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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion
und zum Identifizieren von Biopartikeln.
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In
verschiedenen Branchen, wie z.B. der pharmazeutischen oder der Lebensmittelindustrie, finden
Produktionen und Forschung unter Reinraumbedingungen statt, wobei
hohe Reinheitserfordernisse einzuhalten sind. Es besteht daher Bedarf
an Information über
die aktuell vorhandene Partikelbelastung im gesamten Produktionsbereich,
um das Kontaminationspotential durch Mikroorganismen zu kontrollieren
bzw. die Einhaltung der Reinheitsanforderungen quantitativ zu verifizieren.
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Bislang
erfolgt die Überwachung
der Biopartikelkontamination von Produktionsbereichen meist anhand
von konventionellen molekularbiologischen Methoden. Bei den konventionellen
Methoden wird die Probe auf verschiedene Nährmedien aufgebracht, da verschiedene
Mikroorganismen unterschiedlichen Nährmedien benötigen, diese
bebrütet, die
Mikroorganismen gezählt
und anhand ihrer Morphologie sowie dem Wachstum unter variablen
Umgebungsbedingungen identifiziert. Frühestens nach einem Zeitraum
von ca. 2 bis 5 Tagen lassen sich aus den Labor-Ergebnissen Rückschlüsse auf
die Art und Häufigkeit
vorhandener Kontaminationen von einem weiter zurückliegenden Zeitpunkt ziehen.
Im allgemeinen ist auch keine Einzelmethode, sondern nur die Kombination
mehrerer Methoden in der Lage, die Mikroorganismen eindeutig zu
identifizieren.
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Bei
einem weiteren Verfahren werden einzelne Zellen mit Vitalfarbstoffen
gekennzeichnet und die angefärbten
Zellen mit Hilfe eines Laserscanners detektiert. Problematisch erweist
sich hier, dass die Vitalität
der Zellen nach der Anfärbung
nicht mehr gegeben ist und der Anfärbeprozess manuell durchgeführt werden
muss. Ein automatisiertes Umgebungsmonitoring ist so nicht möglich.
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Bei
einem weiteren bekannten Verfahren wird eine Fluoreszenzanregung
von Partikeln, die angesaugt und durch einen speziellen Triggermechanismus
im Flug angeregt werden. Das Verfahren beinhaltet keinerlei Probenvorbereitung
und liefert unmittelbar Ergebnisse. Problematisch erweist sich hier der
Verlust der untersuchten Partikel. Erkannte biotische Partikel können keiner
weiterführenden
Identifizierung zugeführt
werden.
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Die
DE 197 17 749 offenbart
ein Verfahren zur Größenbestimmung
und Online-Differenzierung von luftgetragenen biotischen und abiotischen
Kontaminationen mit Hilfe von optischen Partikelzählern in Kombination
mit einer Veränderungseinheit.
Eine genotypische Unterscheidung der Mikroorganismen kann mit diesem
Verfahren nicht erzielt werden.
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Die
WO 98/48243 offenbart ein Verfahren zur Detektion von Partikeln
auf technischen Oberflächen über Streiflicht,
wobei eine Unterscheidung bzw. Identifizierung der Biopartikel nicht
gegeben ist.
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Die
US 5,701,012 , WO 96/18205
und WO 97/28439 offenbaren Fluoreszenzverfahren bei denen nach UV-Licht-Anregung
von Stoffwechselprodukten in biologischen Zellen das emittierte
Fluoreszenzlicht detektiert wird. Ein Echtzeit-Verfahren zur Bestimmung
der Partikelgrößen kombiniert
mit der Detektion von biologisch aktiven, vitalen Kontaminanten
wird in der
US 5,701,012 beschrieben.
Die Partikelgröße wird
hierbei durch die unterschiedlichen Flugzeiten der Partikel aufgrund
ihrer Masse ermittelt (Aerodynamic Particle Sizing – APS).
Anschließend
werden die Zellinhaltsstoffe wie NADH und Riboflavin per UV-Licht
angeregt und das Fluoreszenzlicht detektiert. Eine genotypische
Bestimmung der biologischen Materialien ist mit diesem Verfahren
nicht möglich.
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Es
ist ferner bekannt, mit schwingungs-spektroskopischen Methoden die
chemische Zusammensetzung einer Biokontamination zu identifizieren.
