DE10023887A1

DE10023887A1 - Verfahren zur transienten Insertion genetischer Elemente

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Publication number: DE10023887A1
Application number: DE2000123887
Authority: DE
Inventors: Axel Haverich; Ulrich Martin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-05-17
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2001-11-29

Abstract

Ein neues Konzept ermöglicht die transiente Insertion fremder genetischer Elemente in Genome oder extrachromosomale genetische Elemente prokaryotischer und eukaryotischer Zellen. Angegeben werden rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, die Verwendung dieser Konstrukte und die mit dem Konstrukt transfizierten prokaryoten oder eukaryoten Zellen. Die Nukleinsäurekonstrukte enthalten eine Rekombinase kodierende Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promotorsystems und ermöglichen die transiente Transfektion verschiedenster rekombinanter Nukleinsäuresequenzen in eukaryote oder prokaryote Zellen. Die Zugabe eines geeigneten Induktors ermöglicht die spätere komplette und effiziente Entfernung der Konstrukte aus den transfizierten Zellen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur transienten Insertion genetischer Elemente in fremde Genome oder extrachromosomale genetische Elemente prokaryotischer und eukaryotischer Zellen, Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren zur Durchführung dieses Verfahrens sowie mit dem Konstrukt transfizierte Zellen und Tiere.

In der Gentechnik und der Gentherapie ist es häufig erwünscht, bestimmte in die Zelle(n) künstliche eingeführte Gene später wieder zu entfernen, insbesondere, wenn die inserierte Gense quenz die normale Zellfunktion stört oder allgemein nicht dau erhaft tolerierbar ist.

Es ist bekannt, das Ausschneiden bestimmter Sequenzen mit Hilfe targetspezifischer Rekombinasen vorzunehmen. Ein Beispiel hier für ist das Cre-Rekombinase-System.

Die Cre Rekombinase, eine Integrase des Coliphagen P1 kata lysiert die Sequenz-spezifische Rekombination von 34 Basen paaren (bp) langen Erkennungssequenzen, loxP genannt, in Abwesenheit weiterer Kofaktoren (Austin, S., M. Ziese, and N. Sternberg. 1981. A novel role for site-specific recombination in maintenance of bacterial replicons. Cell 25, no. 3: 729). Das Cre-lox System erlaubt damit ein präzises Ausschneiden von DNA-Fragmenten, welche von zwei lox sites eingerahmt sind, di rekt in der Zelle und ist daher sehr nützlich, um genetische Elemente, welche zuvor in Zellen eingeführt worden sind (z. B. Selektionsmarker), wieder zu entfernen (Sauer, B., and N. Henderson. 1988. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA 85, no. 14: 5166). Ähnliche Funktionen können auch mittels anderer Rekombinssysteme, wie z. B. dem Flp-System ausgeführt werden.

Derzeitige Methoden verwenden Expressionsvektoren, welche Cre (oder Flp) Rekombinase unter Kontrolle von verschiedenen Promo toren exprimieren. Transfektion dieser Vektoren in Zellen, die transgen für ein anderes, von Targetsequenzen eingerahmtes Kon strukt sind, führen zur präzisen Entfernung dieses zweiten Kon struktes (Rinaldi, A., K. R. Marshall, and C. M. Preston. 1999. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site-specific recombination. Vi rus Res 65, no. 1: 11). Da jedoch zum einen die Transfektionsef fizienz und zum anderen die Effizienz der Cre-Rekombinase nicht hoch genug sind, um mit Sicherheit in 100% der Zellen das Kon strukt zu entfernen, hat diese Methode bei vielen Anwendungen große Nachteile.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zu finden, mit dem vorher in Genome oder extrachromo somale Elemente prokaryoter und eukaryoter Zellen eingeführte genetische Elemente präzise und in allen betroffen Zellen ent fernt werden können. Das Verfahren sollte in vitro und in vivo anwendbar sein.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Nukleinsäurekon strukt, einen das Nukleinsäurekonstrukt enthaltenden Vektor, sowie ein mit dem Nukleinsäurekonstrukt oder dem Vektor durch führbares Verfahren zur transienten Insertion fremder genetischer Elemente in Genome oder extrachromosomale genetische Ele mente prokaryotischer und erkaryotischer Zellen gelöst. Ferner umfasst die Erfindung prokaryotische oder eukaryotische Zellen, ausgenommen humane embryonale Zellen, die mit dem Nukleinsäure konstrukt transfiziert sind, sowie transgene Tiere, die Zellen enthalten, die Nukleinsäurekonstrukte nach dieser Erfindung um fassen.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt umfasst folgende Be standteile:

