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Die
vorliegende Erfindung ist auf Nukleinsäuren und die durch
sie codierten Polypeptide gerichtet, wobei die Polypeptide eine
Alkoholdehydrogenase-Aktivität aufweisen. Die Polypeptide
bzw. Nukleinsäuren stammen aus Gluconobacter oxydans bzw.
sind von ihnen abgeleitet. Weiterhin richtet sich die vorliegende
Erfindung auf Expressionssysteme, Primer, Verfahren zur Herstellung
von verbesserten Nukleinsäuren bzw. durch sie codierte
Polypeptide sowie deren Verwendung zur Herstellung von enantiomerenangereicherten
Alkoholen, Hydroxyketonen oder auch Hydroxyaldehyden. Ebenfalls
ist die Erfindung auf Ganzzellkatalysatoren, die die entsprechende
Alkoholdehydrogenase (ADH) enthalten sowie gekoppelte Reaktionssysteme
zur Herstellung der enantiomerenangereicherten Produkte gerichtet.
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Eine
Vielzahl biologischer Reaktionen wird von Alkoholdehydrogenasen
katalysiert, wobei Alkoholsubstrate zu den entsprechenden Ketonen
oder Aldehyden oxidiert werden, bzw. auch die entgegengerichtete
Reduktion vom Aldehyd oder Keton zum Alkohol katalysiert wird. Die beschriebenen
Reaktionen sind in der Regel reversibel und laufen in Gegenwart
von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+/NADH)
oder Nicotinamid-Adenin-Dinucleotidphosphat (NADP+/NADPH)
als Coenzym (Cofaktor) ab.
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Neben
der herausragenden Bedeutung von Alkoholdehydrogenasen in biologischen
Prozessen gelten diese Enzyme auch als interessante Katalysatoren
für die organisch-chemische Synthese zur Herstellung von Alkoholen,
Ketonen oder Aldehyden. Die Gewinnung optisch aktiver organischer
Verbindungen, z. B. Alkohole, Hydroxy-Aldehyde oder Hydroxyketone,
auf biokatalytischem Wege gewinnt zunehmend an Bedeutung. Von besonderem
Interesse sind Biokatalysatoren, die regioselektive Umsetzungen
ermöglichen. Als ein Weg zur großtechnischen Synthese
dieser Verbindungen hat sich der gekoppelte Einsatz zweier Dehydrogenasen
unter Cofaktorregenerierung oder auch die substrat-gekoppelte Coenzymregenerierung
erwiesen (als aktuelle, umfassende Übersicht zum Stand
der Technik, siehe: W. Hummel, Adv. Biochem. Engineering/Biotechnology 1997,
58, 145–184).
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Für
einen technischen Einsatz von ADHs limitierend sind die Substratspektren
der beschriebenen Enzyme. Jedes Enzym setzt nur ein begrenztes Spektrum
an Verbindungen um, zudem weisen die Enzyme charakteristische Regio-
und Stereoselektivitäten auf, die die Verwendung ebenfalls
limitieren. Darüberhinaus liegt generell nur ein geringer
Anteil an Alkoholdehydrogenasen in der für technische Einsatzzwecke
benötigten rekombinanten Form vor.
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Deshalb
besteht ein großes Interesse an der Auffindung weiterer
Alkohol-Dehydrogenasen mit neuen enzymatischen Eigenschaften, insbesondere
zur regio- und stereoselektiven Umsetzung von Polyol-Verbindungen.
Es ist gut bekannt, dass Mikroorganismen in der Lage sind, Hydroxylgruppen
eines Polyols zu oxidieren, allerdings werden üblicherweise
sekundäre Alkoholgruppen oxidiert. So wird Glycerol beispielsweise
von Organismen der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter zu Dihydroxyaceton
oxidiert (Prescott, S. C. und Dunn, C. G. (1959) Industrial
Microbiology, McGraw Hill Book Co., Inc., New York, "The
Acetic Acid Bacteria and sone of Their Biochemical Activities",
pp. 428–469).
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Von
besonderem Interesse als Produkte sind dabei Glyceraldehyd (Formelschema
1) oder Homologe, die durch Oxidation der entsprechenden Polyole
(Formelschema 2; R = aromatische oder aliphatische Seitenkette)
gebildet werden können.
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Glyceraldehyd
ist eine industriell wichtige Verbindung, die chemisch beispielsweise
durch Osmiumtetraoxide-katalysierte Umsetzung von Acrolein hergestellt
wird; Osmium allerdings ist toxisch und die Wiedergewinnung aus
der Produktlösung stellt ein großes technologisches
Problem dar. Ein Enzym-katalysierter Prozess, der zu Glyceraldehyd
führt, ist von Upjohn Co. (
US
4,353,987 ) beschrieben, in welchem eine Methanol-Dehydrogenase
eingesetzt wird, die Glycerol zu Glyceraldehyd oxidiert. Bei dem
Enzym handelt es sich um ein sog. Chinoprotein-Enzym, Coenzym der
Reaktion ist eine unnatürliche Verbindung, das Phenazinmethosulfat.
Die in der Patentschrift beschriebenen Umsetzungen verlaufen allerdings
nicht vollständig. Mit ganzen Zellen von Methylobacterium
organophilum, die Methanol-Dehydrogenase produzieren, erhält
man 35% Glyceraldehyd; setzt man Enzym (als Rohextrakt) ein, werden
von einer Substratlösung von 100 g/L nur 1 g/L Glyceraldehyd
erhalten.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Nukleinsäuresequenz
anzugeben, welche für Alkoholdehydrogenasen codiert, die
die Nachteile der im Stand der Technik vorhandenen Enzyme zu überwinden
vermögen. Insbesondere sollten solche Alkoholdehydrogenasen
auch Polyole regioselektiv oxidieren bzw. Hydroxyketone bzw.
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Hydroxyaldehyde
stereoselektiv reduzieren. Bevorzugt werden insbesondere solche
Enzyme, die NAD- oder NADP-abhängig sind, da für
diese Coenzyme Regenerierungsmethoden gut bekannt sind. Weiterhin
sollten die Alkoholdehydrogenasen den bekannten Enzymen im Hinblick
auf ökonomische Gesichtspunkte, insbesondere hinsichtlich
Stabilität, Aktivität und/oder Selektivität überlegen
sein.
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Weiterhin
ist es die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Expression von
Alkoholdehydrogenasen anzugeben, welche die Nachteile der im Stand
der Technik vorhandenen Enzyme zu überwinden vermögen.
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Diese
Aufgabe wird hinsichtlich der Nukleinsäuresequenz erfindungsgemäß gelöst
durch eine:
Nukleinsäuresequenz, die für
ein Polypeptid mit Alkoholdehydrogenaseaktivität codiert,
ausgewählt aus der Gruppe:
- a) einer
Nukleinsäuresequenz mit der in Sequenz GO-ADH dargestellten
Sequenz,
- b) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten
Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Sequenz
GO-ADH oder der dazu komplementären Sequenz hybridisiert,
- c) einer Nukleinsäuresequenz, die eine Homologie von
mindestens 50%, bevorzugt mindestens mindestens 75%, noch bevorzugter
von mindestens 80% und besonders bevorzugt von über 90%
zur Sequenz GO-ADH oder zu der zur Sequenz GO-ADH komplementären
Sequenz aufweist.
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Hinsichtlich
des Verfahrens wird die Aufgabe gelöst durch ein:
Verfahren
zur Herstellung eines verbesserten rekombinanten Polypeptids mit
Alkoholdehydrogenaseaktivität ausgehend von Nukleinsäuresequenzen
ausgewählt aus der Gruppe:
- a) einer
Nukleinsäuresequenz mit der in Sequenz GO-ADH dargestellten
Sequenz,
- b) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten
Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Sequenz
GO-ADH oder der dazu komplementären Sequenz hybridisiert,
- c) einer Nukleinsäuresequenz, die eine Homologie von
mindestens 50%, bevorzugt mindestens mindestens 75%, noch bevorzugter
von mindestens 80% und besonders bevorzugt von über 90%
zur Sequenz GO-ADH oder zu der zur Sequenz GO-ADH komplementären
Sequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man
- a) eine Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch
1 einer Mutagenese unterwirft,
- b) die aus a) erhältliche Nukleinsäuresequenz
in einen geeigneten Vektor kloniert und dieses in ein geeignetes
Expressionsystem transferiert und
- c) die gebildeten Polypeptide mit verbesserter Aktivität
und/oder Selektivität und/oder Stabilität detektiert und
isoliert.
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Durch
die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
sowie das erfindungsgemäße Verfahren gelingt die
Lösung der beschriebenen Aufgaben in überraschend
einfacher, dafür aber nicht minder vorteilhafter Art und
Weise. Mit den angegebenen Nukleinsäurensequenzen können
rekombinante Alkoholdehydrogenasen des Typs aus Gluconobacter oxydans
gewonnen werden, die sich in hohen Ausbeuten in Wirtsorganismen, wie
z. B. Escherichia coli, exprimieren lassen und welche in einer hohen
Aktivität auch sterisch anspruchsvolle Polyole mit hoher
Selektivität zu den entsprechenden enantiomerenangereicherten
Verbindungen umsetzen können. Auch die Stabilität
der so gewonnenen Alkoholdehydrogenasen läßt einen
Einsatz im technischen Maßstab unter ökonomischen
Gesichtspunkten als besonders vorteilhaft erscheinen. So kann mit
den durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptiden mit
Alkoholdehydrogenase-Aktivität aus racemischem Glyceraldehyd
stereoselektiv das D-Enantiomere reduziert werden und damit enantiomerenangereicherter
L-Glyceraldehyd gewonnen werden.
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Das
erfindungsgemäße Enzym katalysiert bevorzugt folgende
Reaktion (Formelschema 1):
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Daneben
werden auch Ketone reduziert bzw. sekundäre Alkohole oxidiert.
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Eine
detaillierte Analyse der Dehydrogenase-Gene des Bakteriums Gluconobacter
oxydans hat gezeigt, dass dieser Organismus NAD(P)-abhängige
Enzyme enthält, die überraschenderweise Glycerol
nicht zu Dehydroxyaceton, sondern durch Oxidation der endständigen
Hydroxylgruppe zu Glyceraldehyd umsetzen. Ähnliche Gensequenzen
liegen auch in Pseudomonas aeruginosa oder Hypocrea jecorina vor.
Wegen der guten Aktivität des rekombinanten Enzyms aus
G. oxydans wird im Folgenden hauptsächlich dieses Enzym
beschrieben. Bei der Charakterisierung dieses Enzym hat sich zudem
gezeigt, dass die Reduktion von Glyceraldehyd mit diesem Enzym stereoselektiv
verläuft. Wird das Racemat von Glyceraldehyd eingesetzt,
wird nur das D-Enantiomer reduziert, wobei bei vollständigem
Ablauf dieser Reaktion enantiomerenreiner L-Glyceraldehyd gewonnen
werden kann (Formelschema 4). Technologisch hat diese Reaktion den
Vorteil, dass die Regenerierung des Conzyms NADPH in vorteilhafter
Weise beispielsweise mit Glucose und Glucose-Dehydrogenase erfolgen
kann.
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In
der vorliegenden Erfindung werden neben den Nukleinsäuresequenzen
der Sequenz GO-ADH also auch solche aufgezeigt, die unter stringenten
Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder
deren Komplementär hybridisieren bzw. weitere, die durch
geeignete Mutageneseverfahren verbessert wurden. Insbesondere sind
solche Nukleinsäuren mit umfasst, welche Allele oder funktionelle
Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
darstellen. Funktionelle Varianten weisen bevorzugt eine Homologie
von mindestens 50%, bevorzugt mindestens 66%, mehr bevorzugt von
mindestens 70% weiter bevorzugt von mindestens 80% und besonders
bevorzugt von über 90% zur Sequenz GO-ADH auf.
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So
weist beispielsweise die Sequenz PA-ADH aus Pseudomonas aeruginosa
eine Übereinstimmung mit der Sequenz GO-ADH von 66% auf
und codiert ebenfalls für ein Peptid mit entsprechender
Alkoholdehydrogenaseaktivität.
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Die
Vorgehensweise zur Verbesserung der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen durch Mutagenese-Methoden ist dem
Fachmann hinlänglich bekannt. Als Mutagenese-Methoden kommen
alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung
stehenden Methoden in Frage. Insbesondere sind dies die Sättigungsmutagenese,
die Random-Mutagenesis, in vitro-Rekombinations-Methoden sowie Site-Directed-Mutagenesis (Eigen,
M. und Gardiner, W., Evolutionary molecular engineering based an
RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56, 967–978; Chen,
K. und Arnold, F., Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random
mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic
media. Bio/Technology 1991, 9, 1073–1077; Horwitz, M.
und Loeb, L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc
Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7405–7409; Dube,
D. und L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides
Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 1989,
28, 5703–5707; Stemmer, P. C., Rapid evolution of
a Protein in vitro by DNA shuffling, Nature 1994, 370, 389–391
und Stemmer, P. C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:
In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci
USA 91, 1994, 10747–10751).
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Die
erhaltenen neuen Nukleinsäuresequenzen werden nach den
nachfolgend angegebenen Methoden in einen Wirtsorgansmus kloniert
und die so exprimierten Polypeptide mit geeigneten Screening-Methoden detektiert
und anschließend isoliert.
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Die
Information aus der Sequenz GO-ADH kann zu Erzeugung von Primern
genutzt werden, um direkt allele Formen mittels PCR, z. B. in anderen
Gluconobacter species-Stämmen zu identifizieren und zu
klonieren. Darüber hinaus können aufgrund der Sequenzinformation
Sonden zum Auffinden weiterer natürlich vorkommender funktioneller
Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
und damit der entsprechenden codierten Enzymvarianten benutzt werden.
Ausgehend von der Sequenz GO-ADH oder von dazu allelen oder natürlich
vorkommenden funktionellen Varianten kann z. B. über PCR
unter Verwendung einer fehlerhaft arbeitenden DNA-Polymerase eine
Bank künstlich erzeugter funktioneller Enzymvarianten erhalten
werden.
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Der
Ausdruck ”unter stringenten Bedingungen” wird
hierin wie bei Sambrook et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E.
F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual,
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)
beschrieben, verstanden. Bevorzugt liegt eine stringente Hybridisierung
gemäß der vorliegenden Erfindung vor, wenn nach
Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC (150 mM Natriumchlorid,
15 mM Natriumcitrat, pH 7.0) und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat)
bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C
und am meisten bevorzugt bei 68°C und mehr bevorzugt für
1 Stunde mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C,
bevorzugter bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C
und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal
beobachtet wird.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide sind in technischen
Prozessen aufgrund der schon angedeuteten Regio- und Stereoselektivität
und dem erweiterten Substratspektrum sehr gut einzusetzen.
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Mit
umfasst sind damit auch die allelen oder funktionellen Varianten
der erfindungsgemäßen Polypeptide. Unter einer
funktionellen Variante im Sinne dieser Erfindung wird eine Alkoholdehydrogenase
mit einer Aminosäuresequenzhomologie zur Sequenz GO-ADH
von wenigstens 75%, bevorzugt wenigstens 77%, mehr bevorzugt von über
85% ganz bevorzugt von über 90% verstanden.
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So
zeigt beispielsweise das durch die Sequenz PA-ADH codierte Polypeptid
eine Homologie auf Aminosäurebasis zu dem durch die Sequenz
GO-ADH codierten Polypeptid von 77%. Das durch PA-ADH codierte Polypeptid
zeigt eine im Wesentlichen vergleichbare Alkoholdehydrogenaseaktivität,
wie die durch die Sequenz GO-ADH codierten Polypeptide. Durch Mutagenese
(s. o.) können Aminosäureaustausche in die erfindungsgemäßen
Polypeptide eingefügt werden, wobei jedoch die Aktivität
und/oder die Selektivität und/oder die Stabilität
des Polypeptids nicht wesentlich reduziert werden darf.
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So
können beispielsweise Aminosäuren, die sich nicht
im aktiven Zentrum befinden und von denen nicht erwartet wird, dass
der Austausch durch eine Aminosäure der gleichen Gruppe
zu einer wesentlich veränderten dreidimensionalen Struktur
führt, durch eine Aminosäure der gleichen Gruppe
ausgetauscht werden. Beispielsweise kann erwartet werden, dass bestimmte
Aminosäuren aus der Gruppe mit nicht-polaren Seitenketten
(z. B. Alanin durch Valin) untereinander ausgetauscht werden können,
ohne das dies einen (wesentlichen) Einfluss auf eine katalytische
bzw. biochemische Funktion des Enzyms im Sinne der Erfindung hätte. Auf
der Basis seines Fachwissens kann der Fachmann entsprechende Schlussfolgerungen
auch für den Austausch anderen Aminosäurearten,
zum Beispiel den Ersatz saurer Aminosäuren durch andere
saure Aminosäuren erstellen.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide mit Alkoholdehydrogenaseaktivität
können darüber hinaus posttranslationale Modifikationen,
wie z. B. Glycosylierungen oder Phosphorylierungen, aufweisen.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthalten die
erfindungsgemäßen Polypeptide darüber
hinaus mindestens einen heterologen Aminosäureabschnitt,
der diese Polypeptide als Fusionsproteine kennzeichnet. Heterologe
Bestandteile des erfindungsgemäßen Fusionsproteins
können beispielsweise Tags (z. B. His-Tag, Flag-Tag, Maltose-binding
Protein) sein, die bei der Aufreinigung der erfindungsgemäßen
Fusionsproteine eingesetzt werden können. In anderen Ausführungsformen
können die heterologen Bestandteile eine eigene enzymatische
Aktivität aufweisen. In einem derartigen Fall sind die
beiden enzymatischen Komponenten vorzugsweise durch einen Linker
wie einen flexiblen 6–10 Aminosäure langen Glycin
oder Glycin-Serin Linker verbunden, um die Funktionalität
der Komponenten zu gewährleisten. Wie hier verwendet, kann
der Begriff ”heterolog" einerseits bedeuten, dass die Komponenten
des Fusionsproteins natürlicherweise nicht zusammen kovalent
verbunden vorkommen, andererseits, dass die Komponenten aus verschiedenen
Spezies stammen. Fusionsproteine werden üblicherweise durch
rekombinante DNA-Technologie hergestellt (siehe Sambrook
et al., a. a. O.).
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In
einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf rekombinante Expressionssysteme oder rekombinante Plasmide/Vektoren
aufweisend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren. Unter einem Expressionssystem ist ein System
zur rekombinanten Expression der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren und damit zur rekombinanten Herstellung der
erfindungsgemäßen Polypeptide zu verstehen.
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Diese
Herstellung kann bevorzugt in mit entsprechenden Nukleinsäuresequenzen
oder Vektoren (s. u.) transformierten oder transfizierten (die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion” werden
gemäß dieser Erfindung sinngleich verwendet) Mikroorganismen
oder anderen Wirten erfolgen. Geeignete Wirtszellen schließen
Zellen von einzelligen Mikroorganismen wie bakterielle Zellen ein.
Als Mikroorganismen sind diesbezüglich Prokaryonten, wie
E. coli, Bacillus subtilis oder Pseudomonas sp. Ferner können
Bakterien der Genera/Spezies Lactobacillus, Bacillus, Rhodococus,
Campylobacter, Caulobacter, Mycobacterium, Streptomyces, Neisseria,
Ralstonia, sowie Agrobacterium für die Expression der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden. Entsprechende
Stämme sind im Stand der Technik verfügbar und
können, zumindest teilweise, über die internationalen
Hinterlegungsstellen wie die ATCC oder die DMSZ bezogen werden. Gleichfalls
können Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen
oder Pflanzenzellen oder Organismen wie z. B. Hefen wie Hansenula
polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, für die
rekombinante Herstellung der Polypeptide eingesetzt werden.
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Die
Klonierung wird nach Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann
wohlbekannt sind (
Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis,
T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York). Vorzugsweise
werden E. coli-Stämme für diesen Zweck benutzt,
wobei ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101,
JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10-, HB101, BL21 codon plus,
BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21 (DE3), MM294, W3110, DSM14459
(
EP1444367 ).
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Ferner
kann die rekombinante Herstellung der erfindungsgemäßen
Polypeptide in einem nicht-menschlichen Wirt erfolgen. Geeignete
eukaryontische Zellen schließen CHO-Zellen, HeLa-Zellen
und andere ein.
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Die
oben beschriebene Transformation bzw. Transfektion kann nach bekannten
Methoden erfolgen, z. B. durch Calciumphosphat-Copräzipitation,
Lipofektion, Elektroporation, PEG/DMSO-Methode, Partikelbeschuß oder
virale/bakteriophage Infektion. Die erfindungsgemäße
Zelle kann die rekombinante Nukleinsäure in extrachromosomaler
oder chromosomal integrierter Form enthalten. Transfektions- und
Transformations-Protokolle sind dem Fachmann bekannt (Chan
and Cohen. 1979. High Frequency Transformation of Bacillus subtilis
Protoplasts by Palsmid DNA. Mol Gen Genet. 168(1): 111–5; Kieser
et al.. 2000. Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation
Norwich.; Sambrook et al.. 1989. Molecular Cloning.
A Laboratory Manual. In: second ed.. Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Cold Spring Harbor. NY.; Irani and Rowe. 1997.
Enhancement of transformation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 by
Mg2+ and heat. Biotechniques 22: 54–56).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Wirt
ein transgenes nicht-menschliches Tier. Transgene nicht-menschliche
Tiere können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren
hergestellt werden. Das erfindungsgemäße transgene
nicht-menschliche Tier kann bevorzugt verschiedene genetische Konstitutionen
aufweisen. Es kann (i) das Gen einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenz konstitutiv oder induzierbar überexprimieren,
(ii) das endogene Gen einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenz in inaktivierter Form enthalten, (iii)
das endogene Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
vollständig oder teilweise durch ein mutiertes Gen einer
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
ersetzt enthalten, (iv) eine konditionale und gewebsspezifische Überexpression
oder Unterexpression des Gens einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenz aufweisen oder (v) einen konditionalen
und gewebsspezifischen Knock-out des Gens einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenz aufweisen. Vorzugsweise enthält
das transgene Tier zusätzlich ein exogenes Gen einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines die Überexpression
erlaubenden Promotors. Alternativ kann das endogene Gen einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenz durch Aktivierung oder/und Austausch
des eigenen Promotors überexprimiert werden. Vorzugsweise
weist der endogene Promotor des Gens einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenz eine genetische Veränderung
auf, die zu einer erhöhten Expression des Gens führt.
Die genetische Veränderung des endogenen Promotors umfasst
dabei sowohl eine Mutation einzelner Basen als auch Deletions- und
Insertionsmutationen.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Wirts ist dieser ein transgener Nager, vorzugsweise eine transgene
Maus, ein transgenes Kaninchen, eine transgene Ratte, oder ein transgenes
Schaf, eine transgene Kuh, eine transgene Ziege oder ein transgenes
Schwein. Mäuse haben gegenüber anderen Tieren
zahlreiche Vorteile. Sie sind leicht zu halten und ihre Physiologie
gilt als Modellsystem für die des Menschen. Die Herstellung
solcher Gen-manipulierten Tiere ist dem Fachmann hinreichend bekannt
und wird nach üblichen Verfahren durchgeführt
(s. h. z. B.
Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F. und Lacy,
E. (1994), Manipulating the Mouse-Embryo;
A Laboratory
Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY;
WO91/08216 ).
Alternativ oder zusätzlich können auch Zellkultursysteme,
insbesondere humane Zellkultursysteme, für die Anwendungen
eingesetzt werden, die für das erfindungsgemäße nicht-menschliche
transgene Tier beschrieben sind.
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Die
codierenden Nukleinsäuresequenzen können in herkömmliche
Plasmide/Vektoren kloniert und nach Transfektion von Mikroorganismen
oder anderen Wirtszellen mit solchen Vektoren in Zellkultur exprimiert werden.
Als Plasmide oder Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für
diesen Zweck zur Verfügung stehende Ausführungsformen
in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B.
von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A.
H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.;, Use of the T7 RNA polymerase
to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 1990, 185,
61–89) oder den Broschüren der Firmen
Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen
werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können
gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a
practical approach, Vol. I–III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez,
R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular
cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel,
D. V., Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol.
1990, 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch,
E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual,
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
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Plasmide,
mit denen das in dieser Erfindung beschrieben Genkonstrukt in bevorzugter
Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden kann, sind: pUC18 (Roche
Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals),
pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET
(Novagen). Geeignete Vektoren sind z. B. auch pET-21a(+) für
E. coli, aber auch andere Expressionsvektoren für prokaryontische
Einzeller sowie Vektoren für Eukaryoten, wie z. B. Hefen
und Insekten- oder Säugerzellen, können verwendet
werden. Als geeignete Vektoren für Hefen haben sich z.
B. der pREP-Vektor oder der pINT-Vektor erwiesen. Für die
Expression in Insektenzellen sind z. B. Baculovirus-Vektoren wie
in
EP127839 oder
EP549721 offenbart, und für
die Expression in Säugerzellen sind z. B. SV40-Vektoren
geeignet, welche allgemein erhältlich sind. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform ist die in den Vektor eingeschleuste
erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
darüber hinaus mit einem von dem Vektor bereitgestellten
Histidin-Tag fusioniert. Bevorzugt wird die eingeschleuste Nukleinsäuresequenz
so in pET-Vektoren, beispielsweise pET-21a(+) oder pET22b kloniert,
dass die Transkription unter der Kontrolle des im Vektor vorhandenen
IPTG-regulierbaren Promotors steht. Alternativ werden auch Rhamnose-regulierbare
Promotoren bevorzugt eingesetzt.
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Die
Vektoren können neben den üblichen Markern, wie
z. B. Antibiotika-Resistenzgenen, weitere funktionelle Nukleotidsequenzen
zur Regulation, insbesondere zur Repression oder Induktion der Expression
des ADH-Gens und/oder eines Reportergens enthalten. Als Promotoren
werden bevorzugt regulierbare schwache Promotoren, wie z. B. der
rha-Promotor oder der nmt1–Promotor, oder regulierbare
starke Promotoren, wie z. B. der lac-, ara-, lambda-, pL-, T7- oder
T3-Promotor, benutzt. Die codierenden DNA-Fragmente müssen
in den Vektoren von einem Promotor aus transkribierbar sein. Weitere
bewährte Promotoren sind z. B. der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor
für die Expression in Insektenzellen (s. z. B.
EP127839 ) oder der frühe
SV40-Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (
Mouse
Mammary Tumour Virus; Lee et al. (1981) Nature, 294 (5838), 228–232).
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Die
erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können
weitere funktionale Sequenzbereiche, wie z. B. einen Replikationsstartpunkt,
Operatoren, oder Terminationssignale enthalten.
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In
einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf Teilsequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
wobei diese Teilsequenzen, bevorzugt aus mindestens 5 oder 10, bevorzugt
50, mehr bevorzugt 100, ganz bevorzugt 150 aufeinanderfolgenden
Nukleotiden, besonders bevorzugt aus mindestens 300 aufeinanderfolgenden
Nukleotiden der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
bestehen. Insbesondere sind dies Primer zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen mittels PCR oder LCR oder Sonden
zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen.
Die Primer sind abgeleitet aus dem 3'- bzw. 5'-Ende der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen. Bevorzugt weisen sie zusätzlich gängige
Schnittstellen, wie z. B. NdeI- am 5'-Ende sowie am 3'-Ende eine
BamHI-Schnittstelle, auf.
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In
einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf ein Verfahren zur Herstellung von verbesserten rec-Polypeptiden
(rekombinante Polypeptide) mit Alkoholdehydrogenaseaktivität
ausgehend von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
wobei man
- a) die Nukleinsäuresequenzen
einer Mutagenese unterwirft,
- b) die aus a) erhältlichen Nukleinsäuresequenzen
in einen geeigneten Vektor kloniert und diesen in ein geeignetes
Expressionsystem transferiert und
- c) die gebildeten Polypeptide mit verbesserter Aktivität
und/oder Selektivität und/oder Stabilität detektiert und
isoliert.
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Ebenfalls
einen Gegenstand der Erfindung bilden rec-Polypeptide oder diese
codierende Nukleinsäuresequenzen, welche nach einem wie
eben beschriebenen Verfahren erhältlich sind.
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Die
Herstellung der zur Erzeugung der verbesserten rec-Polypeptide benötigten
Nukleinsäuresequenzen und deren Expression in Wirten wird
im weiteren Verlauf der Beschreibung angesprochen und gilt hier
entsprechend.
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Ebenfalls
Gegenstand der Erfindung sind Mutanten der Alkoholdehydrogenase
mit geänderter Coenzym-Spezifität, insbesondere
solche Mutanten, die NAD an Stelle von NADP akzeptieren.
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In
einer nächsten Ausgestaltung richtet sich die vorliegende
Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen
(rec-)Polypeptide zur Herstellung von enantiomerenangereicherten
Alkoholen, Hydroxyketonen oder Hydroxyaldehyden. Die Umsetzung entsprechender
Substrate zu enantiomerenangereicherten Produkten mit Hilfe von
Alkoholdehydrogenasen ist dem Fachmann grundsätzlich bekannt
(siehe oben angegebene Literaturstellen).
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Beispiele
für enantiomerenangereicherte Verbindungen, die aus den
entsprechenden Vorstufen hergestellt werden können, sind
dem Fachmann ebenfalls geläufig. Sie lassen sich an Hand
folgender allgemeiner Reaktionsgleichung erläutern:
in der
R
1 und R
2 verschieden
voneinander sind und folgende Strukturen umfassen können:
(C
1-C
20)-Alkyl, (C
1-C
8)-Alkoxy, HO-(C
1-C
8)-Alkyl, (C
2-C
8)-Alkoxyalkyl,
(C
1-C
8)-Alkoxycarbonyl,
(C
6-C
18)-Aryl, (C
7-C
19)-Aralkyl, (C
3-C
18)-Heteroaryl,
(C
4-C
19)-Heteroaralkyl,
(C
1-C
8)-Alkyl-(C
6-C
18)-Aryl, (C
1-C
8)-Alkyl-(C
3-C
18)-Heteroaryl,
(C
3-C
8)-Cycloalkyl,
(C
1-C
8)-Alkyl-(C
3-C
8)-Cycloalkyl,
(C
3-C
8)-Cycloalkyl-(C
1-C
8)-Alkyl, oder
R
1 und R
2 bilden eine
(C
3-C
5)-Alkylenbrücke.
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Besonders
bevorzugte Substrate für die erfindungsgemäßen
Alkohol-Dehydrogenasen sind R2 = OH, NH2, SH oder andere Heteroatom-haltige Gruppen.
Glyceraldehyd ist eine bevorzugte Verbindung. Weitere Substrate
sind ebenfalls Ketoesterverbindungen, insbesondere α-, β-, γ-Ketoesterverbindungen.
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Eine
weitere Ausgestaltung der Erfindung betrifft die Verwendung der
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
zur Herstellung von Ganzzellkatalysatoren bzw. die Verwendung der
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
zur Mutagenese.
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Ebenfalls
Gegenstand der Erfindung ist ein Ganzzellkatalysator, aufweisend
ein kloniertes Gen codierend für ein erfindungsgemäßes
Polypeptid mit Alkoholdehydrogenase-Aktivität und ein kloniertes
Gen für ein Enzym, das zur Regenerierung von NADPH oder – bei
Vorliegen von NAD-abhängigen Mutanten – NADH geeignet
ist, insbesondere eine Formiat-Dehydrogenase, eine Glucose-Dehydrogenase
oder ein NADP- oder NAD-regenerierendes Enzym wie die NAD(P)H-Oxidase,
Lactat-Dehydrogenase oder Glutamat-Dehydrogenase. Der Vorteil eines
Ganzzellkatalysators ist die gleichzeitige Expression beider Polypeptidsysteme
(Alkohol-Dehydrogenase und ein Enzym zur Coenzym-Regenerierung),
womit nur noch ein rec-Organismus für die Reaktion angezogen
werden muss. Um die Expression der Polypeptide im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten
abzustimmen, können die entsprechend codierenden Nukleinsäuresequenzen
auf unterschiedlichen Plasmiden mit unterschiedlichen Kopienzahlen
untergebracht werden und/oder unterschiedlich starke Promotoren
für eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen
verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise
eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung
nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit
ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt
(
Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.;
Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996),
Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression
of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase
T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46–54;
Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.;
Strasser, A. W.;
DE19920712 ).
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
lassen sich also vorzugsweise zur Herstellung von rec-Polypeptiden
einsetzen. Durch rekombinante Techniken, die dem Fachmann hinlänglich
bekannt sind, gelangt man zu Organismen, welche in der Lage sind,
das betrachtete Polypeptid in für einen technischen Prozess
ausreichender Menge zur Verfügung zu stellen. Die Herstellung
der erfindungsgemäßen rec-Polypeptide erfolgt
nach dem Fachmann bekannten gentechnologischen Verfahren (Sambrook,
J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design
and construction of expression plasmid vectors in E. coli, Methods
Enzymol. 185, 14–37; Rodriguez, R. L.
und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning
vectors and their uses, 205–225, Butterworth, Stoneham).
Bezüglich der allgemeinen Vorgehensweise (PCR, Klonierung,
Expression etc.) sei auch auf folgende Literatur und das dort zitierte
verwiesen: Universal GenomeWalkerTM Kit
User Manual, Clontech, 3/2000 und dort zitierte Literatur; Triglia
T.; Peterson, M. G. und Kemp, D. J. (1988), A procedure for in vitro
amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known
sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook,
J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York; Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds)
(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their
uses, Butterworth, Stoneham.
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Darüber
hinaus betrifft die vorliegende Erfindung in einem nächsten
Aspekt ein gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem aufweisend
eine cofaktorabhängige enzymatische Transformation einer
Vorstufe (Substrat) mit einem erfindungsgemäßen
Polypeptid und eine enzymatische Regeneration des Cofaktors (NAD(P)H).
Die enzymatische Regeneration des Cofaktors sollte vorteilhafterweise
mit den oben im Zusammenhang mit dem Ganzellkatalysator besprochenen
Enzymen vonstatten gehen, sie kann jedoch auch elektrochemisch oder
durch chemische Oxidation ohne den Einsatz von Enzymen durchgeführt
werden. Als Reaktionssystem kann jedes Gefäß verstanden
werden, in dem die erfindungsgemäße Reaktion durchgeführt
werden kann, also Reaktoren jeder Art (Schlaufenreaktor, Rührkessel,
Enzymmembranreaktor etc.), oder Diagnosekits in jedweder Form. Bei
Verwendung einer Formiatdehydrogenase erfolgt die Cofaktor-Regenerierung
unter Einsatz von Ameisensäure bzw. deren Salze als Reduktionsmittel.
Alternativ können aber auch andere enzymatische oder substratbasierende
cofaktoregenerierenden Systeme (z. B. NADH-Oxidase, Glucosedehydrogenase)
eingesetzt werden.
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Eine
abschließende Verwendung der erfindungsgemäßen
(rec-)Polypeptide mit Alkoholdehydrogenase-Aktivität bzw.
des erfindungsgemäßen Ganzellkatalysators betrifft
deren Einsatz in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion
von Aldehyden. Für die Umsetzung der Aldehyde eignen sich
wässrige Lösungsmittel, die entsprechend gepuffert
sind.
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Bevorzugt
wird die Reduktion bei einer Temperatur zwischen 10 und 80°C,
besonders bevorzugt zwischen 20 und 50°C ausgeführt
(siehe dazu 2). Der bevorzugte pH-Wert für
die enzymatisch katalysierte Reduktion von Carbonylverbindungen
mit der erfindungsgemäßen Alkoholdehydrogenase
liegt zwischen pH 4 und pH 8, besonders bevorzugt zwischen pH 4,5
und pH 6,5 (siehe dazu 1a). Für die Oxidation
von Hydroxygruppen liegt der bevorzugte pH-Wert zwischen 7,5 und
11, besonders bevorzugt zwischen 8 und 10 (siehe dazu 1b).
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Für
die Anwendung kann das betrachtete Polypeptid in nativer Form als
homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes
Enzym verwendet werden. Weiterhin kann das (rec-)Polypeptid auch
als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden
oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten
Zellmasse des Wirtsorganismus. Möglich ist ebenfalls die
Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma B.
P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien – Techniken
und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836–852). Vorteilhafterweise
erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar,
V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of Chymotrypsin
Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc.
116, 5009–5010; Mori, T.; Okahata, Y.
(1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective
glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron
Lett. 38, 1971–1974; Otamiri, M.; Adlercreutz,
P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin
and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form
in toluene, Biocatalysis 6, 291–305). Ganz besonders
bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven
Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol
(PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya,
N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase
complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech.
11, 375–378). Äußerst bevorzugt
ist die Immobilisierung an Eupergit®,
insbesondere Eupergit C® und Eupergit
250L® (Röhm) (als Übersicht, siehe: E.
Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym. (2000),
10, 157). Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung
an Ni-NTA in Kombination mit dem durch Anhängen eines His-Tags
(Hexa-Histidin) veränderten Polypeptid (Petty,
K. J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography In: Ausubel,
F. M. et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2,
New York: John Wiley and Sons). Die Verwendung als CLECs
ist ebenfalls denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin,
A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC)
of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380–383).
Durch diese Maßnahmen kann es gelingen, aus (rec-)Polypeptiden,
welche durch organische Solventien instabil werden, solche zu generieren,
die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln
bzw. ganz in Organik arbeiten können.
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Für
die Umsetzung von Ketonen mit den erfindungsgemäßen
Polypeptiden geht man vorzugsweise wie folgt vor. Die Polypeptide
werden in der gewünschte Form (frei, immobilisiert, in
Wirtsorganismen oder als Ganzzellkatalysator) in die wässrige
Lösung gegeben. Unter Einhaltung der optimalen Temperatur-
bzw. des optimalen pH-Wertbereiches wird das Keton, ggf. der Cofaktor
und ggf. die den Cofaktor regenerierenden Mittel zu dieser Mischung
gegeben. Nach der erfolgten Umsetzung kann der gewonnene Alkohol
nach dem Fachmann bekannten Verfahren (Kristallisation, Extraktion,
Chromatographie) aus der Reaktionsmischung isoliert werden.
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Folgendes
Schema 5 zeigt die Reaktionsgleichung der Umsetzung von racemischem
Glyceraldehyd zu L-Glyceraldehyd durch ADH-katalysierte Reduktion.
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Es
konnte überraschend gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen
exprimierbaren Proteine eine enzymatische Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität
besitzen. Insbesondere aliphatische Hydroxyaldehyde oder Aldehyde
mit Polyol-Struktur werden von der erfindungsgemäßen
Alkoholdehydrogenase reduziert (siehe experimenteller Teil).
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Weiterhin
zeichnet sich die erfindungsgemäße Alkoholdehydrogenase
durch ihre ausgezeichnete Regioselektivität aus. So wird
Glyceraldehyd mit guter Aktivität reduziert, während
die strukturanaloge Verbindung Dihydroxyaceton praktisch nicht umgesetzt
wird. Des Weiteren zeichnet sich die beanspruchte Alkoholdehydrogenase
durch ihre ausgezeichnete Stereoselektivität aus. So wird
D-Glyceraldehyd mit sehr guter Aktivität umgesetzt, das
L-Enantiomere dagegen nicht. Diese Stereoselektivität bleibt
auch erhalten, wenn als Substrat die racemische Mischung eingesetzt
wird. Das Enzym reduziert aus diesem Gemisch nur die D-Komponente.
Diese Umsetzung kann vollständig ablaufen, so dass als
Produkt der vollständigen Reduktion hoch enantiomerenangereichteres
L-Glyceraldehyd in der Reaktionslösung verbleibt, es können
damit ee-Werte > 99%
erreicht werden.
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Unter
optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten)
Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen
Antipode im Gemisch mit der anderen in > 50 mol-% verstanden.
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Unter
dem Begriff Nukleinsäuresequenzen werden alle Arten von
einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA als
auch RNA oder Gemische derselben subsumiert. Die erfindungsgemäße
Nukleinsäuresequenz kann demnach ein DNA- oder ein RNA-Molekül
sein. Bevorzugt ist, dass das Nukleinsäuremolekül
ein cDNA- oder ein mRNA-Molekül ist. Erfindungsgemäß kann
das DNA-Molekül desweiteren ein genomisches DNA-Molekül
sein.
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Der
Begriff ”komplementär” bedeutet erfindungsgemäß,
dass sich die Komplementarität über den gesamten
Bereich des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls
ohne Lücken erstreckt. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt,
dass die Komplementarität sich zu 100% über den
gesamten Bereich der erfindungsgemäßen Sequenz,
d. h. vom dargestellten 5'-Ende bis zum dargestellten 3'-Ende erstreckt.
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Die
Verbesserung der Aktivität und/oder Selektivität
und/oder Stabilität bedeutet erfindungsgemäß, dass
die Polypeptide aktiver und/oder selektiver bzw. unter den verwendeten
Reaktionsbedingungen stabiler sind. Während die Aktivität
und die Stabilität der Enzyme für die technische
Anwendung naturgemäß möglichst hoch sein
sollte, ist in Bezug auf die Selektivität dann von einer
Verbesserung die Rede, wenn entweder die Substratselektivität
abnimmt, die Enantioselektivität der Enzyme jedoch gesteigert
ist.
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Der
Ausdruck ”Homologie” (oder Identität)
wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1 – V/X] × 100
definiert werden, worin H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an
Nukleobasen/Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V
die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren
der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist.
Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequenzen,
welche für Polypeptide codieren, alle Sequenzen umfasst,
die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes
möglich erscheinen.
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Als
(C1-C8)-Alkylreste
sind anzusehen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl,
sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl oder Octyl samt aller
ihrer Bindungsisomeren. Ein (C1-C20)-Alkylrest ist im Rahmen der erfindungsgemäßen
Definition ein entsprechender Rest mit 1 bis max. 20 C-Atomen. Ein
(C3-C20)-Alkylrest
ist im Rahmen der erfindungsgemäßen Definition
ein entsprechender Rest mit 3 bis max. 20 C-Atomen. Der Rest (C1-C8)-Alkoxy entspricht
dem Rest (C1-C8)-Alkyl
mit der Maßgabe, dass dieser über ein Sauerstoffatom
gebunden ist. Als (C2-C8)-Alkoxyalkyl
sind Reste gemeint, bei denen die Alkylkette durch mindestens eine Sauerstoffunktion
unterbrochen ist, wobei nicht zwei Sauerstoffatome miteinander verbunden
sein können. Die Anzahl der Kohlenstoffatome gibt die Gesamtzahl
der im Rest enthaltenen Kohlenstoffatome an. Eine (C3-C5)-Alkylenbrücke ist eine Kohlenstoffkette
mit drei bis fünf C-Atomen, wobei diese Kette über
zwei verschiedene C-Atome an das betrachtete Molekül gebunden
ist.
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Die
eben beschriebenen Reste können einfach oder mehrfach mit
Halogenen und/oder (C1-C8)-Alkoxycarbonyl
und/oder N-, O-, P-, S-, Si-atomhaltigen Resten substituiert sein.
Dies sind insbesondere Alkylreste der oben genannten Art, welche
eines oder mehrere dieser Heteroatome in ihrer Kette aufweisen bzw.
welche über eines dieser Heteroatome an das Molekül
gebunden sind.
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Unter
(C3-C8)-Cycloalkyl
versteht man Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl bzw.
Cycloheptylreste etc. Diese können mit einem oder mehreren
Halogenen und/oder N-, O-, P-, S-, Si-atomhaltige Reste substituiert
sein und/oder N-, O-, P-, S-Atome im Ring aufweisen, wie z. B. 1-,
2-, 3-, 4-Piperidyl, 1-, 2-, 3-Pyrrolidinyl, 2-, 3-Tetrahydrofuryl,
2-, 3-, 4-Morpholinyl.
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Ein
(C3-C8)-Cycloalkyl-(C1-C8)-Alkylrest bezeichnet
einen wie oben dargestellten Cycloalkylrest, welcher über
einen wie oben angegebenen Alkylrest an das Molekül gebunden
ist.
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(C1-C8)-Alkoxycarbonyl
bedeutet im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest
mit max. 8 C-Atomen, welcher über eine O(C=O)-Funktion
gebunden ist.
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(C1-C8)-Acyloxy bedeutet
im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit
max. 8 C-Atomen, welcher über eine (C=O)O-Funktion gebunden
ist.
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(C1-C8)-Acyl bedeutet
im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit
max. 8 C-Atomen, welcher über eine (C=O)-Funktion gebunden
ist.
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Unter
einem (C6-C18)-Arylrest
wird ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 C-Atomen verstanden. Insbesondere
zählen hierzu Verbindungen wie Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-,
Phenanthryl-, Biphenylreste oder an das betreffende Molekül
annelierte Systeme der vorbeschriebenen Art, wie z. B. Indenylsysteme,
welche ggf. mit ((C1-C8)-Alkyl,
(C1-C8)-Alkoxy,
(C2-C8)-Alkoxyalkyl,
NH(C1-C8)-Alkyl,
N((C1-C8)-Alkyl)2, OH, O(C1-C8)-Alkyl, NO2, NH(C1-C8)-Acyl, N((C1-C8)-Acyl)2, F, Cl, CF3, (C1-C8)-Acyl, (C1-C8)-Acyloxy, (C7-C19)-Aralkylrest, (C4-C19)-Heteroaralkyl substituiert sein können.
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Ein
(C7-C19)-Aralkylrest
ist ein über einen (C1-C8)-Alkylrest an das Molekül gebundener
(C6-C18)-Arylrest.
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Ein
(C3-C18)-Heteroarylrest
bezeichnet im Rahmen der Erfindung ein fünf-, sechs- oder
siebengliedriges aromatisches Ringsystem aus 3 bis 18 C-Atomen,
welches Heteroatome wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel
im Ring aufweist. Als solche Heteroaromaten werden insbesondere
Reste angesehen, wie 1-, 2-, 3-Furyl, wie 1-, 2-, 3-Pyrrolyl, 1-,
2-, 3-Thienyl, 2-, 3-, 4-Pyridyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-Indolyl,
3-, 4-, 5-Pyrazolyl, 2-, 4-, 5-Imidazolyl, Acridinyl, Chinolinyl,
Phenanthridinyl, 2-, 4-, 5-, 6-Pyrimidinyl. Die Heteroaromaten können in
gleicher Weise wie die oben genannten (C6-C18)-Arylreste substituiert sein.
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Unter
einem (C4-C19)-Heteroaralkyl
wird ein dem (C7-C19)-Aralkylrest
entsprechendes heteroaromatisches System verstanden.
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Als
Halogene (Hal) kommen Fluor, Chlor, Brom und Iod in Frage.
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Unter
dem Begriff wässriges Lösungsmittel wird Wasser
oder ein hauptsächlich aus Wasser bestehendes Lösungsmittelgemisch
mit wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln
wie z. B. Alkoholen, insbesondere Methanol oder Ethanol, oder Ethern,
wie THF oder Dioxan, verstanden
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Die
Gewinnung und biochemische Charakterisierung eines Enzyms, mit dem
optisch aktive Verbindungen wie Glyceraldehyd gewonnen werden können,
ist am Beispiel der Glycerol-Dehydrogenase aus Gluconobacter oxydans
im folgenden beschrieben.
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Beispiele:
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Beispiel 1: Auffindung, Sequenzierung
und Klonierung des Glyceraldehyd-umsetzenden ADH-Gens aus Gluconobacter
oxydans
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Ausgehend
von der Proteinsequenz der GlyDH aus Hypocrea jecorina wurde ein
in silico Screening nach Alkohol-Dehydrogenase (ADH)-Genen mit dem
Genom von G. oxydans durchgeführt. Nach Klonierung und
Expression verschiedener ADH-Gene wurden photometrische Aktivitätstests
mit enzymhaltigem Rohextrakt durchgeführt. Ein wichtiges
Kriterium für die Bewertung der ADHs war die Substratselektivität,
d. h. erfindungsgemäß geeignete Enzyme sollten
Glyceraldehyd (GA) deutlich besser umsetzen als die strukturanaloge Verbindung
Dihydroxyaceton (DHA). Daher wurden alle rekombinanten Enzyme sowohl
mit GA als auch mit DHA getestet, die Testansätze enthielten
dabei pro 1 ml: 100 mM TEA-Puffer pH 7,0; 0, 24 mM NADH oder NADPH;
10 mM DHA bzw. GA und 10 μl Enzym (Rohzellextrakt). Überraschenderweise
konnte bei diesen Tests ein Protein gefunden werden, das Glyceraldehyd
mit guter Aktivität umsetzt, während Dihydroxyaceton praktisch
nicht akzeptiert wird. Im photometrischen Test wurden gefunden:
Glyceraldehyd-Reduktion mit NADPH: 67 U/ml; Glyceraldehyd-Reduktion
mit NADH: 0,5 U/ml; Dihydroxyaceton-Reduktion mit NADPH: 1,5 U/ml;
Dihydroxyaceton-Reduktion mit NADH: 0 U/ml. Die Ergebnisse zeigen
zudem, dass es sich um ein NADPH-abhängiges Enzym handelt,
NADH zeigt nur eine vernachläßigbare Aktivität.
Da bei dieser Reaktion ein Aldehyd zu einem Alkohol reduziert wird,
muss es sich bei dem katalysierenden Enzym um eine Alkohol-Dehydrogenase
(ADH) handeln. Abgeleitet aus dem Namen des sie ursprünglich
exprimierenden Bakteriums wurde sie GO-ADH genannt.
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Beispiel 2: Heterologe Expression von
GO-ADH
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Zur
Expression der GO-ADH wurden E. coli BL21(DE3)-Zellen mit dem Vektor
pGOADH transformiert und in Ampicillin-haltigem LB-Medium kultiviert.
Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte (bei 600 nm) von
0,5 bei 37°C inkubiert und die Expression der GO-ADH bei
Erreichen der genannten optischen Dichte mit 0,3 mM IPTG-Lösung
induziert. Daraufhin wurde die Zellsuspension für 18 Stunden
bei 25°C inkubiert, um die optimale Ausbeute an GO-ADH
zu erzielen.
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Beispiel 3: Untersuchung des Substratspektrums
der rekombinanten Alkoholdehydrogenase
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In
einem ersten Schritt erfolgt die Herstellung von Rohextrakt, enthaltend
die rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Gluconobacter oxydans,
durch Zellaufschluss des Stamms E. coli BL21(DE3) pGOADH. Dazu werden
52 g des Zellpellets mit 120 ml Tris-HCl-Puffer (pH 7,5; 100 mM)
versetzt und darin resuspendiert, so dass eine Biomassenkonzentration
von ca. 433 g/L vorliegt. Anschließend wird 1 ml dieser
Suspension unter Kühlung für 2 × 2 min
mittels Ultraschall aufgeschlossen. Nach Abzentrifugation (14.000
rpm; 10 min) wird ein Überstand erhalten, der anschließend
als Enzymlösung (Rohextrakt) für die Aktivitätsbestimmung
und präparativen Versuche verwendet wird. Die photometrische
Aktivitätsbestimmung kann in oxidativer und reduktiver
Richtung erfolgen, für die Reduktion werden eingesetzt:
100 mM TEA-Puffer pH 7; 0, 24 mM NADPH; 10 mM Substrat (Glyceraldehyd
oder andere Keto-Verbindungen); 10 μl Enzym (Rohextrakt).
