DE102009024133A1 - Bakterielle Nanocellulose zur Knorpelneubildung - Google Patents

Abstract

Aufgabe war es, ein universell verwendbares Netzwerk zu schaffen, das sowohl eine dauerhafte, gerüstbildende Stabilität aufweist als auch eine schnellstmögliche und homogene Besiedlung mit knorpelbildenden Zellen zur Ausbildung von funktionsfähigem Knorpelgewebe gewährleistet. Erfindungsgemäß werden zur Knorpelneubildung Implantate hergestellt, die jeweils durch einen Aufbau aus einer weitmaschigen Phase (1) sowie aus zumindest einer mit dieser fest verbundenen engmaschingen Phase (2) der bakteriellen Nanocellulose charakterisiert sind. Ein solcher Aufbau wird in einem Kultivierungsschritt generiert. Die Erfindung dient zur Verwendung als Gerüst für eine insbesondere In-vivo-Besiedlung durch knorpeleigene Zellen.

Description

• Die Erfindung betrifft eine spezielle bakterielle Nanocellulose (BNC) zur Verwendung als Gerüst für eine insbesondere in vivo-Besiedlung durch knorpeleigene Zellen zwecks Ausbildung von Knorpelgewebe. Die Erfindung dient beispielsweise zur Korrektur von traumatischen und degenerativen Schäden des Knorpelgewebes, wie Schäden an Gelenkknorpeln, durch Applikation eines initial zellfreien und nicht resorbierbaren Materials in den Knorpeldefekt. Hierzu dient ein Netzwerk, welches von den ortsständigen Zellen des Knorpels besiedelt und mit neugebildeter Knorpelmatrix aufgefüllt wird.
• Knorpel besitzt ein sehr geringes Potential zur natürlichen Regeneration von traumatischen oder degenerativen Defekten.
• Es sind verschiedene Möglichkeiten bzw. Ansätze zur Regeneration von Knorpeldefekten bekannt, die sich z. B. nach der Art der verwendeten Materialien unterscheiden lassen. So ist eine Einteilung in zellhaltige und zellfreie sowie in resorbierbare und nicht resorbierbare Materialien möglich.
• Eine in der Praxis angewendete Behandlungsmethode mit zellhaltigem Material ist die autogene Chondrozyten-Transplantation, kurz als ACT bezeichnet (z. B. M. Brittberg et al.: Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologeous chondrocyte transplantation, Engl J Med, 1994, 331, 889 oder T. Minas: Autologous chondrocyte implantation in the arthritic knee, Orthopedics, 2003, 26, 945). Dabei wird dem Patienten ein gesundes Knorpelgewebestück aus dem unbelasteten Bereich des Gelenkes entnommen und die Knorpelzellen werden unter autologen Bedingungen vermehrt und anschließend als Zellsuspension in den Defekt gegeben. Die ACT hat mehrere Nachteile, wie insbesondere Einsetzbarkeit nur in bestimmten Regionen des Knies, „Auslaufen” der Zellsuspension und Hypertrophie der Chondrozyten bzw. des Periostes.
• Um diese Probleme zu umgehen, wurden „Tissue Engineering” – Knorpeltransplantate auf der Basis resorbierbarer Polymere entwickelt, die das regenerative Potential autologer Knorpelzellen mit stabilisierenden resorbierbaren Biomaterialien kombinieren sollen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen, eine bessere initiale mechanische Stabilität, Förderung der Gewebereifung und eine einfachere Handhabung durch den Operateur zu erreichen. Bei dieser Matrix-/Biomaterial-unterstützten ACT werden in vitro vermehrte, autologe Knorpelzellen in Hyaluronsäuremembranen, in Kollagenmembranen oder in textile resorbierbare Polymere (Polyglykolsäure und Co-Polymere von Polyglykolsäure und Polymilchsäure) eingebracht (beispielsweise S. Nehrer et al.: Three-year clinical outcome alter chondrocyte transplantation using a hyaluronan matrix for cartilage repair, Eur J Radiol, 2006, 57, 3; P. Gehrens et al.: Matrix-associated autologous chondrocyte transplantation/implantation (MACT/MACI)-5-year follow-up, Knee, 2006, 13, 194; C. Ossendorf et al.: Treatment of posttraumatic and focal osteoarthritic cartilage defects of the knee with autologous polymer-based three-dimensional chondrocyte grafts: 2-year clinical results, Arthritis Res Ther, 2007, 9, R41). Die resorbierbaren Materialien, z. B. auf der Basis von Hyaluronsäure oder Kollagen, weisen allerdings entscheidende Nachteile durch schlechte Fixierbarkeit, insbesondere für die Positionierung und das Befestigen (Nähprozess) von Implantaten, bei zu geringer Formstabilität auf. Die stabileren synthetischen Polylactid-co-glycolid(PLGA)- und Polyglycolid(PGA)-Materialien können bei ihrem Abbau chronisch-entzündliche Zellreaktionen auslösen.
