DE602005003369T2

DE602005003369T2 - Neue sequenz um die expression einer nukleinsäure zu erhöhen

Info

Publication number: DE602005003369T2
Application number: DE602005003369T
Authority: DE
Inventors: Arie Pieter Otte; Theodorus Hendrikus Kwaks; Richard George Antonius Bernardus Sewalt; Henricus Johannes Maria Van Blokland
Original assignee: Chromagenics BV
Current assignee: Chromagenics BV
Priority date: 2004-07-08
Filing date: 2005-07-07
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2025-07-08
Also published as: AU2005261699B2; EA200700233A1; HK1097004A1; NZ551510A; JP2008505626A; EA011747B1; CA2573022C; ATE378426T1; AU2005261699A1; CA2573022A1; IL180531A0; ZA200610470B; JP4805262B2; DK1763586T3; WO2006005718A2; CN1981057B; NO341862B1; NO20070757L; WO2006005718A3; BRPI0512798A

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und Biotechnologie. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Mittel und Verfahren, um die Herstellung einer oder mehrerer Nucleinsäuren, die Proteine in einer Wirtszelle codieren können, zu verbessern.
Proteine können in verschiedenen Wirtszellen für eine breiten Anwendungsbereich in der Biologie und Biotechnologie zum Beispiel als Biopharmazeutika hergestellt werden. Verfahren für eine solche Herstellung sind gut etabliert und sind im Allgemeinen mit der Expression einer Nucleinsäure, die das Protein von Interesse codiert (auch als „Transgen" bezeichnet), in einer Wirtszelle verbunden. Ein Problem, das mit der Expression von Transgenen einhergeht, ist, dass sie unvorhersehbar ist, was von der Wahrscheinlichkeit herrührt, dass das Transgen durch das Silencing von Genen (McBurney et al., 2002) inaktiv wird und daher viele Wirtszellclone auf hohe Expression des Transgens getestet werden müssen. Weiterhin ist die Expression des Transgens oft nicht stabil, sobald ein solcher Clon etabliert wurde, und das Silencing der Transgen-Expression während der anhaltenden Züchtung der Wirtszellen ist ein häufig beobachtetes Phänomen. In Wirbeltierzellen kann es durch Bildung von Heterochromatin am Transgen-Locus verursacht werden, was die Transkription des Transgens verhindert (Whitelaw et al., 2001). Silencing von Transgenen ist stochastisch; es kann kurz nach der Integration des Transgens in das Genom oder nach einer Anzahl von Zellteilungen auftreten. Dies führt zu heterogenen Zellpopulationen nach einer anhaltenden Züchtung, in der einige Zellen weiterhin hohe Spiegel des rekombinanten Proteins exprimieren, während andere niedrige oder nicht nachweisbare Spiegel des Proteins exprimieren (Martin & Whitelaw, 1996, McBurney et al., 2002). Eine Zelllinie, die zur heterologen Proteinherstellung verwendet wird, stammt von einer einzelnen Zelle ab, wird aber oft bis zu Zelldichten über zehn Millionen Zellen pro ml in Kultivatoren von 1000 Litern oder mehr hochgezüchtet und für längere Zeitspannen bei diesen Zelldichten gehalten. Diese großen Zellpopulationen (10¹⁴–10¹⁶ Zellen) sind anfällig für ernsthafte Produktivitätseinbrüche durch Silencing der Transgene (Migliaccio et al., 2000, Strutzenberger et al., 1999).
Eine Möglichkeit, die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen, ist die Verwendung sogenannter STAR-Sequenzen im Expressionssystem. Eine Vielfalt solcher STAR-Sequenzen wurde in WO 03/004704 beschrieben. Diese Sequenzen können verwendet werden, um die Vorhersagbarkeit, die Ausbeute und/oder die Stabilität der Proteinherstellung durch Verwendung von Expressionskonstrukten in verschiedenen Typen von Wirtszellen zu verbessern ( WO 03/004704 ; Kwaks et al, 2003).
Die internationale Veröffentlichung WO 03/106674 beschreibt die Verwendung von STAR-Sequenzen zur Expression von Nucleinsäuren, die rekombinante Proteine codieren, in einigen Zelllinien.
Die internationale Veröffentlichung WO 03/106684 beschreibt die Verwendung von STAR-Sequenzen zur Expression von Nucleinsäuren, die multimere Proteine wie Antikörper codieren.
Die vorliegende Erfindung hat die Bereitstellung alternativer Mittel und Verfahren zur Verbesserung der Proteinherstellung zum Ziel.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt rekombinante Nucleinsäuremoleküle, Zellen, Verfahren und eine Verwendung gemäß der Ansprüche bereit.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Anti-Repressor-Sequenzen
Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität, wie sie hier verwendet werden, sind Sequenzen, die in der Lage sind, zumindest teilweise der repressiven Wirkung von HP1- oder HPC2-Proteinen entgegenzuwirken, wenn diese Proteine an DNA gebunden sind. Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität (hier manchmal auch als Anti-Repressor-Sequenzen oder Anti-Repressor-Elemente bezeichnet), die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, wurden in WO 03/004704 offenbart, die durch Bezugnahme hierin eingebunden ist, und wurden darin als „STAR"-Sequenzen bezeichtet (immer wenn hierin eine Sequenz als STAR-Sequenz bezeichnet wird, hat diese Sequenz erfindungsgemäß Anti-Repressor-Aktivität). Als ein nichteinschränkendes Beispiel werden die Sequenzen von 65 Anti-Repressor-Elementen, genannt STAR1-65 (vgl. WO 03/004704 ), hierin entsprechend als SEQ. ID. NOs. 1–65 präsentiert.
Gemäß der Erfindung wird ein funktionelles Fragment oder ein Derivat eines bestimmten Anti-Repressor-Elements als äquivalent zum Anti-Repressor-Element angesehen, wenn es noch Anti-Repressor-Aktivität hat. Das Vorhandensein einer solchen Anti-Repressor-Aktivität kann leicht durch den Fachmann überprüft werden, zum Beispiel durch den nachstehend beschriebenen Test. Funktionelle Fragmente oder Derivate können durch den Fachmann der Molekularbiologie leicht erhalten werden, indem man mit einer bestimmten Anti-Repressor-Sequenz beginnt und Deletionen, Additionen, Substitutionen, Inversionen und Ähnliches durchführt (vgl. z. B. WO 03/004704 ). Ein funktionelles Fragment oder Derivat umfasst auch Orthologe von anderen Spezies, welche unter Verwendung der bekannten Anti-Repressor-Sequenzen mit dem Fachmann bekannten Verfahren gefunden werden können (vgl. z. B. WO 03/004704 ). Daher umfasst die vorliegende Erfindung Fragmente der Anti-Repressor-Sequenzen, wobei die Fragmente noch Anti-Repressor-Aktivität haben. Für Fragmente einer bestimmten Sequenzen bezieht sich die prozentuale Identität auf den Anteil der nativen Referenzsequenz, die im Fragment gefunden wird. Die Erfindung umfasst auch Sequenzen, die zu mindestens 70% in der Nucleotidsequenz identisch zu den Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität oder zu funktionellen Fragmenten davon mit Anti-Repressor-Aktivität sind, solange diese Sequenzen, die mindestens zu 70% identisch sind, noch die erfindungsgemäße Anti-Repressor-Aktivität aufweisen. Vorzugsweise sind die Sequenzen mindestens zu 80% identisch, stärker bevorzugt mindestens zu 90% identisch und noch stärker bevorzugt mindestens zu 95% identisch zur nativen Referenzsequenz oder dem funktionellen Fragment davon.
Sequenzen mit erfindungsgemäßer Anti-Repressor-Aktivität können durch verschiedene Verfahren erhalten werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Clonieren aus dem menschlichen Genom oder aus dem Genom eines anderen Organismus oder zum Beispiel durch Amplifizierung bekannter Anti-Repressor-Sequenzen direkt aus einem solchen Genom unter Verwendung der Kenntnis der Sequenzen, z. B. durch PCR, oder sie können zum Teil oder in Gänze chemisch synthetisiert werden.
Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität und funktionelle Fragmente oder Derivate davon werden hier strukturell durch ihre Sequenzen definiert und werden zusätzlich als Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität funktionell definiert, welche mit dem nachstehend beschriebenen Test bestimmt werden kann.
Jede beliebige Sequenz mit erfindungsgemäßer Anti-Repressor-Aktivität sollte zumindest in der Lage sein, den folgenden funktionellen Test zu überstehen (vgl. WO 03/004704 ), Beispiel 1, hierin durch Bezugnahme eingebunden). Menschliche U-2 OS-Zellen (ATCC HTB-96) werden mit dem pTet-Off-Plasmid (Clontech K1620-A) und mit Nucleinsäure, codierend ein LexA-Repressor-Fusionsprotein, enthaltend die LexA-DNA-bindende Domäne und die codierende Region von entweder HP1 oder HPC2 (Proteine der Drosophila-Polycomb-Gruppe, welche die Genexpression reprimieren, wenn sie an DNA gebunden sind; der Test funktioniert mit beiden Fusionsproteinen) unter Kontrolle des transkriptionellen regulatorischen Tet-Off-Systems (Gossen und Bujard, 1992) stabil transfiziert. Diese Zellen werden nachstehend als Reporterzellen für den Anti-Repressor-Aktivitätstest bezeichnet. Ein Reporterplasmid, welches Hygromycinresistenz bereitstellt, enthält eine Polylinkersequenz, die zwischen vier LexA-Operator-Stellen und dem SV40-Promoter, der das Zeocin-Resistenzgen steuert, positioniert ist. Die auf Anti-Repressor-Aktivität zu prüfende Sequenz kann in den Polylinker cloniert werden. Die Konstruktion eines geeigneten Reporterplasmids wie pSelect wird in Beispiel 1 und 1 von WO 00/004704 beschrieben. Das Reporterplasmid wird in die Reporterzellen transfiziert und die Zellen werden unter Hygromycin-Selektion (25 μg/ml, Selektion auf die Anwesenheit des Reporterplasmids) und Tetracyclin-Repression (Doxycyclin, 10 ng/ml, verhindert die Expression des LexA-Repressor-Fusionsproteins) gezüchtet. Nach 1 Woche des Wachstums unter diesen Bedingungen wird die Doxycyclin-Konzentration auf 0,1 ng/ml (oder niedriger) reduziert, um das LexA-Regressorgen zu induzieren, und nach 2 Tagen wird Zeocin zu 250 μg/ml zugegeben. Die Zellen werden für 5 Wochen gezüchtet, bis die Kontrollkulturen (transfiziert mit dem leeren Reporterplasmid, d. h. es fehlt eine clonierte Anti-Repressor-Sequenz im Polylinker) durch das Zeocin abgetötet werden (in diesem Kontrollplasmid wird der SV40-Promoter durch das LexA-Repressor-Fusionsprotein reprimiert, das an die LexA-Operatorstellen gebunden ist, was zu einer Zeocin-Expression in solchen Zellen führt, die nicht ausreicht, um die Zeocin-Selektion zu überleben). Eine Sequenz hat eine erfindungsgemäße Anti-Repressor-Aktivität, wenn die Reporterzellen die 5 Wochen der Selektion unter Zeocin überleben, wenn die Sequenz in den Polylinker des Reporterplasmids cloniert wird. Zellen aus solchen Kolonien können immer noch nach 5 Wochen der Zeocin-Selektion in neuem Medium, das Zeocin enthält, vermehrt werden, während Zellen, die mit Reporterplasmiden transfiziert wurden, denen Anti-Repressor-Sequenzen fehlen, nicht in neuem Medium, das Zeocin enthält, vermehrt werden können. Jede Sequenz, die nicht in der Lage ist, ein solches Wachstum nach 5 Wochen mit Zeocin in diesem Test zu vermitteln, qualifiziert sich nicht als erfindungsgemäße Sequenz mit Anti-Repressor-Aktivität oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionelles Derivat davon. Als ein Beispiel überleben bekannte Randsequenzen wie jene, die von Van der Vlag et al. (2000) getestet wurden, einschließlich Drosophila-scs. (Kellum und Schedl, 1991), 5'-HS4 des Huhn-β-Globin-Locus (Chung et al., 1993, 1997) oder Matrix Attachment Regions (MARs) (Phi-Van et al., 1990) den Test nicht.
Zusätzlich wird es bevorzugt, dass die Anti-Repressor-Sequenz oder ein funktionelles Fragment oder Derivat davon einen höheren Anteil an den Reporter überexprimierenden Clonen vermittelt, wenn sie/es ein Reportergen flankiert (z. B. Luciferase, GFP), welches in das Genom von U-2 OS- oder CHO-Zellen integriert ist, im Vergleich dazu, wenn das Reportergen nicht von Anti-Repressor-Sequenzen oder von schwächeren Regressions-blockierenden Sequenzen wie Drosophila-scs flankiert wird. Dies kann unter Verwendung von zum Beispiel dem pSDH-Vektor oder ähnlichen Vektoren, wie in Beispiel 1 und 2 von WO 03/004704 beschrieben, bestätigt werden.
Erfindungsgemäße Anti-Repressor-Elemente können zumindest eine von drei Konsequenzen für die Proteinherstellung haben: (1) sie erhöhen die Vorhersagbarkeit der Identifizierung der Wirtszelllinien, welche ein Protein in einem industriell akzeptablen Ausmaß exprimieren, (2) sie führen zu Wirtszelllinien mit erhöhten Proteinausbeuten und/oder (3) sie führen zu Wirtszelllinien, die eine stabilere Proteinprotein während der anhaltenden Züchtung zeigen. Jede dieser Eigenschaften wird nachstehend genauer diskutiert:

(1) Eine erhöhte Vorhersagbarkeit: Integration von Transgen-Expressionskassetten kann an zufälligen Positionen innerhalb des Wirtszellgenoms auftreten. Ein Großteil des Genoms ist jedoch transkriptionell stummes Heterochromatin. Wenn die Expressionskassetten das Transgen flankierende Anti-Repressor-Elemente umfassen, hat die Position der Integration eine verringerte Wirkung auf die Expression. Die Anti-Repressor-Elemente behindern die Fähigkeit des angrenzenden Heterochromatins, das Transgen stumm zu schalten. Infolgedessen wird der Anteil der Transgen-enthaltenden Wirtszellen mit annehmbarem Expressionsniveau erhöht. In der Tat führt der Einbau der Anti-Repressor-Sequenzen zur Etablierung von bis zu 10-fach mehr Kolonien, verglichen mit demselben Transgen, dem die Anti-Repressor-Sequenzen fehlen, wenn dieselbe Menge DNA transfiziert wird.
(2) Ausbeute: Das Niveau der Proteinexpression in den Primärpopulationen der rekombinanten Wirtszellen direkt nach der Integration des Transgens wurde beobachtet. Der Expressionsspiegel der Individuen in den Populationen variiert. Wenn die Transgene jedoch durch Anti-Repressor-Elemente geschützt werden, ist die Variabilität verringert. Diese verringerte Variabilität ist am auffälligsten dahingehend, dass weniger Clone gewonnen werden, die niedrige Expressionsspiegel haben. Weiterhin weisen die Populationen mit Anti-Repressor-Elementen üblicherweise Individuen mit auffällig hoher Expression auf. Diese Individuen mit hoher Ausbeute sind für die Proteinherstellung zu bevorzugen, entweder zu Erntezwecken oder zu Zwecken der Änderung des Phänotyps der Zelle oder eines Organismus, der solche Zellen umfasst.
(3) Erhöhte Stabilität: Anti-Repressor-Elemente erhöhen die Stabilität von Transgenen in rekombinanten Wirtszellinien durch Sicherstellen, dass die Transgene während der anhaltenden Züchtung nicht transkriptionell stummgeschaltet werden. Vergleichsstudien zeigen, dass unter Bedingungen, in denen Transgene, die nicht durch Anti-Repressor-Elemente geschützt werden, progressiv stummgeschaltet werden (5-25 Passagen der Züchtung), durch Anti-Repressor-Elemente geschützte Transgene weiterhin auf hohem Niveau exprimiert werden. Dies ist ein Vorteil während der industriellen Herstellung von proteinartigen Molekülen, währenddessen die Zellzüchtung für längere Zeiträume von einigen Wochen bis zu vielen Monaten fortfährt. In ähnlicher Weise kann die Stabilität der Expression über längere Zeiträume in Pflanzen oder Tieren mit veränderten Phänotypen als Folge der rekombinanten Expression von Anti-Repressor-geschützten Transgenen vorteilhaft sein.