a) eine Transkriptionskassette, enthaltend eine Rekombinase kodierende Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promo torsystems;
b) wenigstens eine ein weiteres Gen kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines konstitutiven, gewebespezifischen oder indu zierbaren Promotorsystems;
c) je eine 5'-flankierende und eine 3'-flankierende natürliche oder künstliche Rekombinase-Targetsequenz.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Be griff "genetisches Element" ein natürliches oder rekombinantes lineares oder zirkuläres Nukleinsäuremolekül, welches ver schiedenste regulatorische und proteinkodierende Sequenz bereiche, die aus prokaryoten oder eukaryoten Zellen, bzw. aus Viren stammen können, enthalten kann.

Ein "Nukleinsäurekonstrukt" bezeichnet ein rekombinantes lineares oder zirkulares Nukleinsäuremolekül, das sowohl aus Desoxyribonukleinsaure als auch aus Ribonukleinsäure bestehen kann. Vektoren, die als Ausgangsmaterial für die erfindungs gemäßen Nukleinsäurekonstrukte dienen können, sind dem Fachmann bekannt.

Eine "Rekombinase" ist ein natürliches oder synthetisches En zym, das spezifische Targetsequenzen erkennt, schneidet und miteinander rekombiniert. Beispiele hierfür sind die Cre- Rekombinase aus dem P1-Coliphagen und die Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae (Argos, P., A. Landy, K. Abremski, J. B. Egan, E. Haggard-Ljungquist, R. H. Hoess, M. L. Kahn, B. Kalionis, S. V. Narayana, L. S. d. Pierson, and et al. 1986. The integrase family of site-specific recombinases: regional similarities and global diversity. Embo J 5, no. 2: 433; Hoess, R. H., and K. Abremski. 1984. Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Cre with the recombining site loxP. Proc Natl Acad Sci USA 81, no. 4: 1026).

Eine "Targetsequenz" ist eine natürliche oder synthetische Se quenz, die von einer Rekombinase spezifisch erkannt werden kann. Als Beispiel können die loxP-Sequenzen aus dem P1- Coliphagen und die FRT-Sequenzen aus S. cerevisiae angeführt werden.

"Transkriptionskassetten" sind Nukleinsäureeinheiten, die neben der für ein Protein kodierenden Sequenz die erforderlichen regulatorischen Bereiche, z. B. Promotor, Enhancer, Repressor, Transkriptionsfaktorbindestelle und Polyadenylierungssequenzen, enthalten. Vorzugsweise enthalten eine oder mehrere der Kasset ten in dem Konstrukt Polyadenylierungssequenz(en).

Zentraler Bestandteil der erfindungsgemäßen Konstrukte ist die in (a) aufgeführte Transkriptionskassette, die eine Rekombinase kodierende Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promo torsystems enthält. Die nach Induktion mit dem passenden Induk tor induzierte Rekombinase, z. B. die Cre-Rekombinase aus dem P1 Coliphagen, katalysiert über ihre das Nukleinsäurekonstrukt flankierenden Targetsequenzen (z. B. loxP) das Herausschneiden des erfindungsgemäßen Konstruktes und damit auch der eigenen kodierenden Sequenz. Erst nach Gabe des geeigneten Induktors kommt es zur Expression der Rekombinase. Bei Präsenz des Induk tors wird in den transgenen Zellen solange Rekombinase exprim iert, bis alle erfindungsgemäßen Konstrukte wieder entfernt wurden. Zurück bleibt alleine eine kurze Rekombinase- Targetsequenz, die auf die Funktion der Zelle keine Einfluss hat. Mit der selbstdeletierenden Rekombinase-kodierenden Se quenz wird auch die in (b) auf geführte wenigstens eine ein weiteres Gen kodierende Sequenz, die unter Kontrolle eines konstitutiven, gewebespezifischen oder induzierbaren Promotorsys tems steht, herausgeschnitten.

In bevorzugter Ausführungsform ist die Rekombinase eine Cre- Rekombinase aus dem P1 Coliphagen und und die Target-Sequenzen sind loxP-Sequenzen.

Alternativ kann die Rekombinase auch eine Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae sein, wobei die Target-Sequenzen frt-Sequenzen sind.

Das induzierbare Promotorsystem für die Rekombinase kann vor zugsweise ein Tetracyclin, Ecdysone oder Mifepristone induzier bares Promotorsystem sein, d. h. dass zu dem Zeitpunkt, zu dem schließlich die Entfernung des zuvor eingeführten Konstruktes aus der Zelle gewünscht wird, Tetracyclin, Ecdysone, Mifepri stone oder Analoga dieser Stoffe zugeführt wird.

