DE102005036880A1

DE102005036880A1 - Stereoselektive Synthese von chiralen Diolen

Info

Publication number: DE102005036880A1
Application number: DE102005036880A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr. Daußmann
Original assignee: Julich Chiral Solutions GmbH
Current assignee: Codexis Inc
Priority date: 2005-08-02
Filing date: 2005-08-02
Publication date: 2007-02-08
Also published as: WO2007014544A3; WO2007014544A2

Abstract

Die Erfindung betifft eine Verfahren zur stereoselektiven Synthese von chiralen Diolen, chiralen Hydroxyketonen, chiralen Alkoholen und deren Derivate, bei dem als Substrat ein Dion, ein prochirales Keton oder ein Hydroxyketon in eine Kultur ganzer Zellen gegeben wird, welche ein Enzym produzieren, das als Katalysator für die Umsetzung des Substrats dient. Erfindungsgemäß wird zunächst in Enzym-negative Zellen mindestens eine rekombinante Nukleinsäure eingebracht, die zumindest das Gen für das Enzym umfasst, und anschließend werden die derart hergestellten Enzym-positiven Zellen für die Synthese eingesetzt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur stereoselektiven Synthese von chiralen Diolen, chiralen Hydroxyketonen, chiralen Alkoholen und deren Derivate, bei dem als Substrat ein Dion, ein prochirales Keton oder ein Hydroxyketon in eine Kultur ganzer Zellen gegeben wird, welche ein Enzym produzieren, das als Katalysator für die Umsetzung des Substrats dient. Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz zur Expression zumindest eines Enzyms, das als Katalysator für die Umsetzung des Substrats dient, sowie Zellen, welche das Nukleinsäuremolekül enthalten.

Enantiomerenreine Diole folgender allgemeiner Struktur, wobei R₁ und R₂ Alkyl-, Aryl-, Säure- oder auch Estergruppen bzw. Verbindungen mit Heteroatomen sein können (n = 0, 1, 2, 3 und höher), sind beispielsweise aus Dionen mittels eines Verfahrens gemäß dem folgenden Formelschema herstellbar.

Chirale Diole sind wertvolle Bausteine für eine Vielzahl von Wirkstoffen und Katalysatoren. So enthält beispielsweise der Homogenkatalysator Me-DuPHOS enantiomerenreines 2,5-Hexandiol. (S,S)- oder auch (R,R)-Hexandiol können in 2,5-Dimethylphospholane überführt werden, die als Bausteine in chirale Tricarbonylchrom- oder Ferrocen-Derivate eingebaut werden können und damit Liganden von Katalysatoren des Josiphos- and Daniphos-Typs darstellen (Braun, W. et al. (2004) Eur. J. Inorg. Chem. 11: 2235-2243). Cholesterin-Senker auf Basis von Hemmstoffen der HMG-CoA-Reduktase die Dihydroxy-Verbindung (3S,5R)-Dihydroxy-6-(benzyloxy)hexansäureethylester und Derivate davon oder Penem- und Carbapenem-Antibiotika die Verbindung (R)-1,3-Butandiol (R₁=H im Formelschema).

Chemische Synthesemethoden zur gezielten Darstellung chiraler Diole sind offensichtlich für diese Produktgruppe nicht gut geeignet. Zur Synthese von enantiomerenreinem Hexandiol beispielsweise ergab die Direktreduktionen ein Produkt mit geringer optischer Reinheit (Bach, J. et al. (1997) Tetrahedron Letters 38: 1091-1094; Fan, Q.-H. et al. (1997) Tetrahedron: Asymmetry 8 : 4041-45). Andere Verfahren beinhalten mehrstufige Synthesen, beispielsweise wird in einem üblichen Verfahren zunächst ein β-Ketoester mit NOYORIS BINAP-Reagens (Burk, M. J. et al. (1991) Tetrahedron: Asymmetry 2: 569-592) reduziert. Nach anschließender Verseifung wird eine KOLBE-Kupplung durchführt. Dieses elektrochemische Verfahren ist im Labor gut anwendbar, leidet aber unter dem Problem des Elektrodenfoulings bei der Maßstabsvergrößerung. Eine weitere Synthese benötigt fünf Stufen ausgehend von Mannitol (Saravanan, P. et al. (1997) J. Org. Chem. 62: 2669-2670).

Biologische Methoden verwenden Mikroorganismen oder isolierte Enzyme als Katalysator. Enzyme haben den Vorteil, dass die Umsetzungen in aller Regel ohne Nebenprodukte und mit hoher Enantiomerenreinheit ablaufen. Geeignete Enzyme sind Oxidoreduktasen zur Reduktion der prochiralen Keton-Vorstufe (z.B. NAD(P)abhängige Dehydrogenasen) oder auch Hydrolasen, die durch Racemattrennung zur Darstellung chiraler Diole eingesetzt werden können (Bianchi, D. et al. (1993) Indian J. Chem, Sect. B, 32B : 176-80; Bosetti, A. et al. (1992). J. Chem Soc. Perkin Trans. I: 2395-2398; Caron, G. und Kazlauskas, R. J. (1993) Tetrahedron: Asymmetry, 4: 1995-2000; Hof, R. P. und Kellogg, R. M. (1994) Tetrahedron: Asymmetry 5: 565-568; Theil, F. et al. (1994) J. Org. Chem. 59: 388-393). Der Einsatz von Lipasen ist allerdings unter ökonomischen Gesichtspunkten in diesem speziellen Fall nicht attraktiv, da bei der kinetischen Racematspaltung mit einer Lipase lediglich eine maximale Ausbeute von 25% erzielt werden kann. Trotz dieser niedrigen erreichbaren Ausbeute ist die Herstellung von 2,5-Hexandiol im kg-Maßstab durch lipasekatalysierte Racematspaltung beschrieben (Nagai, H. et al. (1994) Synlett 4: 289-90). Dieses Verfahren weist bei einer theoretischen maximalen Ausbeute von 25% nur eine tatsächliche Ausbeute von 17 % auf, ist also zusätzlich mit der Erzeugung größerer Mengen an unerwünschten Nebenprodukten behaftet.

