DE102006011918A1

DE102006011918A1 - Verfahren und Vektor zur steuerbaren Genexpression

Info

Publication number: DE102006011918A1
Application number: DE102006011918A
Authority: DE
Inventors: Dirk Dr. Gründemann; Edgar Prof. Dr. Schömig
Original assignee: Universitaet zu Koeln
Current assignee: Universitaet zu Koeln
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2007-08-09

Abstract

Die Erfindung betrifft ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül zur Expression mindestens einer Femd-Nukleinsäure, deren Transkription unter der Kontrolle zumindest einer regulatorischen Einheit steht. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression mindestens einer Fremd-Nukleinsäure, bei dem die Fremd-Nukleinsäure in das Nukleinsäuremolekül kloniert wird. Das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst mindestens einen Operator (tet-Operator) zur Bindung eines Tetrazyklin-Repressor-Moleküls, der zwischen dem die Fremd-Nukleinsäure umfassenden Sequenzabschnitt und der regulatorischen Einheit positioniert ist, und mindestens einen Replikationsursprung (oriP) zur selbstständigen Replikation des Nukleinsäuremoleküls.

Description

Die Erfindung betrifft ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül zur Expression mindestens einer Fremd-Nukleinsäure, deren Transkription unter der Kontrolle zumindest einer regulatorischen Einheit steht. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression mindestens einer Fremd-Nukleinsäure, bei dem die Fremd-Nukleinsäure in das Nukleinsäuremolekül kloniert wird.

Der klassische Ansatz zur heterologen Proteinexpression in Mammalia-Zelllinien beruht auf Plasmiden (z.B. pcDNA3), die eine cDNA stromabwärts von einem starken viralen Promotor tragen. Im Rahmen einer stabilen Transfektion unter Antibiotika-Selektion überleben nur die Zellen, die das Plasmid in ihr Genom integrieren. In den überlebenden Zellen wird das gewünschte Protein dauerhaft (= konstitutiv) hergestellt. Die konstitutive Expression ist aber grundsätzlich ungünstig, beispielsweise wenn das Protein toxisch für die Zelle ist, was im Extremfall bereits während der Selektionsphase zu einem Absterben der gewünschten Zellen führt. Eine steuerbare Expression vermeidet diesen Nachteil. Dabei ist die Expression zunächst ausgeschaltet und wird nur bei Bedarf durch Zugabe eines Induktors eingeschaltet. Es gibt mehrere Systeme zur gesteuerten Expression von Proteinen in Mammalia-Zellen. Breite Anwendung findet das Tet-System, welches auf dem Tetrazyklin-Repressor beruht. Im einfachsten Fall (Yao et al., 1998) bindet hierbei der Tet-Repressor an seine Operator-Sequenz und blockiert damit die Transkription einer stromabwärts liegenden cDNA. Durch Zusatz von Tetrazyklin oder dessen Analogon Doxyzklin in das Kulturmedium wird die Expression eingeschaltet, wobei der Induktor an den Repressor bindet, der daraufhin den Operator freigibt. Kompliziertere Varianten wurden von Bujard und Kollegen entwickelt (Tet-On bzw. Tet-Off) (Gossen et al., 1994; Gossen and Bujard, 1992). Explizite Vorteile dieser steuerbaren Expression sind erstens die Möglichkeit der Dosierung der Expression durch Veränderung der Konzentration des Induktors und zweitens ein homogener Hintergrund. Bei der dauerhaften Expression müssen dagegen zwei separate Zelllinien (mit (= Vektor plus cDNA) und ohne (= Leervektor) Expression der cDNA) angelegt werden, um die Funktion des Proteins zu untersuchen. Während der Selektion kön nen dabei sekundäre Veränderungen entstehen, die die Vergleichbarkeit der Zelllinien aufheben.