Wichtige Voraussetzung für die Funktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte ist, daß das Basallevel der Rekombinase expression (ohne Induktor) extrem niedrig oder im Idealfall gleich null ist. Dieses ist z. B. bekanntermaßen bei bestimmten Ecdysone oder Mifepristone induzierbaren Promotorsystemen der Fall. Nur dann ist es gewährleistet, daß die Konstrukte in den transfizierten Zellen nicht sofort wieder aus der Integrations stelle herausgeschnitten werden.

Ein niedriges basales Expressionslevel kann, falls nötig, durch die Expression einer Rekombinase-Antisense-mRNA oder einem ent sprechenden Ribozym kompensiert werden, wie in der Literatur bekannt. Hierfür enthält das Nukleinsäurekonstrukt in Weiter bildung der Erfindung eine Transkriptionskassette mit einer Rekombinase-Antisense-Sequenz unter Kontrolle eines konstitu tiven oder induzierbaren Promotorsystems, sowie gegebenenfalls eine Polyadenylierungssequenz.

Die das "weitere" nur transient zu inserierende Gen kodierende Sequenz kann beispielsweise eine Telomerase-reverse- Transkriptase oder eine SV40 large T-Antigen kodierende Sequenz sein.

Innerhalb der Transkriptionskassette(n) können durch Verwendung von IRES-Sequenzen (internal ribosome entry sites elements) weitere Gene, z. B. ein Selektionsmarkergen wie ein Neomycin- oder ein Zeozinresistenzgen, unter Kontrolle desselben Promo tors exprimiert werden. Ein Selektrionsmarkergen kann jedoch auch unter Kontrolle eines eigenen Promotors in das erfindungs gemäße Konstrukt eingefügt werden.

Als zusätzliches Sicherheitsmerkmal, vor allen Dingen im Falle von in vivo Anwendungen, kann optional ein Suizidgen unter Kon trolle eines weiteren induzierbaren Promotorsystems in den Nuk leinsäurekonstrukten enthalten sein. Damit besteht zusätzlich die Möglichkeit, einzelne Zellen, bei denen das Konstrukt noch vorhanden sein sollte, über Induktion des Suizidgens abzutöten.

Ein "Suizidgen" ist eine Nukleinsauresequenz, die durch Tran skription und gegebenenfalls Expression zum Zelltod führt (z. B. Thymidinkinase oder Diphterie-Toxin). In dem hier beschriebenen Konstrukt oder Vektor ist es optional als Teil einer Transkrip tionskassette, d. h. in Verbindung mit einem Promotor und gege benenfalls einer Polyadenylierungssequenz, vorhanden.

Insbesondere bei Anwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte für die transiente Inaktivierung von Genen über 'Gene-Targeting'- Technologien bzw. für die zielgerichtete Einführung der Kon strukte (ebenfalls über homologe Rekombination) kann das ver wendete Konstrukt in 5'-Richtung der 3'-flankierenden Rekom binase-Targetsequenz eine oder mehrere Transkriptions- Terminator-Sequenzen (z. B. T phi, rrnBT1, rrnBT2 oder Tfd) oder andersartige Stop-Sequenzen, wie z. B. beschrieben in: Lakso, M., B. Sauer, B. Mosinger, Jr., E. J. Lee, R. W. Manning, S. H. Yu, K. L. Mulder, and H. Westphal. 1992. Targeted oncogene acti vation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 89, no. 14: 6232. Araki, K., M. Araki, J. Miyazaki, and P. Vassalli. 1995. Site-specific recombination of a transgene in fertilized eggs by transient expression of Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci USA 92, no. 1: 160.

"Maneewannakul, S., K. Maneewannakul, and K. Ippen-Ihler. 1994. The pKSM710 vector cassette provides tightly regulated lac and T7lac Promoters and strategies for manipulating N-terminal pro tein sequences. Plasmid 31, no. 3: 300". Die Terminations- Sequenzen sorgen für eine Abkopplung des zu inaktivierenden Gens vom endogenen Promoter und von den eingeführten Promotor systemen.

Wo notwendig können Transkriptions-Terminator-Sequenzen oder andersartige Stop-Sequenzen auch die eingeführten unterschied lichen Transkriptionskassetten untereinander entkoppeln. Ein Selektionsgen kann je nach Selektionsstrategie unter Kontrolle eines exogenen Promotors (wie weiter unten zu Abb 2. beschrie ben) oder Promotorlos vorliegen (siehe Abb. 3).