• Ein besonderes Problem aller resorbierbaren Materialien besteht darin, dass die Geschwindigkeit und Art des Gerüstabbaus des Implantats mit der Aufbaugeschwindigkeit des Knorpels synchronisiert werden müssen, um die Funktion des zu regenerierenden Knorpels zu gewährleisten. Diese Prozesse sind bei den einzelnen Patienten hoch variabel und zudem stark altersabhängig. Prinzipiell kann man jedoch davon ausgehen, dass resorbierbare Materialien bereits nach ca. 4 bis 6 Wochen abgebaut sind. Die Bildung von neuem intaktem und funktionsfähigem Knorpelgewebe vollzieht sich aber über eine Zeitspanne von mehreren Monaten.
• Zellfreie Hydrogele waren die ersten Biomaterialien, die in rationalem Design für die Anwendung am Menschen entwickelt wurden (Review: J. Kopecek, J. Yang: Hydrogels as smart biomaterials, Polymer International 2007, 56/9, 1078). Sie zeichnen sich in der Regel durch sehr gute Biokompatibilität aus, die u. a. durch ihren hohen Wassergehalt bedingt ist. Hydrogele weisen aber häufig eine unzureichende mechanische Stabilität auf, wodurch ihre Einsatzgebiete bisher limitiert sind. Die bereits bekannten nicht resorbierbaren Biomaterialien auf der Basis von Hydrogelen aus synthetischen Polymeren wie Polyvinylalkohol werden vom Organismus nicht als in vivo-Scaffold akzeptiert, d. h. in solche Implantate wandern keine körpereigenen Zellen ein. Dagegen konnte gezeigt werden, dass nicht resorbierbare bakterielle Nanocellulose (BNC) ein Material ist, das im Ergebnis zahlreicher Untersuchungen eine sehr gute Gewebe- und Blutverträglichkeit zeigt und schnell und dauerhaft von Zellen (z. B. Endothelzellen, Fibroblasten) besiedelt wird. Zugleich weisen die Nanofasern der BNC Festigkeiten im Bereich von Stahl bzw. Kevlar auf (Review: D. Klemm et al.: Nanocelluloses as innovative polymers in research and application, Adv. Polym. Sci. 2006, 205, 49).
• In der EP 1953174 A1 wird die Anwendung von oxidierter bakterieller Nanocellulose als Gewebesubstitut beschrieben. Oxidierte BNC ist jedoch resorbierbar und bietet durch ihren Abbau keine dauerhafte, sondern lediglich eine zeitlich begrenzte Stützstruktur, so dass dieses Material für die vorliegende spezielle Verwendung zum Aufbau von dauerhaft formstabilem Knorpelgewebe nicht geeignet ist.
• WO 2007/064881 A2 und WO 2007/146946 A2 beschreiben den Einsatz von BNC für die Reparatur und den Ersatz von Weich- und Hartgewebe. In beiden Fällen wird die BNC nach der Biosynthese zur Entfernung der aus dem Kulturmedium stammenden Bestandteile einer intensiven mechanischen Behandlung unterzogen. Zusätzlich wird die BNC im Fall von WO 2007/064881 A2 durch Trocknen und Komprimieren in die endgültige Implantatform gebracht. Bei dem beschriebenen Prozedere ist davon auszugehen, dass die Netzwerkstruktur der BNC stark geschädigt und nicht mehr für das Einwandern von Zellen, insbesondere zur Ausbildung eines zu generierenden Knorpelgewebes, geeignet ist.
• Es ist auch bekannt ( WO 2008/079034 A2 ), bakterielle Nanocellulose bevorzugt als Wundauflage bzw. zur Behandlung von Hernien zu verwenden. Es werden durchgehende Flächen von BNC, aber auch Flächen mit künstlich generierten Löchern beschrieben. Die Durchmesser dieser Löcher liegen dabei im Bereich von 0,08–0,5 cm jeweils in einem Abstand von 0,7–2,5 cm. Eigene Untersuchungen haben gezeigt, dass diese Netzwerkstruktur der BNC nicht hinreichend mit Knorpelzellen besiedelt wird. Die künstlich generierten Löcher stellen aufgrund der mittleren Durchmesser für die im Verhältnis zur Lochgröße sehr kleinen Zellen keine dreidimensionale Struktur dar, sondern eine zweidimensionale Oberfläche, welche Dedifferenzierungsprozesse in Chondrozyten fördert. Dieses Netzwerk mit den darin generierten Löchern der besagten Größe und Abstände erscheint deshalb für die Ausbildung eines entsprechenden Knorpelersatzes als nicht geeignet.
• In WO 2005/018435 wird thermisch modifizierte BNC beschrieben. Die Temperatur in der BNC wird auf unter 0°C gesenkt und das Wasser durch Abgießen, Abtupfen, Pressen oder das Anlegen von Vakuum partiell oder auch vollständig entfernt. Mögliche Anwendungsfelder für dieses Material sollen der Gewebeersatz und der Einsatz als Füllstoff oder „chirurgisches” Netz in der Chirurgie, der plastischen Chirurgie und der Neurochirurgie sein. Bei der Trocknungsmethode, die nicht explizit offenbart ist, ist allerdings die Gefahr einer Beschädigung der BNC-Netzwerkstruktur, beispielsweise durch thermische und/oder mechanische Beanspruchung, nicht auszuschließen, so dass für eine Verwendung zur Generierung von Knorpelgewebe die Besiedlung des BNC-Netzwerkes mit Zellen gehemmt oder zumindest nicht unwesentlich beeinträchtigt wird. Auch nichtthermische Trocknungsmethoden zur Entfernung des Wassers, beispielsweise, Auspressen, können Schädigungen der BNC-Netzwerkstruktur zur Folge haben.