Bei dem Flp-In^TM-T-REx^TM-System (kurz FIT-System) der Fa. Invitrogen wird in der 1. Transfektion ein Plasmid im Genom integriert, welches eine FRT-Sequenz trägt (= FLP recombinase target site). In der 2. Transfektion wird ein Expressionsplasmid für den Tet-Repressor an einer anderen Stelle im Genom integriert. Bei der 3. Transfektion werden schließlich zwei Plasmide gleichzeitig transfiziert, pOG44, ein Expressionsplasmid für die FLP-Rekombinase, und pcDNA5/FRT/TO plus cDNA. Die transient exprimierte Rekombinase fügt das pcDNA5-Plasmid in die genomische FRT-Stelle ein. Dem Resistenzgen auf dem pcDNA5-Plasmid fehlt das Start-Codon, so dass bei zufälliger Integration des Plasmids in das Genom keine resistenten Zellen entstehen. Nur bei geordnetem Einbau über die FRT-Stelle entstehen resistente Zellen. Daraus resultiert homogenes Zellmaterial, so dass die in anderen Systemen erforderliche klonale Vereinzelung und Testung einzelner Zellklone (wegen der zufälligen Plasmidintegration an unterschiedliche Positionen im Genom) hier nicht erforderlich ist. Es ist aber ein Nachteil dieses Systems, dass die Transfektion einer Zelllinie 10 Wochen dauert (alle 3 Transfektionen nacheinander, inklusive jeweils klonaler Vereinzelung nach den ersten beiden Transfektionen) oder mindestens 3 Wochen benötigt werden, wenn die Zelllinie nach den ersten beiden Transfektionen zugekauft wird, was wiederum die Kosten deutlich erhöht. Der entscheidende Nachteil der bekannten Systeme liegt aber vor allem darin, dass eine erfolgreiche Rekombination ein seltenes Ereignis ist, so dass die Effizienzen der Transfektionen sehr gering sind.

Aus der WO 99/00510 A1 sind ein Verfahren und ein Vektor zur gesteuerten Expression eines Fremd-DNA-Gens in Säugerzellen bekannt, wobei die Transkription durch den mit Tetrazyklin induzierbaren Tetrazyklinresistenz-Operator (tet-Operator) kontrolliert wird. Der rekombinante Vektor enthält einen Säugetier-Promotor mit einem TATA-Element, zumindest einen tet-Operator und das Fremd-DNA-Gen. Dieser Vektor beinhaltet entweder zusätzlich auch das Gen für den Tetrazyklin-Repressor (tet-Repressor) oder er wird in Zellen eingebracht, die das Tetrazyklin-Repressor-Protein (tet-Repressor) konstitutiv exprimieren. Durch Zugabe von Tetrazyklin kann dann die Expression des Fremdproteins induziert werden. Die hier verwendeten viralen Vektoren integrieren dabei in das Genom der Wirtszellen, d. h. es ist eine klonale Vereinzelung erforderlich und die Effizienz des Verfahrens ist sehr gering.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Nukleinsäure und ein Verfahren der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, die eine schnelle und effektive Proteinexpression ermöglichen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gelöst, das mindestens einen Operator (tet-Operator) zur Bindung eines Tetrazyklin-Repressor-Moleküls, der zwischen dem die Fremd-Nukleinsäure umfassenden Sequenzabschnitt und der regulatorischen Einheit positioniert ist, und mindestens einen Replikationsursprung (oriP) zur selbstständigen Replikation des Nukleinsäuremoleküls umfasst.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß ferner durch ein Verfahren zur Expression mindestens einer Fremd-Nukleinsäure gelöst, das durch die folgenden Schritte charakterisiert ist:

a) Klonieren der Fremd-Nukleinsäure in das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül,
b) Einbringen des Nukleinsäuremoleküls in geeignete Zellen,
c) Stabile, episomale Vermehrung des Nukleinsäuremoleküls in den Zellen und
D) Inkubation der transfizierten Zellen mit einer Substanz (Induktor), vorzugsweise mit Tetrazyklin oder Doxyzyklin als Induktor, welche die Expression der Fremd-Nukleinsäure induziert.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül wird, beispielsweise wie das Epstein-Barr-Virus, stabil episomal vermehrt, d.h. eine Integration in das Genom findet nicht statt (Yates et al., 1985; Young et al., 1988). Während bei einer klassischen Integration aus 10 Millionen transfizierten Zellen lediglich ca. 100 Klone resultieren, womit die Erfolgsquote bei höchstens 0.001 % liegt, sind nach der Transfektion des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls ca. 1 % der transfizierten Zellen stabil vermehrungsfähig (Leight and Sugden, 2001). Folglich läuft das erfindungsgemäße Verfahren mindestens 1000-mal effizienter ab als die herkömmlichen Verfahren. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthält dabei alle Elemente für eine mittels Tetrazyklin steuerbare Expression, so dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich eine einzige Transfektion erforderlich ist. Daraus entsteht insgesamt eine enorme Zeitersparnis, denn die Transfektion einer Zelllinie dauert beim erfindungsgemäßen Verfahren nur noch ca. 1 Woche, statt wie bisher mindestens 3 Wochen (FIT-System). Während die bekannten Syteme Rekombinase-abhängig sind, also aufgrund der geringen Rekombinationswahrscheinlichkeit eine sehr geringe Effizienz aufweisen, kommt das erfindungsgemäße Verfahren ohne Rekombinase aus, d. h. mit einer einzigen Transfektion werden alle benötigten Elemente in die Zellen eingeschleust. Die Erfolgsquote liegt deshalb nahezu bei 100%.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül mindestens einen Sequenzabschnitt enthält, der eine das Tetrazyklin-Repressor-Molekül kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst. Hierdurch kann die vollständige Transfektion zeitsparend auch dann in nur einem Schritt durchgeführt werden, wenn die Wirtszelle den Tetrazyklin-Repressor nicht konstitutiv exprimiert. In diesem Fall ist es von Vorteil, wenn das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressor-Moleküls (tet-Repressor) umfasst. Diese kann beispielsweise einen geeigneten Promotor und vorzugsweise ein eukaryontisches Strukturgen, beispielsweise ein β-Globulin-Intron, zur Imitation einer eukaryontischen Expression umfassen. Zusätzlich kann sich an die Nukleinsäuresequenz, die den Tetrazyklin-Repressor kodiert, ein polyA-Signal anschließen.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass der Sequenzabschnitt, der die das Tetrazyklin-Repressor-Molekül kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, und der Sequenzabschnitt, der eine die Fremd-Nukleinsäure kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, in Bezug auf die Transkriptionsrichtung gleich orientiert sind. Bei gleicher Orientierung dieser beiden Bestandteile im Molekül kann eine effektive Transfektion mit hoher Transfektionsrate und starker anschließender Expression des Fremdproteins gewährleistet werden.

Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein ringförmiger DNA-Vektor, vorzugsweise ein episomales Plasmid. Bei der Verwendung eines selbst-replizierenden, episomalen Plasmids, das beispielsweise für humane und Primatenzellen spezifische Epstein-Barr-Virus-Komponenten enthält, kann das erfindungsgemäße Verfahren optimal an die in der Biomedizin hauptsächlich verwendeten humanen Zelllinien angepasst werden. Die Größe der erfindungsgemäßen Plasmide, beispielsweise des Plasmids pEBTet (z.B. 13.3 kb inkl. cDNA), im Vergleich zu beispielsweise pcDNA5-Plasmiden (z.B. 6.9 kb inkl. cDNA) ist dabei nicht problematisch, d. h. hat keine negativen Auswirkungen auf die Effizienz des Verfahrens.

Insbesondere, wenn das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein ringförmiger DNA-Vektor ist, sollten sowohl die Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressor-Moleküls als auch die regulatorische Einheit zur Steuerung der Transkription der Fremd-Nukleinsäure, der tet-Operator und der die Fremd-Nukleinsäure umfassende Sequenzabschnitt im Molekül derart angeordnet und orientiert sein, dass die Transkription jeweils in der gleichen Richtung verläuft. Bei dieser Konstruktion des Vektors wird in vorteilhafter Weise eine hohe Transfektionsrate mit starker anschließender Expression des Fremdproteins gewährleistet.

