TWI586351B - 哺乳類tor抑制劑 - Google Patents

Description

哺乳類TOR抑制劑

本發明關於一種抑制劑，特別攸關一種哺乳類TOR抑制劑。

哺乳類TOR，或稱mTOR(mammalian target of rapamycin)，為一種絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，可調控細胞生長、增生、移動、存活、蛋白質合成、自體吞噬、與轉錄。

目前，常見的mTOR抑制劑如表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、咖啡因、薑黃素、白藜蘆醇(resveratrol)、雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、或地磷莫司(ridaforolimus)。因此，確實有必要尋找出更多種新穎的mTOR抑制劑，以期能應用於所調控的生物機制，從而期待用於治療相關疾病。

本發明之第一目的是在提出一種如式(1)所示之化合物的用途，此用途為用於製備mTOR抑制劑，其中式(1)為：

本發明之第二目的是在提出一種如式(1)所示之化合物的用途， 此用途為用於製備延長壽命的製劑，其中式(1)為：

本發明之第三目的是在提出一種如式(1)所示之化合物的用途，此用途為用於製備治療mTOR活化導致之疾病的製劑，其中式(1)為：

圖1說明著補骨脂寧自補骨脂(Psoralea corylifolia)的萃取。

圖2說明著補骨脂寧可提升酵母菌的繁殖代數。

圖3說明著補骨脂寧可延緩人類臍帶靜脈上皮細胞HUVEC的老化。

圖4說明著補骨脂寧可抑制S6K的磷酸化。

圖5說明著補骨脂寧所抑制的S6K磷酸化與哺乳類SIRT1無關。

圖6說明著補骨脂寧可抑制脂肪細胞分化。

圖7說明著補骨脂寧可抑制胰島素導致的S6K磷酸化。

圖8說明著補骨脂寧可抑制脂多醣體導致的ICAM-1表現。

為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特 舉較佳實施方式，作詳細說明：本發明乃基於一項不可思議之發現完成的，其中萃取自補骨脂的式(1)所示化合物能延長細胞的繁殖代數。依此，進一步發現此化合物尚能抑制mTOR。須敘明的是，式(1)為： 式(1)所示化合物於學術上又稱「補骨脂寧」或「榛仁球蛋白」(corylin)。若無特別強調，本文所使用的「式(1)所示化合物」、「補骨脂寧」、或「榛仁球蛋白」用語為同義的。

本發明的第一實施方式提出一種補骨脂寧的用途，其為用於製備mTOR抑制劑。一般而言，補骨脂寧可利用化學合成或於自然界萃取等方式取得，如自補骨脂萃取。

本發明的第二實施方式提出一種補骨脂寧的用途，其為用於製備延長壽命的製劑。換言之，補骨脂寧可製成製劑來投予至有此需求的個體。另外，補骨脂寧可抑制mTOR來達到延長壽命的功效。同樣地，補骨脂寧可採用化學合成或於自然界萃取等方式取得，如自補骨脂萃取。

本發明的第三實施方式提出一種補骨脂寧的用途，其為用於製備治療mTOR活化導致之疾病的製劑。本實施方式的疾病可以為但不限於心血管疾病、肥胖、或糖尿病。換言之，補骨脂寧可作成製劑來投予至有此需求的個體。而且，補骨脂寧可透過抑制mTOR來達到治療上述疾病的功效。同樣地，補骨脂 寧可採用化學合成或於自然界萃取等方式取得，如自補骨脂萃取。

茲以下述實施例，例示說明本發明上述實施方式：

《補骨脂寧的萃取》

如圖1所示，粉碎5.4公斤補骨脂種子後，用11公升乙醇浸泡萃取，其包含冷浸4次、70℃熱萃4小時5次。於過濾萃取物後，濃縮所得的乙醇抽粗物。接著，用正己烷與水分配萃取乙醇抽粗物來取得正己烷層與水層。水層再以乙酸乙酯進行分配萃取以得到乙酸乙酯層與水層。於正己烷層通入矽膠管柱後，利用不同濃度比的正己烷/乙酸乙酯混合液沖提以依序分離取得11個分層。

第1個分層為以50：1的正己烷/乙酸乙酯混合液沖提得到的，含補骨脂酚(bakuchiol)；第3個分層為以20：1的正己烷/乙酸乙酯混合液沖提得到的，含異補骨脂素(isopsoralen)；第4個分層為以7：1的正己烷/乙酸乙酯混合液沖提得到的，含補骨脂素(psoralen)；第5個分層為以5：1的正己烷/乙酸乙酯混合液沖提得到的，含補骨脂寧；第7個分層為以1：1的正己烷/乙酸乙酯混合液沖提得到的，含補骨脂次素(psoralidin)。