STAR67
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Sequenz mit Anti-Repressor-Aktivität bereit, die als STAR67 bezeichnet wurde (SEQ. ID. NO. 66). Diese Anti-Repressor-Sequenz erhöht die Expression bereits stark, wenn sie nur stromaufwärts eines Promoters, der die Expression eines Gens von Interesse steuert, eingebaut wird, wie es aus den hier bereitgestellten Beispielen offensichtlich wird, während bislang bekannte, potente Anti-Repressor-Sequenzen wie STAR6 oder STAR7 anscheinend viel weniger Vorteile in dieser Konfiguration bereitstellen (sie funktionieren besonders gut, wenn sie ein Transgen flankieren, d. h. wenn sie sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts des Transgens vorhanden sind). Daher stellt STAR67 eine Alternative zu bereits bekannten Anti-Repressor-Sequenzen bereit und, wenn sie stromaufwärts eines Promoters eingebaut wird, scheint sie einen erhöhten Nutzen im Vergleich zu solchen bekannten Anti-Repressor-Sequenzen zu haben. STAR67 ist im Gegensatz zu anderen Anti-Repressor-Sequenzen, die auf diese Eigenschaft getestet wurden (Kwaks et al, 2003), kein Enhancer-Blocker, was einen weiteren Unterschied zwischen STAR67 und anderen zuvor offenbarten Anti-Repressor-Sequenzen bereitstellt. STAR67 kann auch in zwei Richtungen funktionieren, wie es in Beispiel 7 gezeigt wird. Gemäß der Erfindung stellt die Anwesenheit der STAR67-Sequenz in einer Expressionskassette eine verbesserte Vorhersagbarkeit und/oder Ausbeute und/oder Stabilität der Expression bereit. Hier wird gezeigt, dass STAR67 in Kombination mit verschiedenen Promotoren und in verschiedenen Zelllinien funktionell ist.
Expressionskassette
Ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, umfassend STAR67, kann in einem beliebigen Format sein, z. B. als DNA-Fragment, das wahlweise in einem Clonierungsvektor wie einem Plasmid, vorzugsweise einem Expressionsvektor, vorhanden ist, und kann zum Beispiel zu Clonierungszwecken unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardverfahren verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Nucleinsäure eine Expressionskassette, die zur Expression von Sequenzen von Interesse zum Beispiel in Wirtszellen nützlich ist.
Eine 'Expressionskassette', wie sie hier verwendet wird, ist eine Nucleinsäuresequenz, die zumindest einen Promoter umfasst, der funktionell an eine Sequenz geknüpft ist, von der die Expression gewünscht wird, wobei die Sequenz, von der die Expression gewünscht wird, vorzugsweise ein offener Leserahmen ist, der das Protein von Interesse ganz oder teilweise codiert. Der Promotor ist vorzugsweise ein heterologer Promotor bezogen auf die Nucleinsäure von Interesse, wobei ein heterologer Promotor als ein Promotor definiert wird, der nicht der natürliche Promotor der Sequenz von Interesse ist. Mit anderen Worten wurde einige Arten des menschlichen Eingreifens z. B. molekulares Clonieren, zu irgendeinem Zeitpunkt verwendet, um eine funktionelle Kombination eines heterologen Promotors mit einer Nucleinsäure von Interesse herzustellen, und es wird in diesem Zusammenhang leicht zu verstehen sein, dass ein heterologer Promotor von demselben oder einem anderen Organismus wie die Sequenz von Interesse abgeleitet werden kann. Vorzugsweise enthält eine Expressionskassette weiterhin Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen. Andere regulatorischen Sequenzen wie Enhancer können auch eingeschlossen werden. Die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten umfassen weiterhin mindestens eine Anti-Repressor-Sequenz wie STAR67. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Anti-Repressor-Sequenz, vorzugsweise STAR67, stromaufwärts des Promotors eingebaut, vorzugsweise so, dass weniger als 2 kb zwischen dem 3'-Ende der Anti-Repressor-Sequenz und dem Beginn der Promotorsequenz vorhanden sind. In bevorzugten Ausführungsformen sind weniger als 1 kb, stärker bevorzugt weniger als 500 Nucleotide (Nt), noch stärker bevorzugt weniger als etwa 200, 100, 50 oder 30 Nt zwischen dem 3'-Ende der Anti-Repressor-Sequenz und dem Beginn der Promotorsequenz vorhanden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Anti-Repressor-Sequenz direkt stromaufwärts des Promotors cloniert, was zu nur 0–20 Nt. zwischen dem 3'-Ende der Anti-Repressor-Sequenz und dem Beginn der Promotorsequenz führt.
Um die Expression der das rekombinante Protein codierenden Nucleinsäuresequenzen zu erhalten, ist es dem Fachmann wohlbekannt, dass Sequenzen, die in der Lage sind, eine solche Expression zu steuern, funktionell mit Protein codierenden Nucleinsäuren verknüpft werden können, was zu rekombinanten Nucleinsäuremolekülen führt, die ein rekombinantes Protein in einem exprimierbaren Format codieren. Im Allgemeinen wird die Promotorsequenz stromaufwärts der Sequenzen, die das Protein von Interesse codieren, eingebaut. Nützliche Expressionsvektoren sind im Fachgebiet erhältlich, z. B. die pcDNA- und pEF-Vektorserien von Invitrogen, pMSCV und pTK-Hyg von BD Sciences, pCMV-Script von Stratagene etc..
Wo die das Polypeptid von Interesse codierende Sequenz in Bezug auf Sequenzen, welche die Transkription und Translation des codierten Polypeptids steuern, richtig eingefügt ist, ist die entstehende Expressionskassette nützlich, um das Protein von Interesse herzustellen, was als Expression bezeichnet wird. Die Expression antreibende Sequenzen können Promotoren, Enhancer und Ähnliche und Kombinationen davon umfassen. Diese sollten in der Lage sein, in der Wirtszelle zu funktionieren, um die Expression der Nucleinsäuresequenzen, die funktionell daran geknüpft sind, anzutreiben. Der Fachmann ist sich bewusst, dass verschiedene Promotoren verwendet werden können, um die Expression eines Gens von Interesse in Wirtszellen zu erhalten. Promotoren können konstitutiv oder reguliert sein und sie können aus verschiedenen Quellen, einschließlich Viren, prokaryontischen oder eukaryontischen Quellen, erhalten oder künstlich entworfen werden. Die Expression von Nucleinsäuren von Interesse kann vom natürlichen Promotor oder einem Derivat davon oder von einem gänzlich heterologen Promotor erfolgen (Kaufman, 2000). Einige wohlbekannte und viel verwendete Promotoren für die Expression in eukaryontischen Zellen umfassen Promotoren, die von Viren stammen, wie Adenoviren, z. B. der E1A-Promotor, Promotoren, die aus dem Cytomegalievirus (CMV) stammen, wie der sehr frühe (IE) CMV-Promotor (hier als der CMV Promotor bezeichnet) (erhältlich zum Beispiel von pcDNA, Invitrogen), Promotoren aus dem Affenvirus 40 (SV40) (Das et al., 1985) und Ähnliche. Geeignete Promotoren können auch aus eukaryontischen Zellen stammen, wie Metallothionein (MT)-Promotoren, Elongationsfaktor 1 α (EF-1α)-Promotor (Gill et al., 2001), Ubiquitin C- oder UB6-Promotor (Gill et al., 2001, Schorpp et al., 1996), Actin-Promotor, ein Immunglobulin- Promotor, Hitzeschock-Promotoren und Ähnliche. Einige Promotoren, die bevorzugt werden, um Expression in eukaryontischen Zellen zu erhalten, welche für die vorliegende Erfindung geeignete Promotoren sind, sind der CMV-Promotor, ein Säuger-EF1-alpha-Promotor, ein Säuger-Ubiquitin-Promotor wie ein Ubiquitin-C-Promotor oder ein SV40-Promotor (z. B. erhältlich von pIRES, Kat.-Nr. 631605, BD Sciences). Das Testen auf die Promotorfunktion und die Stärke eines Promotors ist eine Routinesache für einen Fachmann und kann im Allgemeinen das Clonieren eines Testgens wie lacZ, Luciferase, GFP etc. hinter der Promotorsequenz und einen Test auf die Expression des Testgens umfassen. Natürlich können die Promotoren durch Deletion, Addition oder Mutation von Sequenzen darin verändert und auf Funktionalität getestet werden, um neue attenuierte oder verbesserte Promotorsequenzen zu finden.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette kann monocistronisch, bicistronisch oder multicistronisch sein. Der Begriff „bicistronisches Gen" ist als ein Gen definiert, das in der Lage ist, ein RNA-Molekül bereitzustellen, das zwei Proteine/Polypeptide codiert. Der Begriff „monocistronisches Gen" ist als ein Gen definiert, das in der Lage ist, ein RNA-Molekül bereitzustellen, das ein Protein/Polypeptid codiert. Der Begriff „multicistronisch" ist als ein Gen definiert, das in der Lage ist, ein RNA-Molekül bereitzustellen, das zwei oder mehr Proteine/Polypeptide codiert, und ein bicistronisches Gen ist daher innerhalb der Definition eines multicistronischen Gens eingeschlossen. Ein „Gen", wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann chromosomale DNA, cDNA, künstliche DNA, Kombinationen davon und Ähnliches umfassen und könnte auch in Form von anderen Nucleinsäuren, z. B. RNA, vorliegen. In bestimmten Ausführungsformen umfasst eine Proteinexpressionseinheit ein multicistronisches Gen. Einheiten, die einige Cistrone umfassen, können als eine einzelne mRNA transkribiert werden. Die Translation der zweiten und weiteren codierenden Regionen, die auf dieser RNA vorhanden sind, kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, einschließlich der Verwendung der Translations-Reinitiationsstellen oder der internen Ribosomen-Eintrittsstellen, wobei die letzteren davon bevorzugt werden. Ein Vorteil der bi- oder multicistronischen Einheiten kann eine einfache Selektion von Clonen, die das Protein von Interesse exprimieren, durch Einbauen der Nucleinsäure, die ein selektierbares Markerprotein codiert, stromabwärts der Nucleinsäure sein, die ein Protein oder Polypeptid von Interesse codiert.
Zur Herstellung von multimeren Proteinen können zwei oder mehr Expressionskassetten verwendet werden. Diese Ausführungsform hat gezeigt, dass sie gute Ergebnisse erzielt, z. B. zur Expression der schweren und der leichten Kette von Antikörpern. Gemäß der Erfindung sollte zumindest eine der Expressionskassetten, vorzugsweise jedoch jede von ihnen, eine STAR-Sequenz umfassen. In einer anderen Ausführungsform sind verschiedene Untereinheiten oder Teile eines multimeren Proteins auf einer einzelnen Expressionskassette vorhanden.
Anstelle von oder zusätzlich zur Anwesenheit einer Anti-Repressor-Sequenz, die stromaufwärts eines Promotors in einer Expressionskassette eingebaut ist, hat es sich als hochgradig vorteilhaft herausgestellt, eine Anti-Repressor-Sequenz auf beiden Seiten einer Expressionskassette bereitzustellen, so dass die das Transgen enthaltende Expressionskassette von zwei Anti-Repressor-Sequenzen flankiert wird, welche in bestimmten Ausführungsformen im Wesentlichen identisch miteinander sind. Natürlich kann dies mit STAR67 durchgeführt werden, um eine Expressionskassette zu erhalten, die von zwei STAR67-Sequenzen flankiert wird. Alternative Positionen einer einzelnen STAR67-Sequenz in einer Expressionskassette, z. B. hinter dem Transgen, vorzugsweise hinter dem Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignal, mit dem 3'-Ende der STAR67-Sequenz dem Transgen zugewandt, sind ebenfalls möglich.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette kann wahlweise ein Selektionsmarkergen umfassen. Der Begriff „Selektionsmarker oder selektierbarer Marker" wird typischerweise verwendet, um sich auf ein Gen und/oder Protein zu beziehen, dessen Gegenwart direkt oder indirekt in einer Zelle nachgewiesen werden kann, zum Beispiel ein Gen und/oder ein Protein, das ein Selektionsmittel inaktiviert und die Wirtszelle vor den tödlichen oder wachstumshemmenden Wirkungen des Mittels schützt (z. B. ein Antibiotikum-Resistenzgen und/oder -protein). Eine andere Möglichkeit ist, dass der Selektionsmarker Fluoreszenz oder eine Farbablagerung induziert (z. B. grün fluoreszierendes Protein und Derivate, Luziferase, LacZ, alkalische Phosphatase etc.). In bestimmten Ausführungsformen ist ein für die Erfindung verwendeter Selektionsmarker Zeocin und zur Selektion einer zweiten Expressionskassette wird Puromycin verwendet. Der Fachmann wird wissen, dass andere Selektionsmarker verfügbar sind und verwendet werden können, z. B.
Neomycin, Blasticidin, Puromycin, Bleomycin, Hygromycin, dhfr etc..
Der Begriff „Selektion" wird typischerweise als das Verfahren der Verwendung eines Selektionsmarkers/selektierbaren Markers und eines Selektionsmittels definiert, um Wirtszellen mit spezifischen genetischen Eigenschaften zu identifizieren (z. B. dass die Wirtszelle ein Transgen enthält, das in sein Genom integriert ist). Es ist einem Fachmann klar, dass zahlreiche Kombinationen der Selektionsmarker möglich sind. Ein Beispiel eines möglichen Antibiotikums wird vorstehend bereitgestellt. Ein Antibiotikum, das besonders vorteilhaft ist, ist Zeocin, da das Zeocin-Resistenzprotein (Zeocin-R) dadurch wirkt, dass es den Wirkstoff bindet und harmlos macht. Daher ist es einfach, die Menge des Wirkstoffs zu titrieren, die die Zellen mit niedrigem Zeocin-R-Expressionsniveau abtötet, während es den hochexprimierenden Zellen das Überleben ermöglicht. Alle anderen Antibiotika-Resistenzproteine sind in üblicher Verwendung Enzyme und wirken daher katalytisch (nicht 1:1 mit dem Wirkstoff). Wenn eine Selektion in zwei Schritten durchgeführt wird, ist es daher vorteilhaft, ein Antibiotikum-Resistenzprotein mit diesem 1:1-Bindungsmodus zu verwenden. Daher ist das Antibiotikum Zeocin ein bevorzugter Selektionsmarker. Der Einfachheit halber kann das Zeocin-Antibiotikum in einem Selektionsverfahren in zwei Schritten mit zum Beispiel Puromycin, Blasticidin oder Hygromycin, welche zum Beispiel in einem monocistronischen Gen vorhanden sein können, kombiniert werden.
Es auch möglich, einen antibiotischen Selektionsmarker mit einem Selektionsmarker, welcher die Induktion von Fluoreszenz oder eine Farbstoffablagerung bereitstellt, zu kombinieren. Verschiedene Promotoren können verwendet werden, solange sie in der verwendeten Zelle funktionell sind.
In bestimmten Ausführungsformen wird eine Expressionskassette mit einer (schwachen) internen Ribosomenbindungsstelle (IRES) als ein Beispiel für eine Protein-Translations-Initiationsstelle mit einer reduzierten Translationseffizienz bereitgestellt, z. B. zwischen dem offenen Leserahmen des Proteins von Interesse und dem offenen Leserahmen des Selektionsmarkers. Die Translation von Proteinen von den IRES-Elementen ist weniger effizient als die Kappenstruktur-abhängige Translation: die Menge des Proteins aus IRES-abhängigen offenen Leserahmen (ORFs) reicht von weniger als 20% bis 50% der Menge vom ersten ORF (Mizuguchi et al., 2000). Weiterhin kann die Mutation von IRES-Elementen ihre Aktivität attenuieren und die Expression von IRES-abhängigen ORFs auf unter 10% des ersten ORF senken (Lopez de Quinto & Martinez-Salas, 1998, Rees et al., 1996). Wenn der IRES-abhängige ORF ein selektierbares Markerprotein codiert, bedeutet sein niedriges, relatives Translationsniveau, dass das hohe, absolute Transkriptionsniveau vorhanden sein muss, um die rekombinante Wirtszelle selektieren zu können. Daher exprimieren ausgewählte rekombinante Wirtszellisolate notwendigerweise große Mengen der Transgen-mRNA. Da das rekombinante Protein vom Kappenstruktur-abhängigen ORF translatiert wird, kann es im Übermaß produziert werden, was zu hohen Produktausbeuten führt.
Konventionelle Expressionssysteme sind DNA-Moleküle in Form eines rekombinanten Plasmids oder eines rekombinanten viralen Genoms. Das Plasmid oder das virale Genom wird in (eukaryontische Wirts-)Zellen eingeführt und vorzugsweise durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in ihre Genome integriert. In bevorzugten Ausführungsformen verwendet die vorliegende Erfindung auch diese Typen von DNA-Molekülen, um ihr verbessertes Transgen-Expressionssystem abzugeben. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Plasmid-DNA zur Abgabe des Expressionssystems. Ein Plasmid enthält einige Komponenten: konventionelle Komponenten, die im Fachgebiet bekannt sind, sind ein Replikationsursprung und ein selektierbarer Marker zur Vermehrung des Plasmids in Bakterienzellen; einen selektierbaren Marker, der in eukaryotischen Zellen funktioniert, um Wirtszellen zu identifizieren und zu isolieren, welche ein integriertes Transgen-Expressionssystem tragen; Nucleinsäuren, die das Protein von Interesse codieren, dessen hohes Transkriptionsniveau durch einen Promotor erreicht wird, der in eukaryontischen Zellen funktionell ist (z. B. der menschliche sehr frühe Haupt-Promotor/Enhancer aus dem Cytomegalievirus, pCMV (Boshart et al., 1985), und transkriptionelle Terminatoren (z. B. die SV40-Polyadenylierungsstelle (Kaufman & Sharp, 1982) für das Transgen von Interesse und den selektierbaren Marker.
Der verwendete Vektor kann ein beliebiger Vektor sein, der für die Clonierung von DNA geeignet ist und für die Transkription einer Nucleinsäure von Interesse verwendet werden kann. Wenn die Wirtszellen verwendet werden, wird es bevorzugt, dass der Vektor ein integrierender Vektor ist. Alternativ kann der Vektor ein episomal replizierender Vektor sein.
Einige nicht-limitierende schematische Abbildungen möglicher Konfigurationen von Expressionskassetten werden in 1 bereitgestellt. Dies ist die Konfiguration der DNA-Elemente der Expressionskassetten im Plasmid sowie nach Integration in das Genom. Das Konstrukt A enthält eine Expressionseinheit, welche einen ein Protein codierenden offenen Leserahmen (Gen) umfasst. Dieses liegt stromaufwärts des attenuierten EMCV-IRES (Martinez-Salas et al., 1999, Mizuguchi et al., 2000, Rees et al., 1996) und des offenen Leserahmens, codierend das selektierbare Markerprotein für die Zeocin-Resistenz (zeo). Die Genkassette hat den transkriptionellen Terminator aus SV40 an ihrem 3'-Ende (t). Dieses bicistronische Transgen wird auf hohem Niveau von CMV-Promotor transkribiert. Das Konstrukt B stammt von Konstrukt A ab, aber STAR67 wird nun stromaufwärts des CMV-Promotors cloniert. Konstrukt C stammt von Konstrukt B ab, aber nun werden zwei Anti-Repressor-Elemente (in diesem Fall STAR7) cloniert, so dass die gesamte Kassette flankiert wird.
Kombination von Anti-Repressor-Sequenzen in Expressionskassetten
Es wird hier gezeigt, dass die Kombination eines ersten Anti-Repressor-Elements, stromaufwärts des Promotors und die Expressionskassette flankierend, mit zwei anderen Anti-Repressor-Sequenzen bessere Ergebnisse erzielt. Insbesondere wenn SV40-Promotor in CHO-Zellen verwendet wird, ist die Expression schon in Abwesenheit von Anti-Repressor-Sequenzen sehr hoch, wird aber erheblich verstärkt, wenn STAR67 stromaufwärts des Promotors eingebaut und die gesamte Expressionskassette von zwei Anti-Repressor-Elementen flankiert wird, wie STAR6, STAR7 oder STAR40.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Expressionskassette, bereitzustellen, welche (von 5' bis 3') umfasst: Anti-Repressor-Sequenz A – Promotor – Nucleinsäure, die ein Protein von Interesse codiert – Anti-Repressor-Sequenz B, charakterisiert dadurch, dass die Expressionskassette weiterhin eine Anti-Repressor-Sequenz C zwischen den Anti-Repressor-Sequenzen A und B umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anti-Repressor-Sequenz C stromaufwärts des Promotors in einer Konfiguration vorhanden, die vorstehend unter der Überschrift „Expressionskassette" beschrieben wird. Die Expressionskassette zwischen den Anti-Repressor-Sequenzen A und B kann weiterhin die Elemente, wie vorstehend für Expressionskassetten beschrieben, umfassen, z. B. Transkriptions-Terminatorsequenz, Polyadenylierungssignal, Selektionsmarkergen, Enhancer etc., und kann monocistronisch, bicistronisch oder multicistronisch sein, wie vorstehend beschrieben.