Wenn mehrere, vorzugsweise zwei, tet-Operatoren vorgesehen sind, kann die Expression des Fremdproteins in Abwesenheit des Induktors praktisch vollständig unterdrückt werden.

In weiterer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls ist vorgesehen, dass die regulatorische Einheit zur Steuerung der Transkription der Fremd-Nukleinsäure ein Promotor, vorzugsweise der CMV-Promotor, ist.

Vorzugsweise enthält die Promotorsequenz den (oder die) tet-Operator-Sequenz(en).

Vorzugsweise ist die Fremd-Nukleinsäure eine cDNA-Sequenz.

Die Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressor-Moleküls umfasst vorzugsweise einen Promotor, insbesondere den RSV-LTR-Promotor, und vorzugsweise ein Gen eines eukaryontischen Peptids oder Proteins, insbesondere das Kaninchen β-Globulin-Intron II.

In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls ist ferner vorgesehen, dass oriP der Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus ist und/oder das Molekül zusätzlich eine Kassette zur Expression des Epstein-Barr-Nuclear-Antigen 1 (EBNA-1) umfasst. Diese Konstruktion des Vektors mit für humane und Primatenzellen spezifischen Epstein-Barr-Virus-Komponenten ermöglicht die selbstständige episomale Replikation des Moleküls und gleichzeitig eine optimale Anpassung des erfindungsgemäßen Verfahrens an die in der Biomedizin hauptsächlich verwendeten humanen Zelllinien.

Die Erfindung umfasst insbesondere auch ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer

a) rekombinanten Nukleotidsequenz, welche eine Kassette zur Expression einer beliebigen Nukleinsäure, vorzugsweise einer cDNA, mit mindestens einem Operator zur Bindung eines Tetrazyklin-Repressor-Moleküls, eine Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressors, eine Kassette zur Expression des Epstein-Barr-Nuclear-Antigen 1 (EBNA-1) und einen Epstein-Barr-Virus-Replikationsursprung umfasst;
b) rekombinanten Nukleotidsequenz, welche eine beliebige Kombination der Nukleotidsequenzen gemäß Seq ID No: 2, 3, 4 und 7 oder der Nukleotidsequenzen gemäß Seq ID No: 2 bis 5 und 7 umfasst;
c) rekombinanten Nukleotidsequenz gem Seq ID No: 1 oder Seq ID No: 9;
d) Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synony mes Codon unterscheidet;
e) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotidsequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisiert;
f) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 80 %, vorzugsweise 90 %, insbesondere 95 %, mit der Nukleotidsequenz gemäß a), b), c), d) oder e) identisch ist;
g) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis f) entspricht.

Die Erfindung umfasst ferner Zellen, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthalten, Zellkulturen und transgene Tiere, welche diese Zellen enthalten, und Proteine, die mittels des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, der genannten Zellen und/oder der genannten transgenen Tiere hergestellt wurden.

Die Erfindung wird im Weiteren anhand der Abbildungen und Ausführungsbeispiele beispielhaft näher erläutert.

In den Abbildungen zeigt

1 eine Plasmidkarte einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls (pEBTet) ohne Fremd-Nukleinsäure-Insert, in der die funktionellen Elemente, deren Orientierung und die Klonierungsstellen für die cDNA markiert sind,

2 eine Plasmidkarte einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls mit cDNA-Insert „SLC22A16" (pEBTet/SLC22A16h), in der die funktionellen Elemente, deren Orientierung und die Klonierungsstellen für die cDNA markiert sind,

3 eine Plasmidkarte für ein alternatives Konstrukt, bei dem die Kassette zur Expression des Tet-Repressors gegenüber pEB-Tet/SLC22A16h (2) umgedreht wurde (siehe Pfeile),

4 einen Northern-Blot zur Analyse der Steuerbarkeit für pEB-Tet/SLC22A16h, wobei die quantitative Auswertung per PhosphorImager (Fujifilm BAS-1800 II) erfolgte,