《補骨脂寧對細胞壽命延長的影響》

挑選出單一酵母菌落至YEPD培養液中，並均勻混合。於菌液OD值達0.6至0.8時，取20μl菌液至含不同藥劑的YEPD固態培養基，並採用三向顯微定位系統取出20至30個酵母菌細胞。於30℃下培養酵母菌細胞3至5小時使其分離出第0代子細胞。接著，於30℃下培養第0代子細胞3至5小時使其分離出第1代子細胞。重複上述步驟，直到未有任何新的子細胞分離出。最後，依分離次數便可計算出酵母菌的繁殖代數。如圖2所示，補骨脂寧可提升酵母菌的繁殖代數。

另外，以不同濃度的補骨脂寧處理人類臍帶靜脈上皮細胞HUVEC，並將此時的細胞稱為第1代細胞。於培養2至3天後，將第1代細胞繼代培養成第2代細胞，並以不同濃度的補骨脂寧處理第2代細胞。重複上述步驟來培養出第3至N代細胞。於繼代培養時，以SA-βgal染色分析用來繼代培養的細胞。由於細胞中SA-βgal為正的細胞所佔比例越高，表示細胞越老化。如圖3所示，補骨脂寧可以劑量依賴(dose-dependent)形式延緩細胞老化。

綜上，說明著補骨脂寧具延長細胞壽命的效果。

《補骨脂寧對哺乳類S6K磷酸化的影響》

以不同濃度的藥物處理人類骨肉瘤細胞U2OS。經培養8小時後，萃取細胞內的蛋白質。最後，以西方點墨法分析細胞內的蛋白質。如圖4所示，補骨脂寧以劑量依賴形式來抑制S6K的磷酸化。

另外，先以哺乳類SIRT1抑制劑EX-527處理人類骨肉瘤細胞U2OS並培養1小時。接著，以不同濃度的補骨脂寧處理細胞，並於培養8小時後，萃取細胞內的蛋白質。最後，以西方點墨法分析細胞內的蛋白質。如圖5所示，哺乳類SIRT1抑制劑EX-527不會干涉補骨脂寧所致之S6K磷酸化的抑制。

《補骨脂寧對脂肪細胞分化的影響》

先以DMI(5μM地塞米松(dexamethasone)、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine)、0.1724mM胰島素)與不同藥物共同處理小鼠脂肪細胞3T3-L1。經不同藥物處理8天後，移除細胞培養液並以油紅O染色(oil-red O staining)來分析脂肪細胞的分化情形。如圖6所示，補骨脂寧具有較白藜蘆醇顯著之抑制脂肪細胞分化的作用。

綜上，表示補骨脂寧具減肥效果。

《補骨脂寧對胰島素所致之S6K磷酸化的影響》

由於高濃度胰島素會導致S6K磷酸化，進而使細胞對胰島素產生阻抗性，此為第2型糖尿病的成因之一。為模擬第2型糖尿病，先以400nM胰島素處理人類骨肉瘤細胞U2OS並培養10分鐘後，萃得細胞內的蛋白質。最後，用西方點墨法分析細胞內的蛋白質。另於胰島素處理時，以不同藥物處理細胞。如圖7所示，胰島素可促進細胞內S6K的磷酸化，並可藉由補骨脂寧來抑制此種磷酸化。又如圖7所示，於胰島素存在下，補骨脂寧亦可抑制mTOR磷酸化。

綜上，說明著補骨脂寧具有治療糖尿病的效果，尤其是第2型糖尿病。

《補骨脂寧對經脂多醣體所致之ICAM-1表現的影響》

脂多醣體可誘發血管細胞發生發炎反應。發炎時，血管細胞會產生大量的血管細胞黏附因子ICAM-1，此為造成心血管疾病的成因之一。為模擬此病癥，預先以不同濃度補骨脂寧處理人類主動脈平滑肌細胞HASMC並培養24小時後，再以脂多醣體處理細胞24小時。最後，收集細胞內的蛋白質並以西方點墨法分析細胞內的蛋白質。如圖8所示，補骨脂寧可抑制脂多醣體誘發的ICAM-1產生。

綜上，表示補骨脂寧具預防及/或治療心血管疾病的效果。

綜上所陳，補骨脂寧可抑制mTOR，故補骨脂寧具有作為mTOR抑制劑的潛力。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

Claims (8)

1. 一種如式(1)所示之化合物的用途，係用於製備mTOR抑制劑，其中該式(1)為：
2. 如請求項第1項所述之用途，其中該化合物為萃取自補骨脂。
3. 如請求項第1項所述之用途，其中該化合物為用於活化mTOR的下游因子。
4. 一種如式(1)所示之化合物的用途，係用於製備延長壽命的製劑，其中該式(1)為： 其中該化合物為用於抑制mTOR以延長壽命。
5. 如請求項第4項所述之用途，其中該化合物為萃取自補骨脂。
6. 一種如式(1)所示之化合物的用途，係用於製備治療mTOR活化導致之疾病的製劑，其中該式(1)為：
7. 如請求項第6項所述之用途，其中該化合物為萃取自補骨脂。
8. 如請求項第6項所述之用途，其中該mTOR活化導致的疾病為肥胖、心血管疾病、或糖尿病。