• Die Verwendung von BNC als in vitro-/ex vivo-Zellcarrier wird in DE 2003-10361898 und in A. Svensson et al.: Bacterial cellulose as a potential scaffold for tissue engineering of cartilage, Biomaterials, 2005, 26(4), 419–431 beschrieben. Diese Art der Anwendung ist jedoch lediglich in vitro möglich. Zudem hat sich gezeigt, dass mit dieser Methode nur eine oberflächliche (zweidimensionale), aber keine in die Tiefe gehende (dreidimensionale) Besiedlung des Netzwerkes erreicht wird. Daher ist die Ausbildung einer funktionsfähigen Knorpelmatrix nicht zu erwarten. Über eine diesbezügliche Verwendung eines solchen Carriers zur in vivo-Knorpelneubildung ist in der Fachwelt auch nichts bekannt geworden.
• Bekannt ist auch (beispielsweise C. R. Rambo et al.: Template assisted synthesis of porous nanofibrous cellulose membranes for tissue engineering, Materials Science & Engineering, C: Biomimetic and Supramolecular Systems, 2008, 28(4), 549–554), optische Fasern bzw. Fasern aus Polystyren senkrecht in die BNC einzubringen. So konnte BNC mit Poren zwischen 60–300 μm hergestellt werden. Nachteilig ist auch hier wiederum der Trocknungsprozess und die mit diesem einhergehende Gefahr der Beschädigung der BNC-Netzwerkstruktur. Ein weiteres Problem ist nach wie vor die tiefenwirksame Besiedelung des Netzwerkes, da eine Ansiedlung von Zellen ausschließlich im Oberflächenbereich der Poren der BNC-Netzwerkstruktur nicht zu einer Generierung vollständiger und qualitativ hochwertiger Knorpelgewebe führt. Die Gefahr von Beschädigungen der BNC-Netzwerkstruktur durch den besagten Trocknungsprozess schränkt dieses Anwendungsfeld weiter ein.
• Ferner ist die Imitation knorpelähnlicher Eigenschaften durch den Aufbau von Doppelhydrogelnetzwerken, z. B. durch die Kombination von BNC mit Gelatine, beschrieben worden (beispielsweise A. Nakayama et al.: High Mechanical Strength Double-Network-Hydrogel with Bacterial Cellulose, Adv. Funct. Mater. 2004, 14, 1124–1128). Allerdings schränken Komposite, welche beispielsweise die Stabilität des BNC-Netzwerkes temporär erhöhen können, den Raum für die Besiedelung der Netzwerkstruktur nachteilig ein, so dass die Generierung von Knorpelstrukturen zumindest zeitweise eingeschränkt ist. Selbst resorbierbare Komposite, wie Gelatine, benötigen für ihren Abbau nicht unwesentlich Zeit, während der die Besiedelung der Netzwerkstruktur gehemmt ist.
• Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein universell verwendbares dreidimensionales Netzwerk zu schaffen, das sowohl eine dauerhafte, gerüstbildende Stabilität aufweist als auch eine schnellstmögliche und homogene Besiedlung mit knorpelbildenden Zellen zur Ausbildung von funktionsfühigem Knorpelgewebe in vivo gewährleistet.
• Die Aufgabe wird durch den Aufbau einer bakteriellen Nanocellulose, bestehend aus einer weitmaschigen Phase der BNC sowie aus zumindest einer mit dieser fest verbundenen engmaschigen Phase der BNC, gelöst, die als Implantat zur Knorpelneubildung eingesetzt werden kann. Ein solcher Aufbau wird in einem Kultivierungsschritt generiert, und das Material wird vorzugsweise als sogenanntes initial-feuchtes (d. h. ohne eine vollständige Trocknung) Gerüst zur insbesondere in vivo-Besiedlung durch knorpeleigene Zellen zwecks Ausbildung von Knorpelgewebe eingesetzt.
• Es hat sich gezeigt, dass der Aufbau mit dem vorgeschlagenen Schichten-Netzwerksystem ein besagtes Gerüst zur Generierung von Knorpelneugewebe darstellt, welches einerseits aufgrund der zumindest einen engmaschigen Phase (niedriger Wassergehalt) eine vorteilhafte Formstabilität und damit eine sofortige und beständige ”gerüststützende” Wirkung für die weitmaschige Phase (hoher Wassergehalt) und damit für den Implantateinsatz gewährleistet. Zudem sichert diese engmaschige Phase eine gute chirurgische Handhabbarkeit, d. h. sie verleiht der BNC die nötige Festigkeit, damit diese schneid- und auch gut fixierbar, insbesondere nähbar, ist. Andererseits bietet die weitmaschige Phase des Implantataufbaus hervorragende Voraussetzungen für eine sofortige, ungehemmte und homogene in vivo-Besiedlung durch knorpeleigene Zellen des Patienten, ohne dass erst stützende Elemente des Implantats abgebaut werden müssen, bevor diese Räume als Besiedlungsorte verwendbar sind. Die Erfindung kombiniert auf vorteilhafte Weise die bekannten positiven Eigenschaften der bakteriellen Nanocellulose (insbesondere sehr gute Gewebe- und Blutverträglichkeit, schnelle und dauerhafte Besiedlung durch Zellen) mit den Merkmalen einer stabilen Formgebung und der Stützfunktion eines Gerüstes zur Besiedlung mit Zellen. Diese neuen Eigenschaften der bakteriellen Nanocellulose sind zudem in einem Kultivierungsprozess erreichbar. Der vorgeschlagene Aufbau der bakteriellen Nanocellulose ermöglicht die Verwendung als Implantat zur Knorpelneubildung und vermeidet durch seine speziellen Eigenschaften die eingangs beschriebenen Nachteile bekannter Methoden.