Allgemein können die Nukleinsäurekonstrukte als DNA oder RNA, als lineares Molekül oder in geeigneten Vektoren, nackt oder in virale Partikel verpackt, über verschiedenste Transfek tionsmethoden in Zielzellen eingebracht werden. Als Transfek tionsmethode für die unter Umständen sehr großen Konstrukte ist insbesondere eine Methode zu nennen, bei der inaktivierte Ade noviren als Shuttle genutzt werden, um große Nukleinsäure moleküle (bis 300 kb) mit hoher Effizienz in Zellen einzubrin gen. diese Methode ist ausführlich beschrieben in: Baker, A., and M. Cotten. 1997. Delivery of bacterial artificial chromo somes into mammalian cells with psoralen-inactivated adenovirus carrier. Nucleic Acids Res 25, no. 10: 1950, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, so dass sie hier nicht geson dert geschildert zu werden braucht.

Neben bestimmten "High Copy" Plasmiden, in die DNA-Fragmente bis zu 20 kb kloniert werden können, können auch Cosmide oder "Bacterial Artificial Chromosomes" (BAC's) für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Konstrukte verwendet werden.

Allgemein kann der Vektor, der das Nukleinsäurekonstrukt ent hält abgeleitet sein aus

- einem Plasmid, insbesondere einem "High Copy" Plasmid
- einem Cosmid
- einem Bacterial Artificial Chromosome (BAC)
- einem Bacteriophagen
- einem viralen Vektor, vorzugsweise adenoviralen oder retroviralen Ursprungs

Zur Lösung der Aufgabe umfasst die Erfindung ferner ein Verfah ren zur transienten Insertion fremder genetischer Elemente in Genome oder extrachromosomale genetische Elemente prokaryoti scher und eukaryotischer Zellen mit den folgenden Schritten:

1. Herstellung eines Nukleinsäurekonstrukts wie oben beschrie ben,
2. Transfektion des Nukleinsäurekonstrukts oder eines damit erzeugten Vektors in eine prokaryote oder eukaryote Zelle (ausgenommen eine humane embryonale Zelle),
3. Induktion der Rekombinaseaktivität mit Hilfe des Induktors für das die Rekombinaseexpression kontrollierende induzierbare Promotorsystem zu einem gewählten späteren Zeitpunkt.

Das Nukleinsäurekonstrukt kann wie bereits beschrieben nackt, als DNA oder RNA, als lineares oder zirkulares Molekül oder in nerhalb von Vektoren in die Zelle transfiziert werden.

Das Verfahren kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden.

Eine wichtige Anwendung der Erfindung liegt in der transienten Immortalisierung primärer somatischer Zellen, vorzugsweise mit Hilfe der Telomerase Reverse Transkriptase, einem Enzym, oder dem SV40 large T-Antigen. Generell können auch andere immorta lisierende Gene verwendet werden.

In Weiterbildung der Erfindung umfasst das Verfahren die ge zielte Induktion eines Zell-Suizidmechanismus durch Zugabe des entsprechenden Induktors (der das Promotorsystem für ein in dem Nucleinsäurekonstrukt vorhandenes Suizidgen kontrolliert) zu einem beliebigen gewählten späteren Zeitpunkt in vitro oder in vivo.

Die Erfindung umfasst auch prokaryotische oder eukaryotische Zellen, ausgenommen embryonale Zellen, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt nach der Erfindung transfiziert sind, sowie transgene Tiere, die Zellen enthalten, in die Nukleinsäure konstrukte nach dieser Erfindung eingebracht wurden.

Der große Vorteil der Erfindung liegt u. a. darin, dass das Re kombinasegen fest an die im Zuge der gentechnischen Behandlung in fremdes genetisches Material zu integrierenden Gene gekop pelt ist und alle später zu entfernenden Elemente innerhalb des von der Rekombinase geschnittenen Target-Sequenz-Systems lie gen. Dadurch kann die vollständige Entfernung der gesamten ein geführten Sequenz (bis auf eine verbleibende Target-Sequenz) zu einem sehr variablen, praktisch beliebigen Zeitpunkt extern in duziert werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Strategien, kann die Erfindung die Entfernung der zuvor eingeführten Konstrukte in 100% der transgenen Zellen garantieren.

Die Erfindung kann in verschiedenen Bereichen der Biotechnolo gie und Medizin vorteilhaft eingesetzt werden.

