DE102005022032A1 - Expansion medium for in vitro cultivation of stem cells, methods for propagating stem cells in vitro and using the stem cells propagated by the method - Google Patents
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Abstract
Ein Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zusammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, ist derart ausgestaltet, dass die Zusammensetzung plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.An expansion medium for in vitro cultivation of stem cells in a composition comprising all the components necessary for stem cell growth, excluding xenogenic additives, is designed such that the composition contains platelet-rich plasma (PRP) and at least one growth factor.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zusammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, und ein Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro sowie die Verwendung der nach dem Verfahren vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus.The The present invention relates to an expansion medium for in vitro Cultivation of stem cells in a composition under Exclusion of xenogenic additives all for stem cell growth having required components, and a method of propagation of stem cells in vitro as well as the use of the method increased stem cells for transplantation or reimplantation in a recipient organism.
Bisher gestaltete sich die in vitro Kultivierung von adulten Stammzellen, wie zum Beispiel von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenders, als sehr anspruchsvoll und schwierig. Dies ist dadurch begründet, dass die zum Zeitpunkt der Entnahme pluripotenten Zellen einem natürlichen Alterungsprozess unterliegen, wodurch die Zellen neben ihrer Teilungsfähigkeit ihren pluripotenten Charakter, also ihre Pluripotenz verlieren. Eine gesteuerte Differenzierung der Stammzellen, z.B. in Knochen oder Knorpel, ist spätestens zu diesem Zeitpunkt nicht mehr möglich. Deshalb ist eine Expansion von mesenchymalen Stammzellen in den bekannten Kulturmedien nur über einen sehr kurzen Zeitraum möglich, nämlich bis zu dem Zeitpunkt der Kultur, an dem die Zellen ihren pluripotenten Charakter verlieren würden. Dieser Zeitraum ist dabei in erheblichem Maß vom Ursprung der Stammzellen abhängig, d.h., dass Stammzellen verschiedener Spender über unterschiedliche Zeiträume kultivierbar sind, bevor sie ihre Pluripotenz verlieren. Zudem sind bisher keine Medien ohne xenogene Zusatzstoffe bekannt, also Medien mit rein allogenen oder autogenen Zusätzen, in denen sich die Stammzellen schnell und in einer für die jeweilige Anwendung ausreichend großen Anzahl expandieren lassen.So far was the in vitro cultivation of adult stem cells, such as mesenchymal stem cells (MSC) from the bone marrow aspirate a donor, as very demanding and difficult. This is by it justified that the pluripotent cells at the time of collection of a natural Subject to aging process, causing the cells in addition to their ability to divide lose their pluripotent character, ie their pluripotency. Controlled differentiation of stem cells, e.g. in bone or Cartilage, is latest at this time no longer possible. Therefore, an expansion of mesenchymal stem cells in the known culture media only about a very short period of time possible namely to at the time of the culture when the cells become pluripotent Lose character. This period is to a considerable extent the origin of the stem cells dependent, that is, stem cells of different donors can be cultured for different periods of time are before they lose their pluripotency. In addition, so far none Media without xenogenic additives known, so pure media allogenic or autogenic additives, in which the stem cells quickly and in one for each Application sufficiently large Let number expand.
Im Allgemeinen werden die MSC aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenderorganismus, welches zum Beispiel aus dem Beckenkamm, dem Sternum oder gelegentlich aus den Röhrenknochen, falls diese im Rahmen einer Operation eröffnet werden, gewonnen. Nach der Entnahme des Knochenmarkaspirats folgen Aufreinigungs- und Selektierungsschritte, um die MSC zu isolieren. Die aufgereinigten und isolierten MSC werden dann in einem Kulturmedium, das xenogene Zusatzstoffe enthält, unter geeigneten Standardkulturbedingungen, üblicherweise mit 6% CO2 Luftsättigung bei 37°C und 98% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank in Flaschen, Petrischalen oder anderen Kulturgefäßen bis zu einer für die geplante klinische Anwendung ausreichenden Zellzahl expandiert. Ein xenogener Zusatzstoff, der in den von vielen Forschungsgruppen verwendeten Expansionsmedien vorkommt, ist hierbei zum Beispiel ein fötales Rinderserum (FCS).In general, the MSCs are obtained from the bone marrow aspirate of a donor organism which, for example, is from the iliac crest, sternum, or occasionally from the long bones, if opened in the course of surgery. After removal of the bone marrow aspirate, purification and selection steps follow to isolate the MSC. The purified and isolated MSCs are then incubated in a culture medium containing xenogenic additives under appropriate standard culture conditions, usually with 6% CO 2 air saturation at 37 ° C and 98% humidity in an incubator in bottles, petri dishes or other culture vessels planned clinical application expands sufficient cell count. A xenogenic additive found in the expansion media used by many research groups is, for example, a fetal bovine serum (FCS).