Das untersuchte Probenvolumen liegt im Bereich von 1 μm3, d. h. für die Identifizierung müssen Mikrokolonien
gezüchtet
werden. Die Untersuchung von einzelnen Mikroorganismen mit konfokaler
Raman-Spektroskopie auf Calciumfluoridsubstraten wurde berichtet.
SERS bzw. SERRS wurde zur Spektroskopie von Einzelzellen sowie zur
Identifizierung von DNA-Fragmenten eingesetzt.
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In
der WO 03/060444 wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Identifizierung
von pathogenen Mikroorganismen auf einer Oberfläche beschrieben, das unter
anderem Raman-Spektroskopie zur Identifizierung der Mikroorganismen
einsetzt. Mit diesem Verfahren wird ein integriertes Spektrum über einen Oberflächenbereich
erzeugt und daraus die vorkommenden pathogenen Mikroorganismen bestimmt.
Es ist jedoch mit diesem Verfahren nicht möglich, die Anzahl der Mikroorganismen
zu bestimmen und gezielt einen einzelnen Mikroorganismus aus der
vorhandenen Mehrzahl zu identifizieren.
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Aus
der WO 02/097409 ist ein Verfahren zur automatisierten Erkennnung,
spektroskopischen Analyse und Identifizierung von Partikeln bekannt.
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Es
ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen
mit dem bzw. mit der zeitnahe Identifizierung von Biokontaminationen auf
einfache schnelle und zuverlässige
Weise möglich
ist.
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Die
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren nach Patentanspruch 1 bzw. durch eine Vorrichtung nach
Patentanspruch 12. Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Die
Erfindung weist den Vorteil auf, daß einzelne aus einer Mehrzahl
zu untersuchender Biopartikel, wie z.B. einzelne Bakterien, in einem
Zeitraum von wenigen Minuten detektierbar und identifizierbar sind.
Eine Unterscheidung zwischen biotischen und abiotischen Partikeln
ist möglich.
Bei der Analyse können
selektiv die interessierenden Partikel betrachtet werden, wodurch
sich die Gesamtanalysezeit deutlich reduzieren läßt.
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Der
Einsatz von höchstsensitiver
Raman-Spektroskopie (Raman, Resonanz-Raman, UV-Resonanz-Raman) erlaubt
den spezifischen Nachweis geringster Stoffmengen. Es ist keine Probenvorbereitung
und kein Züchten
erforderlich. Ferner werden die Biopartikel bei der Detektion und
der Identifizierung nicht zerstört.
Die Identifizierung der einzelnen Mikroorganismen erfolgt an Hand
charakteristischer Markermoleküle
wie z.B. DNA bzw. Proteinen. Durch die gezielte Analyse einzelner
Partikel ist es möglich,
die Spektroskopieparameter optimal an die Streucharakteristiken
individueller Organismen anzupassen, wodurch die Analysezeit optimiert
wird. Das Verfahren ist daher nahezu unabhängig von Wachstumsphasen bzw.
Umwelteinflüssen.
Der Zeitgewinn gegenüber
konventionellen Methoden ist somit außerordentlich hoch. Im Vergleich
zu konventionellen mikrobiologischen Methoden erfolgt die Identifizierung
etwa 1000 mal schneller. So werden konventionell z.B. etwa 3000
Minuten benötigt,
während etwa
3 Minuten mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
benötigt
werden.
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Falls
eine weiterführende
Untersuchung erforderlich ist, können
einzelne Partikel abgenommen werden und entsprechend weiterverarbeitet
werden, z.B. mit SERS oder SERRS oder durch klassische mikrobiologische
Verfahren.
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Die
Erfindung eignet sich für
den automatisierten Betrieb in Produktionsbereichen wie z.B. der pharmazeutischen
Produktion, der Lebensmittelherstellung, der Wasserversorgung und
-aufbereitung. Durch die zeitnahe Analyse lassen sich die Kosten und
Risiken, die durch Produktionsausfälle oder Produktverderb entstehen,
minimieren.