Zwei oder alle drei der Anti-Repressor-Sequenzen A, B und C können dieselbe sein oder alle drei können unterschiedlich sein. Die Anti-Repressor-Sequenzen A und B können dieselben wie die Anti-Repressor-Sequenz C oder unterschiedlich sein. In bestimmten Ausführungsformen sind die Anti-Repressor-Sequenzen A und B (im Wesentlichen) identisch miteinander. In einer Ausführungsform ist die Anti-Repressor-Sequenz C STAR67 oder ein funktionelles Fragment oder Derivat davon. Die Anti-Repressor-Sequenzen A und B können beliebige Anti-Repressor-Sequenzen sein und in bestimmten Ausführungsformen eine der SEQ. ID. NOs. 1–65 oder funktionelle Fragmente oder Derivate davon sein. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Expressionskassette ein multicistronisches Gen und in bevorzugten Ausführungsformen davon umfasst das multicistronische Gen eine Sequenz, die ein Protein von Interesse und ein Selektionsmarkergen codiert. Alternativ ist ein Selektionsmarkergen unter der Kontrolle eines getrennten Promotors vorhanden.
In bestimmten Ausführungsformen kann eine vierte Anti-Repressor-Sequenz D zwischen den STAR-Sequenzen A und B vorhanden sein. In einer solchen Ausführungsform ist die Anti-Repressor-Sequenz D vorzugsweise stromabwärts der Nucleinsäure positioniert, die das Protein von Interesse codiert. Wiederum kann diese Anti-Repressor-Sequenz D dieselbe sein oder sich von anderen Anti-Repressor-Sequenzen im rekombinanten Nucleinsäuremolekül unterscheiden, sie kann eine beliebige Anti-Repressor-Sequenz sein und wird in bestimmten Ausführungsformen aus einer beliebigen der SEQ. ID. NOs. 1–66 oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon ausgewählt.
Da zumindest einige Anti-Repressor-Sequenzen gerichtet sein können ( WO 00/004704 ), können die Anti-Repressor-Sequenzen, welche die Expressionskassette flankieren (Anti-Repressor-Sequenzen A und B), günstigerweise in umgekehrter Richtung zueinander eingebaut werden, so dass das 3'-Ende jeder dieser Anti- Repressor-Sequenzen einwärts zur Expressionskassette (und zueinander) zeigt. Daher zeigt in bevorzugten Ausführungsformen die 5'-Seite eines Anti-Repressor-Elements zur DNA/zum Chromatin, von welchen der Einfluss auf das Transgen durch das Anti-Repressor-Element gemindert wird. Bei einer Anti-Repressor-Sequenz stromaufwärts eines Promotors in einer Expressionskassette zeigt das 3'-Ende zum Promotor. Die Sequenzen des Anti-Repressor-Elements (SEQ. ID. NOs. 1–66) im Sequenzprotokoll werden in 5'-3'-Richtung angegeben, wenn nicht anders angezeigt.
Erfindungsgemäße Zellen
Nucleinsäuremoleküle, welche STAR-Sequenzen und/oder erfindungsgemäße Expressionskassetten umfassen, können zur Verbesserung der Expression von Nucleinsäure vorzugsweise in Wirtszellen verwendet werden. Die Begriffe „Zelle"/"Wirtszelle"" und „Zelllinie"/"Wirtszelllinie" sind jeweils typischerweise als eine Zelle und homogene Populationen davon definiert, die mit im Fachgebiet bekannten Verfahren in Zellkultur gehalten werden können und die Fähigkeit haben, heterologe oder homologe Proteine zu exprimieren. Eine erfindungsgemäße Wirtszelle ist vorzugsweise eine eukaryontische Zelle, stärker bevorzugt eine Säugerzelle wie eine Nagerzelle oder eine menschliche Zelle oder eine Fusion zwischen verschiedenen Zellen. In bestimmten nicht-limitierenden Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine U-2 OS-Osteosarkom-, CHO-(Ovarzelle des Chinesischen Hamsters), HEK293-, HuNS-1-Myelom-, WERI-Rb-1-Retinoblastom-, BHK-, Vero-, nicht-sekretierende Maus-Myelom Sp2/0-Ag 14-, nicht-sekretierende Maus-Myelom-NS0-, NCl-H295R-Nebennierencarcinom- oder eine PER-C6^®-Zelle.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist eine Wirtszelle eine Zelle, die zumindest E1A und vorzugsweise auch E1B eines Adenovirus exprimiert. Als nicht-limitierende Beispiele kann eine solche Zelle zum Beispiel von menschlichen Zellen zum Beispiel von einer Niere (Beispiel: HEK 293-Zellen, vgl. Graham et al., 1977), aus der Lunge (z. B. A549, vgl. z. B. WO 98/39411 ) oder der Retina (Beispiel: HER-Zellen, die unter dem Handelsnamen PER.C6^® vertrieben werden, vgl. US-Patent 5,994,128 ) oder von Amniocyten (z. B. N52.E6, beschrieben im US-Patent 6,558,948 ) und gleichermaßen von anderen Zellen stammen. Verfahren zum Erhalten solcher Zellen werden zum Beispiel in den US-Patenten 5,994,128 und US 6,558,948 beschrieben. PER.C6^®-Zellen zum Zwecke der vorliegenden Anmeldung bedeuten Zellen aus der Stromaufwärts- oder Stromabwärts-Passage oder einen Abkömmling von einer Stromaufwärts- oder Stromabwärts-Passage von Zellen, die unter ECACC Nr. 96022940 hinterlegt wurden. Es wurde zuvor gezeigt, dass solche Zellen in der Lage sind, Proteine auf hohem Niveau zu exprimieren (z. B. WO 00/63403 und Jones et al., 2003).
Solche Wirtszellen, die das gewünschte erfindungsgemäße Protein exprimieren, können durch Einführung eines Nucleinsäuremoleküls vorzugsweise in Form einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in die Zellen erhalten werden. In einer alternativen Ausführungsform wird auf die STAR67-Sequenz für die Integration in eine chromosomale Region abgezielt, um die Expression eines Gens von Interesse zu verbessern, das bereits in das Genom integriert ist, z. B. ein natürlich vorkommendes Gen, wahlweise unter Kontrolle eines heterologen Promotors, der stromaufwärts des Gens eingebaut wurde, um die Expression des Gens zu regulieren.
Vorzugsweise stammen die Wirtszellen aus einem stabilen Clon, der gemäß den dem Fachmann bekannten Standardverfahren ausgewählt und vermehrt werden kann. Eine Kultur eines solchen Clons ist in der Lage, rekombinantes Protein von Interesse herzustellen. Erfindungsgemäße Zellen sind vorzugsweise in der Lage, in serumfreiem Medium in Suspensionskultur zu wachsen.
Ein erfindungsgemäßes Protein von Interesse kann ein beliebiges Protein und ein monomeres oder ein multimeres Protein sein. Ein multimeres Protein umfasst mindestens zwei Polypeptidketten. Nicht-limitierende Beispiele für ein erfindungsgemäßes Protein von Interesse sind Enzyme, Hormone, Immunglobulinketten, therapeutische Proteine wie Anti-Krebs-Proteine, Blutgerinnungsproteine wie Faktor VIII, multifunktionelle Proteine wie Erythropoietin, diagnostische Proteine oder Proteine oder Fragmente davon, die zu Impfzwecken nützlich sind; alle sind dem Fachmann bekannt.
In bestimmten Ausführungsformen codiert eine erfindungsgemäße Expressionskassette eine schwere oder leichte Kette oder einen Antigen-bindenden Teil eines Immunglobulins, eines Derivats und/oder eines Analogs davon. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Proteinexpressionseinheit bereitgestellt, worin das Protein von Interesse eine schwere Kette eines Immunglobulins ist. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Proteinexpressionseinheit bereitgestellt, worin das Protein von Interesse eine leichte Kette eines Immunglobulins ist. Wenn diese beiden Proteinexpressionseinheiten innerhalb derselben (Wirts-)Zelle vorhanden sind, wird ein multimeres Protein und spezifischer ein Antikörper zusammengesetzt. Daher ist das Protein von Interesse in bestimmten Ausführungsformen ein Immunglobulin wie ein Antikörper, der ein multimeres Protein ist. Vorzugsweise ist ein solcher Antikörper ein menschlicher oder humanisierter Antikörper. In bestimmten Ausführungsformen davon ist er ein IgG-, IgA- oder IgM-Antikörper. Ein Immunglobulin kann durch die schweren und leichten Ketten auf verschiedenen Expressionskassetten codiert sein oder auf einer einzelnen Expressionskassette, wobei das Gen, das jede einzelne Kette codiert, jeweils unter Kontrolle eines getrennten Promotors in monocistronischen Transkriptionseinheiten vorliegt oder alternativ können beide Ketten auf einem multicistronischen Gen codiert sein.
Das Protein von Interesse kann aus einer beliebigen Quelle stammen und in bestimmten Ausführungsformen ist es ein Säugerprotein, ein künstliches Protein (z. B. ein Fusionsprotein oder ein mutiertes Protein) und ist vorzugsweise ein menschliches Protein.
Offensichtlich können die Anti-Repressor-Sequenzen und -Konfigurationen der erfindungsgemäßen Expressionskassetten auch verwendet werden, wenn das letztendliche Ziel nicht die Herstellung eines Proteins ist, sondern die RNA selbst, zum Beispiel zur Herstellung erhöhter Mengen von RNA von einer Expressionskassette, welche zum Zweck der Regulierung anderer Gene (z. B. RNAi, Antisense-RNA), Gentherapie, in vitro-Proteinherstellung etc. verwendet werden kann.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Expression einer Sequenz von Interesse, die vorzugsweise ein Protein von Interesse codiert, durch Bereitstellung einer Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül oder einer erfindungsgemäßen Expressionskassette durch Züchtung der Zelle und Expression der Sequenz von Interesse bereit.
Der Begriff „Expression" wird typischerweise verwendet, um auf die Herstellung eines spezifischen RNA-Produkts oder von RNA-Produkten oder eines spezifischen Proteins oder von Proteinen in einer Zelle Bezug zu nehmen. Im Fall von RNA-Produkten bezieht er sich auf den Prozess der Transkription. Im Fall von Proteinprodukten bezieht er sich auf die Prozesse der Transkription, Translation und wahlweise der posttranslationalen Modifizierungen (z. B. Glycosylierung, Bildung von Disulfidbrücken etc.). Im Fall von sekretierten Proteinen bezieht er sich auf die Prozesse der Transkription, Translation und wahlweise der post-translationalen Modifizierungen, gefolgt von Sekretion.
Die Einführung der Nucleinsäure, die in einer Zelle exprimiert werden soll, kann durch eines von mehreren Verfahren, welche als solche dem Fachmann bekannt sind, in Abhängigkeit vom Format der einzuführenden Nucleinsäure durchgeführt werden. Die Verfahren beinhalten Transfektion, Infektion, Injektion, Transformation und Ähnliche, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Die Züchtung einer Zelle wird durchgeführt, um Stoffwechsel, Wachstum, Teilung zu ermöglichen und/oder rekombinante Proteine von Interesse herzustellen. Dies kann durch dem Fachmann wohlbekannte Verfahren erreicht werden und umfasst die Bereitstellung von Nährstoffen für die Zelle, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die Verfahren umfassen das Wachstum von Zellen, die an Oberflächen anhaften, Wachstum in Suspension oder Kombinationen davon. Die Züchtung kann zum Beispiel in Schalen, Rollflaschen oder in Bioreaktoren unter Verwendung von Batch-, Fed-Batch-, kontinuierlichen Systemen wie Perfusionssystemen und Ähnlichen durchgeführt werden. Um eine (kontinuierliche) Herstellung von rekombinanten Proteinen durch Zellkultur im großen Maßstab zu erreichen, wird es im Fachgebiet bevorzugt, Zellen zu haben, die in der Lage sind, in Suspension zu wachsen, und es wird bevorzugt, Zellen zu haben, die in der Lage sind, in Abwesenheit von Serum aus Tieren oder Menschen oder in Abwesenheit von Serumkomponenten aus Tieren oder Menschen zu wachsen.
Die Bedingungen zum Züchten oder Vervielfachen von Zellen (vgl. z. B. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, Herausgeber (1973)) und die Bedingungen für die Expression des rekombinanten Produkts sind dem Fachmann bekannt. Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Säugerzellkulturen bei Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, Hrsg., IRL Press, 1991). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das exprimierte Protein entweder aus den Zellen oder aus dem Kulturmedium oder aus beiden gesammelt (isoliert). Es kann dann unter Verwendung bekannter Verfahren, z. B. Filtrieren, Säulenchromatographie etc., durch Verfahren, die dem Fachmann im Allgemeinen bekannt sind, weiter gereinigt.
Neues Selektionsverfahren
Die vorliegende Erfindung offenbart ein neues Verfahren zur Erzeugung von Wirtszellen, welche zwei Polypeptide von Interesse exprimieren, wobei das Verfahren zu überraschend guten Ergebnissen führt dahingehend, dass beinahe keine oder keine Kolonien ohne Verwendung der Anti-Repressor-Sequenz erscheinen, während die Anwesenheit einer Anti-Repressor-Sequenz zu Clonen führt, welche die Selektion überleben, und diese Clone exprimieren im Allgemeinen die beiden Polypeptide von Interesse auf hohem Niveau (Beispiel 7, 11). Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erzeugung einer Wirtszelle, die zwei Polypeptide von Interesse exprimiert, bereit, wobei das Verfahren umfasst: a) Einführung von einem oder mehreren Nucleinsäuremolekül/en in eine Wirtszelle, wobei das Nucleinsäuremolekül oder die Moleküle zusammen umfassen: (i) einen Promotor, der funktionell an eine Sequenz geknüpft ist, die ein erstes Polypeptid von Interesse und ein erstes selektierbares Markergen codiert und (ii) einen Promotor, der funktionell an eine Sequenz geknüpft ist, die ein zweites Polypeptid von Interesse und einen zweiten selektierbaren Marker codiert und (iii) mindestens eine Anti-Repressor-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) SEQ. ID. NO. 66, (b) Fragmente von SEQ. ID. NO. 66, wobei die Fragmente Anti-Repressor-Aktivität haben, (c) Sequenzen, die mindestens zu 70% identisch zu (a) oder (b) sind und Anti-Repressor-Aktivität haben, und (d) dem Komplement zu einem beliebigen aus (a)–(c), b) Selektion einer Wirtszelle durch im Wesentlichen gleichzeitiges Selektieren auf Expression der ersten und zweiten selektierbaren Markergene. Die ausgewählten Wirtszellen können günstigerweise für die Expression der beiden Polypeptide durch Züchtung der ausgewählten Wirtszellen verwendet werden. In einer Ausführungsform werden zwei Nucleinsäuremoleküle, eines enthaltend (i) und das andere enthaltend (ii), für die Einführung in die Wirtszelle verwendet. In dieser Ausführungsform enthält jedes Nucleinsäuremolekül vorzugsweise mindestens eine Anti-Repressor-Sequenz. In einer anderen Ausführungsform wird ein einzelnes Nucleinsäuremolekül, enthaltend sowohl (i) als auch (ii), verwendet, welches dann mindestens eine Anti-Repressor-Sequenz enthalten muss. Ein Vorteil davon, die codierenden Sequenzen für beide Polypeptide auf einem einzelnen Nucleinsäuremolekül zu haben, ist, dass nur eine Nucleinsäurepräparation benötigt wird, bevor die Nucleinsäure in die Zellen eingeführt wird. Weiterhin ist in einer solchen Ausführungsform ein einzelnes Integrationsereignis für die codierenden Sequenzen beider Polypeptide ausreichend, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass die das erste Polypeptid codierende Nucleinsäure an einem anderen Ort oder mit einer anderen Kopienzahl als diejenige, welche das zweite Polypeptid codiert, integriert wird. In bevorzugten Ausführungsformen können die beiden Polypeptode einen Teil eines multimeren Proteins wie ein Immunglobulin bilden. Das Verfahren ist daher besonders für die Expression von Antikörpern geeignet. Die beiden Promotoren können dieselben oder unterschiedlich sein und können beliebige der vorstehend beschriebenen Promotoren sein. Wenn die Ausführungsform, bei der ein einzelnes Nucleinsäuremolekül sowohl (i) als auch (ii) enthält, verwendet wird, kann die Richtung der beiden Transkriptionseinheiten auf einem einzelnen Nucleinsäuremolekül zum Beispiel bei beiden dieselbe sein oder in entgegengesetzter Richtung zueinander weisend oder in entgegengesetzter Richtung jede nach außen weisend sein. Im letzteren Fall kann die Anti-Repressor-Sequenz zwischen die beiden Promotoren eingebaut werden (vgl. z. B. 11B). Weiterhin können die Anti-Repressor-Sequenzen hinzugefügt werden, so dass eine oder beide Transkriptionseinheiten flankiert werden. Die Markergene müssen jeweils unterschiedlich sein und können zum Beispiel, wie vorstehend beschrieben, aus den Markergenen ausgewählt werden. In bestimmten Ausführungsformen ist ein selektierbarer Marker Zeocin und der andere selektierbare Marker ist zum Beispiel Puromycin. Es wird jedoch klar sein, dass andere Kombinationen verwendet werden können und innerhalb des Umfangs dieses Aspekts der Erfindung liegen. Die Expression der Marker sollte vorzugsweise von der Expression der Polypeptide von Interesse abhängig sein. Dies kann durch Verknüpfung der Expression der Markergene mit der der Polypeptide von Interesse zum Beispiel unter Verwendung von multicistronischen Genen, z. B. mit IRES Sequenzen, etabliert werden, wie vorstehend diskutiert. „Im Wesentlichen gleichzeitig" bedeutet, dass zumindest zu einem Teil der Zeit, vorzugsweise mindestens einen Tag, stärker bevorzugt mindestens zwei Tage, noch stärker bevorzugt mindestens 5 Tage beide Selektionsmittel vorhanden sind, welche dadurch eingebracht werden können, dass beide Selektionsmittel zur selben Zeit zum Kulturmedium hinzugefügt werden oder das Kulturmedium, welches beide Selektionsmittel enthält, hinzugefügt wird (z. B. Beispiel 7). Es wird klar sein, dass die Zugabe eines zweiten Selektionsmittels nach nur wenigen Stunden oder Tagen zum Medium, in dem das erste Selektionsmittel bereits enthalten ist, immer noch zu einer im Wesentlichen simultanen Selektion im Sinne der Erfindung führt. Diese Situation wird von der Situation unterschieden, in der die Zellen erst mit dem ersten Selektionsmittel selektiert werden und sobald sich Kolonien gebildet haben, die Zellen auf einem neuen Medium selektiert werden, zu dem das zweite Selektionsmittel und nicht das erste Selektionsmittel zugegeben wurde (aufeinanderfolgende Selektion, z. B. Beispiel 5 und WO 03/106684 ). Durch die im Wesentlichen gleichzeitige Selektion auf beide selektierbare Marker wird hier überraschend offenbart, dass eine schnelle und starke Selektion bereitgestellt wird, wodurch viele schwach produzierende Clone eliminiert werden, was zu einer stark verminderten Arbeitslast für das Auffinden eines Clons mit wünschenswerten Expressionscharakteristika führt. Dies ist insbesondere für die biotechnologische Industrie vorteilhaft, wo viele, üblicherweise hunderte oder sogar tausende von Kolonien durchmustert werden müssen, bevor ein gewünschter Clon mit hohem Expressionsniveau identifiziert wird.
Die Praxis dieser Erfindung verwendet, wenn nicht anders angegeben, konventionelle Verfahren der Immunologie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, Zellbiologie und DNA-Rekombination, welche innerhalb des Stands der Technik liegen. Vgl. z. B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2te Auflage, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al., Hrsg. 1987, die Serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, Hrsg., 1995, Antibodies: A Laborstory Manual, Harlow und Lane, Hrsg., 1988.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter erklärt. Die Beispiele schränken die Erfindung in keiner Weise ein. Sie dienen lediglich dazu, die Erfindung zu verdeutlichen.
Beispiele
Beispiel 1: Konstruktion der STAR67-Vektoren
Eine neue Anti-Repressor-Sequenz wurde unter Verwendung einer genetischen Durchmusterung, wie in WO 03/004704 beschrieben, isoliert und diese neue Sequenz wurde STAR67 (SEQ. ID. NO. 66) genannt. Die Wirkungen von STAR67 auf die Expression von Transgenen in Säugerzelllinien wurden geprüft. Hier beschreiben wir die Konstruktion der verschiedenen Konstrukte.
Materialien und Verfahren
Drei Plasmide wurden erzeugt (1):