Als ein Ziel einer klinischen Anwendung wird auf dem Gebiet der rekonstruktiven Medizin die Verbesserung einer Knochenheilung und Knochenherstellung unter Verwendung der expandierten mesenchymalen Stammzellen in Kombination mit einem geeigneten Trägermaterial (z.B. eine Keramik) angesehen.When A goal of a clinical application is in the field of reconstructive Medicine improving bone healing and bone production using the expanded mesenchymal stem cells in combination with a suitable carrier material (e.g., a ceramic).
Häufig scheitern diese klinischen Anwendungen jedoch schon in ihren Ansätzen, da eine ausreichend große Anzahl an Stammzellen, die benötigt wird, um zum Beispiel einen Knochen- oder Knorpeldefekt eines Empfängerorganismus zu heilen, nicht erreicht werden kann, und da die Zellen aufgrund des beschriebenen Alterungsprozesses im Verlauf der Kultivierung ihre Teilungsfähigkeit (Pluripotenz) verlieren und differenzieren. So ist zum Beispiel für einen Knochendefekt von einer Länge von 1,5 cm und einem Durchmesser von 4 mm eine Anzahl von 106 MSC notwendig, um eine befriedigende Heilung des Knochens zu erzielen. Eine Expansion mit einer Zellzahl von mehr als 106 MSC aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenderorganismus ist aber mit den bekannten Kulturmedien fast oder gar nicht möglich (variiert je nach Allgemeinzustand und Alter des Spenders) oder benötigt einen zu langen Zeitraum bis zur klinischen Anwendung.Frequently, however, these clinical applications fail even in their beginnings, since a sufficiently large number of stem cells, which is needed, for example, to cure a bone or cartilage defect of a recipient organism, can not be achieved, and because the cells due to the aging process described in Course of cultivation lose their ability to divide (pluripotency) and differentiate. For example, for a bone defect of 1.5 cm in length and 4 mm in diameter, a number of 10 6 MSC is necessary to achieve satisfactory bone healing. An expansion with a cell count of more than 10 6 MSC from the bone marrow aspirate of a donor organism but with the known culture media almost or not possible (varies depending on the general condition and age of the donor) or takes too long a period to clinical application.
Um dennoch eine ausreichende Anzahl MSC in kürzester Zeit zu gewinnen, wird daher der Ansatz verfolgt, der eine wiederholte Isolierung von MSC aus nacheinander entnommenem Knochenmarksaspiraten desselben Spenders vorsieht, um die so gewonnen Zellen miteinander zu vermischen. Ein Nachteil dabei ist, dass der Spender wiederholt einer Knochenmarkspunktion unterzogen wird, was einen schmerzhaften und belastenden Eingriff darstellt.Around Nevertheless, to win a sufficient number of MSC in the shortest possible time Therefore, the approach followed, which involves repeated isolation of MSC from successively withdrawn bone marrow aspirates of the same donor, to mix the cells thus obtained together. A disadvantage it is that the donor repeatedly a bone marrow puncture undergoes, causing a painful and stressful procedure represents.
Ein anderer Ansatz zur Gewinnung einer ausreichenden Anzahl MSC ist die Vermischung (das „Poolen") von MSC verschiedener Spender. Ein Problem dabei stellt sich aufgrund der Tatsache, dass der Empfängerorganismus nicht nur eigene (wie im Fall einer Reimplantation oder autologen Transplantation) sondern auch körperfremde Zellen bei der Transplantation (allogene Transplantation) erhält, was zu Infektionen oder zu immunologischen Reaktionen im Empfängerorganismus führen kann. Dies hat zur Folge, dass ein Heilungsprozess des zu behandelnden Knochen- bzw. Knorpeldefekts verschlechtert wird oder sogar bei einer immunologischen Reaktion des Empfängerorganismus auf die körperfremden MSC das transplantierte Gewebe abgestoßen wird. Eine Heilung des zu behandelnden Knochen- bzw. Knorpeldefekts wird dadurch verhindert und insgesamt verschlechtert sich der Gesamtzustand des Empfängers.Another approach for obtaining a sufficient number of MSCs is the mixing ("pooling") of MSCs from different donors, a problem that arises from the fact that the recipient organism not only owns (as in the case of a reimplantation or autologous transplant) but also transplantation (allograft), which may lead to infections or to immunological reactions in the recipient organism, as a result of which a healing process of the bone or cartilage defect to be treated is worsened, or even in the case of a the transgenic tissue is repelled by the recipient organism's reaction to alien MSC. Healing of the bone or cartilage defect to be treated is thereby prevented and, overall, the overall condition of the recipient deteriorates.
Ein noch anderer Ansatz erfolgt durch den Einsatz mit für die Anwendung suboptimalen Zellzahlen. Nachteil dabei ist, dass der Erfolg einer Defektheilung des Knochens oder des Knorpels durch die zu geringe Dichte der transplantierten Stammzellen gefährdet wird.One still another approach is made by using with for the application suboptimal cell counts. Disadvantage thereby is that the success of a Defective healing of the bone or cartilage due to the low density the transplanted stem cells is endangered.
Ein weiterer Nachteil der Kultivierung von MSC in Expansionsmedien mit xenogenen Zusatzstoffen, wie zum Beispiel Rinderserumprodukten, ist die Gefahr einer Kontamination mit Prionen, die die MSC infizieren und an den Empfängerorganismus bei der Transplantation weitergegeben werden können. Insofern erfolgt die Transplantation von Stammzellen, die in einem Medium expandiert wurden, das Rinderserumprodukte enthält, unter einem erheblichen gesundheitsgefährdenden Potential, nämlich mit der Gefahr, dass der Empfänger an Rinderwahnsinn (BSE) erkrankt. Zudem sind immunologische Reaktionen von humanen Empfängern auf Rinderserumprodukte bekannt geworden.One Another disadvantage of the cultivation of MSC in expansion media with xenogenic additives, such as bovine serum products, is the risk of contamination with prions that infect the MSC and to the recipient organism can be passed on during transplantation. In this respect, the transplant takes place of stem cells that have been expanded in a medium, the bovine serum products contains, under a significant health hazard Potential, namely with the danger that the recipient of mad cow disease (BSE) suffers. In addition, immunological reactions of human recipients Become known on bovine serum products.
Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Expansionsmedium und ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, die durch xenogene Komponenten verursacht werden, sowie die Verwendung der vermehrten Stammzellen für klinische Anwendungen zur Verfügung zu stellen.Of the The present invention is based on the object, an expansion medium and a method for rapid proliferation of stem cells in vitro in a for clinical applications sufficient number excluding Infections or immunological reactions of the recipient organism, caused by xenogeneic components as well as the use the increased stem cells for clinical applications available to deliver.
Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe hinsichtlich des Expansionsmediums durch eine Zusammensetzung für ein Expansionsmedium mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Danach ist die Zusammensetzung der eingangs genannten Art derart ausgestaltet, dass die Zusammensetzung plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.According to the invention above task with regard to the expansion medium through a composition for a Expansion medium solved with the features of claim 1. After that If the composition of the type mentioned above is designed in such a way that that the composition is platelet rich Plasma (PRP) and at least one growth factor contains.
Des Weiteren ist die obige Aufgabe im Hinblick auf ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, die durch xenogene Komponenten verursacht werden, durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 10 gelöst. Danach ist ein Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro der eingangs genannten Art derart ausgestaltet, dass die Stammzellen in einem Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe vermehrt werden, welches die für das Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten, plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.Of Further, the above object is to a method for rapid proliferation of stem cells in vitro in one for clinical Applications of sufficient number excluding infections or immunological reactions of the recipient organism by xenogeneic Components are caused by a procedure with the features of claim 10. Thereafter is a method of propagating stem cells in vitro of the type mentioned above designed such that the stem cells be propagated in an expansion medium without xenogenic additives, which for the the growth of stem cells required components, platelet-rich Plasma (PRP) and at least one growth factor contains.
Schließlich ist die obige Aufgabe hinsichtlich der Verwendung der MSC durch die Merkmale des Anspruchs 18 gelöst. Danach ist eine Verwendung der nach dem beanspruchten Verfahren vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus vorgesehen.Finally is the above task regarding the use of the MSC by the Characteristics of claim 18 solved. Thereafter, a use of the claimed method increased stem cells for transplantation or reimplantation in a recipient organism intended.
In erfindungsgemäßer Weise ist erkannt worden, dass durch den Zusatz von PRP, das zum Beispiel anstelle von fötalem Rinderserum (FCS) eingesetzt wird, ein Expansionsmedium zur Expansion von humanen Stammzellen bereitgestellt werden kann. Mit anderen Worten ist hierdurch das Risiko des Empfängers nach einer Transplantation oder Reimplantation der expandierten Stammzellen, an BSE zu erkranken, vollkommen ausgeschlossen. Durch den Einsatz des PRP können zudem immunologische Reaktionen oder Infektionen eines humanen Empfängers auf xenogene Zusatzstoffe im Medium, wie zum Beispiel Reaktionen auf Rinderserumprodukte, wirksam vermieden werden. Darüber hinaus ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass durch die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine Expansion der Stammzellen beschleunigt werden kann. Zudem ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem erfindungsgemäßen Expansionsmedium vermehrten Stammzellen für eine Transplantation und/oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus verwenden lassen.In according to the invention has been recognized that by the addition of PRP, for example, instead of fetal Bovine serum (FCS) is used, an expansion medium for expansion can be provided by human stem cells. With others In other words, this is the risk of the recipient after a transplant or re-implantation of the expanded stem cells to develop BSE, completely excluded. In addition, by using the PRP can immunological reactions or infections of a human recipient xenogenic additives in the medium, such as reactions to Bovine serum products can be effectively avoided. Furthermore is in accordance with the invention It has been recognized that by the addition of growth factors one Expansion of stem cells can be accelerated. Moreover, in according to the invention been recognized that with the inventive method in the expansion medium according to the invention increased stem cells for a transplantation and / or reimplantation into a recipient organism to use.
Folglich ist ein Expansionsmedium und ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, welche durch xenogene Komponenten verursacht werden, sowie die Verwendung der vermehrten Stammzellen für klinische Anwendungen realisiert.consequently is an expansion medium and a method for rapid multiplication of stem cells in vitro in a sufficient for clinical applications Number excluding infections or immunological reactions the recipient organism, which are caused by xenogeneic components, as well as the use the increased stem cells for realized clinical applications.
Vorzugsweise kann die Zusammensetzung für das Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen plättchenreiches Plasma (PRP) enthalten, dass eine 0,5 bis 2,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut aufweist. Noch bevorzugter weist das PRP eine 2,5 bis 4,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut auf und am meisten bevorzugt weist das PRP eine 3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut auf. Es ist aber auch denkbar, dass das PRP so stark anreicherbar ist, dass eine Konzentration an Thrombocyten von mehr als 6,5-fach im Vergleich zu Vollblut erreichbar ist. In besonders vorteilhafter Weise ist das angereicherte PRP in einer Endkonzentration von 0,5 bis 10 % (v/v) im Expansionsmedium zur Kultivierung der Stammzellen einsetzbar. Je nach Art und Beschaffenheit der Stammzellen ist aber auch eine Endkonzentration des PRP im Expansionsmedium von mehr als 10 % (v/v) verwendbar.Preferably, the composition for the expansion medium for in vitro cultivation of Stem cells contain platelet-rich plasma (PRP) that has a 0.5 to 2.5-fold increased concentration of platelets compared to whole blood. More preferably, the PRP has a 2.5 to 4.5-fold increased concentration of platelets compared to whole blood, and most preferably, the PRP has a 3 to 6.5-fold increased concentration of platelets compared to whole blood. However, it is also conceivable that the PRP can be enriched so much that a concentration of platelets of more than 6.5 times in comparison to whole blood can be achieved. In a particularly advantageous manner, the enriched PRP can be used in a final concentration of 0.5 to 10% (v / v) in the expansion medium for culturing the stem cells. Depending on the type and nature of the stem cells, however, a final concentration of the PRP in the expansion medium of more than 10% (v / v) can also be used.
Damit ein speziell auf den Empfängerorganismus abgestimmtes Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung der Stammzellen zur Verfügung gestellt werden kann, welches keine xenogenen Zusatzstoffe enthält, hat das PRP seinen Ursprung in der Art der Empfängers. Im Konkreten hat das PRP zur Expansion von humanen Stammzellen einen humanen Ursprung („allogene Transplantation"). Eine Vermeidung immunologischer Reaktionen auf fremdes plättchenreiches Plasma aus der gleichen Art ist durch die Verwendung des körpereigenen Plasmas des Empfängers zur Vermehrung der eigenen Stammzellen erzielbar („autologe Transplantation").In order to a specific to the recipient organism Coordinated expansion medium for the in vitro cultivation of stem cells to disposal can be made, which contains no xenogenic additives, has the PRP originates in the type of recipient. In concrete terms, that has PRP for the expansion of human stem cells of a human origin ( "Allogeneic Transplantation"). Avoidance of immunological reactions to foreign platelet-rich Plasma of the same kind is through the use of the body's own Plasmas of the recipient to increase the number of own stem cells achievable ("autologous Transplantation").
