DE69417900T2

DE69417900T2 - Vorrichtung und Verfahren zum schnellen und hochempfindlichen Erkennen und Zählen von Mikroorganismen mittels Fluoreszenz

Info

Publication number: DE69417900T2
Application number: DE69417900T
Authority: DE
Inventors: Patrick Desfetes; Jean-Louis Drocourt; Jaspal Sanghera
Original assignee: CHEMUNEX MAISONS ALFORT
Current assignee: CHEMUNEX MAISONS ALFORT
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2014-11-18
Also published as: DE69417900D1; JP3035698B2; EP0713087A1; US5891394A; US5663057A; EP0713087B1; JPH08292145A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Einrichtung für das schnelle, ultraempfindliche und automatische Zählen von fluoreszenten biologischen Zellen, wie Mikroorganismen, die von einem festen Träger, wie einem Filter, getragen sind, und ein Verfahren für die genannte schnelle Zählung der genannten Mikroorganismen durch die genannte Einrichtung.

Hintergrund der Erfindung

Die Analyse von biologischen Proben, Nahrungsmittelproben, Trinkwasserproben und pharmazeutischen Produkten hinsichtlich des Vorhandenseins von Mikroorganismen ist wichtig und hat wesentliche indirekte Folgen für die Sicherheit, die Qualitätsverordnungen bzw. -durchführungsbestimmungen und die öffentliche Gesundheit. Zum Beispiel unterstreichen kürzliche Ausbrüche von aus Nahrungsmitteln hervorgegangener Krankheit, welche implizieren, daß Käse und andere Molkereiprodukte mit pathogenen Bakterien kontaminiert sind, das Bedürfnis nach schnellen Verfahren für die mikrobiologische Analyse.
In der traditionellen Plattentechnik wird eine zu analysierende Probe kultiviert, und die resultierenden Kolonien werden gezählt. Die Ergebnisse des Tests werden nach einer Wachstumsperiode erhalten, die in dem Bereich von einem Minimum von 1 Tag bis zu so viel wie 7 bis 8 Tagen liegt. In dieser Technik liefert die Wachstumsperiode auf einmal die Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nichtlebensfähigen Organismen, wie auch die Vergrößerung der Signale von den lebensfähigen Organismen, um ihre Detektion bei niedriger Konzentration zu erleichtern.
Es gibt einen entscheidenden Bedarf für schnellere, empfindlichere und automatisiertere Verfahren für industrielle wie auch medizinische Anwendungen.
Es sind schnelle Verfahren entwickelt worden, die auf dem Messen der Auswirkung der metabolischen Aktivität der Mikroorganismen auf eine Masseneigenschaft der Probe, wie Impedanz, basieren. Alle diese Verfahren, die als indirekte Verfahren bezeichnet werden, leiden an verminderter Empfindlichkeit und erfordern noch ein Kultivieren, wenn die Detektion von niedrigen Kontaminationsniveaus erforderlich ist.
Es sind andere Verfahren, die auf der direkten Zählung von Mikroorganismen basieren, kürzlich entwickelt worden. Unter diesen kann die Direkt-Epifluoreszenz-Filtertechnik (DEFT) zitiert werden. Mit dieser Technik wird bewirkt, daß die zu analysierende Probe durch ein Filter hindurchgeht, welches die Mikroorganismen zurückhält. Die Mikroorganismen werden dann fluoreszent gemacht und durch visuelles Analysieren der Filteroberfläche mit einem Epifluoreszenzmikroskop gezählt. In diesem Verfahren werden interessierende Teilchen generell mit einem fluoreszenten Farbstoff, wie Acridinorange oder anderen spezifischeren Farbstoffen, markiert.
Die visuelle Analyse ist langwierige und kompliziert: erstens, weil in der Abwesenheit einer Wachstumsphase die Organismen ziemlich klein sind (was eine Vergrößerung hoher Stärke für ihre Detektion erfordert), und zweitens, weil die Gesamtfläche des Filters so groß ist, daß eine unpraktische Anzahl von Feldern hoher Vergrößerungsstärke erforderlich sind, um das gesamte Filter abzudecken. Demgemäß wird typischerweise nur ein kleiner Teil des Filters visuell untersucht (weniger als 10%). Das macht die Technik unangemessen für Sterilitätstesten, wo ein einziger Mikroorganismus auf dem gesamten Filter detektiert werden muß.
Ein zusätzliches Problem bei der DEFT-Technik ist die Unterscheidung zwischen den gesuchten Mikroorganismen und anderen Teilchen, welche natürlicherweise fluoreszent sind, die auch auf dem Filter konzentriert worden sein können.
Als Ergebnis dieser Probleme sind die Wiederholbarkeit und Genauigkeit des DEFT-Verfahrens generell niedriger als jene der Plattenzählverfahren. Andere Beschränkungen der DEFT umfassen niedrige Empfindlichkeit, Schwinden der Intensität und Ermüdung der Bedienungsperson von dem langzeitigen Gebrauch des Mikroskops.
Die Verwendung des Epifluoreszenzmikroskops, das mit einer Bildanalysiereinrichtung versehen ist, im Hinblick darauf, die DEFT-Technik zu verbessern, ist auch berichtet worden. Jedoch ist sie, obwohl dieses effektiv im Eliminieren von Subjektivität und Bedienungspersonermüdung ist, noch durch das fundamentale Problem beschränkt, daß die Organismen klein sind und der abzudeckende Bereich groß ist.
Um dieses Problem besser zu verstehen, ist es nützlich zu bemerken, daß in elektronischen Abbildungssystemen das resultierende Bild aus individuellen Bildelementen (Pixeln) aufgebaut ist. Beim gegenwärtigen Stand der Technik der elektronischen Abbildung können selbst die besten Videokameras nur Bilder von so viel wie 100.000 oder 1 Million Pixel bilden. Jedoch ist der Durchmesser eines einzelnen Mikroorganismus typischerweise etwa 1 um, während der Durchmesser des Filters 25.000 um ist. Demgemäß würde es, wenn man 1 Pixel als die Größe eines Mikroorganismus betrachten würde, 625 Millionen Pixel erfordern, um das gesamte Filter abzudecken.
Infolgedessen muß entweder ein einzelnes Bildelement (Pixel) viel größer als die Dimensionen eines einzelnen Mikroorganismus gemacht werden oder die Analyse muß viele aufeinanderfolgende Bilder umfassen. Jedoch ist keines dieser Verfahren zufriedenstellend. In dem ersten Falle ist die Empfindlichkeit der Detektion herabgesetzt, während in dem zweiten Falle die Zeit und Kompliziertheit der Analyse beschränkende Faktoren sind.
Ein anderes bekanntes Mittel zum Verbessern der DEFT-Technik, das in Betracht gezogen werden mag, ist die Verwendung eines abtastenden konfokalen Epifluoreszenz-Mikroskops. In dieser Einrichtung wird ein kleiner Laserfleck dazu benutzt, aufeinanderfolgend jedes Element des Bildfelds zu beleuchten, während ein Detektor, der hinter einem sehr kleinen Loch positioniert ist, auch auf das gleiche Element fokussiert ist. Das Bild wird dann von den Detektorsignalen in einer Art und Weise gebildet, die gleichartig bzw. ähnlich jener ist, welche oben für ein elektronisches Abbildungssystem beschrieben ist. In der optimalen Ausbildung einer solchen Einrichtung sind die Dimensionen des Beleuchtungsflecks geringer als die oder gleich den Dimensionen des kleinsten zu detektierenden Teilchens, und die Dimensionen des sehr feinen Lochs sind gleich den Dimensionen des Beleuchtungsflecks oder kleiner als die Dimensionen des Beleuchtungsflecks.
Die Benutzung dieser bekannten Technologie der abtastenden konfokalen Mikroskopie ist aus wenigstens den folgenden Gründen für diese Anwendung auch nicht angemessen:
1) Wie oben angegeben, ist das Verhältnis der Größe des Filters zu der Fläche der Mikroorganismen größer als 100 Millionen. Demgemäß muß entweder ein Fleck verwendet werden, der viel größer als der Organismus ist (mit begleitendem Verlust an Empfindlichkeit), oder die Abtastzeit muß unpraktisch lang sein.
2) In praktischen industriellen Proben sind die Membranen sowohl dick als auch nicht flach. Demgemäß können die Mikroorganismen in unterschiedlichen Niveaus in den Poren der Filtermembranen eingefangen sein. Infolgedessen ist der Bereich des Filters, in dem die interessierenden Mikroorganismen eingefangen sind, nicht genügend gut längs der optischen Achse definiert, um es der Fokussierungsoptik zu gestatten, die Tiefe des Felds zu begrenzen, was ein Ergebnis der Einführung eines feinen Lochs vor dem Detektor ist.
3) Eine Einrichtung, die auf der obigen Technologie basiert, welche eine Abtastung des gesamten Filters mit hoher Auflösung ausführt, würde sehr kompliziert und teuer und demgemäß für die Routineverwendung nicht praktisch sein.
Demgemäß ist es zusammenfassend so, daß die bekannten Mittel der elektronischen Abbildungsanalyse entweder durch die Verwendung einer Videokamera, einer Abtasteinrichtung oder Kombinationen von diesen Techniken für die Automation der DEFT- Technik nicht geeignet sind, und zwar prinzipiell wegen des großen Verhältnisses zwischen der Größe des Filters und der Größe eines einzelnen Mikroorganismus.