Verwendungsbereiche für die Erfindung Tissue-Engineering

Ein weites Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen Kon strukte liegt in der Therapie verschiedener Erkrankungen, die sich durch Transplantation syngener oder allogener Zellen oder durch Transplantation bioartifiziell hergestellter Gewebe oder Organe behandeln lassen. Eines der Hauptprobleme des Tissue- Engineering ist, daß die meisten Typen primärer somatischer Zellen sich nicht oder nur sehr schlecht kultivieren und in Zellkultur expandieren lassen. Tumorzellinien oder auf andere Art und Weise permanent immortalisierte Zellinien sind für eine Anwendung im Patienten normalerweise nicht geeignet, da sie häufig im Vergleich zur primären Ursprungszelle stark modi fizierte Eigenschaften aufweisen. Außerdem wachsen solche Zel linien in vivo oft unkontrollierbar und können zur Ausbildung von Tumoren führen. Ob die Transplantation von Zellen, welche konstitutiv und auf hohem Level Telomerase Reverse Transkrip tase (hTERT) exprimieren, langfristig zur Entstehung von Tu moren führen kann, ist unklar. Aus diesem Grund werden auch Zellen, stabil immortalisiert mit hTERT, kaum Anwendung im Pa tienten finden.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die transiente Immortalis ierung von Zellen durch Einführung von erfindungsgemäßen Kon strukten, welche immortalisierende Gene wie z. B. Telomerase Re verse Transkriptase oder das SV40 large T-Antigen enthalten. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist in Abb. 2 gezeigt und wird dort noch näher beschrieben. Unter Verwendung der er findungsgemäßen Konstrukte kann das immortalisierende Gen bei Bedarf wieder aus allen transgenen Zellen entfernt werden.

Ebenso kann das endogene Telomerase Reverse Transkriptase Gen (hTERT) durch Einführung erfindungsgemäßer Konstrukte über "Gene Targeting Technologien" transient unter Kontrolle eines starken konstitutiven, gewebespezifischen oder induzierbaren Promotors gebracht werden. Ein Beispiel hierfür ist nachfolgend in Abb. 3 und der zugehörigen Beschreibung angegeben.

Weiterhin können Zellen auch unter Verwendung der erfindungs gemäßen Konstrukte in Verbindung mit geeigneten 'Gene targeting-Technologien' immortalisiert werden, indem endogene wachstumsregulierende Gene (Onkogene) durch transiente Ein führung von erfindungsgemäßen Konstrukten an geeigneter Stelle von ihren endogenen Promotoren entkoppelt werden. Ein Beispiel hierzu wird nachfolgend in Abb. 4 und der zugehörigen Beschreibung angegeben. In Frage kommen hier z. B. das p21^CIP1/WAF1 Gen (Brown, J. P., W. Wei, and J. M. Sedivy. 1997. Bypass of senescence after disruption of p21CIP1/WAF1 gene in normal diploid human fibroblasts. Science 277, no. 5327: 831) oder Rb/p16^INK4a (Kiyono, T., S. A. Foster, J. I. Koop, J. K. McDougall, D. A. Galloway, and A. J. Klingelhutz. 1998. Both Rb/p16INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells [see comments]. Nature 396, no. 6706: 84).

"Gene-Targeting"-Technologien bezeichnen Methoden, mit denen über homologe Rekombination in prokaryoten oder eukaryoten Zel len gezielt endogene Gene inaktiviert ("Knock-Out") oder Nuk leinsäurekonstrukte an definierte Stellen des zellulären Genoms (oder an definierten Stellen extrachromosomaler Elemente) eingeführt werden können ("Knock-In").

Primäre somatische Zellen, die erfindungsgemäß transient immor talisiert wurden, können für Zelltherapiezwecke und für die in vitro Züchtung von Geweben oder Organen genutzt werden. Nach der notwendigen Expansionsphase können die Zellen in vitro oder in vivo nach Transplantation in Patienten vollständig in einen nicht immortalisierten Zustand zurückversetzt werden. Der einzige genetische Unterschied zur Ursprungszelle ist eine nur wenige Basenpaare lange Rekombinase-Targetsequenz. Wenn die er findungsgemäßen Konstrukte in geeignete genomische Bereiche eingeführt worden sind, ist das zelluläre Expressionsmuster nach Entfernung der Konstrukte unverändert im Vergleich zum Ex pressionsmuster der Ursprungszelle.

Herstellung von transgenen bzw. Knock Out-Tieren und Zellinien: Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Konstrukte können transgene oder "Knock-Out"-Tiere hergestellt werden. In Verbindung mit immortalisierenden Genen, wie oben beschrieben, können z. B. Maus- oder Rattenstämme etabliert werden, aus denen sich tran sient immortalisierte Zellinien der unterschiedlichsten Zelltypen für experimentelle Zwecke etablieren lassen. Weiterhin können nach Herstellung transgener Tiere problemlos die verwendeten Selektionsmarkergene entfernt werden, was z. B. notwendig sein kann, um anschließend weitere Transgene ein zuführen. Die Entfernung der Selektionsgene kann dabei auch zeitsparend in vivo erfolgen.