• Aufgrund des Nichtvorhandenseins von Cellulasen im menschlichen Organismus, ist die BNC nicht resorbierbar, so dass keine Stoffe freigesetzt werden, die chronischentzündliche Zellreaktionen auslösen könnten. Weiterhin wird die Problematik der Synchronisation von der Art und von der Geschwindigkeit des Gerüstabbaus mit der Aufbaugeschwindigkeit des Knorpels zur Gewährleistung der Funktion des zu regenerierenden Knorpels umgangen. Die erfindungsgemäße BNC verleiht dem Implantat von Beginn an langfristige Stabilität und fungiert zugleich als stabiles dreidimensionales Gerüst, welches durch das gebildete Regenerationsgewebe aufgefüllt wird.
• Durch die schonende Behandlung der BNC bei der Entfernung der aus dem Kulturmedium stammenden Bestandteile nach der Biosynthese ohne strukturzerstörende Trocknung und/oder mechanische Behandlungsschritte bleibt die BNC-Nanonetzwerkstruktur, die es der BNC ermöglicht, große Mengen an Flüssigkeit zu binden, vollständig erhalten. Anders als Hydrogele aus synthetischen Polymeren ermöglicht diese BNC nach der Implantation, besonders durch das Vorhandensein der weitmaschigen Phase, das Einwandern der sich hauptsächlich am Rand des Implantats befindenden ortständigen Knorpelvorläufer- bzw. Knorpelzellen in vivo. Diesen körpereigenen Zellen bietet die BNC eine dreidimensionale Gerüststruktur, die durch die Ausbildung homogenen und voll funktionsfähigen Knorpelgewebes „vitalisiert” werden kann.
• BNC ist sterilisierbar und biokompatibel einsatzfähig. In einer sterilen Verpackung ist das initial-feuchte Material, vorzugsweise in Wasser, mindestens ein Jahr haltbar, vorzugsweise bei Temperaturen um 4°C sowie unter Lichtausschluss. Die Lagerung kann ebenso nach schonender Trocknung bei Raumtemperatur erfolgen. Durch geeignete Trocknungsmethoden (beispielsweise Gefriertrocknung, Kritischpunkttrocknung) bleibt die erfindungsgemäße Struktur der BNC erhalten, so dass eine vollständige Requellbarkeit gewährleistet bleibt.
• Eine solche BNC wird als ein zellfreies, bioaktives, dauerhaft stabiles Implantat zur Regeneration von Knorpeldefekten, beispielsweise in größeren Gelenken, vorgeschlagen. Da sie keine autologen Zellen enthält, ist eine vorhergehende Biopsieentnahme beim Patienten nicht erforderlich. Das Implantat kann entweder arthroskopisch (kleinere Defekte) oder bei einer Operation direkt an Ort und Stelle (großer Defekt) einfach und unkompliziert eingesetzt werden. Es bildet aufgrund seines erfindungsgemäßen zweiphasigen BNC-Netzwerkes eine formstabile Hydrogel-Struktur und gestattet das Passieren bzw. das Einwandern und Ansiedeln von Ionen, organischen Molekülen und Zellen. Seine hohe Festigkeit ermöglicht die zuverlässige chirurgische Handhabung und die Verwendung unterschiedlicher Fixierungstechniken (z. B. Knorpel-Naht, Verklebung, Fixierung mit Pins/Nägeln).
• Das Implantat kann zusätzlich Zytokine oder Wachstumsfaktoren enthalten, welche die Einwanderung und Proliferation von ortständigen Zellen in das defektfüllende Implantat fördern sowie die Ausbildung von vollwertiger Knorpelmatrix anregen. Dabei stellt das BNC-Implantat eine langfristig stabile Gerüststruktur dar, die durch ein voll funktionsfähiges sich neu bildendes Knorpelgewebe aufgefüllt wird. Dieses zellfreie Implantat ist langfristig lagerfähig und leicht zu versenden. Es kann in großen Mengen hergestellt und bei Bedarf für einen operativen Eingriff direkt und schnell eingesetzt werden.
• Zur Verwendung des Implantates zur Knorpelneubildung bei Knorpelschäden wird nach Diagnose (z. B. mittels MRT, Arthroskopie) der Knorpelschaden des Patienten entweder klassisch durch Eröffnung des Gelenkes oder aber arthroskopisch freigelegt. Gegebenenfalls erfolgt eine Glättung der Knorpelläsion bzw. des arthrotischen Defektes. In Abhängigkeit von der Größe des Knorpeldefektareals kann der Operateur aus einer Palette vorgefertigter BNC-Implantate auswählen und ein BNC-Implantat entsprechender Form und Größe in den Defekt einbringen. Die Fixierung des BNC-Implantates erfolgt durch Vernähen mit der randständigen Knorpelschulter mittels resorbierbaren Nahtmaterials. Ebenso ist das Einkleben des Implantates mit chirurgischen Klebern, z. B. Fibrinklebern, sowie eine Verankerung des Implantates im darunter liegenden Knochen mittels resorbierbarer Pins/Nägel möglich. Nach Vernähen der Operationsöffnung sollte der Patient aufgrund des relativ schonenden Vorgehens (keine Verletzung intakter Knorpelareale zur Gewinnung von Chondrozyten wie bei der ACT) und der mechanischen Stabilität des Implantates nach kurzer Ruhephase das Gelenk wieder belasten können.
• Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
• In der Zeichnung zeigen:
• 1: schematische Darstellung der zur Implantatverwendung vorgesehenen zweiphasigen BNC
• 2: Migration von Chondrozyten in das BNC-Netzwerk
• A) Besiedlung der engmaschigen Netzwerkstruktur des BNC-Netzwerkes
• B) Besiedlung der weitmaschigen Phase des BNC-Netzwerkes
• 3: In vitro-Modell für die endogene Regeneration eines Knorpeldefekts mit einem in diesen eingepassten BNC-Netzwerk
• 4: Frühe Stadien der Knorpelmatrixregeneration im BNC-Netzwerk nach 8-wöchiger in vitro-Kultivierung mit bovinem Knorpel
• Ausführungsbeispiel 1:
• Herstellung des zweiphasigen BNC-Netzwerkes
• Eine Nährlösung, die pro Liter aqua dest. 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat und 1,15 g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 (Schramm-Hestrin-Medium) aufweist, wird bei 120°C für 20 Minuten dampfsterilisiert. Nach dem Beimpfen von 20 ml Nährmedium mit dem Bakterium Gluconacetobacter xylinus aus einer 7 Tage alten flüssigen Stammkultur in Schramm-Hestrin-Medium (1 ml) werden 0,3 ml dieser beimpften Nährlösung in ein Gefäß aus Polystyren, mit einer Kapazität von 1,8 ml gefüllt. Zur Gewährleistung der Sterilität und eines feuchten, aeroben Milieus im Gefäß wird dieses während des Kultivierungsprozesses mit einem Deckel verschlossen. Die Kultivierungszeit beträgt 14 Tage bei einer Temperatur zwischen 28°C und 30°C. Überraschend hat sich gezeigt, dass sich unter diesen Kultivierungsbedingungen eine bakterielle Nanocellulose bildet, die in einem zweiphasigen Aufbau zu 67% aus einer weitmaschigen Phase 1 und zu 33% aus einer engmaschigen Phase 2 von bakterieller Nanocellulose besteht. Der zweiphasige Aufbau der generierten bakteriellen Nanocellulose wurde dem Gefäß (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellt) entnommen, mit siedender, wässriger 0,1 N Natronlauge 10 min lang behandelt und gründlich mit Wasser neutral gewaschen. Auf diese Weise erhält man bakterienfreie und als Implantat zur Knorpelneubildung verwendbare bakterielle Nanocellulose mit einem Durchmesser von 11,5 mm und einer Höhe von 1,0 mm. Es zeigte sich überraschend, dass das beschriebene Zweiphasensystem auch nach der Behandlung mit der besagten Natronlauge strukturstabil blieb.
• 1 zeigt in schematischer Darstellung den Aufbau dieser im Kultivierungsprozess generierten zweiphasigen bakteriellen Nanocellulose als dreidimensionalen zylindrischen Formköper in perspektivischer Betrachtung (linke Abbildung) sowie im Querschnitt (rechte Abbildung). Aus diesen Abbildungen ist der Aufbau des BNC-Netzwerkes aus der unteren besagten weitmaschigen Phase 1 sowie der mit dieser fest verbundenen oberen engmaschigen Phase 2 ersichtlich.
• Ausführungsbeispiel 2:
• Besiedlung des BNC-Netzwerkes mit isolierten Chondrozyten
• Die dreidimensionale Besiedlung der BNC wurde mit isolierten Knorpelzellen untersucht. Das Isolieren der humanen bzw. bovinen Knorpelzellen aus der sie umgebenden Knorpelmatrix erfolgte durch enzymatischen Verdau sowie anschließende Aufreinigung mittels zweifacher Passagierung der Zellen in Monolayerkulturen. Eine Migration von Chondrozyten 3 in das BNC-Netzwerk wurde in sogenannten Transwellsystemen untersucht. Die Verwendung des Transwellsystems ermöglicht die Einstellung eines Serumgradienten, durch den eine zielgerichtete Anlockung der Chondrozyten in tiefere Schichten des BNC-Netzwerkes induziert werden sollte. Die zuvor isolierten bovinen bzw. humanen Chondrozyten wurden als Zellsuspension auf die in den Transwelleinsätzen befindliche BNC aufgebracht und kultiviert. In der oberen Transwellkammer befand sich Serum-armes Medium (1% Serum), in der unteren Transwellkammer Serum-reiches Medium (10% Serum). Durch die Anwesenheit der feinporigen Membran zwischen den beiden Kammern entstand ein Serumgradient zur Anlockung der oberflächlich applizierten Chondrozyten in tiefere Regionen des BNC-Netzwerkes. Da die engmaschige BNC ein sehr dichtes Netzwerk aus Nanocellulosefasern bildet, dessen Poren eine kritische Größe im Verhältnis zu den vergleichsweise großen Chondrozyten aufweisen, adhärierten isolierte Chondrozyten bei Besiedlung von engmaschiger BNC auf der Oberfläche des BNC-Netzwerkes.