Abriß der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Einrichtung und ein Verfahren, welche zu schnellen und vollständigen Zählungen von fluoreszenten Organismen fähig sind, wie jene, die auf dem Filter in der DEFT-Technik eingefangen sein mögen. Die gesamte Oberfläche des festen Trägers, wie einer Filtermembrane, wird mit einem Laserbündel abgetastet, und die emittierte Fluoreszenz wird bei einer oder mehreren Wellenlängen gemessen. In der Erfindung werden die oben beschriebenen Nachteile durch die Verwendung eines unterschiedlichen bzw. anderen und einzigartigen Abtastmusters in Kombination mit einem einzigartigen Mittel des Verarbeitens der umfangreichen Detektorsignaldaten, die beim Abtasten des gesamten Filters erhalten worden sind, überwunden. In der Erfindung wird ein größerer Abtastfleck zusammen mit einem überlappenden Abtastmuster verwendet, welche dahingehend zusammen wir ken, daß sie die Empfindlichkeit, die typischerweise mit einem kleineren Fleck verbunden ist, aufrechterhalten, während sie eine schnelle Abtastung gestatten.
Weiterhin vermeidet die vorliegende Erfindung sowohl falsche negative als auch falsche positive Ergebnisse. Sie stellt ein Verfahren zum vollständigen Unterscheiden gewünschter von ungewünschten Signalen zur Verfügung, das zu einer genauen und schnellen Zählung von Mikroorganismen führt, die auf einem festen Träger von großer Dimension (typischerweise 25 mm Durchmesser) vorhanden sind, und zwar selbst bei sehr niedrigen Anzahlen. Die Erfindung hat das Potential, unzweideutig herab bis zu einem einzigen Mikroorganismus auf dem Filter zu detektieren.
Um die Erfindung zu verstehen, ist es instruktiv, zu bemerken, daß die Wahrscheinlichkeit der Detektion für N unabhängige Abtastdurchgänge über ein Target proportional der Quadratwurzel von N mal der Wahrscheinlichkeit der Detektion für einen einzigen Durchgang ist. Die Wahrscheinlichkeit der Detektion für einen einzelnen bzw. einzigen Durchgang ist ihrerseits umgekehrt proportional der Geschwindigkeit, mit welcher der Durchgang ausgeführt wird. Demgemäß ist im allgemeinen das zweifache Abtasten des Felds mit der zweifachen Geschwindigkeit in der Detektionswahrscheinlichkeit äquivalent dem einmaligen Abtasten, und kein Nettogewinn in der Abtastzeit wird realisiert. Wenn jedoch die beiden Durchgänge in Zeitsynchronizität addiert werden, sind sie nicht länger unabhängige Versuche, und ein Signalereignis (welches zwischen den beiden Durchgängen korreliert wird) wird über ein Rauschereignis (welches unkorreliert ist) bevorzugt. Demgemäß hat man eine Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Detektion und es wird eine Verminderung in der Abtastzeit ermöglicht.
In der Erfindung wird eine erhöhte Abtastrate z. B. dadurch bewerkstelligt, daß man mit einem großen Laserfleck (siehe Fig. 1) abtastet und die Abtastung überlappt, derart, daß jedes Element in dem Feld wenigstens zweimal abgetastet wird. Die Ergebnisse von jedem benachbarten Paar von Abtastungen in der X-Richtung werden dann in Zeitsynchronizität zum Zwecke des Aufrechterhaltens der Detektionswahrscheinlichkeit durch Eliminieren von unkorrelierten Signalen verglichen. Demgemäß wird jedes positive Ereignis zwischen zwei oder mehr Abtastlinien korreliert (was von der Größe des fluoreszenten Objekts abhängt).

Definitionen:

Wenn sich der Laserfleck längs Abtastlinien auf dem festen Träger (wie einer Filtermembrane) bewegt, wird das emittierte Fluoreszenzlicht (wenn welches vorhanden ist) kontinuierlich durch einen oder mehrere Detektoren (bei verschiedenen Wellenlängen) gemessen. Das aus den Detektoren kommende Analogsignal wird digitalisiert, indem sein Wert in konstanten Frequenzintervallen genommen wird.
Ablesung: Eine Ablesung ist der Wert des Signals zu der Zeit der Messung.
Probe: Eine Probe ist definiert als eine Ablesung des Signals von dem Detektor, welches einen gegebenen dynamischen Schwellwert übersteigt.
Merkmal: Ein Satz von benachbarten Proben auf einer Abtastlinie wird als ein Merkmal bezeichnet.
Linie-zu-Linie-Korrelation: Von zwei Proben wird gesagt, daß sie korreliert sind, wenn sie in Zeitsynchronizität auf zwei benachbarten Abtastlinien erscheinen.
Einzelnes Merkmal: Ein Merkmal, das auf nur einer Abtastlinie erscheint, d. h. welches nicht korreliert ist, wird als ein einzelnes Merkmal bezeichnet.
Fluoreszenter Fleck: Fluoreszenz, die durch irgendein fluoreszentes Teilchen emittiert wird, wenn es durch einen Laserstrahl erregt wird. Diese Teilchen können Mikroorganismen oder andere Elemente, wie Staub, sein.
Die Teilchen können autofluoreszent sein oder für die Detektion fluoreszent gemacht worden sein (z. B. Mikroorganismen).
Ereignis: Ein Ereignis ist ein Satz von wenigstens zwei Merkmalen, die in Zeitsynchronizität auf benachbarten Abtastlinien korreliert sind. Ein Ereignis ist die Übersetzung eines fluoreszenten Flecks in dem Meßvorgang.
Ein Ereignis kann nachfolgend durch den Diskriminator als entweder ein positives Ereignis (d. h. ein Ereignis, das gesucht wird, wie ein Mikroorganismus) oder als ein Rauschereignis (d. h. ein Ereignis, das als aufgrund von Fluoreszenz zurückgewiesen werden soll, die z. B. durch autofluoreszente Teilchen erzeugt worden ist) klassifiziert werden. Ein Rauschereignis würde, wenn es in der endgültigen Zählung enthalten wäre, falsche positive Ereignisse ergeben.
Laserfleck: Lichtfleck, der durch einen Laserstrahl auf einem festen Träger gebildet wird.
Zwischenlinien- oder Linienabstand Y: Abstand zwischen zwei Abtastlinien.
Einige der genannten Definitionen sind in Fig. 2 veranschaulicht, in welcher Proben durch O repräsentiert sind und in welcher die Länge eines Ereignisses (Satz von korrelierten Merkmalen) der Anzahl der angesammelten Zählung von Proben von dem Beginn des Merkmals aus, das zum frühesten in einer Abtastlinie in der Abtastrichtung auftritt, und dem Ende des Merkmals, welches am spätesten in einer Abtastlinie endet, entspricht, wobei die genannte Zählung als eine einzige Probe alle die korrelierten Proben auf unterschiedlichen Abtastli nien nimmt, und die Breite eines Ereignisses durch die Anzahl von benachbarten Linien definiert ist, auf denen das gleiche Ereignis erscheint.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Zählen von fluoreszenten Mikroorganismen auf einem festen Träger (oder Probenhalter bzw. -träger), wie einer Filtermembrane, zur Verfügung. Das genannte Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes umfaßt:
- Abtasten eines festen Trägers, auf dem eine potentiell Mikroorganismen enthaltende Probe abgelagert worden ist, wobei die Probe einer fluoreszenten Anfärbung unterworfen worden ist, mit einem von einem Laser einfallenden Strahl, Bilden eines Laserflecks auf dem festen Träger, wobei der Laserfleck wesentlich größer als die zu detektierenden Mikroorganismen ist, wobei die Laserfleckgröße zwischen 4 und 14 um ist, wobei der Abstand zwischen zwei benachbarten Abtastlinien derart ist, daß jedes Element des Trägers wenigstens zweimal durch partielles Überlappen von benachbarten Abtastwegen abgetastet wird, und vorzugsweise geringer als die Hälfte der Dimension der Laserfleckgröße ist; und gleichzeitig:
- Detektieren des resultierenden Fluoreszenzlichts wenigstens bei einer einzigen Wellenlänge, indem nur detektierte Signale, die einen gegebenen Schwellwert übersteigen, z. B. einen dynamischen Schwellwert, ausgewählt werden, wobei ein Satz von benachbarten Proben auf einer Abtastlinie ein Merkmal repräsentiert;
- Aufstellen eines Satzes von korrelierten Merkmalen durch eine Linie-zu-Linie-Korrelation von individuellen Merkmalen mittels Vergleichen von Merkmalen auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität, Zählen der Anzahl von Linien, über welche der Satz von korrelierten Merkmalen auftritt, wobei jeder Satz von korre lierten Merkmalen ein Ereignis bildet, und Eliminieren aller einzelnen unkorrelierten Merkmale;
wobei die Korrelation als vorhanden betrachtet wird, wenn eine oder mehrere Proben innerhalb der beiden unter Vergleich befindlichen Merkmale in der gleichen Position auf dem genannten Linienpaar detektiert werden. Die Anzahl von Linien, über welche der Satz von korrelierten Merkmalen erscheint, wird gezählt und danach in der Größendiskriminierung benutzt;
- Vergleichen der korrelierten Merkmale auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität wenigstens bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ1 und λ2 zum Auswählen der korrelierten Merkmale, die ein Emissionsintensitätsverhältnis bei den beiden Wellenlängen haben, welches niedriger als eine vorbestimmte Zahl ist, und zwar derart spezifiziert, daß, wenn das Emissionsverhältnis bei den genannten Wellenlängen, das durch irgendwelche korrelierten Proben erzeugt wird, größer als ein vordefinierter Wert ist, das vollständige Ereignis eliminiert wird;
- Herstellen einer Größendiskriminierung von zurückgehaltenen Ereignissen und Auswählen von jenen, die eine Größe haben, welche einem Mikroorganismus entspricht;
- Bestimmen, ob für zurückgehaltene Ereignisse nach der Größendiskriminierung das Energieprofil der Ereignisse in drei Dimensionen innerhalb vorbestimmter Gaußformkriterien ist, und Zurückweisen von Ereignissen, die nicht innerhalb der vorbestimmten Gaußformkriterien sind.
Wobei eine solche Analyse z. B. durch einen Software-Kurvenanpassungs-Algorithmus ausgeführt wird. Alle Ereignisse innerhalb der Kriterien werden als Mikroorganismen für den endgültigen Zählwert akzeptiert; jene außerhalb der Kriterien werden als Rauschen klassifiziert (Staub oder andere Verunreinigungen auf dem genannten festen Träger);
- Zählen der übrigbleibenden Ereignisse, um ausschließlich die auf dem festen Träger vorhandenen Mikroorganismen zu bestimmen und zu zählen.
Der Ausdruck "Größendiskriminierung" bedeutet, daß nur Ereignisse, die eine gegebene Anzahl von korrelierten Merkmalen und eine gegebene Anzahl von Proben haben, nach den endgültigen Zählwerten zu zurückgehalten werden. In einem solchen Falle umfaßt das gegenwärtige Verfahren die Bestimmung der Anzahl von Abtastlinien, welche durch ein Ereignis (Breite) abgedeckt werden, und der Anzahl von Proben, welche die Länge des Ereignisses bilden; diese letztere Anzahl leitet sich ab von dem angesammelten Zählwert von Proben von dem Beginn des Merkmals, das am frühesten in einer Abtastlinie in der Abtastrichtung auftritt, und dem Ende des Merkmals, welches am spätesten in einer Abtastlinie endet, was als eine einzige irgendeine Probe gezählt wird, die an dem gleichen Ort auf zwei oder mehr benachbarten Linien erscheint. Es werden Ereignisse eliminiert, wenn sie solche Gesamtprobenzählwertlängen umfassen, die größer als eine vorbestimmte Anzahl A sind, und eine Anzahl von Abtastlinien, die größer als eine vorbestimmte Anzahl B ist (siehe Fig. 2).
Genauer wird die genannte Größendiskriminierung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ausgeführt durch:
- Bestimmen der Länge von jedem Ereignis mittels Zählens der Anzahl von Proben durch Beginnen mit der Probe, die zuerst in der Abtastrichtung, bei welchem Merkmal des Ereignisses auch immer, das am frühesten auftritt, erscheint, Fortsetzen, um die Probe einzuschließen, die, bei welchem Merkmal auch immer, das zuletzt endet, zuletzt in der Abtastrichtung erscheint, wobei das genann te Zählen als eine einzige Probe alle die korrelierten Proben auf unterschiedlichen Abtastlinien nimmt,
- Bestimmen der Breite des genannten Ereignisses durch Zählen der Anzahl von benachbarten Linien, welche durch das gleiche Ereignis bedeckt sind, und
- Eliminieren von Ereignissen, für welche die Anzahl der gezählten Proben größer als eine vorbestimmte Zahl A ist und/oder die Anzahl der genannten benachbarten Abtastlinien größer als eine vorbestimmte Zahl B ist.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das gegenwärtige Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es vor dem Abtasten des festen Trägers folgendes umfaßt:
- Sammeln von Mikroorganismen von einer Probe auf dem genannten festen Träger, wie einer Filtermembrane; und
- Markieren der genannten Mikroorganismen mit einem Farbstoff, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die gebildet ist von Vitalfarbstoffen, Lebensfähigkeitsmarkierern, Fluoreszenzsubstanzen, welche durch Antikörper oder Nucleinsonden getragen sind, oder durch ein enzymvernetztes Sondensystem erzeugt sind, das, wenn es erregt ist, fähig ist, eine Emission zu erzeugen, die bei einer Wellenlänge λ1 fluoreszent ist.