Für die enzymatische Synthese von Diolen können Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) eingesetzt werden, wobei nur von wenigen ADH bekannt ist, inwiefern sie zur Diol-Synthese eingesetzt werden können.

Für die Synthese von (R,R)-Diolen sind geeignete Enzyme in EP 0 456 107 A2 (gewonnen aus Lactobacillus kefir), EP 0 796 914 A2 oder auch WO 99/47684 A2 (aus Lactobacillus brevis) beschrieben. Für die Diol-Synthese müssen diese Enzyme allerdings isoliert und gereinigt werden, das erforderliche Coenzym (NADH oder NADPH) und ein Coenzym-Regenerierungssystem müssen zugesetzt werden.

Mikroorganismen stellen dagegen im Vergleich zur Verwendung isolierter Enzyme ein kostengünstigeres Verfahren dar. Allerdings treten bei Verwendung von Wildstämmen häufiger Nebenreaktionen auf, die die Ausbeute und Produktqualität beeinträchtigen. Beides hängt stark vom verwendeten Stamm und den Anzuchtbedingungen ab. Seit langem bekannt ist die Reduktion von Diketonen mit Bäckerhefe. So wird beispielsweise (R)-(–)-1,2-Propandiol durch Reduktion der Ketonvorstufe mit Bäckerhefe mit einem ee-Wert von 98% und einer Ausbeute von 95% erhalten (Kometani, T. et al. (1993) J. Ferment. Bioeng. 76: 414-415), (–)1,3,3-Trimethylcyclohexan-1,2-diol mit einem ee-Wert von > 90% und einer Ausbeute von 36% (Negi, M. et al. (1993) Enzyme Microb. Technol. 15: 483-488). Auch Diole, bei denen die Alkoholgruppen in einem größeren Abstand zueinander stehen (1,3-1,4-Diole) sind durch Reduktion mit Bäckerhefe erhalten worden, z.B. enantiomerenreines (S,S)-2,5-Hexandiol nach 6 Tagen mit einer Ausbeute von 90% (Lieser, J. K. (1983) Synthetic Communications 13: 765-767) oder (S,S)-5-Nitro-2,8-Nonandiol mit einem ee-Wert von 100% und einer Ausbeute von 58% nach 3 Tagen (Occhiato, E. G. et al. (1995) Tetrahedron: Asymmetry 6: 2971-6).

Werden Diketone wie Hexandion mit Bäckerhefe reduziert, erhält man offensichtlich immer (S,S)-Diole. Für (R,R)-Diole, beispielsweise (R,R)-Hexandiol, können dagegen bestimmte Stämme der Gattung Lactobacillus eingesetzt werden ( EP 1 067 195 A3 ).

Zusammenfassend ist festzustellen, dass Umsetzungen mit Wildtyp-Stämmen zwar einfach zugängliche Systeme darstellen, allerdings treten durch die Anwesenheit störender Enzyme häufig Nebenreaktionen auf und die Aktivität der natürlicherweise vorhandenen Enzyme ist relativ gering, so dass die Raum-Zeit-Ausbeuten häufig gering sind.

Für die stereoselektive Reduktion von Ketonen zu Alkoholen unter Verwendung von Alkohol-Dehydrogenasen wurden auch bereits rekombinante Organismen eingesetzt, d.h. Systeme, die gezielt in den Organismus eingebrachte Gene aus dem eigenen (homologe Expression) oder aus einem fremden Organismus (heterologe Expression) in Kombination mit einem geeigneten Expressionssystem enthalten (z.B. Kataoka, M. et al., (1997) Appl. Microbiol. Biotechnol. 48: 699-703 oder Kataoka, M. et al., (1998) Biosci., Biotechnol., Biochem. 62: 167-169).

Für die Herstellung von Diolen durch Reduktion der Diketon-Vorstufe ist bislang die Verwendung ganzer Zellen in Form der Wildstämme beschrieben worden, beispielsweise zur Herstellung von (S,S)-2,5-Hexandiol mit Bäckerhefe (Lieser, J.K. (1983) Synthetic Communications 13: 765-767) oder von (R,R)-Diolen mit Zellen von Lactobacillus kefir ( EP 1067 195 A3 ; Haberland, J. et al. (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 58. 595-599; Haberland, J. et al. (2002) Organic Process Research & Development 6: 458-462). Eine Analyse der Umsetzungen zeigt dabei einen gravierenden Nachteil auf, man beobachtet immer relativ schnell die Bildung des mono-reduzierten Zwischenprodukts (Hydroxyketon) und langsam, teilweise sehr langsam die nachfolgende zweite Reduktion unter Bildung des gewünschten Diols (Haberland, J. et al. (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 58. 595-599; Haberland, J. et al. (2002) Organic Process Research & Development 6: 458-462). Zum Teil wird dies sogar ausgenutzt, um damit gezielt das Zwischenprodukt herzustellen. Die Ursache für die langsame Weiterreduktion hängt wahrscheinlich damit zusammen, dass das Zwischenprodukt chemisch instabil ist und leicht zyklisiert. Für den zweiten Reduktionsschritt ist aber die offenkettige Form erforderlich. Nachteil dieser langsamen Weiterreaktion des Zwischenprodukts ist die lange Reaktionszeit. Häufig wird auch keine vollständige Bildung des Diols erreicht, so dass sich aufwändige Nachreinigungen zur Abtrennung des Zwischenprodukts an schliessen. Ein gleiches Verhalten von schneller erster und langsamer zweiten Reduktion wird auch bei der Verwendung isolierter Enzyme (ADHs) beobachtet.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, das die genannten Nachteile vermeidet und die Synthese enantiomerenreiner Diole, chiraler Hydroxyketone, chiraler Alkohole und deren Derivate mit hoher Umsatzrate und Ausbeute ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei dem zunächst in Enzym-negative Zellen mindestens eine rekombinante Nukleinsäure eingebracht wird, die zumindest das Gen für das Enzym umfasst, und anschließend derart hergestellte Enzym-positive Zellen für die Synthese eingesetzt werden. Als biologische bzw. verfahrenstechnische Alternative zur Verwendung von Wildstämmen als Biokatalysator wurden erfindungsgemäß also rekombinante Organismen eingesetzt. Im Vergleich zur Verwendung isolierter Enzyme zeigen die erfindungsgemäßen Ganzzell-Systeme deutliche Vorteile vor allem bezüglich einer kostengünstigeren Herstellung des Katalysators, da aufwendige Schritte der Enzymreinigung entfallen können. Ein weiterer Kostenvorteil besteht darin, dass im Einzelfall auf den Zusatz des Coenzyms verzichtet werden kann und nur das intrazellulär vorhandene Coenzym Verwendung findet. Überraschenderweise ergaben sich bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens einige unerwartete vorteilhafte Eigenschaften. Zum einen wurden für verschiedene Umsetzungen von Diketonen deutlich schnellere Umsatzraten beobachtet als in Umsetzungen, bei denen vergleichbare Mengen an löslichen Enzymen verwendet wurden. Wie vorab bereits erwähnt, ist bei ganzen Zellen auf Grund von Limitierungen im Transport der Edukte durch die Zellmembran bzw. durch Diffusionslimitierungen und der nicht optimalen Konzentration an Coenzymen eher mit einer verminderten Syntheserate zu rechnen. Überraschenderweise verliefen aber mehrere Umsetzungen signifikant schneller. Eine weitere unerwartete Eigenschaft ganzer rekombinanter Zellen besteht darin, dass die Konzentration des Zwischenprodukts deutlich geringer ist als bei Umsetzungen mit isolierten Enzymen oder Wildtyp-Stämmen. Das bedeutet, dass die Synthese des zweiten Katalyseschritts zum Diol schneller abläuft als auf Grund der Enzymkonzentration in ganzen Zellen zu erwarten war.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die rekombinante Nukleinsäure mindestens ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym umfasst, welches die Umsetzung eines Hilfssubstrats und dabei die Bereitstellung mindestens eines Coenzyms, vorzugsweise eines reduzierten Coenzyms, für die Synthese katalysiert. Die rekombinante Nukleinsäure, beispielsweise ein Plasmid, kann also neben dem Gen für das Enzym noch ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym tragen, das für die Regenerierung des Coenzyms genutzt wird. Der Zusatz eines Coenzyms ist also hier nicht erforderlich, da das intrazellulär regenerierte Coenzym als Wasserstoffquelle für die Reduktion des Substrats dient. Es muss lediglich ein Hilfssubstrat zugegeben werden, was in der Regel wesentlich kastengünstiger ist.

Alternativ kann mindestens eine weitere rekombinante Nukleinsäure in die Enzymnegativen Zellen eingebracht werden, wobei die weitere Nukleinsäure zumindest ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym umfasst, welches die Umsetzung eines Hilfssubstrats und dabei die Bereitstellung mindestens eines Coenzyms, vorzugsweise eines reduzierten Coenzyms, für die Synthese katalysiert. Neben der rekombinanten Nukleinsäure mit dem Gen für das Enzym, beispielsweise einem Plasmid, kann also noch eine weitere rekombinante Nukleinsäure, beispielsweise ebenfalls ein Plasmid, in die Zellen eingebracht werden, die ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym trägt, das für die Regenerierung des Coenzyms genutzt wird. Auch hier ist der Zusatz eines Coenzyms nicht erforderlich.

Den Enzym-positiven Zellen kann in weiterer Ausgestaltung der Erfindung alternativ auch ein Cosubstrat zur Verfügung gestellt werden, welches unter Regeneration eines Coenzyms umgesetzt wird. Dabei kann das Cosubstrat beispielsweise Isopropanol sein, welches unter Reduktion des Coenzyms in der Zelle zu Aceton oxidiert wird. Durch Zugabe des Cosubstrats können also auf einfache Weise Reduktionsäquivalente für die Reduktion des Substrats zur Verfügung gestellt werden.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird zur Regenerierung des Coenzyms folglich entweder ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym in die Zellen eingebracht und dann ein Hilfssubstrat zur Verfügung gestellt oder es wird ein Cosubstrat zugegeben. Allgemein sind aber alle chemischen, biochemischen (enzy matischen) oder elektrochemischen Systeme zur Regenerierung des durch die Reduktion des Substrats verbrauchten Coenzyms in dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar. Besonders geeignet sind alle effizienten Systeme zur Coenzym-Regenerierung, wobei unter den Begriff „System zur Coenzym-Regenerierung" sowohl ein Hilfssubstrat mit dazugehörendem Hilfsenzym als auch ein Co-Substrat ohne Hilfsenzym fallen. Beispiele für solche Systeme sind das oben erwähnte Isopropanol allein oder beispielsweise die Kombination Formiat-Dehydrogenase/Formiat oder Malat-Dehydrogenase/Malat oder Alkohol-Dehydrogenase/Ethanol oder Phosphit-Dehydrogenase/Phosphit oder Glucose-Dehydrogenase/Glucose.

Die rekombinante Nukleinsäure kann in das Genom der Zelle integriert oder in Form bzw. als Bestandteil eines oder mehrerer Plasmide in die Zellen eingebracht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Enzym eine Alkohol-Dehydrogenase oder eine Keto-Reduktase eingesetzt, während als Coenzym NAD, NADH, NADP oder NADPH eingesetzt wird. Biochemisch wird für die Reduktion zwar NADH bzw. NADPH benötigt, in der Praxis wird aber unter Ausnutzung der vorhandenen Regenerierungsmöglichkeit NAD bzw. NADP eingesetzt, da diese deutlich kostengünstiger sind. Als Hilfsenzym können erfindungsgemäß beispielsweise Glucose-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Glucose oder als Hilfsenzym Formiat-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Formiat oder als Hilfsenzym Malat-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Malat oder als Hilfsenzym Alkohol-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Ethanol oder als Hilfsenzym Phosphit-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Phosphit eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden zur Kontrolle der Synthese regulatorische Sequenzen, vorzugsweise das Lactose-Operon, in die rekombinante Nukleinsäure eingefügt, so dass die Synthese durch Zugabe eines Induktors, vorzugsweise IPTG, gezielt und spezifisch induziert werden kann.

Als ganze Zellen können beispielsweise prokaryontische Zellen der Gattung Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptococcus oder Streptomyces oder euka ryontische Zellen der Gattung Saccharomyces, Hansenula, Pichia oder Aspergillus eingesetzt werden. Bevorzugt werden im Rahmen der Erfindung als ganze Zellen aber Escherichia coli – Zellen eingesetzt, da diese verfahrenstechnisch leicht zu handhaben sind und darüber hinaus ein zuverlässiges und erprobtes genetisches System darstellen.

Die Erfindung umfasst auch Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz zur Expression zumindest eines Enzyms umfassen, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

a) Rekombinante Nukleotidsequenz, welche ein Gen für ein Enzym umfasst, das als Katalysator für die Umsetzung von Dionen, prochiralen Ketonen oder Hydroxyketonen in chirale Diole, chirale Hydroxyketone, chirale Alkohole und deren Derivate dient, und welche mindestens ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym umfasst, das die Umsetzung eines Hilfssubstrats und dabei die Bereitstellung mindestens eines Coenzyms für die Synthese der chiralen Diole, chiralen Hydroxyketone, chiralen Alkohole und deren Derivate katalysiert;
b) Rekombinante Nukleotidsequenz, welche eine Kombination der Sequenzen gemäß Seq ID Nrn. 1 und 2 oder Seq ID Nrn. 1 und 3 umfasst;
c) Nukleotidsequenz, welche Fragmente der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a) oder b) kodierten Enzyme kodiert, wobei die Fragmente die biochemische Aktivität der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a) oder b) kodierten Enzyme aufweisen;
d) Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet;
e) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotidsequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisiert und die mindestens die Polypeptide kodiert, welche die biochemische Aktivität der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) kodierten Enzyme aufweisen;
f) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 80 %, vorzugsweise 90 %, insbesondere 95 %, mit der Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder d) identisch ist und die mindestens die Polypeptide kodiert, welche die biochemische Aktivität der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) kodierten Enzyme aufweisen;
g) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis f) entspricht.

Da es aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes möglich ist, bestimmte Codons durch andere Codons zu ersetzen, welche für die gleiche Aminosäure kodieren, ist die Erfindung nicht auf ein spezifisches Nukleinsäuremolekül beschränkt, das das Enzym oder Hilfsenzym kodiert, sondern schließt alle Nukleinsäuremoleküle ein, die für ein funktionelles Enzym oder Hilfsenzym kodieren. Die Erfindung schließt ferner Nukleinsäuremoleküle ein, die sich aufgrund von alternativem Splicing eines gemeinsamen prä-mRNA Moleküls von der als "Wildtyp" anerkannten Sequenz unterscheiden. Derartige Splicing-Mechanismen umfassen die alternative Verwendung von Exons, d.h. Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäuresequenz kodieren, die alternative Anordnung von Exons sowie das "nicht-Entfernen" von Introns, d.h. intervenierenden Sequenzen, die normalerweise nicht für eine Aminosäuresequenz kodieren, aus dem mRNA-Molekül.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können "operativ" mit mindestens einer regulatorischen Sequenz gekoppelt sein, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen. Ein Nukleinsäuremolekül wird als "fähig zur Expression einer Nukleinsäuresequenz" bezeichnet, wenn es Sequenzelemente umfasst, die Informationen hinsichtlich der Regulation von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente "operativ" mit der das Oligopeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in Prokaryonten aus dem Promotor per se besteht, d.h. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren schließen normalerweise 5' nicht-kodierende Sequenzen ein, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die –351-10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryonten oder die TATA-Box, CAAT-Sequenzen und 5'-Capping-Elemente in Euka ryonten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten sowie translatierte Signalsequenzen, um die native Polypeptidkette in ein spezielles Kompartiment der Wirtszelle zu dirigieren. Zusätzlich können auch die 3' nicht-kodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription, der Polyadenylierung und ähnlichem beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz umfassen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung eine Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz. Geeignete prokaryontische Promotoren sind zum Beispiel der IacUV5-Promotor oder der T7-Promotor. Beispiele für geeignete eukaryontische Promotoren sind der SV40-Promotor oder der CMV-Promotor.

Die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können ferner in einem Vektor oder einem anderen Klonierungsvehikel enthalten sein, wie zum Beispiel Phagen, Phagemiden, Cosmiden, Baculoviren oder künstlichen Chromosomen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen Sequenzen und der kodierenden Nukleinsäuresequenz, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, ferner weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt, umfassen.

DNA-Moleküle, die ein Enzym oder Hilfsenzym gemäß der Erfindung kodieren, und insbesondere ein Vektor, der die kodierende Sequenz eines solchen Enzyms enthält, können in eine Zelle transformiert werden, die zur Expression dieser DNA-Moleküle geeignet ist. Die Transformation kann dabei mit Hilfe etablierter Standardverfahren durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft daher auch eine Zelle, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen dieses enthaltenden Vektor enthält.

Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, dass das Gen eine Alkohol-Dehydrogenase (z.B. Seq ID Nr. 2 oder Seq ID Nr. 3) oder eine Keto-Reduktase kodiert und das weitere Gen eine Glucose-Dehydrogenase (z.B. Seq ID Nr. 1) oder eine Formiat-Dehydrogenase oder eine Malat-Dehydrogenase oder eine Alkohol-Dehydrogenase oder eine Phosphit-Dehydrogenase kodiert.

Die Erfindung umfasst ferner einen Vektor zur Expression eines Polypeptids in einer geeigneten Zelle, welcher das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül in exprimierbarer Form umfasst, wobei dieser Vektor vorzugsweise ein Plasmid ist.

Die Erfindung umfasst auch jede Zelle, die das Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung und/oder den oben genannten Vektor enthält, sowie jede diese Zellen enthaltende Zellkultur. Die Zelle ist dabei vorzugsweise eine Bakterienzelle, insbesondere eine Escherichia coli – Zelle.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können also enantiomerenreine chirale Diole durch Reduktion der entsprechenden Ketonvorstufe hergestellt werden, wobei als Katalysator rekombinante Mikroorganismenzellen eingesetzt werden. Wesentlicher Bestandteil solcher geeigneter rekombinanter Organismen ist ein Gen, das für eine NAD- oder NADP-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (ADH) kodiert, die in der Lage ist, ein Diketon stereoselektiv über die Zwischenstufe des Hydroxyketons zum Diol zu reduzieren.

Die erforderlichen Reduktionsäquivalente zur Regenerierung des Coenzyms NADH oder NADPH werden durch Zusatz eines oxidierbaren Co-Substrats wie beispielsweise Isopropanol oder durch ein intrazelluläres Enzym in Kombination mit geeigneten zugesetzten Substraten erzeugt.

Rekombinante Ganzzellsysteme für die Umsetzung von Diketonen zu Diolen enthalten ein Gen, das für eine Alkohol-Dehydrogenase oder Keto-Reduktase codiert. Als Cosubstrat kann ein leicht metabolisierbares Kohlenstoff-haltiges Substrat, beispielsweise Glucose verwendet werden, wodurch die bei der Umsetzung verbrauchten Reduktionsäquivalente nachgeliefert werden. Die Verwertung dieses C-haltigen Substrats kann zudem durch zusätzliche Klonierung eines Enzyms, das dieses Substrat umsetzt, verbessert werden. So kann die Verwertung von Glucose und damit die Bereitstellung von reduzierten Coenzymen für die Reduktion durch zusätzliche Klonierung einer Glucose-Dehydrogenase deutlich verbessert werden. Ebenfalls geeignet zur Regenerierung von NADH oder NADPH sind Cosubstrate der Alkohol-Dehydrogenase bzw. Ketoreduktase, also Substrate wie beispielsweise Isopropanol, die der Zelle bzw. dem Enzym in der reduzierten Form angeboten werden und die unter Oxidation dann intrazellulär das für die Reduktion erforderliche Coenzym reduzieren.

Das ADH- oder Ketoreduktase-Gen kann sowohl plasmidgebunden als auch in die chromosomale DNA integriert vorliegen. Als Wirtsstämme der Klonierung sind neben Escherichia coli auch andere Bakterien beispielsweise der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Lactobacillus oder auch eukaryotische Wirte wie Stämme von Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Aspergillus etc. möglich.

Als für die Diol-Synthese geeignete Alkohol-Dehydrogenasen oder Keto-Reduktasen kommen sowohl (S)- als auch (R)-spezifische Enzyme in Frage, beispielsweise die literaturbekannten (S)-spezifischen Enzyme aus Rhodococcus erythropolis oder R. ruber, aus Thermoanaerobacter-Stämmen, Pferdeleber oder auch Saccharomyces cerevisiae oder die (R)-spezifischen ADHs aus Lactobacillus brevis oder L. kefir oder Enzyme aus Pseudomonas oder Saccharomyces cerevisiae.

Die Erfindung umfasst also ein kostengünstiges, effizientes und einfach durchführbares Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Diolen, in dem rekombinante Zellen, die ein ADH-Gen enthalten, als Katalysator eingesetzt werden.

Die Erfindung wird im Weiteren anhand der Abbildung und der nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen beispielhaft näher erläutert.
Es zeigt
1 die Karte eines erfindungsgemäßen Vektors, hier bezeichnet als pET-21a(+). mit adh und gdh (= pAW3).
Beispiel 1: Konstruktion eines Ganzzell-Katalysators
Um einen Ganzzellbiokatalysator zu erhalten, wurden die Gene für eine Alkohol-Dehydrogenase (adh) und Glucose-Dehydrogenase zur Regenerierung von NADH bzw. NADPH (gdh) hintereinander in einen Expressionsvektor kloniert und dieser neue Vektor in einen geeigneten Escherichia coli-Stamm transformiert. Als Beispiel für eine Alkohol-Dehydrogenase wurde die (R)-spezifische ADH aus Lactobacillus eingesetzt. Allerdings ist auch jede andere ADH, die Diketone als Substrat akzeptiert, für die Konstruktion eines Ganzzell-Biokatalysators geeignet. Die Verwendung von Glucose-Dehydrogenase (GDH) in Kombination mit Glucose stellt eine etablierte Möglichkeit zur Regenerierung von NADH oder NADPH.
Klonierung und Expression einer Alkohol-Dehydrogenase
Anhand der veröffentlichten Sequenz des Gens der (R)-ADH (aus Lactobacillus sp.) konnten Primer entwickelt werden. Mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) konnte das Gen aus der genomischen DNA isoliert und gleichzeitig Restriktionsschnittstellen NdeI und BamHI an das 5'- bzw. 3'-Ende des adh-Gens eingefügt werden. Das PCR-Produkt wurde in den bereits linearisierten und 5'-dephosphorylierten Expressionsvektor pET-21a(+) (Novagen) ligiert. Das erhaltene Plasmid (pADH) wurde zur Expression der ADH in den Expressionsstamm E. coli BL21(DE3) (Novagen) transformiert. Nach Selektion eines ADH-exprimierenden Klons wurden die Zellen in 5 ml LB_amp-Medium überimpft und über Nacht geschüttelt. Anschließend wurden 100 ml LB_amp-Medium 1 %ig überimpft und die Genexpression nach Erreichen einer OD₆₆₀ von 0,5 mit 1 mM IPTG induziert. Nach einer Induktionszeit von 3 h wurden die Zehen geerntet.
Isolierung des gdh-Gens
Für die Regenerierung von NADH oder NADPH wird häufig die GDH aus Bacillus subtilis oder auch B. megaterium eingesetzt. Zur Isolierung des gdh-Gens wurde genomische DNA aus B. subtilis subsp. subtilis isoliert und in H₂O gelöst. Anhand der bekannten Sequenz der gdh (F. Kunst, N. Ogasawara, I. Moszer et al., Nature 1997, vol 390, pp. 249) wurden zwei Primer konstruiert. Dem 5'-Primer GDH+SacI wurde hinter der Restriktionsschnittstelle SacI eine ribosomale Bindungsstelle am 5'-Ende des Gens eingefügt, so dass das gdh-Gen zur Coklonierung zur Verfügung stand. Der 3'-Primer GDH+HindIII enthielt die Restriktionsschnittstelle HindIII am 3'-Ende des Gens. Mittels PCR wurde ein DNA-Fragment amplifiziert.
Coexpression von ADH und GDH
Um einen Ganzzellbiokatalysator zu erhalten, der die Gene beider Enzyme (ADH und GDH) enthält, können sowohl Ein- als auch Zweiplasmidsysteme verwendet werden. Bei der Verwendung von Einplasmidsystemen können Plasmide verwendet werden, die entweder einen oder zwei Promotoren aufweisen. Ebenso können Plasmide mit einem oder zwei Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Des weiteren kann das adh-Gen vor dem gdh-Gen liegen oder umgekehrt.
Hier wurden adh und gdh hintereinander in einen Expressionsvektor (pET-21a(+); (Fa. Novagen)) kloniert; das neue Plasmid wurde als pAW-3 bezeichnet. Für die Coexpression von ADH und GDH wurden pADH sowie das gdh-Gen, welches die Restriktionsschnittstellen SacI und HindIII an seinen Enden trug, einer Restriktion mit SacI und HindIII unterzogen. Nach Ligation der beiden DNA-Fragmente wurde das Plasmid pAW-3 erhalten (1).
Für die Expression wurde pAW-3 (1) in kompetente BL21(DE3)-, Tuner(DE3)- und Origami(DE3)-Zellen transformiert. Jeweils eine Einzelkolonie der Klone wurde in 5 ml LB_amp-Medium überimpft und über Nacht geschüttelt. Anschließend wurde 1 %ig in 100 ml LB_amp-Medium überimpft und nach Erreichen einer OD₆₆₀ von 0,5 mit 1 mM IPTG die Genexpression induziert. Nach einer Induktionszeit von drei Stunden wurden die Zellen geerntet und mittels Ultraschall aufgeschlossen. Anschließend wurden Standard-Aktivitätstests auf ADH- und GDH-Aktivität durchgeführt, wobei die Aktivität der GDH mit Glucose bestimmt wurde, während für die ADH-Aktivität das jeweils für die Umsetzung verwendete Diketon als Substrat verwendet wurde.
Beispiel 2: Herstellung von enantiomerenreinem (R,R)-2,4-Pentandiol
Für die Umsetzung mit ganzen Zellen wurde folgender Ansatz unter Schütteln bei 37°C temperiert: 50 mM 2,4-Pentandion, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃ und 5 mg/ml Biofeuchtmasse (pAW3). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Für die Umsetzung mit isolierten Enzymen wurde eingesetzt: 50 mM 2,4-Pentandion, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃, 25 U/ml ADH und 3 U/ml Glucose-Dehydrogenase (GDH). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Um die beiden Ansätze bezüglich der Katalysatormenge vergleichen zu können, wurden Zellen, die im Ganzzell-Ansatz verwendet wurden, aufgeschlossen und die Aktivitäten der ADH (Standardtestansatz mit 50 mM 2,4-Pentandion als Substrat und NADPH als Coenzym) und GDH (Standardtestansatz mit Glucose als Substrat und NADP als Coenzym) bestimmt. Um bei den Ansätzen mit isolierten Enzymen vergleichbare Aktivitäten einzusetzen wie beim Ganzzellsystem, wurden 25 U/mL ADH und 3 U/mL GDH eingesetzt. Die Reaktionen wurden durch parallele Zugabe des jeweiligen Edukts gestartet. Zu bestimmten Zeiten wurden Proben genommen und gaschromatographisch (GC) untersucht.
Trennbedingungen für die GC: Säule: Chirasil-DEX CB (Fa. Varian), 25m × 0,25 mm i.Durchmesser; Trägergas: Helium (const. 17 psi); Split 1:250; Injektionstemperatur: 250°C; FID: 275°C; Injektionsvolumen: 1 μl; Temperaturprogramm: 8 min bei 60°C, Erhöhung auf 140°C mit 20°C/min, dann 1 min hold, dann Erhöhung auf 160°C mit 20°C/min, dann 3 min hold.
Tabelle 1 zeigt die nach 1 und nach 2 Std. erhaltenen Konzentrationen an verbleibendem Edukt 2,4-Pentandion, an Zwischenprodukt 4-Hydroxy-2-pentanon und an dem Produkt 2,4-Pentandiol für die beiden Ansätze. Insbesondere der Zwischenwert nach 1 Std. zeigt, dass die ganzen Zellen eine deutlich höhere Syntheserate für das Diol aufweisen. Ebenso ist im Ansatz mit den ganzen Zellen die Konzentration des Zwischenprodukts 4-Hydroxy-2-pentanon deutlich geringer als im Ansatz mit isolierten Enzymen.
Tabelle 1: Kinetik der 2,4-Pentandion-Umsetzung. Vergleich von ganzen rekombinanten Zellen und isolierten Enzymen. Enantiomerenüberschuss (ee) für das Produkt (R,R)-Pentandiol immer > 99%.
Beispiel 3: Herstellung von enantiomerenreinem (R,R)-3,5-Heptandiol
Für die Umsetzung mit ganzen Zellen wurde folgender Ansatz unter Schütteln bei 37°C temperiert: 50 mM 3,5-Heptandion, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃ und 5 mg/ml Biofeuchtmasse (pAW3). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Für die Umsetzung mit isolierten Enzymen wurde eingesetzt: 50 mM 3,5-Heptandion, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃, 25 U/ml ADH und 3 U/ml Glucose-Dehydrogenase (GDH). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Wie bereits in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Aktivitäten von ADH (Standardtestansatz mit 50 mM 3,5-Heptandion als Substrat und NADPH als Coenzym) und GDH in aufgeschlossenen Zellen bestimmt, um durch die Verwendung einer bestimmten Enzymmenge eine Vergleichbarkeit beider Ansätze (ganze Zellen und isolierte Enzyme) zu erreichen. Die Reaktionen wurden durch parallele Zugabe des jeweiligen Edukts gestartet. Zu bestimmten Zeiten wurden Proben genommen und gaschromatographisch untersucht.
Tabelle 2: Kinetik der 3,5-Heptandion-Umsetzung. Vergleich von ganzen rekombinanten Zellen und isolierten Enzymen. Enantiomerenüberschuss (ee) für das Produkt (R,R)-3,5-Heptandiol immer > 99%.
Tabelle 2 zeigt die nach verschiedenen Zeiten erhaltenen Konzentrationen an verbleibendem Edukt 3,5-Heptandion, an Zwischenprodukt 5-Hydroxy-3-heptanon und an dem Produkt 3,5-Heptandiol für die beiden Ansätze. Der Vergleich der beiden Ansätze mit ganzen Zellen und isolierten Enzymen zeigt deutlich, dass die ganzen Zellen eine höhere Syntheserate für das Produkt 3,5-Heptandiol aufweisen. Auch die Konzentration des Zwischenprodukts 5-Hydroxy-3-heptanon ist zu jedem Zeitpunkt deutlich niedriger.
Beispiel 4: Herstellung von enantiomerenreinem (R,R)-3,6-Octandiol
Für die Umsetzung mit ganzen Zellen wurde folgender Ansatz unter Schütteln bei 37°C temperiert: 50 mM 3,6-Octandion, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃ und 5 mg/ml Biofeuchtmasse (pAW3). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Für die Umsetzung mit isolierten Enzymen wurde eingesetzt: 50 mM 3,6-Octandion, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃, 25 U/ml ADH und 3 U/ml Glucose-Dehydrogenase (GDH). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Aktivitäten von ADH (Standardtestansatz mit 50 mM 3,6-Octandion als Substrat und NADPH als Coenzym) und GDH in aufgeschlossenen Zellen bestimmt, um durch die Verwendung einer bestimmten Enzymmenge eine Vergleichbarkeit beider Ansätze (ganze Zellen und isolierte Enzyme) zu erreichen. Die Reaktionen wurden durch parallele Zugabe des jeweiligen Edukts gestartet. Zu bestimmten Zeiten wurden Proben genommen und gaschromatographisch untersucht.
Tabelle 3: Kinetik der 3,6-Octandion-Umsetzung. Vergleich von ganzen rekombinanten Zellen und isolierten Enzymen. Enantiomerenüberschuss (ee) für das Produkt (R,R)-3,6-Octandiol immer > 99%.
Tabelle 3 zeigt die nach verschiedenen Zeiten erhaltenen Konzentrationen an verbleibendem Edukt 3,6-Octandion, an Zwischenprodukt 6-Hydroxy-3-Octanon und an dem Produkt 3,6-Octandiol für die beiden Ansätze. Der Vergleich der beiden Ansätze mit ganzen Zellen und isolierten Enzymen zeigt, dass die ganzen Zellen eine höhere Syntheserate für das Produkt 3,6-Octandiol aufweisen. Auch die Konzentration des Zwischenprodukts 6-Hydroxy-3-Octanon ist zu jedem Zeitpunkt deutlich niedriger.
Beispiel 5: Herstellung von enantiomerenreinem (R,R)-2,3-Butandiol
Für die Umsetzung mit ganzen Zellen wurde folgender Ansatz unter Schütteln bei 37°C temperiert: 50 mM Diacetyl, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃ und 5 mg/ml Biofeuchtmasse (pAW3). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Für die Umsetzung mit isolierten Enzymen wurde eingesetzt: 50 mM Diacetyl, 0,1 mM NADP, 200 mM Glucose, 250 mM CaCO₃, 25 U/ml ADH und 3 U/ml Glucose-Dehydrogenase (GDH). Der verwendete Puffer ist 100 mM TEA pH 7,0.
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Aktivitäten von ADH (Standardtestansatz mit 50 mM Diacetyl als Substrat und NADPH als Coenzym) und GDH in aufgeschlossenen Zellen bestimmt, um durch die Verwendung einer bestimmten Enzymmenge eine Vergleichbarkeit beider Ansätze (ganze Zellen und isolierte Enzyme) zu erreichen. Die Reaktionen wurden durch parallele Zugabe des jeweiligen Edukts gestartet. Zu bestimmten Zeiten wurden Proben genommen und gaschromatographisch untersucht.
Tabelle 4 zeigt die nach verschiedenen Zeiten erhaltenen Konzentrationen an verbleibendem Edukt Diacetyl, an Zwischenprodukt Acetoin und an dem Produkt 2,3-Butandiol für die beiden Ansätze. Der Vergleich der beiden Ansätze mit ganzen Zellen und isolierten Enzymen zeigt, dass zu jedem Zeitpunkt die ganzen Zellen eine höhere Syntheserate für das Produkt 2,3-Butandiol aufweisen. Tabelle 4: Kinetik der Diacetyl-Umsetzung. Vergleich von ganzen rekombinanten Zellen und isolierten Enzymen. Enantiomerenüberschuss (ee) für das Produkt (R,R)-2,3-Butandiol immer > 99%.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur stereoselektiven Synthese von chiralen Diolen, chiralen Hydroxyketonen, chiralen Alkoholen und deren Derivate, bei dem als Substrat ein Dion, ein prochirales Keton oder ein Hydroxyketon in eine Kultur ganzer Zellen gegeben wird, welche ein Enzym produzieren, das als Katalysator für die Umsetzung des Substrats dient, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst in Enzym-negative Zellen mindestens eine rekombinante Nukleinsäure eingebracht wird, die zumindest das Gen für das Enzym umfasst, und anschließend derart hergestellte Enzym-positive Zellen für die Synthese eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäure mindestens ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym umfasst, welches die Umsetzung eines Hilfssubstrats und dabei die Bereitstellung mindestens eines Coenzyms, vorzugsweise eines reduzierten Coenzyms, für die Synthese katalysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine weitere rekombinante Nukleinsäure in die Enzymnegativen Zellen eingebracht wird, wobei die weitere Nukleinsäure zumindest ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym umfasst, welches die Umsetzung eines Hilfssubstrats und dabei die Bereitstellung mindestens eines Coenzyms, vorzugsweise eines reduzierten Coenzyms, für die Synthese katalysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass den Enzym-positiven Zellen ein Cosubstrat zur Verfügung gestellt wird, welches unter Regeneration eines Coenzyms umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Cosubstrat Isopropanol ist, welcher unter Reduktion des Coenzyms in der Zelle zu Aceton oxidiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäure in das Genom der Zelle integriert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäure als Bestandteil eines Plasmids in die Zellen eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine Alkohol-Dehydrogenase oder eine Keto-Reduktase eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Coenzym NAD, NADH, NADP oder NADPH eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfsenzym Glucose-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Glucose oder als Hilfsenzym Formiat-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Formiat oder als Hilfsenzym Malat-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Malat oder als Hilfsenzym Alkohol-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Ethanol oder als Hilfsenzym Phosphit-Dehydrogenase und als Hilfssubstrat Phosphit eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kontrolle der Synthese regulatorische Sequenzen, vorzugsweise das Lactose-Operon, in die rekombinante Nukleinsäure eingefügt werden und die Synthese durch Zugabe eines Induktors, vorzugsweise IPTG, induziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als ganze Zellen prokaryontische Zellen der Gattung Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptococcus oder Streptomyces eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als ganze Zellen eukaryontische Zellen der Gattung Saccharomyces, Hansenula, Pichia oder Aspergillus eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als ganze Zellen Escherichia coli – Zellen eingesetzt werden.
Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz zur Expression zumindest eines Enzyms, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Rekombinante Nukleotidsequenz, welche ein Gen für ein Enzym umfasst, das als Katalysator für die Umsetzung von Dionen, prochiralen Ketonen oder Hydroxyketonen in chirale Diole, chirale Hydroxyketone, chirale Alkohole und deren Derivate dient, und welche mindestens ein weiteres Gen für ein Hilfsenzym umfasst, das die Umsetzung eines Hilfssubstrats und dabei die Bereitstellung mindestens eines Coenzyms für die Synthese der chiralen Diole, chiralen Hydroxyketone, chiralen Alkohole und deren Derivate katalysiert; b) Rekombinante Nukleotidsequenz, welche eine Kombination der Sequenzen gemäß Seq ID Nrn. 1 und 2 oder Seq ID Nrn. 1 und 3 umfasst; c) Nukleotidsequenz, welche Fragmente der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a) oder b) kodierten Enzyme kodiert, wobei die Fragmente die biochemische Aktivität der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a) oder b) kodierten Enzyme aufweisen; d) Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet; e) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotidsequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisiert und die mindestens die Polypeptide kodiert, welche die biochemische Aktivität der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) kodierten Enzyme aufweisen; f) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 80 %, vorzugsweise 90 %, insbesondere 95 %, mit der Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder d) identisch ist und die mindestens die Polypeptide kodiert, welche die biochemische Aktivität der durch die Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) kodierten Enzyme aufweisen; g) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis f) entspricht.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül operativ mit mindestens einer regulatorischen Sequenz gekoppelt ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz und/oder eine Transkriptionsterminationssequenz und/oder ein Regulator-Gen umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen eine Alkohol-Dehydrogenase oder eine Keto-Reduktase kodiert und das weitere Gen eine Glucose-Dehydrogenase oder eine Formiat-Dehydrogenase oder eine Malat-Dehydrogenase oder eine Alkohol-Dehydrogenase oder eine Phosphit-Dehydrogenase kodiert.
Vektor zur Expression eines Polypeptids in einer geeigneten Zelle, welcher das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 15 bis 18 in exprimierbarer Form umfasst.
Vektor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass dieser ein Plasmid ist.
Zelle, welche das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 15 bis 18 und/oder den Vektor nach Anspruch 19 oder 20 enthält.
Zelle nach Anspruch 21, wobei diese eine Bakterienzelle ist, insbesondere eine Escherichia coli – Zelle.
Zellkultur, welche Zellen nach Anspruch 21 oder 22 umfasst.