Gentherapie

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte ermöglicht außerdem die vollständige in vivo Excision bestimmter, nur für den Transfektions- oder Selektionsprozeß notwendiger, und unter Umständen später unerwünschter Vektorkomponenten. So können z. B. nach Transfektion der Konstrukte Selektionsmarkergene oder Gene retroviraler oder adenoviraler Vektoren wieder entfernt werden.

Im folgenden werden zur Veranschaulichung der Erfindung einzel ne Ausführungsbeispiele anhand schematischer Abbildungen noch mals genauer dargestellt. In den Zeichnungen zeigen:

Abb. 1 vereinfachte schematische Darstellung eines für das In sertionsverfahren verwendbaren Nukleinsäure konstruktes in verallgemeinerten Begriffen;

Abb. 2 erstes Ausführungsbeispiel eines konkreten Nukleinsäu rekonstruktes;

Abb. 3 zweites Ausführungsbeispiel eines konkreten Nukleinsäu rekonstruktes;

Abb. 4 drittes Ausführungsbeispiel eines konkreten Nukleinsäu rekonstruktes.

Abb. 1 zeigt in allgemeinen Begriffen eine schematische Dar stellung eines Nukleinsäurekonstruktes nach der Erfindung. Das Konstrukt besitzt flankierend zwei Target-Sequenzen (TS) für eine sequenzspezifische Rekombinase (Targetseq. spez. Rek). Beispiele hierfür sind das Cre-Rekombinase kodierende Gen, flankiert von loxP-Targetsequenzen (aus P1-Coliphagen) oder auch das Flp-Rekombinase kodierende Gen flankiert von FRT- Targetsequenzen (aus S. cerevisiae). Das Gen für die target spezifische Rekombinase ist mit einem induzierbaren Promotor (ind. Prom) versehen, der die Expression der Rekombinase nur bei Vorhandensein eines bestimmten Induktors bewirkt. Das Ba sislevel der Expression sollte ohne Induktor faktisch gleich Null oder sehr niedrig sein. Besonders geeignet sind nach dem derzeitigen Stand der Technik Ecdysone oder Mifepristone induz ierbare Promotorsysteme. Weiterhin umfasst das Konstrukt zwischen den Target-Sequenzen wenigstens eine Transkription skassette, mit der eine bestimmte, durch den Einbau in das Kon strukt transiente Funktion verbunden ist.

Es können weitere, hier nicht gesondert dargestellte Transkrip tionskassetten vorhanden sein.

Abb. 2 zeigt in vereinfachter Darstellung ein erstes Aus führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruk tes zur transienten Insertion eines humanen Telomerase Reverse Transkriptase-Gens (hTERT) unter Kontrolle eines Cytomegalievi rus-Promotors (CMV Pro.) Nach Induktion der unter Kontrolle eines Mifepristone induzierbaren Promotorsystems (MP ind. Pro.) stehenden Cre-Rekombinase-Gens (Cre-Rek.), wird das Konstrukt bis auf eine der beiden Cre-Targetsequenzen loxP enfernt.

Weitere Abkürzungen

BGH: Bovine Growth Hormone
pa: Polyadenylierungssequenz
IRES: Internal Ribosome Entry Site
Neo: Neomycinresistenzgen

Abb. 3 zeigt in vereinfachter Darstellung ein zweites Aus führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruk tes, das zur transienten Aktivierung der endogenen humanen Te lomerase Reverse Transkriptase (hTERT)-Expression über Inser tion eines konstitutiven Cytomegalievirus-Promotors (CMV Pro.) eingesetzt werden kann. Dabei wird die von zwei loxP Sequenzen umschlossene Kassette zwischen den endogenen Promotor und die endogene Kozak-Sequenz (endo. Kozak) des zellulären hTERT-Gens inseriert. Nach homologer Rekombination des Konstruktes er möglicht ein Neomycinresistenzgen (Neo) und ein als Negativse lektionsmarker außerhalb der homologen Sequenzen (homol. Seq.) liegendes Thymidinkinase-Gen (HTK) die Selektion geeigneter Zellklone. Eine Induktion mit Mifepristone (MP) führt zur Ex pression der Cre-Rekombinase (Cre-Rek.) und damit zur Entfer nung des Konstruktes. Die zurückbleibende 34 bp lange loxP- Sequenz zwischen endogenem Promoter und Kozak-Sequenz der hTERT beeinflußt die Expression der hTERT nicht. Bei dieser Strategie steht das Selektionsgen unter Kontrolle eines exogenen Promo tors.