A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-Kontrolle),
B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67),
C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)

Die Konstruktion des Konstrukts A wird nachstehend beschrieben. Das Plasmid pd2EGFP (Clontech 6010-1) wurde durch Insertion eines Linkers an der BsiWI-Stelle modifiziert, um pd2EGFP-link zu erhalten. Der Linker, der durch Anelierung der Oligonucleotide
hergestellt wurde, führte die Stellen für die Restriktionsendonucleasen PacI, BglII und EcoRV ein. Dies erzeugte die multiple Clonierungsstelle MCSII zur Insertion von STAR-Elementen. Dann wurden die Primer
verwendet, um eine Region von 0,37 Kb ausgehend von pd2EGFP zu amplifizieren, welche in die BglII-Stelle von pIRES (Clontech 6028-1) inseriert wurde, um pIRES-stuf zu erhalten. Dies führte die Stellen für die Restriktionsendonucleasen AscI und SwaI bei der MCSI ein und wirkt als ein „Füllfragment", um eine potenzielle Wechselwirkung zwischen STAR-Elementen und angrenzenden Promotoren zu vermeiden. pIRES-stuf wurde mit BglII und FspI gespalten, um ein DNA-Fragment freizusetzen, das aus einem Füllfragment, dem CMV Promotor, dem IRES-Element (flankiert von multiplen Clonierungsstellen MCS A und MCS B) und dem SV40-Polyadenylierungssignal zusammengesetzt ist. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor-Rückgrat von pd2EGFP-link ligiert, das durch Spaltung mit BamHI und StuI hergestellt wurde, um pIRES-link zu erhalten.
Der offene Leserahmen des Zeocin-Resistenzgens wurde in die BamHI/NotI-Stellen stromabwärts von pIRES wie folgt inseriert: der Zeocin-Resistenz-ORF wurde mittels PCR mit den Primern
ausgehend vom Plasmid pCMV/zeo amplifiziert (Invitrogen, Kat.-Nr. V50120), mit BamHI und NotI gespalten und mit BamHI/NotI-gespaltenem pIRES-link ligiert, um pIRES-link-zeo zu erhalten. Der d2EGFP-Reporter-ORF wurde in pIRES-link-zeo durch Amplifizierung von pd2EGFP (Clontech 6010-1) mit den Primern
und Insertion der mit EcoRI gespaltenen d2EGFP-Kassette in die EcoRI-Stelle im pIRES-link-zeo-Plasmid eingeführt. Dies erzeugte das Konstrukt A, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo (CMV Kontrolle).
STAR67 wurde stromaufwärts des CMV-Promotors in die AscI-Stelle (etwa 15 Nt. verbleibend zwischen STAR67 und dem Promotor) cloniert. Dies erzeugte Konstrukt B, STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).
STAR67 wurde auch im Kontext einer Kassette geprüft, die auch STAR7 (SEQ. ID. NO. 7) enthält, welches gerichtet in die 5'-SalI- und XbaI-Stellen und 3'-BglII- und PacI-Stellen cloniert wurde, um die gesamte Kassette mit STAR7 zu flankieren. Dies ist Konstrukt C (CMV-STAR67 7/7).
Beispiel 2: STAR67 verstärkt das Expressionsniveau von CMV-, EF1α- und UB6-Promotoren in stabil transfizierten CHO-Zellen.
Wir haben geprüft, ob die Anwesenheit von STAR67, angrenzend an die CMV-, EF1α- und UB6-Promotoren, das Expressionsniveau dieser Promotoren in CHO-Zellen beeinflusst. Die in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukte A und B (1), welche für die jeweiligen Promotoren modifiziert wurden, werden zu diesem Zweck verwendet:

1 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-Kontrolle)
2 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)
3 EF1α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1α-Kontrolle)
4 STAR67-EF1α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1α-STAR67)
5 UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-Kontrolle)
6 STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67).