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Weitere
Merkmale und Zweckmäßigkeiten der
Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen
anhand der Figuren. Von den Figuren zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
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2 eine
schematische Darstellung der Beleuchtungseinrichtung der Vorrichtung
nach 1;
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3a)
bis 3c) Abbildungen des Substrats mit Partikeln;
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4 Raman-Spektren
einzelner Bakterien, die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung aufgenommen
wurden;
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5 die
durchschnittliche Erkennungsrate von Bulk-Spektren eines dicken Bakterienausstrichs auf
der Trägeroberfläche zum
Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren;
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6 die
durchschnittliche Erkennungsrate von Spektren einzelner Bakterien
gemäß dem Identifizierungsschritt
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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7a)
SERS-Spektren von zerstörten
E. coli in ansteigender (b-e) Konzentration der Zellsuspensionen
im Silberkolloid;
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7b SERS-Spektren
von fünf
verschiedenen Spezies; und
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8 UV-Raman-Spektren
einer Auswahl an Mikroorganismen, die mit der erindungsgemäßen Vorrichtung
gemessen wurden.
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Wie
aus 1 ersichtlich ist, weist die Vorrichtung 100 in
einer Ausführungsform
einen Träger 1 mit
einem darauf aufgebrachten Substrat 2 auf. Das Substrat 2 ist
vorzugsweise als eine Filtermembran z.B. aus polymerem Material
oder aus Metall ausgebildet, auf die die zu untersuchenden Partikel
aufgebracht worden sind, z.B. durch Abscheidung aus der Luft. Die
Partikel umfassen in der Regel biotische und abiotische Partikel.
Ferner umfaßt
die Vorrichtung 100 eine Detektionseinheit 3 zum
Bestimmen der Position und der Formfaktoren von einzelnen Biopartikeln
auf dem Substrat 2 und zur Differenzierung zwischen biotischen
und abiotischen Partikeln. Es ist außerdem eine Identifizierungseinrichtung 4 vorgesehen
zum Identifizieren des Partikels, bei biotischen Partikeln der Spezies
bzw. des Stamms. Die Detektionseinheit 3 beinhaltet eine
optische Einheit 5 mit Vergrößerungsfunktion, eine Beleuchtungseinheit 6 und
eine Bildaufnahmeeinrichtung 7.
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Wie
aus 2 ersichtlich ist, ist die Beleuchtungseinheit 6,
bestehend aus einer Lichtquelle 6a, Linsen 6b, Anregungsfiltern 6c und
Lichtleitern 6d derart ausgebildet, daß die Lichtleiter 6d ringförmig oberhalb
des Substrats 2 angeordnet sind und ein streifender Lichteinfall
des Beleuchtungslichts 8 unter einem vorgegebenen Einstrahlwinkel α auf die Oberfläche erfolgt.
Der Einstrahlwinkel α ist
der Winkel zwischen der Haupteinstrahlrichtung und dem Träger 1.
Er liegt bevorzugt zwischen etwa 20° bis etwa 30°. Als Lichtquelle 6a wird
z.B. eine UV-Lichtquelle mit hoher Lichtausbeute im UVA- Bereich
eingesetzt.
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Zur
Erzeugung von wellenlängenspezifischem
UV-Licht sind vor die UV-Lichtquelle 6a wahlweise schaltbare
Anregungsfilter 6c vorgesehen.
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Das
von den Partikeln auf dem Substrat 2 gestreute oder durch
Fluoreszenzanregung über
das Beleuchtungslicht 8 emittierte Licht 9 wird über die optische
Einheit 5 der Bildaufnahmeeinrichtung 7 zugeleitet.
Die optische Einheit 5 beinhaltet eine Zwischenlinse 5a und
ein mehrfachvergrößerndes
Objektiv 5b. Zur Selektion von Fluoreszenzlicht, das von den
Partikeln ausgesandt wird, sind wahlweise in den Strahlengang schaltbare
Fluoreszenzfilter 5c vorgesehen.
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Die
Bildaufnahmeeinrichtung 7 ist vorzugsweise als hochauflösende CCD-Kamera,
mit einer Auflösung
von z.B. 2k × 2k
Pixeln, ausgebildet und erzeugt ein vergrößertes Bild des Substrats.
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Zur
Ausgabe und Weiterverarbeitung des Bildes ist eine Datenverarbeitungseinrichtung 10 mit Bildschirm
vorgesehen. Auf der Datenverarbeitungseinrichtung 10 ist
ein Auswerteprogramm zur Bestimmung der Koordinaten, sowie zur Bestimmung
der Abmessungen der detektierten Partikel auf dem Substrat 2 installiert.
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Die
optische Einheit 5 die Detektionseinheit 3 und
der Träger 1 sind
relativ zueinander über
eine Positioniereinheit 11 positionierbar, z.B. in x-,
y- und z-Richtung verfahrbar. Bevorzugt wird der Träger 1 in x-y-Richtung
verfahren und die optische Einheit 5 in z-Richtung bewegt.