• Bei Besiedlung der weitmaschigen BNC mit isolierten Chondrozyten wurde bereits nach 24-ständigem Kultivierungsprozess histologisch eine Chondrozytenmigration in tiefere Schichten des BNC-Netzwerkes beobachtet. Diese weitmaschige BNC besitzt ein aufgelockertes Netzwerk, dessen Porengrößen in einem günstigen Verhältnis zur Größe der applizierten Chondrozyten stehen.
• 2 zeigt schematisch die Besiedlung des BNC-Netzwerkes mit den Chondrozyten 3. Während diese bei der engmaschigen Phase 2 des BNC-Netzwerkes (2a) auf der Oberfläche adhärierten, besiedelten die Chondrozyten 3 die weitmaschige Phase 1 des BNC-Netzwerkes innerhalb kurzer Zeit auch in der Tiefe (2b).
• Ausführungsbeispiel 3:
• In vitro-Kultivierung eines als Implantat vorgesehenen BNC-Netzwerkes mit bovinem Knorpel
• Es wurde ein in vitro-Modell für die endogene Knorpelregeneration etabliert (3), indem ein künstlicher Defekt 4 eines Knorpels 5 (bovine Knorpelscheiben) mit einem vorgeformten, bakteriell synthetisierten BNC-Netzwerk 6 aufgefüllt und ein daraus gebildetes Modellimplantatsystem 7 (künstlicher Defekt 4 des Knorpels 5 mit eingefügtem BNC-Netzwerk 6) in ein mit Agarose 8 befülltes Kulturgefäß 9 gegeben wurde. Anschließend wurde das Modellimplantatsystem 7 unter Zugabe eines Kulturmediums 10 in vitro unter TGF-b1 Stimulation kultiviert (siehe 3). Die Formgebung des BNC-Netzwerkes 6 orientierte sich an den Maßen des im Knorpel 5 generierten Defektes 4. Nach 4- bzw. 8-wöchiger Kultur, jedoch noch nicht nach 2-wöchiger Kultur, waren frühe Stadien einer Knorpelmatrix-Regeneration im defektfüllenden BNC-Netzwerk erkennbar. Dabei blieb die Integrität des Knorpels trotz der für in vitro-Untersuchungen relativ langen Kulturdauer erhalten. Die frühen Stadien einer Knorpelmatrix-Regeneration waren sowohl in unstimulierten als auch in TGF-b1 stimulierten Proben in Form des immunhistologischen Nachweises intakten Aggrekans und Kollagens Typ II im BNC-Netzwerk 6 detektierbar (4). Weiterhin verließen Chondrozyten 3 den Knorpel 5 und adhärierten auf der Oberfläche des BNC-Netzwerkes 6 (siehe ebenfalls 4).
• 4 zeigt schematisch diese frühen Stadien der Knorpelmatrixregeneration im in den künstlichen Defekt 4 des Knorpels 5 eingepassten BNC-Netzwerk 6 nach 8-wöchiger Kultur mit bovinem Knorpel. Die Einlagerung von Proteoglykanen in das BNC-Netzwerk 6 war durch eine positive Safranin-O Färbung des BNC-Netzwerks 6 ersichtlich.
• Dieser Befund wurde durch den immunhistologischen Nachweis von neugebildetem Aggrekan bestätigt. Als weitere wichtige Knorpelkomponente wurde Kollagen Typ II im Gerüst des BNC-Netzwerks 6 nachgewiesen. Neben einer Einlagerung von Knorpelmatrix im Gerüst des BNC-Netzwerks 6 wurde eine Besiedlung der Oberfläche des BNC-Netzwerks 6 durch die aus dem Knorpel migrierten Chondrozyten 3 beobachtet.
• Zur Verwendung von erfindungsgemäßen Implantaten zur Knorpelneubildung bei Knorpelschäden wird nach Diagnose (z. B. mittels MRT, Arthroskopie) der Knorpelschaden des Patienten entweder klassisch durch Eröffnung des Gelenkes oder aber arthroskopisch freigelegt. Gegebenenfalls erfolgt eine Glättung der Knorpelläsion des arthrotischen Defektes. In Abhängigkeit von der Größe des Knorpeldefektareals kann der Operateur aus einer Palette vorgefertigter BNC-Implantate auswählen und ein BNC-Implantat entsprechender Form und Größe in den Defekt einbringen. Die Besonderheit dieses BNC-Implantates besteht darin, dass das relativ lockere weitmaschige BNC-Netzwerk der Besiedlung mit aus dem Knorpel migrierenden Zellen dient. Diese Zellen können aufgrund der besonderen Beschaffenheit der weitmaschigen BNC gut einwandern und neue Knorpelmatrix bilden. Die für eine Befestigung des BNC-Vlieses während der OP benötigte Stabilität wird durch den verdichteten/engmaschigen Teil der BNC gewährleistet, welcher mit der weitmaschigen Phase der BNC fest verbunden ist. Die Fixierung des BNC-Implantates erfolgt demnach durch Vernähen des verdichteten/engmaschigen Anteils des BNC-Implantates mit der randständigen Knorpelschulter mittels resorbierbaren Nahtmaterials. Ebenso ist das Einkleben des Implantates mit chirurgischen Klebern (z. B. Fibrinkleber) sowie eine Verankerung des Implantates im darunter liegenden Knochen mittels resorbierbarer Pins/Nägel möglich. Nach Vernähen der Operationsöffnung sollte der Patient aufgrund des relativ schonenden Vorgehens (keine Verletzung intakter Knorpelareale zur Gewinnung von Chondrozyten wie bei der ACT) und der mechanischen Stabilität des Implantates nach kurzer Ruhephase das Gelenk wieder belasten können.