Weitere Abkürzungen

Pro.: Promoter
TS: Transkriptionsterminationssequenz
Ind. Pro.: Induzierbarees Promotersystem
BGH: Bovine Growth Hormone
pA: Polyadenylierungssequenz
SV40 Pro.: Simian Virus 40 Promoter

Abb. 4 zeigt in vereinfachter Darstellung ein drittes Aus führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruk tes, das zur transienten Inaktivierung eines zellulären Gens verwendet wird. Über homologe Rekombination wird die von zwei loxP Sequenzen umschlossene Kassette zwischen den endogenen Promotor (endo. Pro.) und die endogene Kozak-Sequenz (endo. Ko zak) des Zielgens inseriert. Die Insertion des Konstruktes inkl, geeigneter Transkriptionsterminationssequenzen entkoppelt den endogenen Promotor vom Zielgen und verhindert damit dessen Expression. Statt dessen wird, nach homologer Rekombination des Konstruktes ein Neomycinresistenzgen (Neo) mit exogener Kozak- sequenz (exo. Kozak) unter Kontrolle des endogenen Promoters exprimiert und ermöglicht damit die hocheffiziente Selektion geeigneter Zellklone. Eine Induktion mit Mifepristone (MP) führt zur Expression der Cre-Rekombinase (Cre-Rek.) und damit zur vollständigen Entfernung des Konstruktes aus allen Zellen. Die zurückbleibende 34 bp lange loxP-Sequenz zwischen endogenem Promoter und Kozak-Sequenz des Zielgens beeinflußt die Expres sion des Zielgens nicht.

Weitere Abkürzungen

TS: Transkriptionsterminations sequenz
Ind. Pro.: Induzierbares Promotersystem
BGH: Bovine Growth Hormone
pA: Polyadenylierungssequenz

Beispiel für eine transiente Immortalisierung von Zellen mit Hilfe eines spezielle Nukleinsäurekonstrukts

Zur transienten Immortalisierung primärer Zellen wurde das Kon strukt aus Abb. 2 wie folgt hergestellt:

1. Die codierende Sequenz der hTERT wurde aus einer cDNA-Library kloniert, für die Herstellung des Konstruktes über LD-PCR am plifiziert und über Cla I und Not I in pIRESneo (Clontech GmbH, Heidelberg) kloniert. Anschließend wurden die Not I und EcoR I Schnittstellen durch Not I/EcoR I-Verdau, blunten und Religation zerstört. Nach gleichem Schema wurde zusätzlich auch die Nsi I-Schnittstelle zerstört.
2. Die codierende Sequenz der Cre-Rekombinase wurde über PCR aus dem Plasmid 705-Cre (Zhang, Y., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128) amplifiziert und über Hind III und Apa I in den Vek tor pGene V5-His (GeneSwitch expression system, Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert.
3. Die Expressionskassette aus 1) einschließlich CMV-Promoter, hTERT, IRES, NeoR und Polyadenylierungsstelle wurde über LD- PCR amplifiziert und mittels TA-Kloning in pCRXL-TOPO (Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert. Die Entfernung aller Restriktionsschnittstellen in 3'- Richtung des Inserts zwischen EcoR I und Nsi I erfolgte über einen Partialverdau mit EcoR I/Nsi I mit nachfolgendem Blun ten und anschließender Religation.
4. Die pGene V5-His/Cre-Kassette aus 2) wurde über LD-PCR am plifiziert und über TA-Kloning in pCRXL-TOPO kloniert.
5. Die Sequenz von 0-3000 aus pSwitch (GeneSwitch expression system, Invitrogen, Groningen, Niederlande) wurde LD-PCR am plifiziert und über TA-Kloning in pCRXL-TOPO kloniert. Alle Schnittstellen zwischen Kpn I und Spe I wurden durch Kpn I/ Spe I-Verdau, Blunten und nachfolgende Religation zerstört.
6. Die pGene V5-His/Cre-Kassette aus 4) wurde über EcoR I in das Konstrukt aus 3) umkloniert.
7. Die pSwitch-Kassette aus 5) wurde über Nsi I in das Konstrukt aus 6) umkloniert.
8. Die Transkriptionseinheit für die Ampicillinresistenz wurde über PCR aus pGene V5-His amplifiziert und über Not I in das Konstrukt aus 7) kloniert.
9. Die loxP-flankierte Kassette aus pSVKeo (wurde freundlicher weise von A. F. Stewart, Heidelberg, zur Verfügung gestellt) wurde über PCR amplifiziert und über Mlu I und Apa I in pCRXL (Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert.
10. Das Konstrukt aus 9) wurde über 'ET-Kloning' (Zhang, Y., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128) in das Konstrukt aus 10 umkloniert. Dazu wurden Primer partiell homolog zu den LoxP- sites verwendet.
11. Die Transkriptionseinheit für die Ampicillinresistenz wurde über Not I-Verdau und Religation aus dem Konstrukt aus 11 entfernt.

