkulturschalen (Firma Nunc) ausgesät und für 2 Tage bei 25 °C bis zu 70-80% Konfluenz kultiviert. Nach 2 Tagen wurde dem Medium DMSO ad 0,5 % (v/v) zugegeben und je nach Versuch für 2 Stunden vor Insulinstimulation die Verbindung gemäß der Formel (9 ad 10μM. Im Falle einer Insulinstimulation wurde humanes Insulin (Sigma) für 15 Minuten ad 10 μg/ml verwendet. Nach erfolgter Stimulation wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen, in kalten (4°C) Lysepuffer (50mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 50 mM NaF, 100 μM Natriumorthovanadat, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und EDTA-freier Proteaseinhibitor (Roche) nach Herstellerangabe lysiert und für die Western Blot Analyse eingesetzt.
Jeweils 10 μg Protein wurde auf einem 12 % igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf 0,22 μm porige Nitrozellulose-Membranen (Amersham) transferiert. Die Membranen wurden mittels 5 % (w/v) Milchpulver (Firma Roth) in TEST (150 mM NaCl; 50 mM Tris pH 7,4; 0,1 % (v/v) Tween-20) blockiert. Die Inkubation mit primärem Antikörper wurde über Nacht in 5 % (w/v) BSA in TEST durchgeführt. Die Primärantikörper Anti-Phospho Akt (Ser505) und Anti-Akt (Cell Signalling) wurden jeweils mit einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Die Inkubation mit sekundärem Antikörper wurde mit Peroxidase-gekoppeltem Ziege-anti-Kaninchen-Immunoglobulin (Santa Cruz, Serum ID sc-2004) oder Peroxidase-gekoppeltem Esel-anti-Maus-Immunoglobulin (Santa Cruz, Serum ID sc-2314) in einer Verdünnung von 1: 15000 durchgeführt.
Die Visualisierung erfolgte mittels des ECL Kits (Enhanced Chemolumineszenz, Amersham) unter Verwendung des VersaDoc 5000 Imaging Systems (BioRad) und der Software QuantityOne (BioRad).
In Übereinstimmung zu dem Ergebnis von Beispiel 4 wurde festgestellt, dass die durch Insulin stimulierte Phosphorylierung das Proteins Akt durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) um die Hälfte vermindert wurde.
Dies zeigt, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) in vivo in der Fliege eine Insulin-Resistenz hervorruft, die in einer Erhöhung der Langlebigkeit resultieren kann.

Claims

Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) wie nachstehend angegeben:
worin: R ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Alkoxy und/oder ein Strukturelement (A1), (B1), (C1), (D1), (E1), (F1), (G1), (H1), (I1), (J1), (L1), (M1) wie nachstehend angegeben:
worin: R₄ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl und/oder C1-C10-Alkoxy, und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.
Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7) und/oder (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin: R₁ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2), (N2) wie nachstehend angegeben:
R₂ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (I2), (J2), (K2), (L2), (M2), (O2) wie nachstehend angegeben:

R₃ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl und/oder C1-C10-Alkoxy.
Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin: R₁ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3), (N3) wie nachstehend angegeben:

R₂ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (I3), (J3), (K3), (L3), (M3), (O3) wie nachstehend angegeben:

R₃ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, NHCO(C1-C10-Alkyl), NHCOCHCl₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF₃, Amin, C1-C10-Alkyl und/oder C1-C10-Alkoxy.
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R, R₁, R₂, R₃ und/oder R₄ gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend C1-C5-Alkyloxy, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend -O-Methyl, -O-Ethyl, -O-Isopropyl und/oder -O-tert-Butyl.
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (22), (23) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen (12), (14), (20), (21) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat eine biotinylierte Verbindung ist, vorzugsweise Verbindung (24) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankungen und pathologischen Zustände, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-Signalwegs in Zusammenhang stehen, ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Fettleibigkeit, Zellalterung, alterungsbedingte Zellschäden, insbesondere in Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, alterungsbedingte pathologische Zustände von Leber- und/oder Bauchspeicheldrüsen-Zellen, alterungsbedingte Funktionsstörungen von Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, Zellstress, insbesondere oxidativer Stress, insbesondere durch erhöhten Zuckermetabolismus ausgelöster Stress, und/oder Apoptose, insbesondere β-Zell-Apoptose.
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche zur Verlängerung des Lebensalters von Säugetieren.
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für die orale oder intravenöse Verabreichung formuliert ist.
Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösemittel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend DMSO, Glycerol und/oder Öl, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend DMSO und/oder Pflanzenöl, insbesondere Olivenöl.