1

weitmaschige Phase des BNC-Netzwerkes

2

engmaschige Phase des BNC-Netzwerkes

3

Chondrozyten

4

künstlicher Defekt

5

Knorpel

6

BNC-Netzwerk

7

Modellimplantatsystem

8

Agarose

9

Kulturgefäß

10

Kulturmedium

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Patentliteratur
• - EP 1953174 A1 [0008]
• - WO 2007/064881 A2 [0009, 0009]
• - WO 2007/146946 A2 [0009]
• - WO 2008/079034 A2 [0010]
• - WO 2005/018435 [0011]
• - DE 2003-10361898 [0012]
• Zitierte Nicht-Patentliteratur
• - M. Brittberg et al.: Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologeous chondrocyte transplantation, Engl J Med, 1994, 331, 889 [0004]
• - T. Minas: Autologous chondrocyte implantation in the arthritic knee, Orthopedics, 2003, 26, 945 [0004]
• - S. Nehrer et al.: Three-year clinical outcome alter chondrocyte transplantation using a hyaluronan matrix for cartilage repair, Eur J Radiol, 2006, 57, 3 [0005]
• - P. Gehrens et al.: Matrix-associated autologous chondrocyte transplantation/implantation (MACT/MACI)-5-year follow-up, Knee, 2006, 13, 194 [0005]
• - C. Ossendorf et al.: Treatment of posttraumatic and focal osteoarthritic cartilage defects of the knee with autologous polymer-based three-dimensional chondrocyte grafts: 2-year clinical results, Arthritis Res Ther, 2007, 9, R41 [0005]
• - J. Kopecek, J. Yang: Hydrogels as smart biomaterials, Polymer International 2007, 56/9, 1078 [0007]
• - D. Klemm et al.: Nanocelluloses as innovative polymers in research and application, Adv. Polym. Sci. 2006, 205, 49 [0007]
• - A. Svensson et al.: Bacterial cellulose as a potential scaffold for tissue engineering of cartilage, Biomaterials, 2005, 26(4), 419–431 [0012]
• - C. R. Rambo et al.: Template assisted synthesis of porous nanofibrous cellulose membranes for tissue engineering, Materials Science & Engineering, C: Biomimetic and Supramolecular Systems, 2008, 28(4), 549–554 [0013]
• - A. Nakayama et al.: High Mechanical Strength Double-Network-Hydrogel with Bacterial Cellulose, Adv. Funct. Mater. 2004, 14, 1124–1128 [0014]

Claims (18)