Eine Linearisierung des kompletten Konstruktes aus 12) zu Transfektionszwecken ist über Sfi I möglich.

Claims

1. Nukleinsäurekonstrukt, das folgende Bestandteile umfasst:

a) eine Transkriptionskassette, enthaltend eine Rekombinase kodierende Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promotorsystems;
b) wenigstens eine ein weiteres Gen kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines konstitutiven, gewebespezifischen oder induzierbaren Promotorsystems;
c) je eine 5'-flankierende und eine 3'-flankierende natürliche oder künstliche Rekombinase-Targetsequenz.

2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Polyadenylierungs sequenz enthält.

3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinase eine Cre-Rekombinase aus dem P1 Coliphagen und ist und die Target-Sequenzen loxP- Sequenzen sind.

4. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinase eine Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae ist und die Target-Sequenzen frt-Sequenzen sind.

5. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das induzierbare Promotorsystem für die Rekombinase ein Tetracyclin, Ecdysone oder Mifepristone induzierbares Promotorsystem ist.

6. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die das weitere Gen kodierende Sequenz eine Telomerase reverse Transkriptase, SV40 large T- Antigen oder ein anderes immortalisierendes Gen kodierende Sequenz ist.

7. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in einer der Transkriptionskassetten eine IRES-Sequenz und wenigstens ein weiteres Gen eingebracht ist, das unter Kontrolle des in dieser Kassette vorhandenen Promotors steht.

8. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eines der weiteren Gene ein Selektionsmarkergen ist, vorzugsweise ein Neomycinresistenzgen oder ein Zeozinresistenzgen.

9. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Transkriptionskassette mit einer Rekombinase-Antisense-Sequenz oder einem Rekombinase-Ribozym unter Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotorsystems und vorzugsweise eine Polyadenylierungssequenz enthält.

10. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Transkriptionskassette mit einer Suizidgen-Sequenz, vorzugsweise kodierend für Thymidinkinase oder Diphterie-Toxin, unter Kontrolle eines induzierbaren Promotorsystems sowie vorzugsweise eine Polyadenylierungssequenz enthält.

11. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich in 5'-Richtung der 3'-flankierenden Rekombinase-Targetsequenz eine oder mehrere Transkriptions-Terminator-Sequenzen oder andersartige Stop- Sequenzen enthält.

12. Vektor, enthaltend das Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass er abgeleitet ist aus
einem Plasmid, insbesondere einem "High Copy" Plasmid
einem Cosmid
einem Bacterial Artificial Chromosome (BAC)
einem Bacteriophagen
einem viralen Vektor, vorzugsweise adenoviralen oder retroviralen Ursprungs.

13. Verfahren zur transienten Insertion fremder genetischer Elemente in Genome oder extrachromosomale genetische Elemente prokaryotischer und eukaryotischer Zellen umfassend folgende Schritte:

1. Herstellung eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 12;
2. Transfektion des Nukleinsäurekonstrukts oder eines damit erzeugten Vektors in eine prokaryote oder eukaryote Zelle
3. Induktion der Rekombinaseaktivität mit Hilfe des Induktors für das die Rekombinaseexpression kontrollierende induzierbare Promotorsystem zu einem gewählten späteren Zeitpunkt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (3) in vitro oder in vivo durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die transiente Insertion eine transiente Immortalisierung primärer somatischer Zellen, vorzugsweise mit Hilfe der Telomerase Reverse Transkriptase oder SV40 large T-Antigen ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt nackt als DNA oder RNA in die Zelle transfiziert wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt innerhalb eines Vektors nach Anspruch 13 eingeführt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig mit oder nach Schritt (3) die Expression eines in dem Nukleinsäurekonstrukt vorhandenen Suizidgens induziert wird.

19. Prokaryotische oder eukaryotische Zellen, ausgenommen humane embryonale Zellen, transfiziert mit einem Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

20. Transgenes Tier, Zellen enthaltend, die Nukleinsäure konstrukte nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfassen.