DE102007045092A1

DE102007045092A1 - Enzymsystem mit der Aktivität einer Monooxygenase und Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen in aliphatischen Kohlenwasserstoffen

Info

Publication number: DE102007045092A1
Application number: DE102007045092A
Authority: DE
Inventors: Roland H. Dr. Müller; Uta Dr. Breuer; Martin von Dr. Bergen
Original assignee: Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Current assignee: Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Priority date: 2007-09-17
Filing date: 2007-09-17
Publication date: 2009-03-19
Also published as: EP2205726A1; WO2009037216A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Proteine und Enzymgemische mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase und seine Verwendung in enzymatischen Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen in aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Verbindungen mit Methylgruppen in verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen oxidiert, welche insbesondere acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen darstellen bzw. Verbindungen mit Methylgruppen an am C2-Atom mono- oder disubstituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffe, wobei die Substituenten gleich oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise betrifft die Erfindung einen biotechnologischen Prozess zur Oxidation von Methylgruppen in den verzweigtkettigen Strukturen, wobei Mikroorganismen, die die gewünschte Monooxygenase-Aktivität besitzen oder produzieren, in einem wässrigen System kultiviert werden und zu entsprechenden Zielprodukten umgewandelt werden.

Description

Die Erfindung betrifft neue Proteine und Enzymgemische mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase und seine Verwendung in enzymatischen Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen in aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Verbindungen mit Methylgruppen in verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen oxidiert, welche insbesondere acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen darstellen, bzw. Verbindungen mit Methylgruppen an am C2-Atom mono- oder disubstituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffe, wobei die Substituenten gleich oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise betrifft die Erfindung einen biotechnologischen Prozess zur Oxidation von Methylgruppen in den verzweigtkettigen Strukturen, wobei Mikroorganismen, die die gewünschte Monooxygenase-Aktivität besitzen oder produzieren, in einem wässrigen System kultiviert werden und zu entsprechenden Zielprodukten umgewandelt werden.
2-Methyl-1,2-dihydroxypropan und Folgeprodukte bzw. in C2-substituierte Propanole und Folgeprodukte sind von großem Interesse als Synthesezwischenprodukte von Arzneimitteln, Feinchemikalien und dergleichen. Z. B. durch Veresterung und/oder Veretherung einer oder beider Hydroxy-Gruppen von Propan-1,2-diol lassen sich zahlreiche als Lösemittel, Weichmacher, Verdickungsmittel oder Emulgatoren verwendbare Produkte gewinnen. Auch die Herstellung von optisch aktiven Verbindungen ist von großer Bedeutung ( EP1 550 730 A1 ). Die optisch aktiven (R)-(–)- und (S)-(+)-Formen finden als chiraler Baustein in organischen Synthesen Verwendung und sind Testsubstrate für die Entwickung von Trennmethoden für Enantiomere. (R)-(–)- und (S)-(+)- Formen von C2-substituierten Propanolen und Folgeprodukten in Form der korrespondierenden Säure z. B. sind wirkstoffaktiv und kommen im pharmazeutischen Bereich oder im Pflanzenschutz und der Landwirtschaft zum Einsatz.
Eine Quelle für Enzymaktivitäten zur Oxidation von verzweigtkettigen Alkanderivaten wird in Bakterien-Stämmen gesehen, die Methyl-tert.butylether (MTBE) und verwandte Verbindungen wie Ethyl-tert-butylether (ETBE) und tert.-Amyl-methylether (TAME) abzubauen vermögen. Diese Verbindungen werden seit den 80-iger Jahren des vorigen Jahrhunderts als sog. Oxygenate zur Erhöhung der Oktanzahl in Kraftstoffen eingesetzt. Der intensive Umgang mit diesen Verbindungen hat zu einer Belastung der Umwelt geführt. Möglichkeiten für eine Entlastung von Kontaminationen werden wegen seiner Universalität und Versatilität im Allgemeinen im metabolischen Potenzial von Mikroorganismen gesehen. MTBE und verwandte Substanzen erweisen sich allerdings als rekalzitrant.
Der Stoffwechsel von MTBE ist allerdings nur teilweise aufgeklärt. Der Abbau beginnt prinzipiell mit einer Spaltung der Etherbindung, dafür kommt ein Monooxygenase-Mechanismus in Frage. Für Rhodococcus ruber IFP2001 bzw. A. tertiaricarbonis L108 wird dieser Schritt durch ein P450-abhängiges Enzym katalysiert, codiert durch die Gene ethABCD. Das aus der Spaltung resultierende tert-Butoxymethanol führt über chemische Dismutation oder eine entspr. Dehydrogenase zu tert-Butylalcohol (TBA). Dieses Intermediat findet man häufig in MTBE abbauenden Kulturen, d. h., dass der Schritt in der weiteren Metabolisierung dieser Verbindung unter diesen Umständen geschwindigkeitsbestimmend ist.
Kürzlich konnte in Mycobacterium austroafricanum IFP2012 gezeigt werden, dass AlkB, die typische und weit verbreitet n-Alkan Monooxygenase in Gegenwart von MTBE indiziert wird (Lopez Ferreira et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75, 909–919). AlkB als allgemeine n-Alkan Monooxygenase verfügt bekanntlich über ein weites Substratspektrum. Die Substratspezifität von AlkB-typischen Enzymen ist allerdings variabel, aber besonders hoch für n-Alkanstrukturen, während verzweigtkettige Verbindungen von diesen Monooxygenasen eher langsam oder gar nicht umgesetzt werden. Das zeigt sich auch im Falle von Stamm IFP2012, der maximale spezifische Wachstumsrate μ_max auf TBA von nur 0.039 h^–1 aufweist. Die Tatsache, dass die Umsatzraten so klein sind, spricht dafür, dass es sich auch hierbei um eine unspezifische Reaktion des Enzyms handelt. Für einen anderen grampositiven Stamm konnte μ_max von 0.032 h^–1 ermittelt werden, zu den beteiligten Enzymen gibt es keine Angaben. Für Variovorax paradoxus CL-8 werden ähnlich kleine Raten von max = 0.042 h-1 erhalten (Zaitsev et al. 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:1092). Auch hier ist das den initialen Schritt katalysierende Enzym unbekannt. Für andere Stämme gibt es bezüglich des beteiligten Enzyms keine und betreffs der realisierten Substratumsätze wenige weitere verwertbare Angaben.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, nach weiteren Proteinen und Enzymsystemen zu suchen, die in der Lage sind, verzweigtkettige aliphatische Verbindungen zu nutzen und in Zielprodukte umzuwandeln, die als Zwischen- oder Endprodukte von industriellem Interesse sind.
Der Erfindung liegt dabei die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass im Stamm L108 (DSM 18260) aufgrund seiner hohen Wachstumsraten auf TBA von 0.1 h^–1 und der daraus resultierenden hohen spezifische TBA Umsatzraten, die sich auf bis zu 210 mmol/h·g Biomasse belaufen, ein Enzymsystem gefunden wurde, das auf Verbindungen mit tertiärem Kohlenstoffatom induziert wurde. Ein Protein konnte nach massenspektrometrischen Untersuchungen und Sequenanalyse als nominelle Phthalatdioxygenase ausgewiesen werden. Ein weiteres Protein konnte als Fe/S-Oxidoreduktase diagnostiziert werden. Beide zusammen stellen ein Enzymsstem dar, wobei die Phthalatdioxygenase eine große Untereinheit und Fe/S-Oxidoreduktase eine kleine Untereinheit dieses Enzymkomplexes darstellen. Die Bestätigung der Funktion des Enzyms bzw. seiner beiden Komponenten im Stoffwechsel von TBA wurde durch Ausschalten der betreffenden Gene gezeigt. Das Enzymsystem wirkt im vorliegenden Fall überraschenderweise als Monooxygenase.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase, welches ein Protein mit Hydroxylase-Aktivität und ein Protein mit Oxidoreduktase-Aktivität aufweist. Dieses Enzymsystem ist zur Oxidation einer Methylgruppe an verzweigtkettigen, aliphatischen Strukturen befähigt, wobei die Oxidation an einem tertiären oder sekundären C-Atom stattfinden kann, sowie an Methylgruppen in Verbindungen, die am C2-Atom substituiert sind, so dass nach Oxidation auch Verbindungen mit einem optisch aktiven C-Atom gewonnen werden.
Unter verzweigtkettigen, aliphatischen Strukturen werden im Sinne der Erfindung insbesondere acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen verstanden, welche die Reaktivität erhöhen und eine charakteristische Reaktionsweise induzieren. Dazu gehören Kohlenwasserstoffverbindungen (KW), wie z. B. Alkane, Alkene und Alkine. Aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen sind z. B. KW mit C,C-Doppelbindung (Alkene), C,C-Dreifachbindung (Alkine), mit Halogengruppe (FKW, CKW, BKW, IKW), Hydroxy-Gruppe (Alkohole), Alkoxy-Gruppe (Ether), Thiol-Gruppe, Carbonylgruppe (Aldehyde, Ketone), Thiocarbonyl-Gruppe (Thioaldehyde, Thioketone), Carboxy-Gruppe (Carbonsäuren), Amino-, Imino-, Carboxamid-Gruppe (Amine, Imine, Amide), Alkoxycarbonyl-Gruppe (Ester), Nitril-Gruppe, Nitro-Gruppe und Sulfonsäure-Gruppe.
Das bevorzugte Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase umfasst mindestens ein Protein mit der SEQ ID NO: 1, sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Hydroxylase-Aktivität aufweisen. Weiterhin umfasst es ein Protein mit der SEQ ID NO: 2, sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen.
Besonders bevorzugt ist ein Enzymsystem, das als große Untereinheit Proteinsequenz SEQ ID NO: 1 und als kleine Untereinheit SEQ ID NO: 2 umfasst sowie deren zu mindestens 50% Homologen, die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein oligomeres Protein, das aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 besteht.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist das Protein mit der SEQ ID NO: 1 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Hydroxylase-Aktivität aufweisen. Bevorzugt weist das Protein mit der SEQ ID NO: 1 und deren zu mindestens 50% Homologe die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 auf, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 für die Bindung des Rieske-Typ Cys₂His₂[2Fe-2S] Clusters und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 für die Bindung eines singulären Fe²⁺ stehen.
Gegenstand der Erfindung ist auch das Protein mit der SEQ ID NO: 2 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen. Bevorzugt weist das Protein SEQ ID NO: 2 die konservierten Motive SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 auf, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 5 für die Bindung von FMN bzw. FAD, SEQ ID NO: 6 für die Bindung eines pflanzentypischen Cys₄[2Fe-2S] Clusters sowie SEQ ID NO: 7 für die Bindung von Ferredoxin stehen.
Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäuremolekül codierend ein Enzym mit der Aktivität einer Monooxygenase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist;
b) Nukleinsäuremoleküle, die die unter SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 9 dargestellte Nukleotidsequenzen aufweisen.

Es hat sich gezeigt, dass das erfindungsgemäße Enzymsystem bevorzugt ein heterodimeres Protein darstellt, welches die unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 beschriebenen Untereinheiten umfasst und so eine hervorragende Enzymaktivität besitzt.
Ein bevorzugtes Nukleinsäuremolekül codiert ein Protein, das als oligomeres Enzym zusammengesetzt aus zwei verschiedenen Untereinheiten die unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist.
Ein Nukleinsäuremolekül kann ein DNA-Molekül, vorzugsweise cDNA oder genomische DNA und/oder ein RNA-Molekül sein. Sowohl Nukleinsäuren als auch Proteine können aus natürlichen Quellen isoliert werden, vorzugsweise aus Bakterienstamm HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) oder Methylibium sp. R8 (DSM 19669).
Die Proteine können aber auch nach an sich bekannten Verfahren chemisch z. B. mittels Festphasensynthese, gentechnisch mittels eines prokaryotischen Wirts synthetisiert oder im weitesten Sinne durch gerichtete Mutagenese respektive Enzym- Design erzeugt werden.
In den erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuremolekülen können mittels an sich bekannter molekularbiologischer Techniken Mutationen erzeugt werden, was ermöglicht, dass weitere Enzyme mit analogen oder ähnlichen Eigenschaften synthetisiert werden können, die ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden können. Mutationen können Deletionsmutationen sein, die zu verkürzten Enzymen führen. Durch andere molekulare Mechanismen wie z. B. Insertionen, Duplikationen, Transpositionen, Genfusion, Nukleotidaustausch oder auch Gentransfer und Kombination von Genen („gene-shuffling") zwischen verschiedenen Mikroorganismenstämmen können ebenfalls modifizierte Enzyme mit ähnlichen oder analogen Eigenschaften erzeugt werden.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleinsäuremoleküle kann unter Verwendung der Nukleinsäuremoleküle oder Teilen davon erfolgen. Die mit den Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, die ein erfindungsgemäß verwendbares Enzym codieren. Unter Fragmente werden dabei Teile der Nukleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um das beschriebene Enzym zu codieren. Unter Derivat werden Sequenzen dieser Moleküle verstanden, die sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%, 95%, 97% oder 99% auf Nukleinsäureebene. Dabei weisen die codierten Enzyme eine Sequenzidentität zu den angegebenen Aminosäuresequenzen von mindestens 50% oder mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt mindestens 97% bzw. mindestens 99% auf Aminosäureebene auf. Die Abweichungen können dabei durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Es kann sich dabei um natürlich auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise auftreten können oder durch gezielte Mutagenese (UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, chemische Mittel oder weitere). Ferner kann es sich bei den Varianten um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Diese Varianten weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie z. B. Enzymaktivität, aktive Enzymkonzentration, Untereinheiten, funktionelle Gruppen, immunologische Reaktivität, Konformation und/oder physikalische Eigenschaften, wie das Laufverhalten in Gelelektrophorese, chromatographisches Verhalten, Löslichkeit, Sedimentationskoeffizienten, pH-Wert-Optimum, Temperatur-Optimum, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität und/oder andere.
Das erfindungsgemäße Enzymsystems mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase wird bevorzugt dadurch hergestellt, dass die Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 oder deren Homologe in einem prokaryontischen Wirt einzeln oder gemeinsam kloniert und exprimiert werden und nach ihrer Expression in geeigneter Weise einzeln oder kombiniert gewonnen werden.
Das erfindungsgemäße Enzymsystem wird bevorzugt in einem Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen, die an einer verzweigtkettigen, aliphatischen Struktur lokalisiert sind, oder an Verbindungen, die nach Oxidation ein optisch aktives C-Atom besitzen, verwendet, wobei die Oxidation an am sec oder tert C-Atom lokalisierten Methylgruppen stattfindet bzw. endständige Methylgruppen in am C2-substituierten Alkanderivaten betrifft. So werden einer wässrigen Reaktionslösung, die ein erfindungsgemäßes Enzymsystem bzw. Protein aufweist oder einen diese produzierenden Mikroorganismus, mit den Methylgruppen-tragenden Verbindungen inkubiert und anschließend die entsprechend umgewandelte Zielverbindung gewonnen, welche als Zwischen- oder Endprodukt bzw. als sog. „building block" fungiert. Mögliche Zwischen- bzw. Zielprodukte bzw. „building blocks" sind Oxidationsprodukte, z. B. im weitesten Sinne Propanderivate, wobei darunter sowohl eigentliche Propanderivate verstanden werden, die am C2-Atom substituiert sind und nach der Oxidation optisch aktive Verbindungen ergeben, die z. B. als R- bzw. S-Enantiomere als Wirkstoffformen in der pharmazeutischen Industrie (bevorzugt das S-Enantiomer), z. B. Profene, bzw. im Pflanzenschutz und der Landwirtschaft (bevorzugt das R-Enantiomer), z. B. Phenoxyalkanoate, eingesetzt werden. Darunter werden aber auch 2-Methyl-Alkanstrukturen verstanden, die hier im Sinne des enzymatischen Mechanismus synonym für an C2 substituierten Propanderivaten verstanden werden.
Strukturen mit tertiären Kohlenstoffatomen sind folglich als an C2 di-substituierte Propanderivate zu interpretieren.
In einer bevorzugten Ausführung wird eine Hydroxylierung von Methylgruppen an aliphatischen Verbindungen, vorzugsweise Alkane oder Kohlenwasserstoffe mit funktionellen Gruppen, vorzugsweise mit 3 bis 10 C-Atomen mit sekundären und tertiären C-Atomen, durchgeführt. Das betrifft z. B. 2,2-Dimethylhexan als einem mittelkettigen verzweigtkettigen Vertreten mit tertiärem C-Atom oder 2,4- bzw. 2,5-Dimethylhexan mit einem oder zwei sekundären C-Atomen.
In einer weiteren Ausführungsvariante werden die Methylgruppen an einem sekundären C-Atom (C2) oxidiert, wobei bevorzugt Verbindungen eingesetzt werden, die nach Oxidation der am sekundären C-Atom lokalisierten Methylgruppe zu Verbindungen mit einem optisch aktiven Zentrum am sekundären C-Atom führen. Das betrifft z. B. 2,5-Dimethylhexan bzw. -hexen als einem mittelkettigen verzweigtkettigen Vertreten in gesättigter bzw. ungesättigter Form oder z. B. 2-Chlorpropan als dem Vertreter mit der kürzesten hier relevanten Kette.
Das erfindungsgemäß Verfahren ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus oder ein Rohextrakt davon eingesetzt wird. Als natürliche Quellen werden vorzugsweise Bakterienstamm HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) oder Methylibium sp. R8 (DSM 19669) genutzt. Mit diesen Stämmen wurden bevorzugte geeignete biologische Systeme gefunden. Stamm HCM-10 wurde gemäß Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, DE unter der Nummer DSM 18028 am 03.03.2006 hinterlegt; Stamm Ideonella sp. L108 wurde am 28.04.2006 bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig, DE unter der Nummer DSM 18260 hinterlegt, und Stamm Methylibium sp. R8 wurde am 04.09.2007 bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig, DE unter der Nummer DSM 19669 hinterlegt. Stamm Methylibium sp. R8 (DSM 19669) ist neu.
Bevorzugt wird das Verfahren so durchgeführt, dass gegebenenfalls Substrate zugeführt werden, die das Wachstum der Mikroorganismen gewährleisten und so eine Stabilität bzw. Stabilisierung des Enzymsystems garantieren bzw. Reduktionsäquivalente für die Monooxygenase bereitstellen. Vorzugsweise handelt es sich dabei um heterotrophe Substrate, die von unveränderten Mikroorganismus als Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum und Vermehrung genutzt werden können. In einer weiter bevorzugten Variante wird die Vor-Kultivierung der Zellen so durchgeführt, dass Produkte oder Speicherstoffe, z. B. Polyhydroxybuttersäure (PHB) akkumuliert werden, indem z. B. die Stickstoffquelle im Medium das Wachstum limitiert, und die polymeren Speicherstoffe während der Produktbildung zur Bereitstellung und Regenerierung von Reduktionsäquivalenten genutzt werden. In einer weiteren bevorzugten Variante werden die Zellen der Mikroorganismen gegebenenfalls in Gegenwart eines auxiliaren Substrates inkubiert, das zur Bereitstellung bzw. zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten geeignet ist. Vorzugsweise wird als auxiliares Substrat Ameisensäure oder seine Salze verwendet. Gegebenenfalls wird dazu das Gen für eine Formiat-Dehydrogenase kloniert und exprimiert. Es können auch zellfreie Rohextrakte der Mikroorganismen eingesetzt werden, vorzugsweise zellfreie Rohextrakte des Mikroorganismus HCM-10.
Dabei wird das Verfahren so gesteuert, dass das Protein mit der Oxidoreduktase-Aktivität zum Transfer von Reduktionsäquivalenten aus reduzierten Coenzymen zum Protein mit Hydroxylase-Aktivität führt. Reduzierte Coenzyme sind in der Regel NADH + H⁺ bzw. NADPH + H⁺.
In einer anderen Ausführungsvariante werden Zellextrakte und/oder Enzymsystem mit Monooxygenase-Aktivität nach teilweiser oder vollständiger Isolierung aus den Mikroorganismen, ggf. in gereinigter Form und ggf. unter Zusatz weiterer Enzyme, z. B. für die Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt.
Ein Mikroorganismus kann nach Klonierung und Expression der Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 als ganze Zelle, unverändert, permeabilisiert oder trägerfixiert eingesetzt werden. In Kombination zu Enzymsystem und Proteinen können dabei weitere Enzyme oder Enzymsysteme zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt werden, welche in Lösung oder trägerfixiert eingesetzt werden können.
Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme produzieren bevorzugt die Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 bzw. umfassen die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 9 oder deren zu mindestens 50% Homologen. Im Sinne der Erfindung können die genannten Proteine auch in angereicherter, isolierter oder synthetisch hergestellter Form eingesetzt werden.
Wie bereits ausgeführt werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung insbesondere Mikroorganismen, Rohextrakte, Teile davon und/oder die angereicherten oder isolierten Enzyme immobilisiert eingesetzt. Durch die Immobilisierung werden Enzyme, Zellorganellen und Zellen in einen unlöslichen und reaktionsraumbegrenzten Zustand versetzt. So können sie z. B. in einer Polymer-Matrix immobilisiert werden (z. B. Alginat-, Polyvinylalkohol- oder Polyacrylamid-Gele). Eine Immobilisierung kann auch auf gelösten oder ungelösten Trägermaterialien (z. B. Celit) zur Erleichterung der Katalysator-Wiedergewinnung und -benutzung erfolgen. Methoden zur Zell-Immobilisierung in einer Polymer-Matrix oder auf einem gelösten oder ungelösten Träger sind dem Fachmann bekannt und bereits ausführlich beschrieben worden. Die Enzymaktivitäten können ebenfalls aus den mikrobiellen Zellen isoliert werden. Diese können dann direkt als Katalysator oder in einer Polymer-Matrix oder auf einem gelösten oder ungelösten Träger immobilisiert eingesetzt werden. Die dazu nötigen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beschrieben z. B. in Methods in Biotechnology, Bd. 1: Immobilization of enzymes and cells, Herausgeber: G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997.
Die Umwandlung zum Zielprodukt erfolgt bevorzugt im Rahmen eines kontinuierlichen Verfahrens, welches in einem durchströmten Reaktor durchgeführt werden kann, in dem mikrobielles Wachstum und somit die Produktbildung stattfindet. Unter einem kontinuierlichen Verfahren kann jedoch auch jedes System wachsender Zellen und katalysierender Enzyme verstanden werden, dem einerseits Nährlösung zugeführt wird und aus dem andererseits Kulturlösung, einschließlich enzymatisch gebildeten Zielprodukts abgezogen wird. Erfindungsgemäß kann das Verfahren auch als semikontinuierliches oder Batch-Verfahren durchgeführt werden.
Im Zusammenhang mit der Erfindung kommen neben der Monooxygenase gegebenenfalls Enzyme zum Einsatz, welche im Mikroorganismus vorhanden sind oder zugegeben werden. Dabei erfolgt die Umwandlung zum Zielprodukt gegebenenfalls in einem einzigen Verfahrensschritt, d. h. die Umwandlung der Ausgangssubstrate laufen gleichzeitig oder leicht zeitversetzt in ein und derselben Reaktionslösung ab.
Das Verfahren kann aerob, vorzugsweise beim Einsatz ganzer Zellen, durchgeführt werden oder auch micro-aerob, z. B. unter Stickstoffbegasung, vorzugsweise wenn Extrakte oder gereinigte Enzyme verwendet werden, wobei in diesem Falle die Sauerstoffbereitstellung im Sinne einer Substratzufuhr gesteuert wird.
Die erfindungsgemäß hergestellten Zielprodukte können durch Behandlung des Kulturmediums (nach Entfernung von ungelösten Bestandteilen wie mikrobiellen Zellen) mit bereits bekannten Methoden isoliert werden. Solche Verfahren sind neben weiteren z. B. Konzentrierung, Ionenaustausch, Destillation, Elektrodialyse, Extraktion und Kristallisation.
SEQ ID NO: 1 zeigt die Phthalatdioxygenase mit Hydroxylase-Aktivität mit 470 Aminosäuren (große Untereinheit des Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase) aus DSM 18028.
SEQ ID NO: 2 zeigt die 337 AS umfassende Sequenz mit Fe/S-Oxidoreduktase-Aktivität (kleine Untereinheit des Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase) aus DSM 18028.
SEQ ID NO: 3 zeigt die konservierten Motive für die Bindung des Rieske-Typ Cys₂His₂[2Fe-2S] Clusters.
SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 10 zeigen die konservierten Motive für die Bindung eines singulären Fe²⁺.
SEQ ID NO: 5 zeigt die konservierten Motive für die Bindung von FMN bzw. FAD.
SEQ ID NO: 6 zeigt die konservierten Motive für die Bindung eines pflanzentypischen Cys₄[2Fe-2S] Clusters.
SEQ ID NO: 7 zeigt die konservierten Motive für die Bindung von Ferredoxin.
SEQ ID NO: 8 zeigt 1413 bp der codierenden Nukleotidsequenz für die Phthalatdioxygenase aus DSM 18028.
SEQ ID NO: 9 zeigt 1014 bp der codierenden Nukleotidsequenz für die Fe/S-Oxidoreduktase aus DSM 18028.
Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher beschrieben, auf die sie jedoch nicht beschränkt werden soll.
Ausführungsbeispiel
Beispiel 1
Der Stamm DSM 18028 wurde auf Mineralsalzmedium (MSM) in Gegenwart einer Vitaminmischung kultiviert. Das Medium enthielt (in mg/l): NH₄Cl, 350; KH₂PO₄, 340; K₂HPO₄, 485; CaCl₂·6H₂O, 27; MgSO₄·7H₂O, 71.2, und 1 ml/l Spurensalz-Stammlösung. Die Spurensalz-Stammlösung enthielt (in g/l): FeSO₄·7H₂O, 4.98; CuSO₄·5H₂O, 0.785; CoCl₂, 5; MnSO₄·4H₂O, 0.81; ZnSO₄·7H₂O, 0.44; Na₂MoO₄·2H₂O, 0.25. Die Konzentration der Vitamin im Medium betrug (in μg/l): Biotin, 20; Folsäure, 20; Pyridoxin-HCl, 100; Thiamin-HCl, 50; Riboflavin, 50; Nikotinsäure, 50; DL-Ca-Pantothenat, 50; p-Aminobenzoesäure, 50; Liponsäure, 50, und Cobalamin, 50. Als Wachstumssubstrat diente Succinat in einer Konzentration von 3 g/l. Die Kultivierung erfolgte kontinuierlich oder diskontinuierlich. Bei kontinuierlicher Kultivierung wurde zusätzlich tert.-Butylakohol (TBA) in einer Konzentration von 0,2 g/l zugeführt. Bei diskontinuierlicher Kultivierung wurde der Kultur TBA im Anschluss an das Wachstum auf Succinat zur Induktion der Monooxygenase-Aktivität zugesetzt und die Kultur für weitere 5 h inkubiert.
Nach kontinuierlicher bzw. diskontinuierlicher Kultivierung wurden die Zellen abgetrennt, gewaschen und mit Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) auf eine Biomassekonzentration von 0,5 g/l eingestellt. Dieser Suspension wurde 2,2-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C inkubiert. Das Verhältnis von Flüssig- zu Gasvolumen lag bei 4 zu 1. Als Ausgangsgas diente Raumluft. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen und unter Einsatz diskontinuierlich kultivierter Zellen 6,8 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan gebildet, bei Einsatz kontinuierlich kultivierter Zellen wurden nach 24 h Inkubationszeit 7,1 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan erhalten.
Beispiel 2
Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert, allerdings in Gegenwart von 760 mg/l NH₄Cl. Nach der Kultivierung wurde die Suspension für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.
Dieser Suspension wurde 2,2-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM sowie 1 g/l Succinat zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 5,4 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan gebildet.
Beispiel 3
Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.
Dieser Suspension wurde 2,5-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 4,2 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexan und 3,8 mM 2,5-Dihydroxymethylhexan gebildet. Nach 48 h lagen die Konzentrationen bei 2,7 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexan und 5,9 mM 2,5-Dihydroxymethylhexan.
Beispiel 4
Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.
Dieser Suspension wurde 2-Chlorpropan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 5,8 mM 2-Chlorpropanol gebildet.
Beispiel 5
Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.
Dieser Suspension wurde 2,5-Dimethyl-2,4-hexadien in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 3,3 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexadien und 3,1 mM 2,5-Dihydroxymethylhexadien gebildet. Nach 48 h lagen die Konzentrationen bei 1,9 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexadien und 6,4 mM 2,5-Dihydroxymethylhexadien.
Beispiel 6
Der Stamm DSM 19669 wurde auf Mineralsalzmedium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.
Dieser Suspension wurde 2,2-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 5,3 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan gebildet.
Abbildungen
SEQ ID NO: 1 (gr UE)
SEQ ID NO: 2 (kl UE)
SEQ ID NO: 3 (Rieske)
SEQ ID NO: 4 (D) oder SEQ ID NO: 10 (E) (singul. Fe)
SEQ ID NO: 5 (FMN)
SEQ ID NO: 6 (NAD)
SEQ ID NO: 7 (Ferredoxin)
SEQ ID NO: 8 (gr UE)
SEQ ID NO: 9 (kl. UE)

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- EP 1550730 A1 [0002]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Lopez Ferreira et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75, 909–919 [0005]
- Methods in Biotechnology, Bd. 1: Immobilization of enzymes and cells, Herausgeber: G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997 [0033]

Claims

Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase, welches ein Protein mit Hydroxylase-Aktivität und ein Protein mit Oxidoreduktase-Aktivität aufweist und das zur Oxidation einer Methylgruppe an verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen befähigt ist.
Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass verzweigtkettige, aliphatische Kohlenwasserstoffe acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen sind, vorzugsweise Alkane, Alkene, Alkine, Verbindungen mit Halogengruppe, Alkohole, Ether, Thiole, Aldehyde, Ketone, Thioaldehyde, Thioketone, Carbonsäuren, Amine, Imine, Amide, Ester, Nitrile, Nitroverbindungen und Sulfonsäuren.
Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach Anspruch 1 oder 2, welches ein Protein mit der SEQ ID NO: 1 umfasst sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Hydroxylase-Aktivität aufweisen.
Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches ein Protein mit der SEQ ID NO: 2 umfasst sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen.
Enzymsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es als große Untereinheit Proteinsequenz SEQ ID NO: 1 und als kleine Untereinheit SEQ ID NO: 2 umfasst sowie deren zu mindestens 50% Homologen, die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
Enzymsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es ein oligomeres Protein ist, das aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 besteht.
Protein mit der SEQ ID NO: 1 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Hydroxylase-Aktivität aufweisen.
Protein nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 aufweist, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 für die Bindung von Eisen- und Schwefelabkömmlingen in einem Rieske-Typ Cys₂His₂[2Fe-2S] Cluster und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 für die Bindung eines singulären Fe²⁺ stehen.
Protein nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 50% Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 1 hat und die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 aufweist.
Protein mit der SEQ ID NO: 2 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen.
Protein nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die konservierten Motive SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 aufweist, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 5 für die Bindung von FMN bzw. FAD, SEQ ID NO: 6 für die Bindung von Eisen- und Schwefelabkömmlingen in einem pflanzentypischen Cys₄[2Fe-2S] Cluster sowie SEQ ID NO: 7 für die Bindung von Ferredoxin stehen.