Wie oben angegeben, ist der Abstand zwischen zwei Abtastlinien (Zwischenlinie oder Linienbeabstandung y) geringer als die Hälfte der Dimension der Laserfleckgröße, was zu einem Überlappen der abgetasteten Oberfläche führt.
Vorzugsweise wird der Schritt des Detektierens des resultierenden Fluoreszenzlichts durch Messen von Signalen ausge führt, die einen dynamischen Schwellwert überschreiten, und zwar mittels eines Digitalsignalprozessors (DSP).
Der genannte DSP ermöglicht es, zwischen gewünschten Signalen (die Mikroorganismen entsprechen) und gewissen ungewünschten Signalen (z. B. elektronischem Rauschen) zu differenzieren.
Ein solches Verfahren vermeidet unerwarteterweise sowohl falsche negative als auch falsche positive Ergebnisse.
Die nachstehende Tabelle I faßt die potentiellen Gründe für falsche negative oder falsche positive Ergebnisse und die relevanten Schritte des gegenwärtigen Verfahrens, um Fehler zu eliminieren, zusammen. TABELLE I
Es muß hervorgehoben werden, daß das vorliegende Verfahren nur mit fluoreszenten Flecken umgeht und fluoreszent markierte Bakterien durch die Analyse des Fluoreszenzansprechens der Markierung auf einen abtastenden Laser identifiziert. Die Analysetechnik macht Gebrauch von der Fluoreszenzdiskriminierung, umfassend:
- Bewertung bzw. Bestimmung der Anzahl von benachbarten Proben auf einer Abtastlinie (= Merkmal),
- Linie-zu-Linie-Korrelation und
- Anzahl von korrelierten Merkmalen im Hinblick darauf, eine "Größendiskriminierung" auszuführen, wie hier oben definiert, und eine genaue Detektion von Mikroorganismen vorzusehen.
Daher macht die gegenwärtige Analysetechnik Gebrauch von der Größe des zu detektierenden Objekts nur in den folgenden beiden Arten und Weisen:
- das fluoreszente Ansprechen auf irgendeiner einzelnen Abtastlinie muß groß genug sein, um einen vorbestimmten Rauschschwellwert zu überschreiten;
- ein Merkmal muß mit einem vorbestimmten Grad an Überlappung auf bzw. in wenigstens zwei aufeinanderfolgenden Linienabtastungen detektiert werden.
Diese Erfordernisse bedeuten, daß sich das gegenwärtige Verfahren bemerkenswert von Abbildungssystemen unterscheidet, die signifikant mehr Informationen über die Form und Größe eines Merkmals erfordern.
Diese Erfordernisse treiben die Ausbildung eines Abbildungssystems nach einer kleinen Laserfleckgröße zu, damit der Fleck kleiner als das Objekt, welches detektiert wird, ist. Die gegenwärtige Fleckgröße kann groß relativ zu dem Merkmal sein und ist gegenwärtig in der Größenordnung des 10fachen der Merkmalsgröße. Dieses ergibt wichtige Vorteile in der Abtastgeschwindigkeit, den Erfordernissen der optischen Genauigkeit und der Verarbeitungsleistung (Datenhandhabungsrate und Speichererfordernisse).
Unerwarteterweise liefert das gegenwärtige Verfahren folgendes:
- dynamische Schwellwertbildung des Signalniveaus: das Datenverarbeitungssystem überwacht kontinuierlich das Hintergrundrauschniveau und stellt das Schwellwertniveau ein, welches Merkmale überschreiten müssen, um als signifikant betrachtet zu werden. Dieses ermöglicht es dem System, eine Änderung in dem Verhalten der Membrane (fester Träger) zu tolerieren, und zwar sowohl von Membrane zu Membrane als auch über den Bereich einer einzelnen Membrane;
- Linie-zu-Linie-Korrelation der Signale: um als Mikroorganismen zugewiesen zu werden, müssen die Merkmale auf wenigstens zwei Abtastlinien vorhanden sein;
- die Verwendung einer grünen Fluoreszenzspektrumform für die Merkmalsdiskrimination (Rot/Grün-Signalniveau). Ein Merkmal, das in dem grünen Kanal detektiert worden ist, muß ein entsprechendes Rotkanalsignal, das klein oder Null ist, haben, wie aus der Form des grünen Fluoreszenzmarkiereremissionsspektrums vorhergesagt. Ein höheres Niveau an Rotkanalansprechen bewirkt, daß das Merkmal zurückgewiesen wird;
- Signaldiskriminierung: Signale müssen für eine vorbestimmte Anzahl von Abtastpunkten vorhanden sein, um ak zeptabel zu sein. Kurze Signale werden als Rauschen zurückgewiesen;
- korrelierte Merkmale, welche mehr als eine vorbestimmte Anzahl von Proben oder mehr als eine vorbestimmte Anzahl von Linien umfassen (d. h. entweder längs einer gegebenen Abtastlinie oder quer über mehrere Linienabtastungen) werden zurückgewiesen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Einrichtung zur Detektion und Zählung von Mikroorganismen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zur Verfügung.
Die genannte Einrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes umfaßt:
- eine Laserlichtquelle zum Emittieren eines einfallenden Lichtstrahls, die mit Mitteln zum Fokussieren des Laserstrahls zu einem Laserfleck zusammenwirkt, dessen Dimension auf einem festen Träger wesentlich größer ist als die zu detektierenden und zu zählenden Mikroorganismen, wobei die Laserfleckgröße zwischen 4 und 14 um liegt;
- Abtastmittel zum Richten des Lichts von der genannten Lichtquelle auf den festen Träger, um die Mikroorganismen fleckweise zu bestrahlen, so daß Fluoreszenzflecken erzeugt werden, worin der Abstand zwischen zwei Abtastlinien derart ist, daß jedes Element des Trägers wenigstens zweimal durch teilweises Überlappen von benachbarten Abtastwegen abgetastet wird und vorzugsweise geringer als die Dimension der genannten Laserfleckgröße ist;
- Mittel zum Detektieren und photoelektrischen Umwandeln der emittierten Fluoreszenz bei wenigstens zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ1 und λ2;
- Mittel zum Diskriminieren und Eliminieren von Nichtbakterienfluoreszenz, umfassend einen Digitalsignalverarbeiter bzw. -prozessor und eine Mehrzahl von optischen Wegen zum Auswählen von wenigstens zwei Emissionsfluoreszenzwellenlängen;
- Signalverarbeitungsmittel zum Aufstellen von Sätzen von korrelierten Merkmalen mittels einer Linie-zu-Linie-Korrelation von individuellen Merkmalen durch Vergleichen von Merkmalen auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität, Zählen der Anzahl von Linien, über welche der genannte Satz von korrelierten Merkmalen auftritt, wobei jeder Satz von korrelierten Merkmalen ein Ereignis bildet, und Eliminieren von allen einzelnen unkorrelierten Merkmalen, die nur auf einer einzigen Linie auftreten; Vergleichen der genannten korrelierten Merkmale auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität, wenigstens bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ1 und λ2, zum Auswählen der korrelierten Merkmale, die ein Emissionsintensitätsverhältnis bei den genannten beiden Wellenlängen haben, das niedriger als eine vorbestimmte Zahl ist, und zwar dahingehend spezifiziert, daß, wenn das Emissionsverhältnis bei den genannten Wellenlängen, erzeugt durch irgendwelche korrelierten Merkmale, größer als ein vordefinierter Wert ist, das vollständige Ereignis eliminiert wird; Herstellen einer Größendiskriminierung von zurückgehaltenen Ereignissen und Auswählen der Ereignisse, die eine Größe haben, welche einem Mikroorganismus entspricht; Bestimmen, ob für zurückgehaltene Ereignisse nach der Größendiskriminierung das Energieprofil der Ereignisse in drei Dimensionen innerhalb vorbestimmter Gaußformkriterien ist, und Zurückweisen von Ereignissen, die nicht innerhalb der genannten vorbestimmten Gaußformkriterien sind, und Zählen der genannten übrigen Ereignisse, um die auf dem festen Träger vorhandenen Mikroorganismen ausschließlich zu bestimmen und zu zählen.
Die genannte Einrichtung ermöglicht es, daß die gesamte Oberfläche des festen Trägers abgetastet wird.
Gemäß einem Aspekt der Einrichtung umfaßt das Abtastmittel einen ersten schwingenden Spiegel, wobei die Achse der Schwingung desselben senkrecht zu der Achse des Lichtstrahls für das Abtasten einer Linie durch den Strahl ist; und einen zweiten Spiegel, dessen Achse senkrecht zu der Achse der Schwingung des ersten Spiegels ist, wobei der zweite Spiegel eine Abtastbewegung ausführt, die mit der Abtastbewegung des ersten Spiegels synchronisiert ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der Einrichtung weist das Detektionsmittel wenigstens zwei Photomultiplier als ein Mittel für die photoelektrische Umwandlung auf.
Gemäß einem anderen Aspekt der Einrichtung hat der Laserfleck eine langgestreckte Form.
Gemäß einem anderen Aspekt der Einrichtung ist der feste Träger eine Filtermembrane.
Gemäß einem anderen Aspekt der Einrichtung arbeitet der Probenhalter mit Kühlmitteln zusammen, wie solchen, die zum Peltiereffekt führen.
Außerdem kann eine dünne Schicht aus einem Material, wie Silicium, zwischen den Probenhalter und die Filtermembrane sandwichartig eingefügt sein.
Die genannte dünne Schicht hat z. B. die folgenden Vorteile: keine Autofluoreszenz, niedrige Lichtreflexion bei der Erregungswellenlänge und leicht zu reinigen.
Die folgende Figuren können dazu benutzt werden, die Mittel zu beschreiben, durch welche die Erfindung in die Praxis gebracht worden ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

- Fig. 1: Zeichnung des überlappenden Abtastmusters, welche die Strahl- bzw. Bündelform, das Abtastmuster, die Richtung und die relativen Dimensionen zeigt.
- Fig. 2: Definition und Dimension eines Ereignisses.
- Fig. 3: Skizze der Einrichtung, die den Laser, die Optik, die Abtastspiegel, den Probenhalter, den Probenhalter-Halter, die Detektoren und eine Blackbox für die Nachdetektionselektronik zeigt.
- Fig. 4: Ablaufdiagramm, das den Steuer- bzw. Kontrollalgorithmus vom oberen Niveau zeigt.
- Fig. 5: Ablaufdiagramm, das die Merkmalsdetektion zeigt.
- Fig. 6: Ablaufdiagramm, das die Zeilen- bzw. Linienkorrelation zeigt.
- Fig. 7: Ablaufdiagramm, das die Farbverhältnisdiskriminierung zeigt.
- Fig. 8: Ablaufdiagramm, das die Ereignisgrößendiskriminierung zeigt.
- Fig. 9 veranschaulicht die prinzipiellen Abtastparameter d, x, y.
- Fig. 10 veranschaulicht einen Vergleich der Reduktion im Signal-zu-Rauschen, wenn der Laserfleck kreisförmig (Fall 1) oder langgestreckt (Fall 2) ist.
- Fig. 11 und 12 veranschaulichen Ereignisse, die mit dem gegenwärtigen Verfahren bei der Detektion von Bakterien in Wasser mit einem Lebensfähigkeitsmarkierer in einem Experiment erhalten worden sind.
- Fig. 11 liefert die Einstellung des Instruments und die Anzahl von Ereignissen, die detektiert und berichtet werden (19 in diesem Experiment).
- Fig. 12 zeigt die Lokalisierung der Mikroorganismen.

Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen

Es sei auf Fig. 3 Bezug genommen, in der eine Einrichtung gemäß der Erfindung gezeigt ist, die Abtastmittel 10, Mittel zum Detektieren der emittierten Fluoreszenz, umfassend dichroitische Filter 20, optische Filter 21, Photomultiplier (PMT) 30, ein Signalverarbeitungssystem 40-42, einen Digitalsignalprozessor 43, einen Instrumenten-PC 50, einen Benutzer- PC 60 und ein automatisiertes Mikroskop 70 umfaßt.
Die Abtasteinrichtung 10 verwendet kohärentes Licht zum Abtasten eines festen Trägers 11, der durch eine Filtermembrane repräsentiert ist, welche auf einem Membranenhalter 8 getragen ist.
In der bevorzugten Ausführungsform umfassen die Komponenten der Abtasteinrichtung 10 einen wassergekühlten 488 nm-Argon- Ionen-Laser 12, Abtastspiegel 16, eine Abtastlinse 17 und einen Strahl- bzw. Bündelabzug 18, welcher ein Sicherheitsmerkmal ist; das genannte Abtastmittel arbeitet mit Mitteln zum Fokussieren des Laserbündels bzw. -strahls zu einem Laserfleck zusammen, umfassend einen Bündeldehner 13, welcher die Beleuchungslaserfleckgröße auf 4-14 um, vorzugsweise 7 um, steuert bzw. regelt und den beleuchtenden Fleck auf die genannten Abtastspiegel 16 richtet.
Der genannte Bündeldehner 13 umfaßt zwei Linsen, die derart geeignet sind (Brennweite und Abstand zwischen den genannten beiden Linsen), daß sie einen Laserfleck auf dem festen Träger von 4 bis 14 um liefern; um z. B. einen Laserfleck von 7 um zu erhalten, ist die Brennweite der Linse Nr. 1 50 mm, die Brennweite der Linse Nr. 2 ist 10 mm und der Abstand zwischen den beiden Linsen ist 35,7 mm.
Die genannten beiden Abtastspiegel werden dazu benutzt, den beleuchtenden Laserfleck quer über den festen Träger 11 abzutasten, auf welchem die Probe abgelagert ist, die die zu detektierenden Mikroorganismen enthält. Der Laserfleck bewegt sich in der x-Richtung mit einer Geschwindigkeit von z. B. 1 Meter pro Sekunde.
Die genannten Abtastspiegel 16 (= Abtaster 16) erlauben z. B. einen Linien-zu-Linien-(y)-Abstand von 3 um (Abstand zwischen zwei Abtastlinien).
Von dem genannten Abtastmittel wird eine hohe optische Genauigkeit gefordert, um einen genaue Positionierung des Laserflecks (abtastende Linse 17) sicherzustellen.
Unter Verwendung einer Laserfleckgröße von 7 um bei einer Geschwindigkeit von 1 m/s kann ein 25 mm-Filter in weniger als 3 Minuten abgetastet werden.
Der feste Träger 11 (wie eine Filtermembrane), auf dem die zu analysierende Probe abgelagert ist, wird auf einem entfernbaren Probenhalter plaziert, der dazu verwendet wird, den Probenträger von dem Laboratorium oder von wo immer die Probe gesammelt wird, zu transportieren, und ihn in die gegenwärtige Einrichtung einzuführen.
Der Ladungseinschub (nicht dargestellt) ist für den Benutzer leicht zugänglich. Der entfernbare Probenhalter ist so ausgebildet, daß er z. B. einen kreisförmigen festen Träger handhabt, und wird auf dem Ladungseinschub abgelagert. Der Einschub wird dann in die Einrichtung geschoben, und die die Mikroorganismen tragende Probenmembrane kommt direkt unter den Abtaster 16. Der Probenmembranenhalter wird gekühlt, um die Stabilität der markierten Mikroorganismen zu schützen (z. B. durch Peltiereffekt).
Der genannte Probenlader arbeitet mit einem Mechanismus zum Einführen des Probenhalters in die Einrichtung und zum automatischen Bringen desselben mit Präzision in den richtigen Abstand von den Abtastlinsen zusammen.
Der Abtaster 16 führt das fokussierte Laserbündel zu dem Target 11, so daß dadurch Fluoreszenz von den Mikroorganismen oder irgendwelchem fluoreszenten Material induziert wird.
Das demgemäß von der Probenmembrane emittierte Fluoreszenzlicht geht durch die dichroitischen Filter 20 und die optischen Filter 21 hindurch zu zwei Photomultipliern (PMTs) 30.
Die genannten PMTs 30 detektieren die Fluoreszenz bei zwei Wellenlängen (als der grüne und der rote Kanal bezeichnet) (zentriert auf 530 nm und 615 nm)
Die PMT-Signale werden zusammen mit Zeitsynchronitätsinformation von dem Abtaster 16 zu dem Signalverarbeitungssystem 40 geschickt.
Dieses System 40 umfaßt Vorverstärker 41, Signalprobennahmeeinrichtungen 42 und eine Digitalsignalverarbeitungseinheit 43.
Genauer ist es so, daß jedes der genannten PMT-Signale mittels eines gewidmeten Vorverstärkers 41 verstärkt wird. Die verstärkten Analogsignale werden digital bei 2 MHz unter Verwendung einer 8-Bit-Auflösung (256 Signalniveaus) gesampelt. Jeder PMT-Kanal hat einen gewidmeten Sampler bzw. Probennehmer.
Die gesampelten PMT-Signale werden zu einem Digitalsignalverarbeiter bzw. -prozessor (DSP) 43 geschickt.
Die Signale werden dann analysiert, und die resultierende Ausgangsinformation wird durch einen Instrumenten-PC 50 geschickt, welcher die Abtasteinrichtung steuert bzw. regelt, als ein Hauptrechner für das DSP-System 43 wirkt, Daten während des Abtastens des festen Trägers speichert und die Abtastergebnisse zu dem Benutzer-PC 60 schickt.
Das genannte Benutzer-PC-System 60 wird dazu verwendet, die Ergebnisse einer Abtastung zu verarbeiten und anzuzeigen, und zwar gegenwärtig unter Verwendung von Matlab®-Software als dem prinzipiellen analytischen Werkzeug.
Die gegenwärtige Einrichtung hat die Möglichkeit, wenn das notwendig ist, eine direkte Beobachtung von irgendeinem Objekt auf dem festen Träger zu erlauben, und zwar durch Antreiben eines automatisierten Mikroskops von dem Benutzer-PC 60 aus.
Die Fig. 4-8 fassen die unterschiedlichen Schritte des gegenwärtigen Verfahrens zusammen, und zwar im Hinblick darauf, folgendes zurückzuweisen:
- Hintergrundrauschen (dynamischer Schwellwert, Fig. 5),
- Farbdiskriminierung (Fig. 7),
- unkorrelierte Merkmale (Fig. 6),
- Größendiskriminierung (Fig. 8).
Wirkung der Variation in den Auslegungsparametern.
Die folgenden physikalischen Abtastparameter: Laserfleckgröße (d), Abtastlinienprobennahme (x) und Linienabstand (y) beeinflussen die Detektionsleistungsfähigkeit des gegenwärtigen Verfahrens, wie in Fig. 9 veranschaulicht ist. Sie sind:
- d: die Abtastlaserfleckdimension. Die Fleckleistungsverteilung ist eine Gaußsche Verteilung, und die Fleckdimension wird gewöhnlich als die Dimension definiert, bei welcher die Laserintensität auf (1/e²) des Spitzenwerts abgefallen ist (angenähert 13%)
- x: der Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Datenproben bzw. -probennahmen auf einer Abtastlinie. Dieser wird durch die Sampling- bzw. Probennahmerate und die Geschwindigkeit der Abtastspiegel gesteuert.
- y: der Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Abtastlinien. Dieser wird durch die Schritt- bzw. Stufengröße gesteuert, die zum Bewegen des Abtastspiegels verwendet wird.
Die Wirkung des Variierens dieser Parameter ist in Tabelle II zusammengefaßt. Es ist klar, daß es einen optimalen Betriebsbereich für jeden Parameter gibt. Die Größe dieses Bereichs wird durch drei prinzipielle einengende Faktoren bestimmt:
- Minimieren der Wahrscheinlichkeit des Erhaltens eines falschen positiven oder falschen negativen Ergebnisses;
- praktische Technikbeschränkungen (Komponententoleranzen, Abtastspiegelpositionsgenauigkeit, etc.);
- Verarbeitungs- und Datenanalysesystemkosten (Prozeßgeschwindigkeit, Speicher für die Datenspeicherung). Tabelle II
Die Rolle dieser Parameter ist außerdem in den Fig. 1 und 10 gezeigt.
Das Target 11 wird abgetastet, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Mit Bezugnahme auf die genannte Fig. 1 kann die Abtastzeit hinsichtlich der Laserfleckdimension und des SNR (Signal- Rauschen-Verhältnis) wie folgt berechnet bzw. beurteilt werden:
- der gesamte abgetastete Bereich ist X.Y
- die Abtastgeschwindigkeit ist v
- die Rücklaufzeit ist vernachlässigbar
- die Fleckdimensionen sind ax und ay
- das Abtastfortschreiten ist Δy
Dann ist die Zeit zum Abtaster des gesamten Bereichs gleich der Zeit zum Abtasten von einer Linie mal der Anzahl der Abtastlinien.
Zeit pro Linie = X/v
Anzahl der Linien = Y/Δy
Y = ay/n, worin n die Anzahl von Malen ist, mit der jeder Fleck abgetastet wird.
Demgemäß wird die Zeit zum Abtasten gegeben durch:
Abtastzeit = X.Yn/v.ay
Wenn alle Dinge gleich sind, ist die Zeit zum Vollenden einer Abtastung proportional dem abgetasteten Bereich bzw. der abgetasteten Fläche und der Anzahl von Malen, die jedes Element abgetastet wird. Sie ist umgekehrt proportional der Geschwindigkeit der Abtastung und der Dimension des Flecks in der Y- Richtung.
Jedoch sind nicht alle Dinge gleich, und wenn die Abtastzeit entweder durch das einfache Mittel des Erhöhens der Fleckgröße oder der Geschwindigkeit vermindert wird, dann wird das Signal-zu-Rauschen gefährdet.
Das Signal ist proportional der Intensität der Beleuchtung (Watt/cm²) und der Zeit, mit der jeder Fleck beleuchtet wird. Das Rauschen ist proportional der Quadratwurzel der beleuchteten Fläche und umgekehrt proportional der Abtastgeschwindigkeit. Demgemäß wird betrachtet, daß:
- der Ziel- bzw. Targetmikroorganismus kleiner als der Beleuchtungsfleck ist;
- die Gesamtlaserleistung eine Konstante (lo) ist und über den Beleuchtungsfleck ausgebreitet ist;
- die Abtastung überlappt sein kann, wie oben beschrieben, wo n die Anzahl von Malen ist, die jeder Fleck abgetastet wird.
Das Signal-zu-Rauschen kann in Ausdrücken von gewohnten Quantitäten ausgedrückt werden:
Dieses demonstriert explizit, wie das Detektionssignal-zu- Rauschen vermindert wird, wenn entweder die Abtastgeschwindigkeit oder die Laserfleckdimension erhöht wird. Wenn auch diese Gleichung nicht die Wiederherstellung des Signal-zu- Rauschen betrachtet, welches bzw. welches durch Korrelation von benachbarten Abtastlinien gewonnen wird (siehe Fig. 1).
Fig. 10 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse der beiden oben entwickelten Gleichungen unter zwei Sätzen von Bedingungen. In jedem Falle wurde angenommen, daß eine Anfangsbedingung mit einem kreisförmigen Laserfleck der Dimension a existierte. Unter dieser Bedingung war das SNR 100% und die Abtastzeit war 100%.
Bedingung 1: Erhöhung der Laserfleckdimension mit bzw. bei konstanter Geschwindigkeit unter Aufrechterhaltung eines kreisförmigen Flecks und ohne Überlappungsabtastung.
n = 1 und ax = ay
Bedingung 2: Langstrecken des Flecks durch Erhöhen der y-Dimension, während die x-Dimension vermindert wird, derart, daß die Fleckfläche konstant ist und überlappt, so daß jeder Fleck zweimal abgetastet wird:
n = 2 und ax · 1/ay
BEISPIEL 1: Detektion von total lebensfähigen Bakterien in Wasser.
Ein aliquoter Teil von Wasser wird in einem markierenden Puffer verdünnt, der einen fluoreszenten Markierer (Fluoresceinsuccimidylester) enthält. Nach 5 min bei Raumtemperatur wird die Probe auf bzw. mit einer Membrane von 0,22 uu Porengröße gefiltert und unter Benutzung der vorliegenden Erfindung analysiert, mit:
d = 14 um (Laserfleckdurchmesser)
x = 2 um (Abtastprobenbeabstandung)
y = 5 um (Abtastlinienbeabstandung).
Die Basis des gegenwärtigen Verfahrens ist, daß die Energie, die auf ein Teilchen fällt in irgendeinem bzw. jedem Punkt in dem Gaußschen Strahlprofil berechnet werden kann; und alle die folgenden Parameter können daher spezifiziert werden:
- Abtastgeschwindigkeit: v = 1 m/s
- Laserleistung (an dem Laser): L = 60 mWatt
- optische Effizienz bzw. optischer Wirkungsgrad: o = 0,66
- Sammeleffizienz bzw. -wirkungsgrad: = 0,01
- Leistung auf dem festen Träger: P = o · L
- Probenzeit t = 2 us
- Fluoreszenzumwandlung: η = 2 · 10&supmin;³
- Hintergrundfluoreszenzumwandlung: ηb = 10&supmin;&sup6;
- Wellenlänge des Lichts: λ = 0,53
- Quanteneffizienz bzw. -wirkungsgrad: q = 0,15
- Prozentsatz im Band: B = 0,89
- PMT-Spannung: Z = 600
- Dynodenkonstante K = 0,75
Unter den genannten Bedingungen können die folgenden Ergebnisse erhalten werden und sind in Tabelle III und in den Fig. 11 und 12 veranschaulicht, wo 19 Fluoreszenzflecke (d. h. 19 Mikroorganismen) detektiert werden können.

Tabelle III

Auslesung bnhs 11.002

Daten aufgezeichnet am: Mittwoch, 13. Juli 1994 15 : 36 : 52 Uhr
Dateiname = bnhs 11.002
Datenblöcke = 312 Bytes = 7924 Proben = 5044 Merkmale = 310
PMT 1: Proben = 4028 Merkmale = 234
PMT 2: Proben = 1016 Merkmale = 76
bnhs 11.002
Grünes Filter: Flecke = 55
Rotes Filter: Flecke = 30
Zurückgewiesen 17 Flecke mit Verhältnis größer als 0
Zurückgewiesen 18 grüne unkorrelierte Flecke mit einzelnen Merkmalen weniger als 13 Proben lang
Zurückgewiesen 0 grüne Flecke größer als 25 Proben lang
Zurückgewiesen 1 grüner Fleck größer als 5 Linien breit
Überlagerung: Proben = 890, Merkmale = 66, Flecke = 19
Ende der Datenkennungen.
BEISPIEL 2: Detektion und Zählung von fluoreszenten lebensfähigen Bakterien.
Aliquote Teile der Kultur von unterschiedlichen Mikroorganismen werden in einer salzhaltigen gepufferten Lösung verdünnt und durch eine Membrane mit 0,2 um Porengröße gefiltert; zurückgehaltene Mikroorganismen werden durch Hinzufügung von 1 ml Markierungslösung (Lebensfähigkeitsmarkierer) markiert, gefolgt durch eine 15minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Die resultierenden fluoreszent markierten Mikroorganismen werden detektiert und gezählt, indem das gegenwärtige Verfahren mit den Parametern ausgeführt wird, die in der folgenden Tabelle IV veranschaulicht sind und welche entsprechend dem Typ der getesteten Mikroorganismen variieren können. Tabelle IV DETEKTION UND ZÄHLUNG VON VERSCHIEDENEN ARTEN VON LEBENSFÄHIGEN MIKROORGANISMEN MIT FLUORESZENTEN LEBENSFÄHIGKEITSMARKIERERN
Es muß hervorgehoben werden, daß in der genannten Tabelle IV "*Verhältnis" die Fluoreszenzintensität in dem roten Kanal, geteilt durch die Fluoreszenzintensität in dem grünen Kanal, bedeutet, und daß die Spalten, die mit "**" markiert sind, aktuell die Gesamtheit von Ereignissen enthalten, wie sie in dem Text definiert sind, und die Anzahl von unkorrelierten Merkmalen (auch Einzelmerkmale genannt).
Es ist außerdem zu bemerken, daß Merkmale und Ereignisse nur in dem roten Kanal zu finden sein können und umgekehrt, und daß die Auswirkung der Diskriminierung durch Gaußsche Kriterien nach anderen Kriterien nicht in dieser Tabelle gezeigt ist.
Diese Tabelle IV zeigt, daß fluoreszente Teilchen, die andere als die relevanten Mikroorganismen sind, eliminiert werden.

Claims

1. Verfahren zum Detektieren und Zählen von fluoreszenten Mikroorganismen auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes umfaßt:

- Abtasten eines festen Trägers, auf dem eine potentiell Mikroorganismen enthaltende Probe abgelagert worden ist, wobei die Probe einer fluoreszenten Färbung ausgesetzt worden ist, mit einem von einem Laser einfallenden Strahl, Bilden eines Laserflecks auf dem festen Träger, wobei der Laserfleck wesentlich größer als die zu detektierenden Mikroorganismen ist, wobei die Laserfleckgröße zwischen 4 und 14 um ist, wobei der Abstand zwischen zwei benachbarten Abtastlinien derart ist, daß jedes Element des Trägers wenigstens zweimal durch partielles Überlappen von benachbarten Abtastwegen abgetastet wird; und gleichzeitig:

- Detektieren des resultierenden Fluoreszenzlichts wenigstens bei einer einzigen Wellenlänge, indem nur detektierte Signale, die einen gegebenen Schwellwert übersteigen, ausgewählt werden, wobei ein Satz von benachbarten Probeerhebungen auf einer Abtastlinie ein Merkmal bzw. eine Besonderheit repräsentiert;

- Aufstellen eines Satzes von korrelierten Merkmalen bzw. Besonderheiten durch eine Linie-zu-Linie-Korrelation von individuellen Merkmalen bzw. Besonderheiten mittels Vergleichen von Merkmalen bzw. Besonderheiten auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität, Zählen der Anzahl von Linien, über welche der Satz von korrelierten Merkmalen bzw. Besonderheiten auftritt, wobei jeder Satz von korrelierten Merkmalen bzw. Besonderheiten ein Ereignis bildet, und Eliminieren aller einzelnen unkorrelierten Merkmale bzw. Besonderheiten;