Als zusätzliche Bestandteile enthält die Zusammensetzung für das Expansionsmedium mindestens zwei unterschiedliche Wachstumsfaktoren. Als besonders vorteilhaft erweist sich dabei in Kombination mit dem PRP ein Plättchen abhängiger Wachstumsfaktor (PDGF) mit einem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um eine schnelle Expansion der Stammzellen, insbesondere von mesenchymalen Stammzellen, zu erreichen. Zur Vermehrung von humanen mesenchymalen Stammzellen bieten sich in Anbetracht der angesprochenen Infektionsproblematik und der Vermeidung der immunologischen Reaktion des Empfängerorganismus auf xenogene Zusatzstoffe besonders rekombinante humane Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel rh EGF und rh PDGF an. In bevorzugter Weise enthält die Zusammensetzung dabei in Kombination mit dem rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh EGF den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDGF-AA, in noch bevorzugter Weise den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDFG-AB und in besonders bevorzugter Weise den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDGF-BB. Dabei wird eine Endkonzentration im Expansionsmedium der jeweiligen Wachstumsfaktoren von 2 bis 5 ng/ml als bevorzugt angesehen. Noch bevorzugter erweist sich eine Endkonzentration von 6 bis 8 ng/ml und am meisten bevorzugt weist das Expansionsmedium eine Endkonzentration der jeweiligen Wachstumsfaktoren von 8 bis 10 ng/ml auf. Je nach Art der Stammzellen und dem zur Verfügung stehenden Zeitraum (bis zur klinischen Anwendung) zur Vermehrung der Stammzellen sind auch, insbesondere zur schnellen Expansion der Zellen in einem möglichst kurzem Zeitraum, Endkonzentrationen der jeweiligen Wachstumsfaktoren von mehr als 10 ng/ml im Expansionsmedium einsetzbar. Dabei ist denkbar, dass bei Verwendung unterschiedlicher Wachstumsfaktoren diese in einem Verhältnis 1:1 oder in einem Verhältnis, das ungleich 1:1 ist, dem Medium hinzugegeben werden, um die Expansionszeit und die Expansion der Stammzellen gezielt steuern zu können.When additional Contains ingredients the composition for the expansion medium at least two different growth factors. It proves to be particularly advantageous in combination with a slide for the PRP dependent Growth factor (PDGF) with an epidermal growth factor (EGF), to a rapid expansion of stem cells, especially mesenchymal Stem cells, to reach. For the reproduction of human mesenchymal Stem cells offer themselves in view of the mentioned infection problem and avoiding the immunological response of the recipient organism on xenogenic additives particularly recombinant human growth factors such as rh EGF and rh PDGF. Preferably, the composition contains in combination with the recombinant human growth factor rh EGF the recombinant human growth factor rh PDGF-AA, in more preferably the recombinant human growth factor rh PDFG-AB and most preferably the recombinant human growth factor rh PDGF-BB. This will be a final concentration in the expansion medium of the respective growth factors from 2 to 5 ng / ml considered preferred. Even more preferable is a Final concentration of 6 to 8 ng / ml and most preferred the expansion medium is a final concentration of the respective growth factors from 8 to 10 ng / ml. Depending on the type of stem cells and the disposal period (up to clinical use) for reproduction The stem cells are also, especially for rapid expansion the cells in one as possible short period, final concentrations of the respective growth factors of more than 10 ng / ml can be used in the expansion medium. It is conceivable that when using different growth factors these in a relationship 1: 1 or in a ratio, which is not equal to 1: 1, can be added to the medium at the expansion time and to be able to control the expansion of stem cells in a targeted manner.
Als
besonders vorteilhaft zur Anzucht von Stammzellen, insbesondere
von humanen mesenchymalen Stammzellen, erweist sich eine Zusammensetzung,
die die folgenden Komponenten pro einem Liter Medium in der angegebenen
Menge bzw. Endkonzentration enthält:
In vorteilhafter Weise ist eine Kultivierung der Stammzellen über einen langen Zeitraum, nämlich bis zu 8 Wochen, mit dem Expansionsmedium in der oben genannten Zusammensetzung und/oder eine schnelle Expansion der Stammzellen, insbesondere der humanen mesenchymalen Stammzellen innerhalb eines Zeitraumes von wenigen Wochen (2 bis 3 Wochen) erzielbar. Dabei ist von Vorteil, dass die Zellen nicht in Knochen-, Knorpel-, Fett- oder Sehnenzellen differenzieren und darüber hinaus ihre Teilungsfähigkeit beibehalten. Dies ermöglicht es, primäre mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenders bis zu einer Anzahl von mehr als 106 Zellen (bis über 108 Zellen) zu expandieren. Dabei ist vorteilhaft, dass eine wiederholte Knochenmarkpunktion an einem Spender überflüssig ist und dass das Knochenmarkaspirat fast jeden Spenders, unabhängig von dessen Alter oder Gesundheitszustand, verwendbar ist.Advantageously, a cultivation of the stem cells over a long period of time, namely up to 8 weeks, with the expansion medium in the above-mentioned composition and / or a rapid expansion of the stem cells, in particular the human mesenchymal stem cells within a period of a few weeks (2 bis 3 weeks). It is advantageous that the cells do not differentiate into bone, cartilage, fat or tendon cells and, moreover, retain their ability to divide. This makes it possible to expand primary mesenchymal stem cells from the bone marrow aspirate of a donor to a number of more than 10 6 cells (up to more than 10 8 cells). It is advantageous that repeated bone marrow aspiration on a donor is superfluous and that bone marrow aspirate can be used by almost any donor, regardless of age or health.
Bezüglich des beanspruchten Verfahrens wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die Ausführungen und die Vorteilsangaben zu dem beanspruchten Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen verwiesen.Regarding the claimed method is used to avoid repetition on the designs and the advantages of the claimed expansion medium for directed in vitro cultivation of stem cells.
In besonders vorteilhafter Weise lassen sich die nach dem genannten Verfahren in dem genannten Expansionsmedium vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus verwenden. So können zum Beispiel expandierte Stammzellen, die von einem Spender stammen, der unterschiedlich zu dem Empfänger ist, aber der gleichen Art entstammt, für die allogene Transplantation verwendet werden. In bevorzugter Weise werden körpereigene Stammzellen des Empfängers, wie zum Beispiel mesenchymale Stammzellen für eine Reimplantation oder autologe Transplantation zur Behandlung und Heilung eines Knochen- oder Knorpeldefekts des Empfängers verwendet. Genauer gesagt, sind bei der Reimplantation der Spender des Knochenmarks und der daraus expandierten MSC und der Empfänger der expandierten MSC die gleiche Person, womit eine immunologische Reaktion auf körperfremde Antigene ausgeschlossen ist.In Particularly advantageous manner can be after the mentioned Methods in said expansion medium increased stem cells for transplantation or reimplantation into a recipient organism use. So can For example, expanded stem cells derived from a donor, the different from the receiver is, but of the same kind stems, used for allogeneic transplantation become. Preferably, endogenous stem cells of the receiver such as mesenchymal stem cells for reimplantation or autologous transplantation for the treatment and healing of a bone or cartilage defect of the recipient used. More specifically, at the time of reimplantation, the donors are of the bone marrow and the MSC expanded therefrom and the recipient of the MSC expanded the same person, bringing an immunological response to foreigners Antigens is excluded.
Als ganz besonders vorteilhaft erweist sich bei der Transplantation oder Reimplantation, insbesondere bei der Behandlung von größeren Knochen- oder Knorpeldefekten, die Verwendung eines Trägermaterials, auf das und/oder in das sich die Zellen bei der Kultivierung ansiedeln. So können beispielsweise mesenchymale Stammzellen einer Primärkultur eines Spenders in Verbindung mit dem Trägermaterial zur Behandlung und Heilung von Knochendefekten mit einer Größe von 0,5 cm bis 10 cm und 0,5 cm bis 5 cm Durchmesser eingesetzt werden. Als Trägermaterial wird dabei, insbesondere auf dem Gebiet des „Tissue Engineering", bevorzugt Hydroxylapatit (HA), eine dimineralisierte Knochenmatrix (DBM), eine Polyactidmatrix oder Polyglycolmatrix verwendet. Noch bevorzugter wird als Trägermaterial ein β-Trikalziumphosphat (β-TCP) und am meisten bevorzugt Kalzium-defizientes Hydroxylapatit (CDHA) verwendet. Es sind aber auch andere Trägermaterialien, wie zum Beispiel eine Kollagenmatrix, eine Gelatinematrix, eine Chitosanmatrix oder dezellularisiertes Gewebe, wie zum Beispiel Mukosa, oder Kombinationen der hier insgesamt aufgezählten Materialien verwendbar.In the case of transplantation or reimplantation, in particular in the treatment of larger bone or cartilage defects, the use of a carrier material to which and / or into which the cells settle during the cultivation proves to be particularly advantageous. For example, mesenchymal stem cells of a primary culture of a donor can be used in conjunction with the carrier material for the treatment and healing of bone defects having a size of 0.5 cm to 10 cm and 0.5 cm to 5 cm in diameter. As a carrier material is, especially in the field of "tissue engineering", before Hydroxylapatite (HA), a dimineralized bone matrix (DBM), a polyactide matrix or polyglycol matrix is used. More preferably, the carrier material used is a β-tricalcium phosphate (β-TCP) and most preferably calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA). However, other support materials, such as a collagen matrix, a gelatin matrix, a chitosan matrix or decellularized tissue, such as mucosa, or combinations of the materials enumerated hereinabove are also useful.
Es ist darüber hinaus auch denkbar, dass die nach dem genannten Verfahren vermehrten Stammzellen zur Regeneration, Behandlung und Heilung von anderen Gewebedefekten als den Knochen- oder Knorpeldefekten verwendet werden. So könnten zum Beispiel Bindegewebs-, Nerven-, Gefäß- oder Sehnendefekte behandelt und regeneriert werden. Es ist aber auch denkbar, dass bei Defekten der Haut, die durch Verbrennungen, Infektionen, Erkrankungen und/oder Abschürfungen entstanden sind, Stammzellen vermehrt und verwendet werden, die die Vorläuferzellen der Haut sind. Als Trägermaterialien kommen dabei zum Beispiel resorbierbare Materialien in Betracht, die sich mit den eingewachsenen Zellen wie eine „zweite" Haut auf die Körperpartien auflegen lassen.It is about it In addition, it is also conceivable that the multiplied by the said method Stem cells for regeneration, treatment and healing of others Tissue defects are used as the bone or cartilage defects. So could For example, connective tissue, nerve, vascular or tendon defects treated and regenerated. But it is also conceivable that in case of defects the skin caused by burns, infections, illnesses and / or abrasions stem cells are propagated and used, the the precursor cells of the skin. As carrier materials come here for example absorbable materials into consideration, which can be placed on the body parts with the ingrown cells like a "second" skin.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Beispiels zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Beispiels werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert, ohne die Lehre darauf einzuschränken.It are now different ways to design the teaching of the present invention in an advantageous manner and further education. This is on the one hand to the subordinate claims, on the other hand to the following explanation of a preferred example. In conjunction with the Explanation of the preferred examples are also generally preferred embodiments and further developments of the teaching explained without the teaching on it limit.
Beispielexample
Humane mesenchymale Zellen wurden aus dem Knochenmarkaspirat gewonnen, das mittels einer Knochenmarkpunktion aus dem Beckenkamm eines Spenders entnommen wurde. Das Knochenmarkaspirat wurde aufgereinigt und selektiert, und die abgesonderten mesenchymalen Stammzellen in einem Expansionsmedium (s.u.) unter Standardkulturbedingungen (6% CO2, 37°C und 98% Luftfeuchtigkeit) vermehrt. 1 Liter Expansionsmedium wurde wie folgt hergestellt: jeweils 567, 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Flüssigmedium (D-MEM) (1x) (high glucose) (Invitrogen, Cat#41966), 400 ml MCDB 201 (Sigma, Cat#I-1884), 20 ml Supplement ([10 mg/l Endkonz.] humanes Insulin (Sigma, Cat#I-9278), [10 mg/l Endkonz.] humanes Transferrin, Cat#T-8158) und [10 μg/l Endkonz] Natriumselenit (Sigma, Cat#S-9133)), 10 ml [1 % Endkonz] Penicillin/Streptomycin (Biochrom AG, Cat#A-2213), 400 μl [0,02 μM Endkonz.] Dexamethason (Sigma, Cat#D-8893) 20 μg/ml in 1 ml Ethanol zum Lösen in 45 ml sterilem Milli-Q-H2O) und 580 μl [0,1 mM Endkonz.] Ascorbinsäure-2-phosphat 1,5 mg (Sigma, Cat#A-8960) wurden zusammengegeben und sterilfiltriert. Die so hergestellte Lösung wurde bei –20°C bis max. 8 Wochen eingefroren. Zur Herstellung des frischen Mediums wurde die benötigte Menge Medium aufgetaut und 30 ml [3% Endkonz] aufkonzentriertes frisches PRP (3 bis 6,5-fache Konzentration der Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut) sowie jeweils 250 μl [10 ng/ml Endkonz.] Wachstumsfaktor rh EGF und 250 μl [10 ng/ml Endkonz] rh PDGF-BB (Strathmann Biotec hEGF-500 bzw. hPDGF-BB-10) wurden dazugegeben und nicht mehr sterilfiltriert. Danach folgte das Stehenlassen des Mediums für mindestens 2 Stunden bei –4°C, damit sich die Thrombocyten verklumpten. Nach dem Stehenlassen wurde zur Bildung eines „Clots" das Medium durch Auf- und Abpippettieren verwendungsfertig gemacht.Human mesenchymal cells were obtained from the bone marrow aspirate, which was removed from the iliac crest of a donor by bone marrow puncture. The bone marrow aspirate was purified and selected, and the secreted mesenchymal stem cells in an expansion medium (see below) under standard culture conditions (6% CO 2 , 37 ° C and 98% humidity) increased. One liter of expansion medium was prepared as follows: 567.5 ml each of Dulbecco's Modified Eagle Liquid Medium (D-MEM) (1x) (high glucose) (Invitrogen, Cat # 41966), 400 ml of MCDB 201 (Sigma, Cat # I-1884) , 20 ml supplement ([10 mg / l final conc.] Human insulin (Sigma, Cat # I-9278), [10 mg / l final conc.] Human transferrin, Cat # T-8158) and [10 μg / l final conc] Sodium selenite (Sigma, Cat # S-9133)), 10 ml [1% final conc.] Penicillin / streptomycin (Biochrom AG, Cat # A-2213), 400 μl [0.02 μM final conc.] Dexamethasone (Sigma, Cat # D -8893) 20 μg / ml in 1 ml of ethanol to dissolve in 45 ml of sterile Milli-QH 2 O) and 580 μl [0.1 mM final conc.] Ascorbic acid 2-phosphate 1.5 mg (Sigma, Cat # A- 8960) were combined and sterile filtered. The solution thus prepared was stored at -20 ° C to max. Frozen for 8 weeks. To prepare the fresh medium, the required amount of medium was thawed and 30 ml [3% final conc.] Concentrated fresh PRP (3 to 6.5-fold concentration of thrombocytes compared to whole blood) and 250 μl each [10 ng / ml final conc.] Growth factor rh EGF and 250 μl [10 ng / ml final concentrate PDGF-BB (Strathmann Biotec hEGF-500 and hPDGF-BB-10, respectively) were added and no longer sterile filtered. This was followed by allowing the medium to stand for at least 2 hours at -4 ° C to allow the platelets to clot. After standing, the medium was made ready for use by pipetting up and down to form a "clot".