Protein nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 50% Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 hat und die konservierten Motive SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 aufweist.
Nukleinsäuremolekül codierend ein Enzym mit der Aktivität einer Monooxygenase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist; b) Nukleinsäuremoleküle, die die unter SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 9 dargestellte Nukleotidsequenzen aufweisen.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein codiert, das als oligomeres Enzym zusammengesetzt aus zwei verschiedenen Untereinheiten die unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13 oder 14, das ein DNA-Molekül ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das eine cDNA oder genomische DNA ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder 14, das ein RNA-Molekül ist.
Mikroorganismus, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17 enthält, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Enzymsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Protein gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12 produziert.
Mikroorganismus nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Protein codiert, das als oligomeres Enzym zusammengesetzt aus zwei verschiedenen Untereinheiten die unter SEQ. ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 18 oder 19 gekennzeichnet durch Bakterienstamm HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) oder Methylibium sp. R8 (DSM 19669).
Verfahren zur Herstellung eines Enzymsystems mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 in einem prokaryontischen Wirt einzeln oder gemeinsam kloniert und exprimiert werden und die Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 nach der Expression in geeigneter Weise einzeln oder kombiniert gewonnen werden.
Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen an verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wobei die Oxidation an einem tertiären oder sekundären C-Atom stattfindet oder an Methylgruppen in Strukturen, die am C2-Atom derivatisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass in einer wässrigen Reaktionslösung, die ein Enzymsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Protein gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12 oder einen Mikroorganismus gemäß Anspruch 18 oder 19 aufweist, mit Methylgruppen-tragenden Verbindungen inkubiert wird und anschließend die entsprechend umgewandelte Zielverbindung gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hydroxylierung von Methylgruppen an Alkanverbindungen oder Alkanverbindungen mit mindestens einer funktionellen Gruppe, vorzugsweise mit 3 bis 10 C-Atomen mit sekundären und tertiären C-Atomen oder an Methylgruppen in Strukturen, die am C2-Atom derivatisiert sind, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylgruppen an einem sekundären C-Atomen (C2) oxidiert werden, wobei bevorzugt Verbindungen eingesetzt werden, die nach Oxidation der am sekundären C-Atom lokalisierten Methylgruppe zu Verbindungen mit einem optisch aktiven Zentrum am sekundären C-Atom führen.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylgruppen einer Verbindung an einem tertiären C-Atomen oxidiert werden.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylgruppen einer Verbindung oxidiert werden, bei der ein oder 2 H-Atome am C2-Kohlenstoff substituiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus gemäß einem Anspruch 18 bis 20 oder ein Rohextrakt davon eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass ganze Zellen der Mikroorganismen, unverändert, permeabilisiert oder trägerfixiert eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Mikroorganismen in Gegenwart eines auxiliaren Substrates inkubiert werden, das zur Bereitstellung bzw. zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass als auxiliare Substrate Ameisensäure oder seine Salze eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die auxiliaren Substrate heterotrophe Substrate sind, welche von unveränderten Mikroorganismen als Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum und Vermehrung genutzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die auxiliaren Substrate als Quelle zur Bereitstellung bzw. Regenerierung von Reduktionsequivalenten eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 27 und 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen auf einem heterotrophen Substrat zur Akkumulation von Produkten kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 27, 28 und 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte intrazelluläre Speicherstoffe sind.
Verfahren nach Anspruch 27, 28, 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass als intrazellulärer Speicherstoff Polyhydroxybuttersäure gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 27, 28, 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten für die Monooxygenase Reaktion genutzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass zellfreie Rohextrakte der Mikroorganismen eingesetzt werden, vorzugsweise zellfreie Rohextrakte des Mikroorganismus DSM18028.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit der Oxidoreduktase-Aktivität zum Transfer von Reduktionsäquivalenten aus reduzierten Coenzymen zum Protein mit Hydroxylase-Aktivität führt.
Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die reduzierten Coenzyme NADH + H⁺ bzw. NADPH + H⁺ sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass Zellextrakte und/oder die Enzymsysteme mit Monooxygenase-Aktivität nach teilweiser oder vollständiger Isolierung aus den Mikroorganismen, ggf. in gereinigter Form, und ggf. unter Zusatz weiterer Enzyme, für die Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus nach Klonierung und Expression der Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 als ganze Zelle, unverändert, permeabilisiert oder trägerfixiert eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass in Kombination zu Enzymsystem und Proteinen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 weitere Enzyme oder Enzymsysteme zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Enzyme und Protein in Lösung oder trägerfixiert eingesetzt werden.
Bakterienstamm Methylibium sp. R8 (DSM 19669).