1. Bakterielle Nanocellulose zur Knorpelneubildung, gekennzeichnet durch einen Aufbau, bestehend aus einer weitmaschigen Phase (1) der bakteriellen Nanocellulose sowie aus zumindest einer mit dieser fest verbundenen engmaschigen Phase (2) der bakteriellen Nanocellulose.
2. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufbau, bestehend aus der weitmaschigen Phase (1) und aus der zumindest einen engmaschigen Phase (2) der bakteriellen Nanocellulose, eine im Wesentlichen zylindrische Form aufweist mit einem Durchmesser von 3 mm bis 40 mm, vorzugsweise 3 mm bis 10 mm, und einer Höhe von 1 mm bis 10 mm, vorzugsweise 2 mm bis 4 mm.
3. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der weitmaschigen Phase (1) in dem Aufbau 10% bis 90%, vorzugsweise 30% bis 80%, beträgt.
4. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanocellulose in der weitmaschigen Phase (1) und/oder in der zumindest einen engmaschigen Phase (2) Wachstums- und/oder Rekrutierungsfaktoren und/oder andere Proteine und sonstige Wirkstoffe, beispielsweise Medikamente, zugesetzt sind.
5. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die weitmaschige Phase (1) einen mittleren Porendurchmesser von 10 μm bis 500 μm, vorzugsweise 100 μm bis 200 μm, und einen Cellulosegehalt von 0,1‰ bis 5,0‰ (Wassergehalt 99,50% bis 99,99%), vorzugsweise 0,5‰ bis 1,5‰ (Wassergehalt 99,85% bis 99,95%), aufweist.
6. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die engmaschige Phase (2) einen mittleren Porendurchmesser von 1 μm bis 20 μm, vorzugsweise 2 μm bis 6 μm, und einen Cellulosegehalt von 5,1‰ bis 10,0‰ (Wassergehalt 99,00% bis 99,49%), vorzugsweise 7,0‰ bis 9,0‰ (Wassergehalt 99,10% bis 99,30%), aufweist.
7. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nanocellulose Wachstumsfaktoren eingebracht sind, beispielsweise Wachstumsfaktoren der TGF Superfamilie, insbesondere TGF-b1 und TGF-b3, und/oder Mitglieder der BMP (Bone morphogenetic protein) Familie, und/oder Vertreter der EGF (Epidermal growth factor) und/oder FGF (Fibroblast groth factor) und/oder IGF (Insulin like growth factor) und/oder PDGF (Platelet derived growth factor) und/oder VEGF (Vascular endothelial growth factor) und/oder GDF (Growth and differentiation factor) Familien.
8. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nanocellulose Rekrutierungsfaktoren eingebracht sind, hauptsächlich Chemokine, beispielsweise Mitglieder der CXC Chemokinfamilie, insbesondere CXCL-7, und/oder Mitglieder anderer Chemokinfamilien (CC, CX3C und XC).
9. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nanocellulose Knorpelmatrixkomponenten, wie beispielsweise Proteoglykane und Kollagene, eingebracht sind.
10. Bakterielle Nanocellulose gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nanocellulose, beispielsweise zum Zweck der Erhöhung ihrer initialen mechanischen Eigenschaften biokompatible Materialien, wie z. B. Calciumalginat und vernetzte Gelatine, eingebracht sind.
11. Verwendung der bakteriellen Nanocellulose gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die bakterielle Nanocellulose ohne Trocknung nach dem Kultivierungs- und Reinigungsprozess als initial-feuchtes Implantat zur Knorpelneubildung eingesetzt wird.
12. Verwendung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das initial-feuchte Implantat aus der bakteriellen Nanocellulose ohne erforderliche weitere Modifikation zur in vivo-Knorpelneubildung vorgesehen ist.
13. Verwendung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die bakterielle Nanocellulose zunächst vollständig oder teilweise in vitro mit Knorpelzellen besiedelt wird und anschließend als Implantat eingesetzt wird.
14. Verwendung der bakteriellen Nanocellulose gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanocellulose zur Lagerung, beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Kritischpunkttrocknung, schonend getrocknet wird, wobei die Struktur und die Requellbarkeit der Nanocellulose erhalten bleiben, und dass das Implantat vor der chirurgischen Verwendung bzw. vor der in vitro-Anwendung, beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung oder auch in patienteneigenem oder allogenem (pharma-grade) Serum regequollen wird.
15. Verfahren zur Herstellung der bakteriellen Nanocellulose gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufbau, bestehend aus der weitmaschigen Phase und aus der zumindest einen mit der weitmaschigen Phase fest verbundenen engmaschigen Phase der bakteriellen Nanocellulose in einem Kultivierungsschritt des Kultivierungsprozesses als Zwei-Phasen-Implantat generiert wird.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an den Kultivierungsprozess und nach einer Reinigung der kultivierten bakteriellen Nanocellulose die Unterseite der weitmaschigen Phase zum Zweck einer Verfestigung vorzugsweise durch partiellen Wasserentzug verdichtet wird.
17. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an den Kultivierungsprozess und nach einer Reinigung der kultivierten bakteriellen Nanocellulose an der Unterseite der weitmaschigen Phase zum Zweck einer Verfestigung ein dort ausgebildetes weiteres Polymernetzwerk, beispielsweise aus Calciumalginat, Calciumcarboxymethylcellulose oder vernetzten Acrylaten, aufgebaut wird.
18. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an den Kultivierungsprozess und nach einer Reinigung der kultivierten bakteriellen Nanocellulose die Oberflächen durch mechanische oder lasertechnische Behandlung geöffnet werden.