Für die Oxidationsreaktion werden eingesetzt: 100 mM Kaliumphosphat
pH 9,7; 2 mM NADP; 100 mM Substrat (Glycerol oder andere Alkohole);
30 mM Ammoniumsulfat; 10 μl Enzym (Rohextrakt). Die Reaktion
wird in einer 1 cm-Küvette durchgeführt, dazu
werden die Komponenten in der Küvette gemischt, die Küvette
ins Photometer gestellt und die Datenaufnahme gestartet. Die Enzymlösung
wird erst direkt vor Messbeginn zugegeben. Die Aktivität
des Enzyms wird durch Änderung der photometrisch bestimmten
Konzentration von NADPH in einem bestimmten Zeitintervall bestimmt.
Die Messung erfolgt bei einer Temperatur von 30°C für
die Reduktion und einer Temperatur von 37°C für
die Oxidation, einer Wellenlänge von 340 nm und mit einer
Messzeit von 1 min.
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Die
Umsetzungen können sowohl mit Rohextrakt-Protein als auch
mit partiell oder vollständig gereinigtem Enzympräparat
durchgeführt werden. Zur Reinigung kann der Rohextrakt
mit Anionenaustausch-Chromatographie partiell gereinigt werden (Reinigung
an Q-Sepharose FF-Material, äquilibriert mit 0,1 M TEA-Puffer
(pH 8,0), Elution mit einen Gradienten von 0–0,6 M NaCl).
Eine einfache Methode zur nahezu vollständigen Reinigung
geht von einem Enzym aus, das am N-Terminus einen sog. His-Tag (Hexahistidin)
trägt. Ein solches modifiziertes Enzym kann in einfacher
Weise an eine Nickel-NTA-Säule (Qiagen) gebunden (äquilibriert
mit 50 mM TEA-Puffer pH 7) und dann mit einem Imidazol-Gradienten
(von 0 auf 500 mM) eluiert werden. Der His-Tag und die nachfolgende
Elution ermöglichen eine sehr effiziente Reinigung des
Enzyms, man erhält mit diesem Reinigungsschritt ein praktisch
homogenes Enzympräparat.
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Die
Ergebnisse sind in U/mg Enzymprotein anbei in Tabelle 1 (Oxidation)
und Tab. 2 (Reduktion) dargestellt. Neben den in der Tab. 2 aufgeführten
Aldehyden und Ketonen wird auch der geschützte Glyceraldehyd,
das Isopropyliden-Glyceraldehyd, mit guter Aktivität akzeptiert.
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Tab.
1: Aktivität der GO-ADH bei Oxidation verschiedener Substrate.
Eingesetzt wurde ein Enzympräparat mit N-terminalem His-Tag,
das durch Chromatographie an Ni-NTA hoch gereinigt wurde. Die Bestimmung des
Rohextraktproteingehalts in der Enzymlösung gemäß der
Methode nach Bradford ergab dabei einen Proteingehalt von 4,3 mg
pro ml Enzymlösung.
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Tab.
2: Aktivität der GO-ADH bei Reduktion verschiedener Substrate
Eingesetzt wurde ein Enzympräparat mit N-terminalem His-Tag,
das durch Chromatographie an Ni-NTA hoch gereinigt wurde. Die Bestimmung des
Rohextraktproteingehalts in der Enzymlösung gemäß der
Methode nach Bradford ergab dabei einen Proteingehalt von 1,2 mg
pro ml Enzymlösung.
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Beispiel 4: Abhängigkeit der
Aktivität der rekombinanten Alkoholdehydrogenase vom pH-Wert
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Zur
Bestimmung der Abhängigkeit der Aktivität der
rekombinanten GO-ADH vom pH-Wert wurden die Enzymaktivitäten
photometrisch mit dem in Beispiel 3 beschriebenen oxidativen bzw.
reduktiven Test, wobei hier lediglich Puffer bei verschiedenen pH-Werten
eingesetzt wurden. Die Auswertungen ergaben (1a und 1b),
dass das Enzym für die reduktive Richtung (Reduktion von
Glyceraldehyd mit NADPH) ein pH-Optimum bei pH 5,5 aufwies, in der
oxidativen Richtung dagegen bei pH 10,0 höchste Aktivität
zeigte.
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Beispiel 5: Abhängigkeit der
Aktivität der rekombinanten Alkoholdehydrogenase von der
Temperatur
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Zur
Bestimmung der Abhängigkeit der Aktivität der
rekombinanten GO-ADH von der Temperatur wurden die Enzymaktivitäten
photometrisch mit dem in Beispiel 3 beschriebenen reduktiven Test
gemessen, lediglich die Temperatur wurde im Bereich von 5 bis 60°C
variiert. 2 zeigt, dass man eine maximale
Aktivität bei 55°C erreicht.
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Beispiel 6: Temperaturstabilität
der rekombinanten Alkoholdehydrogenase
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Zur
Bestimmung der Temperaturstabilität der rekombinanten GO-ADH
wurde das Enzym bei verschiedenen Temperaturen zwischen 5 und 58°C
für 10 min vorinkubiert und danach die Restaktivität
mit dem reduktiven Standardtest (s. Beispiel 3) mit Glyceraldehyd
und NADPH bestimmt. 3 zeigt, dass die Aktivität
durch diese Vorinkubation bei 42°C beträchtlich
abnimmt.
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Beispiel 7: Lagerstabilität der
rekombinanten Alkoholdehydrogenase
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Rohextrakt
der rekombinanten Alkoholdehydrogenase wurde bei 22°C,
4°C und –20°C gelagert und die Restaktivität
nach bestimmten Zeitintervallen mit dem in Beispiel 3 beschriebenen
Standardtest (Glyceraldehyd und NADPH) bestimmt. 4 zeigt
den Verlauf der Restaktivität unter den verschiedenen Lagerbedingungen.
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Beispiel 8: Verwendung der rekombinanten
Alkoholdehydrogenase: Gewinnung von enantiomerenen-angereichertem
Glyceraldehyd durch Racematspaltung mit isolierten Enzymen
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Es
wurden 50 mM racemischer Glyceraldehyd, 100 U/ml GO-ADH, 100 mM
Glucose, 2 U/ml GDH und 0,5 mM NADP in 100 mM TEA pH 7 in einem
Gesamtvolumen von 1 ml eingesetzt. Die Umsetzung fand bei 20°C
statt. Die Reduktion von GA wurde über 3 Stunden beobachtet,
in bestimmten Zeitintervallen wurden Proben entnommen und die Konzentration
der beiden Glyceraldehyd-Enantiomeren gaschromatographisch bestimmt
(GC-Bestimmungsmethode s. Beispiel 9). Eine Cofaktorregenerierung
fand mit Hilfe der GDH statt. In 5 ist das
Ergebnis dargestellt, welches darauf hin deutet, dass GO- ADH Glyceraldehyd
enantioselektiv reduziert, dabei wird das D-Enantiomer abgebaut
und L-Glyceraldehyd wird angereichert. Dabei konnte nach einer Reaktionszeit
von 4 h ein ee-Wert von 95,2% ermittelt werden. Deshalb handelt
es sich bei GO-ADH um ein potenzielles Enzym für die Racematspaltung
von Glyceraldehyd.
-
Beispiel 9: Gewinnung von enantiomerenen-angereichertem
Glyceraldehyd mit einem Ganzzellkatalysator
-
Konstruktion
eines rekombinanten E. coli-Stamm für die Ganzzell-Katalyse:
Als Ganzzell-Katalysator wurde ein rekombinanter E-coli-Stamm konstruiert,
der sowohl das Gen für die GO-ADH als auch ein Gen für ein
Enzym enthält, dessen Genprodukt die Regenerierung von
NADPH übernehmen kann. Als Regenerierungsenzym wurde die
Glucose-Dehydrogenase (GDH) aus Bacillus subtilis eingesetzt. Für
die Coexpression von GO-ADH und GDH wurde der Expressionsvektor
pETDuet-1 (Novagen) gewählt. Dieser Vektor enthält
neben einem Ampicillin-Resistenzgen zwei multiple Klonierungsstellen,
denen jeweils ein T7-Promotor sowie eine ribosomale Bindungsstelle
vorausgeht. Der T7-Terminator sitzt am Ende der zweiten multiplen
Klonierungsstelle. Der Vektor ist für die Coexpression
zweier Gene optimal geeignet.
-
Für
das gdh-Gen wurden Primer konstruiert, die dem Gen die Restriktionsschnittstellen
EcoRI und NotI an den Enden anfügen sollten. Diese Primer
wurden in einer PCR eingesetzt. Das aufgereinigte PCR-Produkt sowie
der Vektor pETDuet-1 wurden anschließend einer Restriktion
mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI unterzogen. Der geschnittene
Vektor wurde mit alkalischer Phosphatase aus Shrimps dephosphoryliert.
Beide DNA-Fragmente wurden nach Ligation mit T4 DNA Ligase mit dem
kompetenten Expressionsstamm E. coli XL1-Blue transformiert. Nach
Anzucht einiger Klone erfolgte die Isolierung der Plasmide mit nachfolgender
Restriktion und gelelektrophoretischer Analyse. Die gdh-Sequenz
einer der erhaltenen Klone wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
-
Anschließend
erfolgten Restriktionsansätze dieses Plasmids und dem goadh-Fragment,
dem mittels PCR die Enden NdeI und KpnI angefügt wurden,
mit den Restriktionsenzymen NdeI und KpnI. Nach der Dephosphorylierung
des Vektors mit alkalischer Phosphatase aus Shrimps erfolgten die
Ligation der beiden DNA-Fragmente mit T4 DNA Ligase und die Transformation
mit kompetenten E. coli XL1-Blue-Zellen. Von den nach Selektion
auf LBamp-Platten resultierenden Kolonien wurden einige Klone ausgewählt
und in jeweils 5 ml LBamp-Medium über Nacht angezogen.
Aus den Kulturen wurde die Plasmid-DNA isoliert, welche nach Restriktion
auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurde. Die Sequenzierung
eines der erhaltenen Klone bestätigte die korrekte Gensequenz. 6 gibt
die Plasmidkarte für das Plasmid wieder, das die Gene für
die beiden Enzyme GO-ADH und GDH enthält.
-
Für
die Expression wurde der Vektor pAW-21 mit kompetenten E. coli BL21(DE3)-Zellen
transformiert. Eine Einzelkolonie wurde in 5 ml LBamp-Medium überimpft
und über Nacht bei 37°C geschüttelt.
Anschließend wurde 1%-ig in 30 ml LBamp-Medium überimpft,
bei 37°C geschüttelt und nach Erreichen einer
OD600 von 0,5 mit 1 mM IPTG die Genexpression induziert. Nach 20-stündigem
Schütteln bei 25°C wurden die Zellen geerntet.
-
Zellanzucht:
E. coli BL21 (DE3) pAW21: Eine Einzelkolonie von einer Agarplatte
(LB/100 mg/L Ampicillin) wird gepickt und in 5 ml LB-Medium (100
mg Ampicillin/L) über Nacht bei 37°C angezogen.
Ein Erlenmeyerkolben mit 30 mL LB-Mediums (100 mg Amp./L) wird mit
300 μL dieser Kultur angeimpft und über das Wochenende
bei Raumtemperatur inkubiert. 500 mL LB-Medium (100 mg/L Ampicillin)
in einem 2-L-Erlenmeyerkolben werden mit 5 mL der Kultur angeimpft
und bei 37°C bis OD580 = 0.56 angezogen, dann mit 1 mM IPTG
induziert und bei 25°C über 16 Stunden geschüttelt.
Nach Zentrifugation bei 4°C (30 min, 3200 G) werden 3.61
g Zellen erhalten, die bei –20°C gelagert werden.
Messungen zur Aktivität der Enzyme GDH und GO-ADH in den
Ganzzellkatalysatoren: 80 mg Zellen werden in 320 μL TEA-Puffer
(50 mM, pH 7.0) suspendiert, per Ultraschall (3 × 60 sec.,
50% Cycle, 50% Intensität, je 60 sec. Pause) auf Eis aufgeschlossen.
Die Aktivität der löslichen Proteine wird nach
Standard-Tests am Photometer ermittelt, es wurden 151 U/ml für
die GO-ADH (Test mit rac. Glyceraldehyd/NADPH) und 89 U/ml für
die Glcucose-Dehydrogenase (Test mit 5 mMGlucose, 0,25 mM NAD) ermittelt.
Der Bradford-Test ergab einen Proteingehalt von 15.6 mg/mL.
-
Racematspaltung
unter Verwendung des Ganzzell-Katalysators (rekombinante E. coli-Zellen):
Zur Gewinnung von enantiomeren-angereichertem Glyceraldehyd wurden
eingesetzt: 100 mM Ammoniumcarbonat-Puffer, mit konz. HCl auf pH
8.0 eingestellt; 300 mM Glyceraldehyd, 180 mM Glucose, wobei nach
80 Std 12,6 mM nachdosiert wurden; 56 g/L Zellen BL21 pAW21 (Zellfeuchtgewicht).
Durchführung: In 30 ml Puffer werden 300 mM racemisches
Glyceraldehyd und 180 mM Glucose vorgelegt, mit 1.7 g Ganzzellkatalysator versetzt
und bei Raumtemperatur (22°C) unter Lichtausschluss gerührt.
Regelmäßig werden Proben entnommen, derivatisiert
und per Gaschromatographie vermessen, gleichzeitig wurde der pH-Wert
regelmäßig kontrolliert. Die GC-Analytik zeigt
bei 71,5 Std Reaktionsdauer einen ee-Wert für das L-Enantiomere
des Glyceraldehyds von 97.4%. Nach 75 Stunden Reaktionsdauer wurden
10 ml Ammoniumcarbonat-Lösung sowie 100 mg Glucose nachdosiert.
Eine Probe nach 80 Std. Reaktionsdauer zeigte am GC, dass nur noch
das L-Enantiomere nachweisbar war. Die Reaktionslösung
wurde zentrifugiert (10 min, 20000 G), der klare Überstand
(ca. 38 ml) wird abgenommen und bei –20°C gelagert.
Für die GC-Analytik wurden die Proben jeweils nach folgender
Methode aufbereitet: Es wurden 120 μL Probe entnommen und
zentrifugiert, 100 μL Überstand wurden derivatisiert
mit 150 μL Ethylacetat, 150 μL 1,4-Dioxan, 100 μL
Essigsäureanhydrid und 10 μL Pyridin; die Lösung wird
direkt injiziert. Die Konzentration der beiden Glyceraldehyd-Enantiomere
wurde unter folgenden Bedingungen bestimmt: Säule: CP-Chirasil-DEX
CB (Varian), Trennung bei 108°C (isotherm), Trägergas:
Helium (200 ml/min), Injektionsvolumen: 8 μl. Unter diesen
Bedingungen eluieren die verschiedenen Glyceralde-Verbindungen zu
folgenden Zeiten: Peakpaar 1: D-Glyceraldehyd = 7,5 min, L-Glyceraldehyd
= 7,6 min; Peakpaar 2: D-Glyceraldehyd = 10,2 min, L-Glyceraldehyd
= 10,8 min; Peakpaar 3: D-Glyceraldehyd = 11,9 min, L-Glyceraldehyd
= 14,10 min. Bei diesen drei Produktpeaks handelt es sich um die
verschiedenartig derivatisierten Glyceraldehyde (in 1- oder 2-Position
mono-derivatisiert oder an 1- und 2-Position di-derivatisiert).
-
Die 7 zeigt
die Entwicklung des ee-Wert für L-Glyceraldehyd in Abhängigkeit
von der Reaktionszeit.
-
Beschreibung der Figuren
-
1: Abhängigkeit der Aktivität
der GO-ADH vom pH-Wert;
-
1a)
Aktivitätsverlauf für die Reduktions-Reaktion.
Die Aktivität der Reduktion wurde photometrisch mit Glyceraldehyd
(racemisch) und NADPH gemessen.
-
1b)
Aktivitätsverlauf für die Oxidations-Reaktion.
Die Aktivität der Oxidation wurde photometrisch mit L-Arabitol
und NADP gemessen.
-
2:
Abhängigkeit der Aktivität der rekombinanten GO-ADH
von der Temperatur;
-
3:
Temperaturstabilität der rekombinanten Alkoholdehydrogenase;
-
4:
Lagerstabilität der rekombinanten Alkoholdehydrogenase;
-
5:
Gewinnung von enantiomerenen-angereichertem Glyceraldehyd durch
Racematspaltung mit isolierten Enzymen;
-
6:
Plasmidkarte für das Ganzzell-Konstrukt mit den beiden
Genen, die für die beiden Enzyme GO-ADH (GOX3) und Glucose-Dehydrogenase
(GDH) kodieren. Angegeben sind die Schnittstellen zur Klonierung
der beiden Gene; Amp = Ampicillin-Resistenz;
-
7:
Entwicklung des ee-Werts für L-Glyceraldehyd in Abhängigkeit
von der Reaktionszeit für eine Umsetzung (Reduktion) von
racemischem Glyceraldehyd mit einem rekombinanten Ganzzell-Katalysator.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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