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Die
Identifizierungseinrichtung 4 umfaßt einen Laser 12,
ein Spektrometer 13, einen Autofokusdetektor 14,
eine elektronische Steuer- und Versorgungseinheit 15 für den Laser
und den Autofokusdetektor, Spiegel 16, 17, 18 und
eine mit dem Spektrometer gekoppelte Notch-Filtereinheit 19 sowie
Faserkopplungen 20 zwischen der Notch-Filtereinheit 19 und
dem Spektrometer 13. Der Laser 12 ist bevorzugt
ein im UV-Bereich
emittierender Laser, aber auch frequenzverdoppelte NdYAG mit einer
Wellenlänge
von 532 nm sind verwendbar. Andere Lasertypen sind je nach Anwendung
ein setzbar. Der Laserstrahl wird über die Spiegel 16, 17, 18 in
die optische Einheit 5 eingekoppelt und über diese
auf das Substrat 2 fokussiert. Mithilfe der Positioniereinheit 11 ist die
optische Einheit 5 so relativ zu dem Substrat 2 positionierbar,
daß der
Laserstrahl auf jede vorgegebene Stelle auf dem Substrat 2 fokussierbar
ist.
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Der
mit der Steuereinheit 15 und der Positioniereinheit 11 verbundene
Autofokusdetektor 14 erhält über die dichroitischen Spiegel 17, 18 einen
Teil des vom Partikel auf dem Substrat reflektierten Laserlichts.
Die von dem Autofokusdetektor 14 gemessene Intensität hängt vom
Grad der Fokussierung des Lasers auf das Partikel ab. Durch systematische vertikale
Verschiebung der Detektionseinheit 3 und durch Messung
der jeweils erzielten Signalstärke
läßt sich
die optimale Fokusposition einstellen.
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Das
von den Partikeln auf dem Substrat 2 aufgrund der Einstrahlung
mit dem Laserstrahl erzeugte Raman-Streulicht wird über den
dichroitischen Spiegel 19 aus dem zur Bildaufnahmeeinrichtung 7 führenden
Strahlengang ausgekoppelt und über
die Notch-Filtereinheit 19 dem Spektrometer 13 zugeführt, mit
dem ein Raman-Spektrum gemessen und an die Datenverarbeitungseinrichtung 10 weitergegeben
wird.
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In
der Datenverarbeitungseinrichtung 10 ist ferner ein Programm
vorgesehen, das jedem detektierten Partikel ein gemessenes Raman-Spektrum zuordnet
und diese Information abspeichert und/oder weiterverarbeitet. Es
ist ferner in dieser Datenverarbeitungseinrichtung oder einer davon
getrennten Datenverarbeitungseinrichtung eine Datenbank abgelegt,
die bekannte Raman-Spektren für
eine Vielzahl von Partikeln und Substanzen enthält.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und der Betrieb der Vorrichtung ist wie folgt.
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Erster Schritt: Lokalisierung
der Partikel
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In
einem ersten Schritt werden die auf dem Substrat 2 befindlichen
Partikel über
die Detektion des elastisch gestreuten Lichts lokalisiert. 3c) zeigt
dabei ein von der Bildaufnahmeeinrichtung 7 in Form der
CCD-Kamera aufgenommenes Bild der Partikel auf dem Substrat, in
diesem Fall einer Edelstahloberfläche, das mit der erfindungsgemäßen Streiflichtbeleuchtung
erzeugt wurde. Im Vergleich dazu zeigen 3a) und 3b)
Bilder, die mit den herkömmlichen
Verfahren, wie Auflicht und Dunkelfeldbeleuchtung erzeugt wurden.
Mittels der Streiflichtbeleuchtung lassen sich die Partikel als
helle Punkte deutlich von der Oberfläche unterscheiden. Die Oberfläche reflektiert
aufgrund der flachen Beleuchtung kaum. So entsteht ein maximaler
Kontrast zwischen Oberfläche
und Partikel, was die Lokalisierung aller Partikel erlaubt.
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Über die
Datenverarbeitungseinrichtung 10 werden die Koordinaten
und falls erforderlich die Abmessungen der detektierten Partikel
bestimmt. Eine Bestimmung der Anzahl der Partikel ist ebenso möglich.