Materialien und Verfahren
Der CMV-Promotor wurde in den in 1 beschriebenen Plasmiden gegen die UB6- und EF1α-Promotoren ausgetauscht. Der UB6-Promotor wurde wie folgt cloniert. Eine 0,37 Kb-Füll-DNA aus dem pd2EGFP-Plasmid wurde unter Verwendung von Primern, die durch die SEQ. ID. NOs. 69 und 70 identifiziert werden, durch PCR amplifiziert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die entstehende Füll-DNA wurde in die BglII-Stelle von pUB6/V5-His [Invitrogen V250-20] cloniert, wodurch pUB6-stuf erzeugt wurde. Von pUB6-stuf wurde ein AscI-SacI-Fragment in CMV-d2EGFP-IRES-Zeo cloniert, von dem der CMV-Promotor entfernt wurde.
Der EF1α-Promotor wurde durch PCR mit pEF1α/V5-His [Invitrogen V920-20] als Matrize amplifiziert unter Verwendung der Primer
Das PCR-Fragment wurde in die AscI- und PpuMI-Stellen von CMV-d2EGFP-IRES-Zeo cloniert, von dem der CMV-Promotor entfernt wurde.
Die Chinesische Hamster-Ovarzelllinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wurde in HAMS-F12-Medium + 10% fötales Kälberserum, enthaltend 2 mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 Mikrogramm/ml Streptomycin bei 37°C/5% CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden mit den Plasmiden unter Verwendung von SuperFect (QIAGEN), wie durch den Hersteller beschrieben, transfiziert. In Kürze beschrieben, wurden die Zellen in Kulturgefäße eingesät und über Nacht bis 70–90% Konfluenz wachsen gelassen. Das Superfect-Reagenz wurde mit Plasmid-DNA in einem Verhältnis von 6 Mikrolitern pro Mikrogramm vereinigt (z. B. für eine 10 cm-Petrischale 20 Mikrogramm DNA und 120 Mikroliter SuperFect) und zu den Zellen hinzugegeben. Nach Inkubation über Nacht wurde das Transfektionsgemisch durch frisches Medium ersetzt und die transfizierten Zellen wurden weiter inkubiert. Nach Züchtung über Nacht wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in frische Kulturgefäße mit frischem Medium gesät. Nach einer weiteren Inkubation über Nacht wurde Zeocin in einer Konzentration von 50 μg/ml hinzugefügt und die Zellen wurden weiter gezüchtet. Nach weiteren drei Tagen wurde das Medium durch frisches, Zeocin (100 μg/ml) enthaltendes Medium ersetzt und weiter gezüchtet. Wenn einzelne Kolonien sichtbar wurden (etwa zehn Tage nach der Transfektion), wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium ohne Zeocin ersetzt. Einzelne Clone wurden isoliert und in Medium ohne Zeocin in Platten mit 24-Vertiefungen übertragen. Ein Tag nach der Isolierung der Kolonien wurde Zeocin zum Medium hinzugefügt. Die Expression des d2EGFP-Reportergens wurde etwa 3 Wochen nach der Transfektion beurteilt. Das d2EGFP-Expressionsniveau in den Kolonien wurde nach Zeitspannen von 2 Wochen gemessen. Nach den anfänglichen zwei Wochen nach der Transfektion, wenn die ersten d2EGFP-Messungen durchgeführt wurden, wurden die Kolonien in Medium ohne Zeocin oder andere Antibiotika gezüchtet. Dies wurde für den Rest des Experiments weitergeführt.
Ergebnisse
2 zeigt, dass die Transfektion des Konstrukts, das STAR67 enthält, welches stromaufwärts des CMV-Promotors cloniert wurde, zu einer Anzahl von CHO-Kolonien führte, welche im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne STAR67, CMV-Kontrolle, signifikant höhere Spiegel des d2EGFP-Proteins exprimieren. Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 10 Kolonien, die mit CMV-Kontrollplasmid transfiziert wurden, war bei Messung 25 Tage nach der Transfektion 34. 60 Tage nach der Transfektion verringerte sich der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in diesen 10 Kolonien auf 13, was zeigt, dass die Expression im Verlauf der Zeit nicht stabil ist. Im Vergleich war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 10 Kolonien, die mit dem STAR67-CMV-Plasmid transfiziert wurden, bei Messung nach 25 Tagen 42 und gemessen 60 Tage nach Transfektion 32. Daher vermittelte ein STAR67-umfassendes CMV-Konstrukt 60 Tage nach Transfektion ein um den Faktor 2,5 höheres, durch den CMV-Promotor gesteuertes Expressionsniveau des Reporterproteins in stabil transfizierten Clonen. Wichtig ist, dass 25 Tage nach der Transfektion nach der ersten Messung durch Züchtung der Kolonien in Medium ohne Zeocin der Selektionsdruck entfernt wurde. Daher sind Kolonien, die das STAR67-Konstrukt enthalten, im Laufe der Zeit stabiler in Abwesenheit des Selektionsdrucks als Kolonien, die kein STAR67-Konstrukt enthalten.
3 zeigt, dass die Transfektion des Konstrukts, das STAR67 enthält, welches stromaufwärts des EF1α-Promotors cloniert wurde, zu einer Anzahl von CHO-Kolonien führt, welche im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne STAR67, EF1α-Kontrolle, signifikant höhere Spiegel des d2EGFP-Proteins exprimieren. Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 10 Kolonien, die mit dem EF1α-Kontrollplasmid transfiziert wurden, war bei Messung 25 Tage nach der Transfektion 31. 60 Tage nach der Transfektion war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in diesen 10 Kolonien 26. Im Vergleich dazu war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 10 Kolonien, die mit dem EF1α-STAR67-Plasmid transfiziert wurden, bei Messung nach 25 Tagen 60 und gemessen 60 Tage nach Transfektion 76. Daher vermittelte ein STAR67-umfassendes EF1α-Konstrukt nach 25 und 60 Tagen nach der Transfektion ein um den Faktor 2,9 höheres, durch den EF1α-Promotor gesteuertes Expressionsniveau des Reporterproteins in stabil transfizierten Clonen.
4 zeigt, dass die Transfektion des Konstrukts, das STAR67 enthält, welches stromaufwärts des UB6-Promotors cloniert wurde, zu einer Anzahl von CHO-Kolonien führte, welche im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne STAR67, UB6-Kontrolle, signifikant höhere Spiegel des d2EGFP-Proteins exprimieren. Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 10 Kolonien, die mit dem UB6-Kontrollplasmid transfiziert wurden, war bei Messung 25 Tage nach der Transfektion 51. 60 Tage nach der Transfektion war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in diesen 10 Kolonien 29, was zeigt, dass die Expression im Verlauf der Zeit nicht stabil war. Im Vergleich war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 10 Kolonien, die mit dem UB6-STAR67-Plasmid transfiziert wurden, bei Messung nach 25 Tagen 218 und gemessen 60 Tage nach Transfektion 224. Daher vermittelte ein STAR67-umfassendes UB6-Konstrukt 25 Tage nach Transfektion ein um den Faktor 4,3 höheres durch den UB6-Promotor gesteuertes Expressionsniveau des Reporterproteins in stabil transfizierten Clonen. Nach 60 Tagen war dieser Faktor aufgrund von Instabilität der Expression in den Kontrollkolonien und Stabilität in den UB6-STAR67-Kolonien 7,7. Wichtig ist, dass 25 Tage nach der Transfektion durch Züchtung der Kolonien in Medium ohne Zeocin nach der ersten Messung der Selektionsdruck entfernt wurde. Daher sind Kolonien, die das STAR67-Konstrukt enthalten, im Verlauf der Zeit in Abwesenheit des Selektionsdrucks stabiler als Kolonien, die kein STAR67-Konstrukt enthalten.
Schlussendlich erhöht STAR67 die Expression ausgehend von drei verschiedenen nicht verwandten Promotoren.
Beispiel 3: STAR67 erhöht das Expressionsniveau ausgehend von CMV-, EF1α- und UB6-Promotoren in stabil transfizierten PER-C6-Zellen.
Wir prüften, ob die Anwesenheit von STAR67 angrenzend an die CMV-, EF1α- und UB6-Promotoren das Expressionsniveau dieser Promotoren in einem anderen Zelltyp als CHO-Zellen, nämlich den menschlichen PER.C6-Zellen, beeinflusst. Dieselben Konstrukte wie in Beispiel 1 wurden verwendet.
Materialien und Verfahren
Transfektion, Züchtung und Analyse von PER.C6-Zellen
PER.C6^®-Zellen wurden in DMEM-Medium + Pyridoxin + 9% fötales Kälberserum (nicht hitzeinaktiviert), 8,9 mM MgCl₂, 100 E/ml Penicillin und 100 Mikrogramm/ml Streptomycin bei 37°C/10% CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden mit den Plasmiden unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) transfiziert, wie vom Hersteller beschrieben. In Kürze beschrieben, wurden die Zellen in Schalen mit 6 Vertiefungen gesät und über Nacht zu 70–90% Konfluenz gezüchtet. Das Lipofectaminreagenz wurde mit Plasmid-DNA in einem Verhältnis von 15 Mikroliter pro 3 Mikrogramm vereinigt (z. B. für eine Petrischale von 10 cm 20 Mikrogramm DNA und 120 Mikroliter Lipofectamin) und nach 30 Minuten der Inkubation bei 25°C zu den Zellen hinzugefügt. Nach einer Inkubation für 6 Stunden wurde das Transfektionsgemisch durch frisches Medium ersetzt und die transfizierten Zellen wurden weiter inkubiert. Nach Züchtung über Nacht wurden die Zellen trypsiniert und in frische Petrischalen (90 mm) mit frischem Medium mit Zeocin, das in einer Konzentration von 100 μg/ml hinzugefügt wurde, ausgesät (Verdünnungen 1:15, 1:30, 1:60, 1:120) und die Zellen wurden weiter gezüchtet. Sobald Kolonien sichtbar wurden, wurden einzelne Clone durch Abschaben isoliert und in Platten mit 24 Vertiefungen in Medium mit Zeocin überführt. Wenn sie zu ~70% Konfluenz gewachsen waren, wurden die Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen überführt. Stabile Kolonien wurden für 2 Wochen in Platten mit 6 Vertiefungen expandiert, bevor das d2EGFP-Signal auf einem XL-MCL Beckman-Coulter-Durchflusscytometer bestimmt wurde. Der Mittelwert des d2EGFP-Signals wurde als Maß für das Expressionsniveau von d2EGFP genommen. Die Kolonien wurde ein zweites Mal nach 2 Wochen gemessen. Danach wurden die Kolonien in Abwesenheit von Zeocin weiter gezüchtet.
Ergebnisse
5 zeigt, dass die Transfektion des Konstrukts, das STAR67 enthält, welches stromaufwärts des CMV-Promotors cloniert wurde, zu einer Anzahl von PER.C6-Kolonien führte, welche im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne STAR67, CMV-Kontrolle, signifikant höhere Spiegel des d2EGFP-Proteins exprimieren. Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 10 Kolonien, die mit CMV-Kontrollplasmid transfiziert wurden, war bei Messung 30 Tage nach der Transfektion 37. 60 Tage nach der Transfektion war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in diesen 10 Kolonien auf 14 reduziert, was zeigt, dass die Expression im Verlauf der Zeit nicht stabil war. Im Vergleich war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 10 Kolonien, die mit dem STAR67-CMV-Plasmid transfiziert wurden, bei Messung nach 30 Tagen 101 und gemessen 60 Tage nach Transfektion 45. Daher vermittelte ein STAR67-umfassendes CMV-Konstrukt 60 Tage nach Transfektion ein um den Faktor 3,2 höheres, durch den CMV-Promotor gesteuertes Expressionsniveau des Reporterproteins in stabil transfizierten Clonen.
6 zeigt, dass die Transfektion des Konstrukts, das STAR67 enthält, welches stromaufwärts des EF1α-Promotors cloniert wurde, zu einer Anzahl von PER.C6-Kolonien führte, welche im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne STAR67, EF1α-Kontrolle, signifikant höhere Spiegel des d2EGFP-Proteins exprimieren. Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 10 Kolonien, die mit dem EF1α-Kontrollplasmid transfiziert wurden, war bei Messung 30 Tage nach der Transfektion 5. 60 Tage nach der Transfektion war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in diesen 10 Kolonien 6. Im Vergleich war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 10 Kolonien, die mit dem EF1α-STAR67-Plasmid transfiziert wurden, bei Messung nach 30 Tagen 25 und gemessen 60 Tage nach Transfektion 20. Daher vermittelte ein STAR67-umfassendes EF1α-Konstrukt sowohl 30 als auch 60 Tage nach Transfektion ein um den Faktor 4 höheres, durch den EF1α-Promotor gesteuertes Expressionsniveau des Reporterproteins in stabil transfizierten Clonen.
7 zeigt, dass die Transfektion des Konstrukts, das STAR67 enthält, welches stromaufwärts des UB6-Promotors cloniert wurde, zu einer Anzahl von PER.C6-Kolonien führte, welche im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne STAR67, UB6-Kontrolle, signifikant höhere Spiegel des d2EGFP-Proteins exprimieren. Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 10 Kolonien, die mit UB6-Kontrollplasmid transfiziert wurden, war bei Messung 30 Tage nach der Transfektion 4. 60 Tage nach der Transfektion war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in diesen 10 Kolonien 2. Im Vergleich war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 10 Kolonien, die mit dem UB6-STAR67-Plasmid transfiziert wurden, bei Messung nach 30 Tagen 27 und gemessen 60 Tage nach Transfektion 18. Daher vermittelte ein STAR67-umfassendes UB6-Konstrukt sowohl nach 30 als auch 60 Tage nach Transfektion ein um den Faktor 7 bis 9 höheres, durch den UB6-Promotor gesteuertes Expressionsniveau des Reporterproteins in stabil transfizierten Clonen.
Daher führt das Einbauen von STAR67 stromaufwärts des Promotors zu einem signifikant höherem Proteinexpressionsniveau im Vergleich zu Konstrukten ohne STAR67, auch in PER.C6-Zellen. Daher funktioniert STAR67 in verschiedenen, nicht verwandten Zelltypen.
Beispiel 4: Neue Konfiguration von STAR67 kombiniert mit anderen Anti-Repressor-Elementen zur Verstärkung des SV40-Promotors in CHO-Zellen.
Wir prüften, ob die Anwesenheit von STAR67 angrenzend an den SV40-Promotor das Expressionsniveau dieses Promotors entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Anti-Repressor-Element, in diesem Beispiel STAR7, beeinflusst. Die Konstrukte, die zu diesem Zweck verwendet wurden (vgl. 8), sind:

1 SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-Kontrolle)
2 STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67)
3 STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7)
4 STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7).