5 ein Balkendiagramm der Aufnahme von Ergothionein in pEB-Tet/ETTh-transfizierte Zellen, wobei der endogene Ergothionein-Gehalt beider Zellsorten durch Inkubation (1 min) mit KRH-Puffer ohne Zusatz von Ergothionein bestimmt und von den Gesamtaufnahmen in Gegenwart von Substrat subtrahiert wurde, und

6 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zum Nachweis der Steuerung der Expression einer ETTh-GFP-Chimäre durch Vorinkubation mit Doxyzyklin, wobei die eingesetzten 293-Zellen mit pEB-Tet/ETTh-GFP transfiziert und mit Puromycin selektiert wurden, die Anfärbung mit Trypanblau zeigt die Zellmembranen aller Zellen im Sichtfeld.

1 zeigt einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor (pEBTet, Seq ID No: 9). Diese Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Plasmids enthält folgende Elemente:

1) pUC-Replikationsursprung und Ampicillin-Resistenzgen für die Vermehrung in E. coli,
2) Kassette zur Expression eines Proteins für Puromycin-Resistenz in Mammalia-Zellen (mit SV40-Promotor und Polyadenylierungssignal (SV40 late)),
3) Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressors (Tet-Repressor, Seq ID No: 2; mit RSV-LTR-Promotor, beta-Globin-Intron II (Kaninchen, Seq ID No: 5) und Polyadenylierungssignal (SV40 late)),
4) Kassette zur Expression beliebiger cDNAs (hier ohne cDNA-Insert) mit CMV-Promotor (Seq ID No: 8) inkl. 2 × Tet-Operator (Seq ID No: 7), Klonierungsregion (multiple cloning site) und Polyadenylierungssignal (BGH), und
5) Epstein-Barr-Virus-Replikationsursprung (oriP, Seq ID No: 3) und Kassette zur Expression von EBNA-1 (Seq ID No: 4).

pEBTet basiert auf dem Plasmid pCEP-Pu (Kohfeldt et al., 1997). Erfindungsgemäß wurde eine Kassette zur Expression des Tet-Repressors (Yao et al. 1998) und eine Kassette zur steuerbaren Expression einer beliebigen cDNA hinzugefügt. Die Epstein-Barr-Virus-Elemente oriP und EBNA-1 sorgen für eine episomale Vermehrung des Plasmids in humanen und Primatenzelllinien, d.h. eine Integration in das Genom findet nicht statt. Eine klonale Vereinzelung ist also nicht erforderlich, da das Plasmid nicht in das Genom integriert. Die Selektion der transfizierten Zellen erfolgt durch Inkubation mit Puromycin (3 μg/ml). Nach der Selektionsphase kann die Expression der cDNA durch Zugabe von Tetrazyklin oder Doxyzyklin (1 μg/ml) in das Kulturmedium eingeschaltet werden. Im Grundzustand (= ausgeschaltet) wird praktisch keine mRNA produziert.

2 zeigt den erfindungsgemäßen Expressionsvektor gemäß 1 mit cDNA-Insert (pEBTet/SLC22A16h, Seq ID No: 1). Die cDNA des humanen Proteins ETTh (Ergothionein-Transporters, Gensymbol SLC22A4, Seq ID No: 6) wurde hier in die Klonierungsregion von pEBTet (Seq ID No: 9) eingefügt.

3 zeigt ein alternatives Konstrukt, bei dem die Kassette zur Expression des Tet-Repressors im Vergleich zum Vektor gemäß 2 hinsichtlich seiner Orientierung umgedreht wurde. Dieses Konstrukt ergab bei einer Transfektion und Selektion mit 3 μg/ml Puromycin nur sehr wenige überlebende Zellen, die sich nicht vermehrten. Eine parallele Transfektion mit pEBTet ergab dagegen viele überlebende Zellen, die sich schnell vermehrten. Folglich ist die gleichgerichtete Orientierung der beiden wesentlichen Expressionskassetten in Bezug auf die Transkriptionsrichtung für die Transfektionsrate und somit auch die Expression des Fremdproteins von entscheidender Bedeutung. Erfindungsgemäß sollten daher der Sequenzabschnitt, der die das Tetrazyklin-Repressor-Molekül kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, und der Sequenzabschnitt, der eine die Fremd-Nukleinsäure kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, in Bezug auf die Transkriptionsrichtung gleich orientiert sein.