Das verwendungsfertige frische PRP-Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe wurde mit einem üblichen Expansionsmedium mit xenogenem Zusatz von FCS (fötales Rinderserum) bezüglich der Proliferationsrate der in den Medien kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen verglichen. Dabei wurde eine Proliferationsrate der MSC im PRP-Expansionsmedium gemessen, die signifikant höher als die Proliferationsrate der MSC im FCS-Expansionsmedium lag (p < 0,05).The ready-to-use fresh PRP expansion medium without xenogenic additives was with a usual Expansion medium with xenogenic addition of FCS (fetal bovine serum) with respect to Proliferation rate of cultured in the media human mesenchymal Compared stem cells. Thereby a proliferation rate of the MSC in the PRP expansion medium measured significantly higher than the proliferation rate of the MSC in the FCS expansion medium was (p <0.05).
Die Verwendung des PRP-Expansionsmediums ohne xenogene Zusatzstoffe zur Expansion von mesenchymalen Stammzellen wurde im Tiermodell für das sogenannte „Tissue-Engineering", nämlich in Verbindung mit Trägerstoffen, wie zum Beispiel in Verbindung mit einer dimineralisierten Knochenmatrix (DBM), einem β-Trikalziumphosphat- (β-TCP) und einem Kalzium-defizienten Hydroxylapatit-(CDHA) Keramikkörper mit 84 % Porosität mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser im makroskopischen Bereich von 0,2 bis 0,6 mm (55 vol %) und einem Porendurchmesser im mikroskopischen Bereich von < 5 μm und einer spezifischen Oberfläche von durchschnittlich 0.5 m2/g erprobt. Dabei konnte eine ektope Knochenbildung nach 8 Wochen in 4 von 16 MSC behandelten CDHA-Keramikkörpern und in 2 von 16 behandelten β-TCP-Keramikkörpern in immundefizienten Mäusen festgestellt werden.The use of the PRP expansion medium without xenogenic additives for the expansion of mesenchymal stem cells has been used in the animal model for so-called "tissue engineering", namely in conjunction with excipients, for example in conjunction with a dimineralized bone matrix (DBM), a β-tricalcium phosphate (β-TCP) and a calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA) ceramic body of 84% porosity with an average pore diameter in the macroscopic range of 0.2 to 0.6 mm (55 vol%) and a pore diameter in the microscopic range of <5 microns and a specific surface area of an average of 0.5 m 2 g tried /. It could ectopic bone formation after 8 weeks in 4 of 16 MSC treated CDHA-ceramic bodies and of 16 treated in 2 β-TCP ceramic bodies are found in immunodeficient mice.
Neben der Eigenschaft des Mediums MSC schneller und zuverlässiger im Vergleich zu den bekannten Medien zu expandieren, wurde zudem die Fähigkeit der in dem PRP-Expansionsmedium hergestellten MSC in vivo ektop Knochen bilden zu können, bewiesen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die MSC ihre gewünschten Eigenschaften behalten, in Knochen und Knorpel zu differenzieren. Zudem konnte festgestellt werden, dass die gewünschten Oberflächenmarker der Zellen im Expansionsprozess erhalten bleiben.In addition to the property of the medium MSC faster and more reliable compared to the known ones In addition, the ability to expand media has been demonstrated to be capable of forming in vivo ectopic bone in the MSC produced in the PRP expansion medium. In addition, it could be shown that the MSC retain their desired properties to differentiate into bone and cartilage. In addition, it was found that the desired surface markers of the cells are retained in the expansion process.
Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das voranstehend beschriebene Beispiel lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Beispiel einschränkt.Finally, be expressly noted that the example described above for discussion only The claimed teaching is, but not on the example limits.
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