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Zweiter Schritt: Differenzierung
in biotische und abiotische Partikel
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In
einem zweiten Schritt wird eine Differenzierung der Partikel in
biotische und abiotische Partikel über Detektierung des Fluoreszenzlichts
vorgenommen. Für
die Erfassung der biotischen Partikel wird z.B. die Fluoreszenz
universeller Zellinhaltsstoffe verwendet. Dazu werden vor die UV-Lichtquelle geschaltete
Anregungsfilter 6c in Form von Bandpassfiltern verwendet,
mit denen die entsprechenden Anregungswellenlängen herausgefiltert werden.
Das Fluoreszenzlicht wird dann durch Vorschaltung eines geeigneten
Fluoreszenzfilters Sc in der optischen Einheit 5 herausgefiltert.
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Die
Differenzierung in abiotische und biotische Partikel wird in einem
Ausführungsbeispiel
anhand der Fluoreszenzmessung von in den Zellen biotischer Partikel
universell vorkommender Inhaltstoffe NAD(P)H und Riboflavin vorgenommen.
Das Coenzym NAD(P)H hat sein Absorptionsmaximum bei ca. 334 nm,
die Fluoreszenzwellenlänge
liegt bei ca. 470 nm, was im elektromagnetischen Spektrum im sichtbaren
blauen Bereich liegt. Riboflavin welches auch ein Coenzym der Zelle
ist, wird bei ihrem Absorptionsmaximum bei ca. 365 nm zu einer Fluoreszenz
bei ca. 515 nm angeregt. Die Detektionseinheit 3 ermöglicht somit
die Erfassung und Differenzierung beider spezifischen Fluoreszenzen
der Coenzyme und die anschließende
Differenzierung zwischen biotischen und abiotischen Partikeln.
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Dritter Schritt: Raman-Spektroskopie
einzelner ausgewählter
Partikel
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In
diesem Schritt wird der Laserstrahl auf ein einzelnes gewünschtes
Partikel fokussiert. Die Positionierung des Strahlfokus erfolgt
dabei über
die Positionierungseinrichtung 11 anhand der zuvor bestimmten
Koordinaten und gegebenenfalls den Abmessungen des Partikels. Über den
Autofokusdetektor 14 wird eine genaue Fokussierung vorgenommen.
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Dann wird das Partikel über eine
vorbestimmte Zeit mit dem Laserstrahl bestrahlt
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Das
Raman-Streulicht wird über
die optische Einheit 5 und die Spiegel 17, 18 und
das Filter 19 dem Spektrometer zugeführt und ein Raman-Spektrum
für das
einzelne Partikel aufgezeichnet, was dann in der Datenverarbeitungseinrichtung 10 abgelegt
und/oder weiterverarbeitet wird.
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Anschließend wird
für jedes
gewünschte Partikel
auf dem Substrat ein Raman-Spektrum wie zuvor beschrieben aufgenommen.
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In
einem konkreten Beispiel wurden einzelne Mikroorganismen mit einer
Anregungswellenlänge von
532 nm gemessen. Wenn ein Spektrum eines Markerpigments detektiert
wurde, z.B. Carotinoid, überdeckt
das entsprechende Resonanzspektrum das partikelspezifische Raman-Spektrum.
Das Pigment kann aber durch die eingestrahlte Energie bei dieser
Messung zerstört
werden. Durch erneutes Messen der Zelle mit zerstörtem Pigment
kann dann das partikelspezifische Spektrum aufgenommen werden. Bei
großen
Zellen wurden mehrere Messungen entlang der Hauptachse vorgenommen,
da es sich hierbei hauptsächlich
um eukaryotische Mikroorganismen (Hefen, Pilze) mit Kompartimentierungen
der Zelle handelt.
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4 zeigt
die gemessenen Raman-Spektren einzelner Bakterien verschiedener
Stämme.
Die Integrationszeit, d.h. die Belichtungszeit mit der Laser betrug
60s.
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Schritt 4: Identifizierung
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Das
erhaltene Spektrum wird mittels chemometrischer Verfahren mit bekannten
in einer Datenbank abgelegten Spektren verglichen und somit eine Identifizierung
des Partikels vorgenommen. Die Identifizierung von biotischen Partikeln
erfolgt dabei anhand charakteristischer Markermoleküle, wie
z.B. DNA bzw. Proteinen.