4 zeigt einen Northern-Blot zur Analyse der Steuerbarkeit für pEB-Tet/SLC22A16h. 293-Zellen wurden mit dem Plasmid pEBTet/SLC22A16h transfiziert. Nach Selektion mit Puromycin wurden die Zellen ca. 20 h mit oder ohne Doxyzyklin im Medium kultiviert. Mit der aus beiden Ansätzen gewonnenen mRNA wurde ein Northern-Blot durchgeführt, der zuerst mit einer Sonde gegen SLC22A16h und dann gegen GAPDH (Kontrolle der mRNA-Beladung) hybridisiert wurde. Die quantitative Auswertung erfolgte per PhosphorImager (Fujifilm BAS-1800 II). Die durchgeführten Versuche mit dem pEBTet-Vektor belegen, dass wichtige günstige Eigenschaften des FIT-Systems erhalten bleiben, d. h. die Steuerbarkeit (geringe basale Expression, hohe Expression im eingeschalteten Zustand) entspricht der des FIT-Systems. Das Verhältnis von SLC22A16h-mRNA (ausgeschaltet) zu SLC22A16h-mRNA (eingeschaltet) ist dabei kleiner 1%, d. h. der erfindungsgemäße Vektor ermöglicht eine präzise Regulation der Expression.