- Vergleichen der korrelierten Merkmale bzw. Besonderheiten auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität wenigstens bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ1 und λ2 zum Auswählen der korrelierten Merkmale bzw. Besonderheiten, die ein Emissionsintensitätsverhältnis bei den beiden Wellenlängen haben, welches niedriger als eine vorbestimmte Zahl ist, und zwar derart spezifiziert, daß, wenn das Emissionsverhältnis bei den genannten Wellenlängen, das durch irgendwelche korrelierten Proben erzeugt wird, größer als ein vordefinierter Wert ist, das vollständige Ereignis eliminiert wird;

- Herstellen einer Größendiskriminierung von zurückgehaltenen Ereignissen und Auswählen von jenen, die eine Größe haben, welche einem Mikroorganismus entspricht;

- Bestimmen, ob für zurückgehaltene Ereignisse nach der Größendiskriminierung das Energieprofil der Ereignisse in drei Dimensionen innerhalb vorbestimmter Gaußformkriterien ist, und Zurückweisen von Ereignissen, die nicht innerhalb der vorbestimmten Gaußformkriterien sind; und

- Zählen der übrigbleibenden Ereignisse, um ausschließlich die auf dem festen Träger vorhandenen Mikroorganismen zu bestimmen und zu zählen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Größendiskriminierung ausgeführt wird durch:

- Bestimmen der Länge von jedem Ereignis mittels Zählens der Anzahl von Probeerhebungen durch Beginnen mit der Probeerhebung, die, bei welchem Merkmal bzw. welcher Besonderheit des Ereignisses auch immer, das bzw. die am frühesten auftritt, in der Abtastrichtung zuerst erscheint, Fortsetzen, um die Probeerhebung einzuschließen, die, bei welchem Merkmal bzw. welcher Besonderheit auch immer, das bzw. die zuletzt endet, als letztes in der Abtastrichtung erscheint, wobei die Zählung als eine einzige Probeerhebung alle die korrelierten Probeerhebungen auf unterschiedlichen Abtastlinien nimmt,

- Bestimmen der Breite des genannten Ereignisses durch Zählen der Anzahl von benachbarten Linien, welche durch das gleiche Ereignis bedeckt sind, und

- Eliminieren von Ereignissen, für welche die Anzahl der gezählten Probeerhebungen größer als eine vorbestimmte Zahl A ist und/oder die Anzahl der benachbarten Abtastlinien größer als eine vorbestimmte Zahl B ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es vor dem Abtasten des festen Trägers folgendes umfaßt:

- Sammeln von Mikroorganismen von einer Probe auf dem festen Träger, wie einer Filtermembrane; und

- Markieren der Mikroorganismen mit einem Farbstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet ist von Vitalfarbstoffen, Lebensfähigkeitsmarkierern, Fluoreszenzsubstanzen, die von Antikörpern oder Nucleinsonden getragen oder durch ein enzymverbundenes Sondensystem erzeugt und, wenn erregt, fähig sind, eine Emissionsfluoreszenz bei einer Wellenlänge λ1 zu erzeugen.

4. Einrichtung zum Detektieren und Zählen von fluoreszenten Mikroorganismen gemäß dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3, welche folgendes umfaßt:

- eine Laserlichtquelle (12) zum Emittieren eines einfallenden Lichtstrahls, die mit Mitteln zum Fokussieren (13) des Laserstrahls zu einem Laserfleck zusammenwirkt, dessen Dimension auf einem festen Träger (11) wesentlich größer als die zu detektierenden und zu zählenden Mikroorganismen ist, wobei die Laserfleckgröße zwischen 4 und 14 um liegt;

- Abtastmittel (10) zum Richten des Lichts von der genannten Lichtquelle auf den festen Träger, um die Mikroorganismen fleckweise zu bestrahlen, so daß Fluoreszenzflecken erzeugt werden, worin der Abstand zwischen zwei Abtastlinien derart ist, daß jedes Element des Trägers wenigstens zweimal durch teilweises Überlappen von benachbarten Abtastwegen abgetastet wird;

- Mittel zum Detektieren (20, 21, 30) und photoelektrischen Umwandeln der emittierten Fluoreszenz bei wenigstens zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ1 und λ2;

- Mittel zum Diskriminieren und Eliminieren von nichtbakterieller Fluoreszenz, umfassend einen Digitalsignalverarbeiter (43) und eine Mehrzahl von optischen Wegen zum Auswählen von wenigstens zwei Emissionsfluoreszenzwellenlängen;

- Signalverarbeitungsmittel (40, 41, 42) zum Aufstellen von Sätzen von korrelierten Merkmalen bzw. Besonderheiten mittels einer Linie-zu-Linie-Korrelation von individuellen Merkmalen bzw. Besonderheiten durch Vergleichen von Merkmalen auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität, Zählen der Anzahl von Linien, über welche der genannte Satz von korrelierten Merkmalen bzw. Besonderheiten auftritt, wobei jeder Satz von korrelierten Merkmalen bzw. Besonderheiten ein Ereignis bildet, und Eliminieren von allen einzelnen unkorrelierten Merkmalen bzw. allen einzelnen unkorrelierten Besonderheiten, die nur auf einer einzigen Linie auftreten; Vergleichen der genannten korrelierten Merkmale bzw. Besonderheiten auf jedem Paar von benachbarten Linien in Zeitsynchronizität wenigstens bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ1 und λ2 zum Auswählen der korrelierten Merkmale, die ein Emissionsintensitätsverhältnis bei den genannten beiden Wellenlängen haben, das niedriger als eine vorbestimmte Zahl ist, und zwar dahingehend spezifiziert, daß, wenn das Emissionsverhältnis bei den genannten Wellenlängen, durch irgendwelche korrelierten Merkmale erzeugt, größer als ein vordefinierter Wert ist, das vollständige Ereignis eliminiert wird; Herstellen einer Größendiskriminierung von zurückgehaltenen Ereignissen und Auswählen der Ereignisse, die eine Größe haben, welche einem Mikroorganismus entspricht; Bestimmen, ob für zurückgehaltene Ereignisse nach der Größendiskriminierung das Energieprofil der Ereignsse in drei Dimensionen innerhalb vorbestimmter Gaußformkriterien ist, und Zurückweisen von Ereignissen, die nicht innerhalb der genannten vorbestimmten Gaußformkriterien sind, und Zählen der übrigen Ereignisse, um die auf dem festen Träger vorhandenen Mikroorganismen ausschließlich zu bestimmen und zu zählen.

5. Einrichtung nach Anspruch 4, worin das Abtastmittel einen ersten schwingenden Spiegel (16) umfaßt, wobei die Achse der Schwingung desselben senkrecht zu der Achse des Lichtstrahls für das Abtasten einer Linie durch den Strahl ist; und einen zweiten Spiegel, dessen Achse senkrecht zu der Achse der Schwingung des ersten Spiegels ist, wobei der zweite Spiegel eine Abtastbewegung ausführt, die mit der Abtastbewegung des ersten Spiegels synchronisiert ist.

6. Einrichtung nach Anspruch 4, worin das Detektionsmittel wenigstens zwei Photomultiplier (30) als ein Mittel für die photoelektrische Umwandlung umfaßt.

7. Einrichtung nach Anspruch 4, worin der Laserfleck eine langgestreckte Form hat.

8. Einrichtung nach Anspruch 4, worin der feste Träger ein Glasobjektträger (11) ist.

9. Einrichtung nach Anspruch 4, worin der feste Träger auf einem Probenhalter (8) plaziert ist, welcher mit Kühlmitteln, und wahlweise einer dünnen Schicht aus Siliciummaterial, welche zwischen den Probenhalter und den festen Träger sandwichartig eingefügt ist, zusammenwirkt.