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5 zeigt
die durchschnittliche Erkennungsrate von Bulk-Spektren von Bakterien, die durch Messung
eines Bakterienausstrichs auf der Trägeroberfläche erzeugt sind.
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Abwandlungen
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Abwandlungen
der grundlegenden Schritte der Erfindung und der zugehörigen Vorrichtung
sind möglich.
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In
einer Abwandlung erfolgt die Lokalisierung der Partikel auf dem
Substrat unter Verwendung von sichtbarem Licht anstelle von UV-Licht.
In einer weiteren Abwandlung wird die zur Lokalisierung und Differenzierung
eingestrahlte Lichtleistung, insbesondere bei der Verwendung von
UV-Licht, so gewählt,
daß die
Vitalität
der biotischen Partikel erhalten bleibt.
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In
einer weiteren Anwandlung ist der Träger 1 gekühlt, um
eine Zerstörung
der Partikel aufgrund von Erwärmung
durch die eingestrahlte Leistung zu verhindern.
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Bei
großen
Substraten erfolgt die Lokalisierung bereichsweise. Anschließend werden
die Bilder der Bereiche zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Somit
lassen sich große
Flächen
untersuchen.
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In
einer weiteren Abwandlung wird der Differenzierungsschritt weggelassen.
Der Aufwand bei der Auswertung ist dann größer, weil Raman-Spektren von
abiotischen Partikeln mitaufgenommen werden und die Differenzierung
zu biotischen Partikeln über
die Differenzierung der Raman-Spektren erfolgen muß.
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In
einer weiteren Abwandlung wird eine oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (Surface Enhanced
Raman Spectroscopy SERS) oder eine oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Spektroskopie (Surface
Enhanced Resonance Raman Spectroscopy.SERRS durchgeführt. Dabei
wird ein einzelner Mikroorganismus vom Substrat entfernt, z.B. mithilfe
eines Mikromanipulators und einer Mikropumpe, und dieser anschließend zerstört, z.B.
durch Schockgefrieren oder Ultraschall. Anschließend wird ein Edelmetallkolloid,
vorzugsweise Gold oder Silber, zugegeben und der zerstörte Mikroorganismus
im Kolloid mit einer geeigneten Anregungswellenlänge, z.B. 532, 633, 785 oder
830 nm bestrahlt und das Raman-Spektrum aufgenommen.
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7a)
zeigt SERS-Spektren von zerstörten E.
coli in ansteigender (b-e) Konzentration der Zellsuspensionen im
Silberkolloid bei einer Integrationszeit von 120 s. a zeigt das
reine Kolloid. 7b) zeigt SERS-Spektren von
fünf verschiedenen
Spezies.
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Die
Aufnahme eines SERS-Spektrums bzw. eines SERRS-Spektrums erfolgt
zusätzlich
insbesondere dann, wenn die Aufnahme eines Raman-Spektrums auf dem
Substrat in der Vorrichtung kein eindeutiges Spektrum liefert und
eine weitere Identifizierung erforderlich ist.
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Es
ist auch möglich
einzelne Partikel nach der Lokalisierung und Identifizierung in
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zu entnehmen und für eine
weiteregehende Untersuchung anzuzüchten.
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In
einer weiteren Abwandlung wird eine UV-Raman-Spektroskopie durchgeführt. Die
Anregungswellenlängen
sind in diesem Fall 264, 257, 244, 238 und 229 nm. Der Träger 1 ist
bevorzugt tiefgekühlt
auf eine Temperatur kleiner als -100°C. Der Abstand des Mikroskopobjektivs
der optischen Einheit 5 vom Substrat 2 ist größer als
bei der normalen Raman-Spektroskopie.
Das Abkühlen
bei der UV-Raman-Spektroskopie hat den Vorteil, daß thermische Schäden am biotischen
Partikel verhindert oder reduziert werden. Das Partikel kann nach
der Messung für eine
Züchtung
verwendet werden.
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8 zeigt
die UV-Raman-Spektren einer Auswahl an gemessenen Mikroorganismen.
Die Anregungswellenlänge
beträgt
beispielhaft, 244 nm, die Laserleistung auf dem Substrat ca. 5-8
mW.
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In
einer weiteren Abwandlung wird ein Bruchteil des Raman-Signals auf eine
hochsensitive Photodiode ausgekoppelt und das entsprechende Meßsignal
als Referenz für
die Einstellung der optimalen Meßzeit verwendet.