Beispiel 1: Einschalten der Proteinexpression durch Vorinkubation mit Doxyzyklin steigert die Aufnahme von Ergothionein in pEB-Tet/ETTh-transfizierte Zellen
Der endogene Ergothionein-Gehalt beider Zellsorten wurde durch Inkubation (1 min) mit KRH-Puffer ohne Zusatz von Ergothionein bestimmt und von den Gesamtaufnahmen in Gegenwart von Substrat subtrahiert. Gezeigt wird in 5 also die tatsächliche Aufnahme während der Inkubation (1 min) mit Substrat. Aus anderen Experimenten ist bekannt, dass die unspezifische, also nicht durch ETT vermittelte Aufnahme von ET z.B. durch Diffusion hier vernachlässigbar klein ist.
Die cDNA des humanen Ergothionein-Transporters ETTh (Gensymbol SLC22A4) mit vollständigem offenen Leserahmen wurde über die Hin dIII- und Not I-Stellen in den Vektor pEBTet (Seq ID No: 9) eingesetzt. Mit dem resultierenden Konstrukt, pEBTet/ETTh, wurden 293-Zellen, eine humane embryonale Nierenzelllinie, transfiziert. Die aus der Selektion mit 3 μg/ml Puromycin hervorgegangenen Zellen wurden in Poly-Ornithin-beschichteten Polystyrolschäl chen (Durchmesser ca. 6 cm) ausgesät und ca. 3 Tage inkubiert. In den letzten 16 h vor dem Funktionstest wurde eine Hälfte der Schälchen mit 1 μg/ml Doxyzyklin inkubiert, um die Expression des Transporters einzuschalten. Im Rahmen des Funktionstests wurden die Schäfchen 20 min in 4.0 ml KRH-Puffer (5.6 mM (+)-Glucose, 125 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄ und 25 mM HEPES-NaOH pH 7.4) bei 37 °C vorinkubiert und anschließend für 1 min mit 2 ml 10 μmol/l Ergothionein (ET) in KRH-Puffer inkubiert. Die Zellen wurden abschließend viermal mit je 4 ml eiskaltem KRH-Puffer gewaschen, um extrazelluläres ET zu entfernen, und dann mit 4 mmol/l HClO₄ aufgeschlossen. Der ET-Gehalt der Lysate wurde mittels LC-MS/MS bestimmt. Die Auswertung der Daten (5) ergab eine sehr geringe Transportaktivität im ausgeschalteten Zustand (Doxyzyklin minus: 1.8 ± 1.6 pmol min^–1 mg Protein^–1) und eine hohe Expression im eingeschalteten Zustand (Doxyzyklin plus: 46 ± 9 pmol min^–1 mg Protein^–1). Durch den Induktor Doxyzyklin konnte also die Expression des Transportproteins in den mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure transfizierten Zellen erfolgreich eingeschaltet werden. Die Expression des Fremdproteins konnte dabei sehr schnell und effektiv durchgeführt werden.
Beispiel 2: Fluoreszenznachweis der Steuerung der Expression einer ETTh-GFP-Chimäre durch Vorinkubation mit Doxyzyklin
Die eingesetzten 293-Zellen waren mit pEBTet/ETTh-GFP transfiziert und mit Puromycin selektiert worden. Die Anfärbung mit Trypanblau zeigt die Zellmembranen aller Zellen im Sichtfeld (6). Die GFP-Fluoreszenz zeigt im deckungsgleichen Bildausschnitt die Expression des Transporters, der hauptsächlich in der Plasmamembran lokalisiert ist (6).
Die cDNA des humanen Ergothionein-Transporters ETTh (Gensymbol SLC22A4) wurde am C-Terminus mit einer cDNA für das grün-fluoreszierende Protein (E-GFP) verknüpft, um ein chimäres Protein herstellen zu können. Die chimäre cDNA wurde über die Hin dIII- und Not I-Stellen in den Vektor pEBTet (Seq ID No: 9) eingesetzt. Mit dem resultierenden Konstrukt, pEBTet/ETTh- GFP, wurden 293-Zellen, eine humane embryonale Nierenzelllinie, transfiziert. Die aus der Selektion mit 3 μg/ml Puromycin hervorgegangenen Zellen wurden in Polystyrolschälchen auf Poly-Ornithin-beschichtete Deckgläschen (Durchmesser 12 mm) ausgesät und ca. 2 Tage inkubiert. In den letzten 16 h vor der Analyse wurde eine Hälfte der Deckgläschen mit 1 μg/ml Doxyzyklin inkubiert, um die Expression des GFP-markierten Transporters einzuschalten. Nach einer Wäsche mit 1 × PBS wurden die Zellen 3 min bei Raumtemperatur mit 0.02% Trypanblau in 1 × PBS gefärbt. Nach erneuter Wäsche mit 1 × PBS wurden die Deckgläschen mit den unfixierten Zellen auf Objektträger aufgelegt und unter dem Fluoreszenz-Mikroskop analysiert (6). Die Abbildung zeigt praktisch keine GFP-Fluoreszenz im ausgeschalteten Zustand (Doxyzyklin minus) und eine hohe Expression im eingeschalteten Zustand (Doxyzyklin plus), d. h. die Expression der Fremd-Nukleinsäure konnte mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr schnell und mit hoher Effizienz durchgeführt werden.
Literatur:

Gossen M, Bonin AL, Freundlieb S, Bujard H (1994): Inducible gene expression systems for higher eukaryotic cells. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 516–520
Gossen M, Bujard H (1992): Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551
Kohfeldt E, Maurer P, Vannahme C, Timpl R (1997): Properties of the extracellular calcium binding module of the proteoglycan testican. FEBS Lett. 414: 557–61
Leight ER, Sugden B (2001): Establishment of an oriP replicon is dependent upon an infrequent, epigenetic event. Mol. Cell. Biol. 21: 4149–61
Yao F, Svensjö T, Winkler T, Lu M, Eriksson C, Eriksson E (1998): Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum. Gene Ther. 9: 1939–50
Yates JL, Warren N, Sugden B (1985): Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature 313: 812–5
Young JM, Cheadle C, Foulke JS, Jr., Drohan WN, Sarver N (1988): Utilization of an Epstein-Barr virus replicon as a eukaryotic expression vector. Gene 62: 171–85