Materialien und Verfahren
Der SV40-Promotor wurde durch PCR mit pIRES als Matrize unter Verwendung der Primer
Das PCR-Fragment wurde in die AscI- und SacI-Stellen von CMV-d2EGFP-IRES-Zeo cloniert, von dem der CMV-Promotor entfernt wurde.
CHO-Zellen wurden transfiziert, Kolonien wurden isoliert und propagiert und analysiert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Ergebnisse
8 zeigt, dass die Transfektion des Konstrukts, das entweder STAR67, welches stromaufwärts des SV40-Promotors cloniert wurde (SV40-STAR67), oder STAR 7, welches cloniert wurde, um das gesamte Konstrukt zu flankieren (SV40-STAR7/7), enthält, nicht zu CHO-Kolonien führte, die im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne Anti-Repressor-Elemente (SV40-Kontrolle) signifikant höhere Spiegel des d2EGFP-Proteins exprimieren. Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 18 Kolonien, die mit SV40-Kontrollplasmid transfiziert waren, war bei Messung 40 Tage nach der Transfektion 86. Im Vergleich dazu war der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 18 Kolonien, die mit dem SV40-STAR67-Plasmid transfiziert waren, bei Messung nach 40 Tagen 82 und der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 18 Kolonien, die mit dem SV40-STAR7/7-Plasmid transfiziert waren, bei Messung nach 40 Tagen 91. Daher wurde keine signifikante Wirkung dieser Anti-Repressor-Elemente auf den SV40-Promotor in CHO-Zellen beobachtet.
Es scheint, dass die Expressionsspiegel ausgehend vom SV40-Promotor in diesen Zellen bereits ziemlich hoch sind und sogar viel höher als jene, die mit dem CMV-Promotor beobachtet wurden, welcher als ein sehr starker Promotor angesehen wurde. Diese hohe Hintergrund-Expression in Abwesenheit eines Anti-Repressor-Elements unter Verwendung des SV40-Promoters in CHO-Zellen kann erklären, warum keine signifikante Wirkung von STAR67 alleine oder von das Transgen flankierendem STAR7 beobachtet wurde.
Das durchschnittliche d2EGFP-Signal in den 18 Kolonien, die mit SV40-STAR67 7/7-Plasmid transfiziert wurden, war jedoch bei Messung bei 40 Tage-Kolonien 209, was um den Faktor 2,4 höher ist, als der Durchschnitt der 18 Kontrollkolonien (86). Daher führte, wenn das STAR67-Element in Kombination mit anderen Anti-Repressor-Elementen verwendet wurde, dies zu einer Anzahl von stabil transfizierten CHO-Kolonien, die signifikant höhere d2EGFP-Expressionsspiegel zeigen.
Daher scheinen die STAR-Elemente in dieser neuen Konfiguration (5'-STAR-Sequenz A – STAR-Sequenz C – Promotor – eine ein Protein von Interesse codierende Nucleinsäure – STAR-Sequenz B – 3', wobei im vorliegenden Beispiel die STAR-Sequenzen A und B STAR 7 und die STAR-Sequenz C STAR67 sind) sogar besser zu funktionieren, als in bislang offenbarten Konfigurationen.
Wir haben Experimente durchgeführt, in denen die flankierenden STAR7-Elemente durch flankierende STAR6-Elemente (SEQ. ID: NO.6) oder durch flankierende STAR4-Elemente (SEQ. ID: NO.4) in Kombination mit STAR67 stromaufwärts des SV40-Promotors (SV40-STAR67 6/6 beziehungsweise SV40-STAR67 4/4, unter Anwendung derselben Nomenklatur wie vorstehend) ersetzt wurden, und beobachteten eine verbesserte Expression auch mit diesen Kombinationen. Dies beweist, dass die flankierenden STAR7-Elemente gegen andere STAR-Sequenzen ausgetauscht werden können und die Verbesserung der neuen Konfiguration der Expressionskassette mit den STAR-Sequenzen immer noch beobachtet wird.
Beispiel 5: Eine Kombination von STAR67 und STAR7 verstärkt das durch UB6 gesteuerte Antikörperexpressionsniveau in stabil transfizierten CHO-Zellen.
In Beispiel 4 zeigten wir, dass die Kombination von STAR67 und STAR7 das Expressionsniveau des d2EGFP-Proteins in CHO-Zellen verstärkte. Hier prüften wir, ob die Kombination von STAR67 und STAR7 für die Produktion eines Antikörpers verwendet werden kann. Wir wählten einen Antikörper gegen das EpCAM-Molekül (Huls et al., 1999) als Testprotein und verwendeten den UB6-Promotor.
Materialien und Verfahren
Plasmide
Die schwere-Ketten-cDNA (HC-EpCAM) wurde in einem Konstrukt, das den UB6-Promotor umfasste, cloniert. Das HC-EpCAM wurde mittels einer IRES-Sequenz an das Zeocin-Resistenzgen gekoppelt. Die leichte-Ketten-cDNA (LC-EpCAM) wurde auch in einem Konstrukt, das den UB6-Promotor umfasste, cloniert. Das LC-EpCAM wurde durch eine IRES-Sequenz an das Puromycin-Resistenzgen gekoppelt. Zusammen stellen diese beiden Plasmide die UB6 (HC+LC)-Kontrolle dar (9).
Um die Wirkungen von STAR67 und STAR7 zu prüfen, wurde STAR67 in beide HC+LC-Konstrukte stromaufwärts des UB6-Promotors cloniert. STAR7 wurde cloniert, um die gesamten Kassetten sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende zu flankieren (9). Diese beiden Plasmide repräsentieren STAR7-STAR67-UB6 (HC + LC) STAR7.
Transfektion und Züchtung von CHO-Zellen
Die Chinesische Hamster-Ovarzelllinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wurde transfiziert und wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Zeocin (100 μg/ml) und Puromycin (2,5 μg/ml) für die Selektion gezüchtet. Einen Tag nach der Transfektion wurde Zeocin zum Kulturmedium hinzugefügt. Als die ersten Kolonien sichtbar wurden (etwa 7 Tage nach der Zugabe von Zeocin) wurde das Kulturmedium entfernt und durch Puromycin enthaltendes Kulturmedium ersetzt. Nach etwa 7 Tagen wurden Kolonien isoliert und auf Platten mit 24 Vertiefungen in Medium nur mit Zeocin überführt.
Ergebnisse
9 zeigt, dass die Transfektion von Antikörperkonstrukten, welche STAR67, das stromaufwärts des UB6-Promotors cloniert wurde, und zwei STAR7-Elemente, die so cloniert wurden, dass sie die gesamten Kassetten flankieren, enthalten, zu einer Anzahl von CHO-Kolonien führte, welche signifikant höhere Spiegel des EpCAM-Antikörpers exprimieren (gemessen mittels ELISA unter Verwendung eines Anti-Mensch-IgG-Antikörpers im Vergleich zur „leeren" Kontrolle ohne STAR67 und STAR7, UB6 (HC+LC)-Kontrolle. Der Durchschnitt der EpCAM-Produktion in den 18 Kolonien, die mit dem UB6 (HC+LC)-Kontrollplasmid transfiziert wurden, war bei Messung 25 Tage nach der Transfektion 2,7 pg/Zelle/Tag. Die Selektionsmittel Zeocin und Puromycin wurden nach 25 Tagen entfernt. 45 Tage nach der Transfektion war die durchschnittliche EpCAM-Produktion in diesen 18 Kolonien 2,7 pg/Zelle/Tag. Im Vergleich dazu war das durchschnittliche EpCAM-Produktionssignal in den 18 Kolonien, die mit STAR7-STAR67-UB6(HC+LC)-STAR7-Plasmid transfiziert wurden, bei Messung nach 25 Tagen 6,7 und bei Messung 45 Tage nach Transfektion 7,7 pg/Zelle/Tag. Daher führte sowohl nach 30 als auch nach 45 Tagen nach der Transfektion ein STAR67/STAR7-umfassendes UB6-Konstrukt zu einem um den Faktor 2,5 bis 2,9-fach höheren, durch den UB6-Promotor gesteuerten EpCAM-Expressionsniveau in stabil transfizierten CHO-Clonen.
Daher führte das Einbauen von STAR67 stromaufwärts des Promotors und von zwei die Kassetten flankierenden STAR7-Elementen zu einem signifikant höheren EpCAM-Antikörper-Expressionsniveau in CHO-Zellen im Vergleich zu Konstrukten ohne STAR67/STAR7.
Beispiel 6: STAR67 ist kein Enhancer-Blocker, während dies bei STAR6 und STAR7 der Fall ist.
Alle bislang bekannten STAR-Elemente, die auf diese Eigenschaft geprüft wurden, einschließlich STAR6 und STAR7, sind Enhancer-Blocker ( WO 03/004704 , Kwaks et al., 2003). Die Enhancer-Blocker-Aktivität wird geprüft, indem ein STAR-Element zwischen einen starken Enhancer und einen Promotor platziert wird. Hier prüften wir, ob auch STAR67 ein Enhancer-Blocker ist.
Materialien und Verfahren
Das d2EGFP-Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer
amplifiziert und in das Plasmid pGL3-Promotor (Promega) unter Verwendung der NcoI- und XbaI-Restriktionsstellen cloniert, um das Luciferasegen zu ersetzen, um das Plasmid pGL3-Promotor-GFP zu erzeugen. Ein Linker (erzeugt durch Anelierung der Oligos
wurde in die SacI- und BglII-Stellen cloniert, um multiple Clonierungsstellen zu schaffen. Die ursprüngliche BglII-Stelle wurde durch die Ligierung mit dem Linker zerstört, wodurch eine neue einzigartige BglII-Stelle innerhalb der Linker-DNA geschaffen wird. Der SV40-Enhancer wurde unter Verwendung von BsaBI und BamHI aus dem Plasmid pGL3-basic (Promega) geschnitten und unter Verwendung der EcoRV- und BglII-Stellen in pGL3-Linker-Promotor-GFP cloniert, wodurch das Plasmid pGL3-Enhancer-Promotor-GFP erzeugt wurde. Das STAR40-Element (SEQ. ID. NO. 40) wurde stromaufwärts des SV40-Enhancers unter Verwendung der KpnI- und SacI-Stellen eingebaut, um die Wirkung des Enhancers auf stromaufwärts liegende Sequenzen zu verhindern. Schließlich wurden die Anti-Repressor-Elemente STAR6, STAR7 und STAR67 unter Verwendung der SpeI- und AscI-Restriktionsstellen zwischen dem SV40-Enhancer und dem SV40-Minimalpromotor eingebaut.
Transfektion und Kultur von CHO-Zellen
Die Chinesische Hamster-Ovarzelllinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wird wie in Beispiel 2 transfiziert. Ein Tag nach der Transfektion wurden die d2EGFP-Spiegel auf einem Epics XL-Durchflusscytometer (Beckmann Coulter) gemessen.
Ergebnisse
10 zeigt, dass STAR67 kein Enhancer-Blocker ist, während STAR6 und STAR7 in demselben Test als Enhancer-Blocker wirken. STAR6, STAR7 und STAR67 wurden zwischen den SV40-Enhancer und einen minimalen SV40-Promotor stromaufwärts des d2EGFP-Gens cloniert. Wenn kein STAR-Element zwischen den Enhancer und den Promotor cloniert wurde, trat eine starke transkriptionelle Aktivierung auf (willkürlich auf 100% gesetzt). Wenn STAR6 oder STAR7 zwischen dem Enhancer und dem Promotor eingebaut wurde, fiel die Transkription auf Hintergrundniveau ab, was darauf hinweist, dass STAR6 und STAR7 potente Enhancer-Blocker sind. Im Gegensatz dazu war das relative Transkriptionsniveau immer noch bei 80% der Kontrolle, wenn STAR67 zwischen den Enhancer und den Promotor cloniert wurde, was darauf hinweist, dass STAR67 kein guter Enhancer-Blocker ist; dies steht im Gegensatz zu STAR6 und STAR7 sowie zu anderen Anti-Repressor-Elementen, wie zuvor beschrieben ( WO 03/004704 , Kwaks et al., 2003).
Beispiel 7: STAR67 verstärkt das UB6- und CMV-gesteuerte Antikörper-Expressionsniveau in stabil transfizierten CHO-Zellen.
In Beispiel 5 zeigten wir, dass die Kombination von STAR67 und STAR7 das Expressionsniveau des EpCAM-Antikörpers in CHO-Zellen im Kontext mit zwei verschiedenen Plasmiden verstärkte, welche die schwere und die leichte Kette enthielten. In diesem Beispiel prüften wir, ob STAR67 für die Herstellung von EpCAM-Antikörpern verwendet werden kann, wenn beide, schwere und leichte Kette, in ein Plasmid eingebaut werden. Wir wendeten die gleichzeitige Selektion für jeden selektierbaren Marker an.
Materialien und Verfahren
Plasmide
Die schwere-Ketten-cDNA (HC-EpCMA) steht unter der Kontrolle des UB6-Promotors und ist durch eine IRES-Sequenz an das Zeocin-Resistenzgen gekoppelt. Die leichte-Ketten-cDNA (LC-EpCAM) steht unter der Kontrolle des CMV-Promotors und ist durch eine IRES-Sequenz an das Puromycin-Resistenzgen gekoppelt. Im Prinzip gibt es Konstrukte, die in Beispiel 5 verwendet werden. Diese beiden Expressionskassetten wurden in einer solchen Art und Weise auf einem Plasmid eingebaut, dass die Transkription der beiden Expressionseinheiten gegenläufige Richtungen hatten. Im Kontrollplasmid waren die UB6- und CMV-Promotoren durch ein Stuffer-Fragment von 500 Bp getrennt (EpCAM-Kontrolle) (10). In einem anderen Plasmid war STAR67 zwischen den UB6- und den CMV-Promotor eingebaut (EpCAM STAR67) (10).
Transfektion und Züchtung von CHO-Zellen
Die Chinesische Hamster-Ovarzellinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wurde transfiziert und wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Zeocin (100 μg/ml) und Puromycin (2,5 μg/ml) für die Selektion gezüchtet. In Beispiel 5 wurde die nachfolgende Selektion für beide Selektionsmarker verwendet. Im Gegensatz dazu waren hier beide Selektionsmittel im Kulturmedium gleichzeitig vorhanden. Einen Tag nach der Transfektion wurden Zeocin und Puromycin zum Kulturmedium hinzugefügt. Das Selektionsmedium war vorhanden, bis die Kolonien isoliert wurden (etwa 14 Tage nach der Transfektion). Nachdem die Kolonien isoliert und in Platten mit 24 Vertiefungen überführt wurden, wurden die Zellen in Gegenwart von Zeocin und Puromycin gezüchtet.
Ergebnisse
11 zeigt, dass die Transfektion des Antikörperkonstrukts, welches STAR67 enthält, das zwischen den UB6- und CMV-Promotor cloniert war, zu einer Anzahl von CHO-Kolonien führte, die EpCAM-Antikörper exprimieren (gemessen durch ELISA unter Verwendung eines Anti-Mensch-IgG-Antikörpers). Der Durchschnitt der EpCAM-Produktion in den 19 Kolonien, die mit dem EpCAM-STAR67-Plasmid transfiziert wurden, war bei Messung 25 Tage nach der Transfektion 9,8 pg/Zelle/Tag.
Im Gegensatz dazu überlebten überraschenderweise keine Kolonien die Transfektion mit dem EpCAM-Kontrollplasmid. Wenn die Selektion mit entweder Zeocin oder Puromycin alleine durchgeführt wurde, überlebten die EpCAM-Kontrollkolonien. Wenn der Selektionsdruck jedoch durch Ausübung des Selektionsdrucks sowohl auf die schwere als auch auf die leichte Kette erhöht wurde, erlaubten diese Bedingungen nur denjenigen Kolonien zu überleben, bei denen ein STAR67 im transfizierten Plasmid vorhanden war.
Die Ergebnisse zeigen auch, dass der Einbau von STAR67 eine vorteilhafte Wirkung auf zwei Promotoren, den UB6- und CMV-Promotor, hat, die stromaufwärts und stromabwärts eines STAR67-Elements eingebaut wurden. Dies zeigt, dass STAR67 in einer bidirektionalen Art und Weise funktionieren kann.
Der Unterschied zwischen der EpCAM-Kontrolle und dem EpCAM-STAR67-Plasmid ist schwarz-weiß in dem Sinne, dass nur die Transfektion von EpCAM-STAR67 zur Etablierung von Kolonien führt, wenn der Selektionsdruck hoch ist. Dies eröffnet eine Gelegenheit, diese Plasmidkonfiguration zur Identifizierung der Region in STAR67 zu verwenden, die für die Vermittlung dieser Wirkung verantwortlich ist. Kleinere, überlappende Anteile von STAR67 werden zwischen den UB6- und CMV-Promotor eingebaut, die das EpCAM-Molekül steuern. Wenn ein Anteil von STAR67 funktionell ist, überleben Kolonien, wenn sowohl Zeocin als auch Puromycin gleichzeitig als Selektionsmittel verwendet werden. Wenn ein Anteil von STAR67 nicht funktionell ist, überleben keine Kolonien unter identischen Selektionsbedingungen.
Daher führte das Einbauen von STAR67 stromaufwärts des Promotors zu einem signifikant höheren EpCAM-Antikörper-Expressionsniveau in CHO-Zellen im Vergleich zu Konstrukten, denen solche Anti-Repressor-Elemente fehlen.
Ein ähnliches Experiment wird mit dem SV40-Promotor durchgeführt, um die Expression der schweren und leichten Ketten des Anti-EpCAM-Antikörpers anzusteuern. In anderen Experimenten wird STAR67 gegen andere STAR-Sequenzen ausgetauscht. In weiteren Experimenten wird die Orientierung der beiden Expressionseinheiten, welche die schweren und leichten Ketten codieren, so ausgetauscht, dass beide in derselben Richtung liegen. In einem anderen Experiment werden die Expressionseinheiten für die schweren beziehungsweise leichten Ketten auf verschiedene Nucleinsäuremoleküle eingebaut (wie in Beispiel 5) und die entstehenden Clone werden gleichzeitig für beide selektierbare Marker ausgewählt. In einem anderen Experiment wird der Typ der Wirtszelle variiert. Kombinationen dieser Variationen werden vorgenommen.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Schematisches Diagramm der Erfindung.