SEQUENCE LISTING

Claims

Rekombinantes Nukleinsäuremolekül zur Expression mindestens einer Fremd-Nukleinsäure, deren Transkription unter der Kontrolle zumindest einer regulatorischen Einheit steht, mit mindestens einem Operator (tet-Operator) zur Bindung eines Tetrazyklin-Repressor-Moleküls, der zwischen dem die Fremd-Nukleinsäure umfassenden Sequenzabschnitt und der regulatorischen Einheit positioniert ist, und mit mindestens einem Replikationsursprung (oriP) zur selbstständigen Replikation des Nukleinsäuremoleküls.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen Sequenzabschnitt enthält, der eine das Tetrazyklin-Repressor-Molekül kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressor-Moleküls (tet-Repressor) umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Sequenzabschnitt, der die das Tetrazyklin-Repressor-Molekül kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, und der Sequenzabschnitt, der eine die Fremd-Nukleinsäure kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, in Bezug auf die Transkriptionsrichtung gleich orientiert sind.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieses ein ringförmiger DNA-Vektor, vorzugsweise ein episomales Plasmid, ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressor-Moleküls sowie die regulatorische Einheit zur Steuerung der Transkription der Fremd-Nukleinsäure, der tet-Operator und der die Fremd-Nukleinsäure umfassende Sequenzabschnitt im Molekül derart angeordnet und orientiert sind, dass die Transkription jeweils in der gleichen Richtung verläuft.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere, vorzugsweise zwei, tet-Operatoren vorgesehen sind.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Einheit zur Steuerung der Transkription der Fremd-Nukleinsäure ein Promotor, vorzugsweise der CMV-Promotor, ist.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Fremd-Nukleinsäure eine cDNA-Sequenz ist.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressor-Moleküls einen Promotor, insbesondere den RSV-LTR-Promotor, und vorzugsweise ein Gen eines eukaryontischen Peptids oder Proteins, insbesondere das Kaninchen β-Globulin-Intron II, umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass oriP der Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus ist und/oder das Molekül zusätzlich eine Kassette zur Expression des Epstein-Barr-Nuclear-Antigen 1 (EBNA-1) umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfassend eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer a) rekombinanten Nukleotidsequenz, welche eine Kassette zur Expression einer beliebigen Nukleinsäure, vorzugsweise einer cDNA, mit mindestens einem Operator zur Bindung eines Tetrazyklin- Repressor-Moleküls, eine Kassette zur Expression des Tetrazyklin-Repressors, eine Kassette zur Expression des Epstein-Barr-Nuclear-Antigen 1 (EBNA-1) und einen Epstein-Barr-Virus-Replikationsursprung umfasst; b) rekombinanten Nukleotidsequenz, welche eine beliebige Kombination der Nukleotidsequenzen gemäß Seq ID No: 2, 3, 4 und 7 oder der Nukleotidsequenzen gemäß Seq ID No: 2 bis 5 und 7 umfasst; c) rekombinanten Nukleotidsequenz gem Seq ID No: 1 oder Seq ID No: 9; d) Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet; e) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotidsequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisiert; f) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 80 %, vorzugsweise 90 %, insbesondere 95 %, mit der Nukleotidsequenz gemäß a), b), c), d) oder e) identisch ist; g) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis f) entspricht.
Zellen, welche das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthalten.
Zellkultur, welche Zellen nach Anspruch 13 enthält.
Transgenes Tier, welches Zellen nach Anspruch 13 enthält.
Protein, hergestellt mittels des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 12, der Zellen nach Anspruch 13 und/oder des transgenen Tiers nach Anspruch 15.
Verfahren zur Expression mindestens einer Fremd-Nukleinsäure mit den folgenden Schritten: a) Klonieren der Fremd-Nukleinsäure in das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 12, b) Einbringen des Nukleinsäuremoleküls in geeignete Zellen, c) Stabile, episomale Vermehrung des Nukleinsäuremoleküls in den Zellen und d) Inkubation der transfizierten Zellen mit einer Substanz (Induktor), welche die Expression der Fremd-Nukleinsäure induziert.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass den Zellen als Induktor Tetrazyklin oder Doxyzyklin zugegeben wird.