A) Bicistronisches Gen, das (von 5' nach 3') ein Transgen (codierend zum Beispiel das d2EGFP-Gen), eine IRES und einen selektierbaren Marker (zeo, vermittelt eine Zeocin-Resistenz) unter Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Die Expressionseinheit hat den transkriptionellen Terminator von SV40 an seinem 3'-Ende (t). Der Name des Konstrukts ist CMV d2EGFP-ires-Zeo (CMV-Kontrolle).
B) Konstrukt wie in A, aber nun ist STAR67 stromaufwärts des CMV-Promotors cloniert. Der Name des Konstrukts ist STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV STAR67).
C) Konstrukt wie in B, aber stromaufwärts und stromabwärts liegende STAR7-Elemente werden so cloniert, dass das gesamte Konstrukt flankiert wird. Der Name des Konstrukts ist STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7).

2. STAR67 verbessert die von CMV gesteuerte d2EGFP-Expression in CHO-Zellen.
Der Mittelwert des d2EGFP-Signals für 10 unabhängige, stabile Kolonien wird für die angegebenen Konstrukte in CHO-Zellen aufgetragen. A) CMV Kontrolle; B) STAR67-CMV. X(10): durchschnittliches d2EGFP-Expressionsniveau der 10 Kolonien. Für Details vgl. Beispiel 2.
3. STAR67 verbessert die von EF1α gesteuerte d2EGFP-Expression in CHO-Zellen.
Wie in 2, aber nun mit dem EF1α-Promotor. A) EF1α-Kontrolle; B) STAR67-EF1α.
4. STAR67 verbessert die von UB6 gesteuerte d2EGFP-Expression in CHO-Zellen.
Wie in 2 und 3, aber nun mit dem UB6-Promotor. A) UB6-Kontrolle; B) STAR67-UB6.
5. STAR67 verbessert die von CMV gesteuerte d2EGFP-Expression in PER.C6-Zellen.
Wie in 2, aber nun in PER.C6-Zellen. A) CMV-Kontrolle; B) STAR67-CMV.
6. STAR67 verbessert die von EF1α gesteuerte d2EGFP-Expression in PER.C6-Zellen.
Wie in 3, aber nun mit dem PER.C6-Zellen. A) EF1α-Kontrolle; B) STAR67-EF1α.
7. STAR67 verbessert die von UB6 gesteuerte d2EGFP-Expression in PER.C6-Zellen.
Wie in 4, aber nun in PER.C6-Zellen. A) UB6-Kontrolle; B) STAR67-UB6.
8. STAR67 verbessert die von SV40 gesteuerte d2EGFP-Expression in CHO-K1-Zellen in Kombination mit einem anderen STAR-Element. Ähnlich wie in 2, aber nun unter Verwendung des SV40-Promotors in CHO-Zellen und der angegebenen Konstrukte. Der Mittelwert des d2EGFP-Signals wird für 18–20 unabhängige, stabile Kolonien 60 Tage nach der Transfektion aufgetragen. A) SV40-Kontrolle, SV40-STAR67, SV40-STAR7/7; B) SV40-Kontrolle und SV40-STAR67 7/7. Für Details vgl. Beispiel 4.
9. STAR67 verbessert das von UB6 gesteuerte Expressionsniveau des EpCAM-Antikörpers in CHO-K1-Zellen. Für Details vgl. Beispiel 5. A) Konstrukte ohne STAR-Elemente; B) Konstrukte mit STAR67 stromaufwärts des Promotors und die STAR7-Elemente flankierend. Die Anti-EpCAM-Antikörper-Konzentration wird als pg/Zelle/Tag dargestellt. X(18): durchschnittliches Produktionsniveau der 18 Kolonien.
10. STAR67 ist kein Enhancer-Blocker, während es bei STAR 6 und 7 der Fall ist. Für Details vgl. Beispiel 6.
11. STAR67 verstärkt das von UB6 und CMV gesteuerte Antikörper-Expressionsniveau in stabil transfizierten CHO-Zellen. Für Details vgl. Beispiel 7. A) einzelnes DNA-Molekül mit der schweren Kette (HC) und der leichten Kette (LC) von Anti-EpCAM, jede hinter einem Promotor und jede an ein unterschiedliches selektierbares Markergen geknüpft (simultane Selektion wurde für beide Marker verwendet): Konstrukt ohne STAR-Elemente. Es wurden keine Kolonien gefunden. B) Dasselbe Konstrukt mit STAR67 zwischen den beiden Promotoren. Die Anti-EpCAM- Antikörper-Konzentration wird als pg/Zelle/Tag dargestellt. X(19): durchschnittliches Produktionsniveau der 19 Kolonien.
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Sequenzprotokoll

Claims

Rekombinantes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) SEQ ID NO: 66, b) Fragmenten von SEQ ID NO: 66, wobei das Fragment Anti-Repressor-Aktivität hat, c) Sequenzen, deren Nucleotidsequenz zu mindestens 70% identisch mit a) oder b) ist, wobei die Sequenzen Anti-Repressor-Aktivität haben; und d) dem Komplement zu einer der Sequenzen von a) bis c), wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül des weiteren eine Expressionskassette umfasst, wobei die Expressionskassette einen heterologen Promoter umfasst, der mit einer Nucleinsäure von Interesse verbunden ist, und wobei die Nucleinsäure von Interesse vorzugsweise alles oder einen Teil eines Proteins von Interesse codiert.
Molekül nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuresequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat, stromaufwärts von dem Promoter in der Expressionskassette gelegen ist.
Molekül nach Anspruch 2, wobei die Sequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat, und der Promoter durch weniger als 2 kb voneinander getrennt sind.
Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Nucleinsäure, die ein Protein von Interesse codiert, in einem multicistronischen Gen vorliegt, das des weiteren ein selektierbares Markergen codiert.
Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, des Weiteren umfassend mindestens eine andere Sequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat, wobei die mindestens eine andere Sequenz ausgewählt ist aus a) irgendeiner der SEQ ID NOs: 1–65, b) Fragmenten irgendeiner der SEQ ID NOs: 1–65, wobei die Fragmente Anti-Repressor-Aktivität haben, und c) Sequenzen, deren Nucleotidsequenz zu mindestens 70% identisch mit a) oder b) ist, wobei die Sequenzen Anti-Repressor-Aktivität haben, und d) dem Komplement zu einer der Sequenzen von a) bis c).
Rekombinantes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Expressionskassette umfassend 5' – Anti-Repressor-Sequenz A – Promotor – Nucleinsäure, die alles oder einen Teil eines Proteins von Interesse codiert – Anti-Repressor-Sequenz B – 3', wobei die Anti-Repressor-Sequenzen A und B gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus (i) einer der SEQ ID NOs: 1–65, (ii) Fragmenten irgendeiner der SEQ ID NOqs: 1–65, wobei die Fragmente Anti-Repressor-Aktivität haben, (iii) Sequenzen, deren Nucleotidsequenz zu mindestens 70% identisch mit a) oder b) ist, wobei die Sequenzen Anti-Repressor-Aktivität haben, und (iv) dem Komplement zu einer der Sequenzen von (i) bis (iii); dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionskassette des weiteren zwischen den Anti-Repressor-Sequenzen A und B eine Sequenz umfasst, die Anti-Repressor-Aktivität hat und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) SEQ ID NO: 66, b) Fragmenten von SEQ ID NO: 66, wobei das Fragment Anti-Repressor-Aktivität hat, c) Sequenzen, deren Nucleotidsequenz zu mindestens 70% identisch mit a) oder b) ist, wobei die Sequenzen Anti-Repressor-Aktivität haben, und d) dem Komplement zu einer der Sequenzen von a) bis c).
Zelle, umfassend ein Molekül nach einem der Ansprüche 1 – 6.
Zelle nach Anspruch 7, die eine Säugerzelle ist.
Zelle nach Anspruch 8, die eine CHO-Zelle ist.
Verfahren zum Herstellen eines Proteins von Interesse, umfassend das Züchten einer Zelle, die ein das Protein von Interesse codierendes rekombinantes Nucleinsäuremolekül umfasst, um die Nucleinsäure, die das Protein von Interesse codiert, in der Zelle zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Nucleinsäuremolekül eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die Anti-Repressor-Aktivität hat und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) SEQ ID NO: 66, b) Fragmenten von SEQ ID NO: 66, wobei das Fragment Anti-Repressor-Aktivität hat, c) Sequenzen, deren Nucleotidsequenz zu mindestens 70% identisch mit a) oder b) ist, wobei die Sequenzen Anti-Repressor-Aktivität haben, und d) dem Komplement zu einer der Sequenzen von a) bis c).
Verfahren nach Anspruch 10, des Weiteren umfassend das Isolieren des Proteins von Interesse.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Nucleinsäuresequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat, stromaufwärts von einem Promotor, der die Expression des Proteins von Interesse kontrolliert, gelegen ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Sequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat, und der Promoter durch weniger als 2 kb voneinander getrennt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Nucleinsäure, die ein Protein von Interesse codiert, in einem multicistronischen Gen vorliegt, das des Weiteren ein selektierbares Markergen codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Zelle eine CHO-Zelle ist.
Verwendung einer Nucleinsäuresequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) SEQ ID NO: 66, b) Fragmenten von SEQ ID NO: 66, wobei das Fragment Anti-Repressor-Aktivität hat, c) Sequenzen, deren Nucleotidsequenz zu mindestens 70% identisch mit a) oder b) ist, wobei die Sequenzen Anti-Repressor-Aktivität haben, und d) dem Komplement zu einer der Sequenzen von a) bis c), zum Erhöhen der Expression einer Nucleinsäure von Interesse.
Verfahren zum Erzeugen einer Wirtszelle, die zwei Polypeptide von Interesse exprimiert, wobei das Verfahren umfasst: a) Einbringen eines oder mehrerer Nucleinsäuremoleküle in eine Wirtszelle, wobei das Nucleinsäuremolekül oder die Nucleinsäuremoleküle zusammen umfassen: (i) einen Promotor, der funktionell verbunden ist mit einer Sequenz, die ein erstes Polypeptid von Interesse und ein erstes selektierbares Markergen codiert, und (ii) einen Promotor, der funktionell verbunden ist mit einer Sequenz, die ein zweites Polypeptid von Interesse und ein zweites selektierbares Markergen codiert, und (iii) mindestens eine Sequenz, die Anti-Repressor-Aktivität hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) SEQ ID NO: 66, (b) Fragmenten von SEQ ID NO: 66, wobei die Fragmente Anti-Repressor-Aktivität haben, (c) Sequenzen, deren Nucleotidsequenz zu mindestens 70% identisch mit a) oder b) ist, wobei die Sequenzen Anti-Repressor-Aktivität haben, und (d) dem Komplement zu einer der Sequenzen von a) bis c). b) Selektieren einer Wirtszelle durch im Wesentlichen gleichzeitiges Selektieren auf Expression des ersten und zweiten selektierbaren Markergens.
Verfahren zum Exprimieren zweier Polypeptide von Interesse, wobei das Verfahren umfasst: Züchten einer Wirtszelle, die mit dem Verfahren nach Anspruch 18 erhalten wurde, um das erste und zweite Polypeptid zu exprimieren, und gegebenenfalls Isolieren der Polypeptide.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die zwei Polypeptide Teil eines multimeren Proteins sind.