DE10160133A1

DE10160133A1 - Verwendung von koagulationsaktivem Antithrombin III zur Therapie von Angiogenese-abhängigen Erkrankungen

Info

Publication number: DE10160133A1
Application number: DE10160133A
Authority: DE
Inventors: Ilhan Celik; Oliver Kisker
Original assignee: Transmit Gesellschaft fuer Technologietransfer mbH
Current assignee: Philipps-Universitaet Marburg 35037 Marburg De
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2003-06-26
Also published as: AU2002357964A1; WO2003054015A3; WO2003054015A2; EP1456236A2; US20050070471A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von antiangiogen wirksamen Antithrombin III aus koagulationsaktivem (nativem) Antithrombin III und die Verwendung von koagulationsaktivem Antithrombin III zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von antiangiogen wirksamem Antithrombin III aus koagulationsaktivem (nativem) Antithrombin III und die Verwendung von koagulationsaktivem Antithrombin III zu Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen

Stand der Technik

Es ist allgemein anerkannt, dass das Tumorwachstum, chronische Entzündungen und Retinopathien angiogeneseabhängig sind. Hierbei spielt das Verhältnis zwischen positiven und negativen Regulatoren der Angiogenese eine entscheidende Rolle. Beispielsweise exprimieren Tumoren sowohl positive Regulatoren und können zusätzlich auch an der Generierung von negativen Regulatoren der Angiogenese beteiligt sein. Hierbei sezenieren Tumoren Enzyme, die bekannte Proteine wie z. B. Kollagen XVIII und Antithrombin III (AT III) proteolytisch spalten bzw. ihre Konformation ändern (z. B. zu latentem AT III). Die so entstandenen Fragmente (Spaltprodukte) zeigen dann in vitro und in vivo potente antiangiogene Eigenschaften. Beispiele dafür sind Angiostatin als Spaltprodukt von Plasminogen, Endostatin als Spaltprodukt von Kollagen XVIII, antiangiogenes Antithrombin III als Spaltprodukt von Antithrombin III und konformationsgeändertes Antithrombin III (O'Reilly et al. Science 1999; Kisker et al. Cancer Research 2001). Es ist weiterhin bekannt dass durch chemische (ex vivo) Modifikation (Citrat-Behandlung) des nativen AT III, latentes AT III entsteht, welches antiendotheliale (in vitro)und antiangiogene (in vivo) Eigenschaften besitzt (O'Reilly et al. Science 1999; Larsson et al. Cancer Research 2000 und Larsson et al JBC 2001).
Die Literaturliste gibt einen Überblick zum Stand der Technik:
Kisker et al. Cancer research 60, 2001, 7298-7304
O'Reilly et al. Science Vol. 285, 1999 1926-1928
Larsson et al. Cancer Research 2000, 6723-6729
Larsson et al. Journal of Biological Chemistry Vol. 276, No. 15 2001, 11996-12002
Die Spaltprodukte mit antiendothelialer oder antiangiogener Eigenschaft können in Form von Medikamenten therapeutisch am Patienten eingesetzt werden. Die Produktion dieser antiangiogenen Spaltprodukte kann allerdings zur Zeit nur in technisch sehr aufwendigen und teuren Herstellungsverfahren z. B. gentechnisch erfolgen (z. B. Endostatin), sie sind zudem für den Einsatz am Patienten nur bedingt geeignet, da die gentechnisch produzierten Proteine je nach verwendetem Expressionssystem keine genaue Übereinstimmung und 100%ige Effektivität im Vergleich zu natürlich vorkommenden Spaltprodukten zeigen. Die Verfügbarkeit der Stoffe ist zudem durch die zusätzlichen Verfahrensschritte limitiert und für die Medikamentenherstellung bedeutet jeder neue technische Verfahrensschritt eine Verteuerung des Produktes.
Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren zu entwickeln, in dem aus einem Stoff der per se keine antiangiogenen Eigenschaften besitzt ein Spaltprodukt mit antiangiogenen Eigenschaften entsteht, das zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe und Therapie von Angiogenese-abhängigen Erkrankungen verwendet werden kann.
Aufgabe war es darüberhinaus, einen solchen Stoff zu identifizieren, der zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen, insbesondere Angiogeneseabhängige Erkrankungen geeignet ist und ein Testverfahren zu entwickeln, das zur in vitro Identifizierung und Herstellung neuer negativer und positiver Regulatoren der Angiogenese oder alternativ zum Test verschiedener Tumorzelllinien geeignet ist.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Ansprüche 1 bis 9 gelöst.
Tumoren bzw. Tumorzellen sezernieren Enzyme (z. B. proteolytische Enzyme wie u. a. Matrix-Metalloproteinasen) die in der Lage sind, aus bekannten Proteinen antiangiogen wirksame Substanzen abzuspalten oder das Protein in ihrer Proteinstruktur so zu verändern, dass das daraus entstandene veränderte Protein potente antiangiogene Eigenschaften besitzt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass antiangiogenes Antithrombin III ein solches Spaltprodukt bzw. ein in seiner Konformität verändertes Protein aus nativen Antithrombin III ist. Die Applikation von nativem Antithrombin III führt in vivo, wenn die Tumorzellen in der Lage sind Antithrombin III zu spalten oder in seiner Konfiguration zu verändern, zu einer Reduktion bzw. zu einem Wachstumsstop durch Hemmung des Gefäßwachstums, da der Tumor sich aus dem Überangebot von Antithrombin III in größerer Menge antiangiogenes Antithrombin III selber herstellt und dadurch die Balance zwischen positiven und negativen Regulatoren zu Gunsten der negativen Regulatoren verschoben wird. Dies bedeutet, dass ein in ausreichender bzw. in genügend hoher Menge vorhandenes Protein wie zum Beispiel natives Antithrombin III ohne aufwendige labortechnische Verfahren, zusätzliche Verfahrensschritte und Kosten sofort zur Therapie eingesetzt werden kann. Eine gesonderte teure, aufwendige und zeitintensive Medikamentenzulassung ist zudem nicht notwendig, da z. B. natives Antithrombin III ein bereits im Handel befindliches Medikament ist.
In der DE 199 37 656 A1 und EP 1075840 A3 wird die Verwendung von Antithrombin zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen vorgeschlagen. Allerdings ist dort die Einsatzmöglichkeit auf die Entzündungsreaktionen beschränkt und die Funktion von Antithrombin III steht in Zusammenhang mit der Migration von Leukozyten.
Die vorliegende Erfindung zeigt, daß die humane Pankreaskarzinom Zelllinie BxPC-3 in der Lage ist, aus nativem Antithrombin III sowohl gespaltenes als auch konfigurations-verändertes antiangiogen wirksames Antithrombin III (latentes AT III) herzustellen. Die Therapie eines 100 mm³ großen BxPC-3 bzw. ASPC-1 Tumors im Mausversuch mit 50 mg/kg/Tag gespaltenem humanem Antithrombin III führt zu einer deutlichen Hemmung der Angiogenese (reduzierte Mikrogefäßdichte)und dadurch zu einer vollständigen Blockierung des Tumorwachstums. Ebenso kann die Applikation von 60 mg/kg/Tag normalen (nativem) AT III zu einer deutliche Hemmung der Angiogenese und des Tumorwachstums führen (Fig. 1), während die Therapie eines Tumors, der nicht die Fähigkeit besitzt natives AT III zu verändern auch nicht mit normalen AT III in seinem Wachstum behindert wird (Fig. 2).
Es wird ein erfindungsgemäßes Verfahren vorgeschlagen, mit dem in vitro durch Tumorzelllinien aus nativem Antithrombin III antiangiogen wirksames AT III generiert werden kann. Dieses Verfahren kann zusätzlich zur in vitro Identifizierung und Herstellung neuer negativer und positiver Regulatoren der Angiogenese oder alternativ zum Test verschiedener Tumorzelllinien verwendet werden.
Darüberhinaus ist die erfindungsgemäße Verwendung von koagulationsaktivem AT III als Arzneimittel bei der Prophylaxe und Therapie von onkologischen Erkrankungen, insbesondere soliden Tumoren und Leukämien gezeigt.
Das Plasmaprotein Antithrombin kann in verschiedenen Konformationen und Varianten vorkommen.
Erfindungsgemäß ist unter koagulationsaktivem AT III das native, im Körper vorhandene Antithrombin III zu verstehen, das bei der Blutgerinnung aktiv ist. Unter antiangiogen wirksamem Antithrombin III sind jedoch das in seiner Konformation veränderte native Antithrombin III, das latente und gespaltenes Antithrombin III zu verstehen, die jeweils keine Funktion bei der Blutgerinnung haben.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von koagulationsaktivem Antithrombin III als Arzneimittel an Patienten, wobei der Begriff Patient sich gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltiere bezieht. Damit können die Arzneimittel in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden.
Das therapeutisch antiangiogen wirksame Antithrombin III der vorliegenden Erfindung wird den Patienten, als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral intravenös, intramuskulär oder subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, intrathekal, intravesikal (durch Instillation in die Blase), lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform (Aerosol) verabreicht. Die intravenöse, subcutane, intraperitoniale und intrathekale Gabe kann dabei kontinuierlich mittels einer Pumpe oder Dosiereinheit erfolgen.
Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können die Modifikationen als Salze, Ester, Amide und "Prodrugs" beinhalten, sofern sie nach zuverlässiger tedizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxidität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen.
Dosierungsformen für die örtliche Administration der Verbindung dieser Erfindung schließen Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Preservativen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.

Ausführungsbeispiele

A) Generierung von antiangiogen wirksamem AT III, gespaltenem und latentem AT III in vitro durch Tumorzelllinien

Methoden: Humane Pankreaskarzinom Zelllinien BxPC3 und ASPC-1 werden in Zellkultur (Medium: RPMI 1640 + 10% FCS + 1% Penicillin/Streptomycin; 37°C und 5% CO₂) gezüchtet. Um zu überprüfen ob das serumfreie Zellmedium dieser Zelllinien die Fähigkeit besitzt, humanes natives AT III in seiner Konfiguration zu verändern, werden die Zellen bis zur Konfluenz hochgezogen. Anschließend werden die Zellen 2 mal mit PBS gewaschen und mit serumfreiem Medium (RMPI 1640) für 48 Stunden inkubiert (sogenanntes konditioniertes Medium). Anschließend wird 1 mg/ml natives humanes AT III zu dem serumfreiem Medium hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 48 Stunden wird der Mediumüberstand gewonnen und anschließend auf einem 72 Stunden dauernden, dem Durchschnittsfachmann geläufigen, bFGF stimulierten Endothelzellproliferations-Assay gegeben. Zusätzlich wird durch Western-Blot-Analyse mit einem Antikörper gegen humanes natives AT III und durch Harnstoffgradienten-Gelanalyse die Konformationsänderung des AT III im Vergleich zu humanem nativem AT III untersucht.
Ergebnis: Der Überstand der BxPC-3 Zellen zeigt im Endothelzellproliferations-Assay eine konzentrationsabhängige Inhibition der Proliferationsrate. Das serumfreie Medium ohne Zugabe von nativem AT III (Kontrolle) zeigt keine inhibitorische Eigenschaft. Auch die Zugabe von AT III zu reinem Medium (ohne Vorinkubation auf den Zellen = negativ Kontrolle) zeigt ebenfalls keine antiproliferativen Eigenschaften. In der Western-Blot-Analyse des konditionierten Mediums mit nativen AT III befindet sich die gespaltene Form des AT III. Zusätzlich ist in der Harnstoffgradienten-Gelanalyse eine latente Form des AT III nachweisbar.
Nach Purifikation mit einer Heparin-Sepharose-Säule (50 mM Tris-Puffer pH 7,4) eluiert das antiangiogen wirksame AT III bei 0,5 molar NaCl. Die weitere Aufreinigung erfolgt durch Anionen-Austausch-Säule (Mono-Q-Säule) mit 20 mM Tris-Puffer, pH 7,0 und Elution mittels eines Gradienten von 0 bis 0,35 molare NaCl. Hier eluiert antiangiogen wirksame AT ITI bei 0,31-0,35 molar NaCl, latentes und gespaltenes AT III in separaten Fraktion. Das antiangiogen wirksame AT III zeigt im Endothelzellproliferations-Assay antiendotheliale Wirksamkeit
Für die Zelllinie ASPC-1 findet sich im identischen Versuchsansatz (siehe oben) keine inhibierende Aktivität des konditionierten Mediums nach Zugabe von nativen AT III im Endothelzellproliferations-Assay. Sämtlich positiven und negativen Kontrollen zeigen ebenfalls keine inhibitorische Aktivität. Western-Blot-Analyse und Harnstoffgradienten- Gelanalyse weisen weder ein gespaltenes noch ein latentes AT III für diese Zelllinie nach. Die Zelllinie ASPC-1 verfügt demnach nicht über die nötige enzymatische Aktivität aus koagulationsaktivem AT III antiangiogen wirksames AT III zu generieren. Mit dem vorliegenden Verfahren können eine Vielzahl von Tumorzelllinien auf ihre enzymatische Aktivität aus koagulationsaktivem AT III antiangiogen wirksames AT III zu generieren, getestet werden. Es ist ebenfalls möglich weitere Proteinkandidaten auf ihre Fähigkeit hin zu untersuchen, ob sie von einer gegebenen Tumorzellinie zu positiven oder negativen Regulatoren der Angiogenese verändert werden können. Das dargestellte Verfahren zeigt das nach Zugabe von Proteinen ohne antiangiogene Eigenschaften in das konditionierte Medium (siehe oben) von Tumorzellen diese in ihrer Konfiguration bzw. Struktur so verändert werden, das positive bzw. negative Regulatoren der Angiogenese entstehen. Diese so entstandenen neuen Substanzen sind in nachfolgenden Purifikationsschritten (z. B. Gelanalyse) zu identifizieren und nach entsprechender Aufreinigung für den Einsatz in vivo als Medikament in der Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen einsetzbar.

B) Koagulationsaktives AT III als Arzneimittel bei der Therapie von zwei humanen Pankreakarzinom-Zelllinien (BxPC3 und ASPC-1) im Tumormaus-Model (SCID-Maus)

Methode

Die beiden (BxPC3 und ASPC-1) humanen Pankreaskarzinom-Zeillinien werden in der Zellkultur gezüchtet (siehe unter Abschnitt A)). Die Zellen werden geerntet und es werden 5 × 10⁶ Zellen/Maus s. c. auf den Rücken der SCID-Mäuse implantiert. Nachdem die Tumoren eine Grösse von ca. 100 mm³erreicht haben, werden die Mäuse in jeweils 3 Gruppen pro Zelllinie randomisiert (n = 4 bzw. 7/Gruppe).
Anschließend erfolgt die s. c. Injektion von 60 mg/kg KG von latentem (antiangiogen wirksamem AT III) bzw. nativem AT III (koagulationsaktivem AT III) weit entfernt vom Tumor. Zur Kontrolle wird entweder Kochsalz (NaCl 0,9%) bzw. BSA (Bovines Serum Albumin 60 mg/kg KG) injiziert. Die Injektionen erfolgt täglich mit den angegebenen Dosierungen. Das Tumorvolumen wird an jedem 3.-5. Tag ermittelt und am Versuchsende (BxPC3 nach 26 Tagen bzw. ASPC-1 nach 11 Tagen) in Bezug zum Tumorvolumen der Kontrollgruppe gesetzt. Dabei wird ein Quotient gebildet aus dem Tumorvolumen der Therapiegruppe geteilt durch das Tumorvolumen der Kontrollgruppe (T/C).

Ergebnisse

Die humane Pankreaskarzinom-Zelllinie BxPC3 kann durch die Gabe von latenten(antiangiogen wirksamem) und nativem AT III (koagualtionsaktivem) signifikant in ihrem Tumorwachstum gehemmt werden. Für latentes AT III ergibt sich ein T/C von 0,1 (90%ige Hemmung im Vergleich zur Kontrollgruppe). Für natives AT III ergibt sich ein T/C von 0,15 (85%ige Hemmung im Vergleich zur Kontrollgruppe (siehe Fig. 1)
Für die humane Pankreaskarzinom-Zelllinie ASPC-1 findet sich im oben beschriebenen Versuchsansatz für latentes AT III ein T/C von 0,31 (69%ige Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zur Kontrollgruppe). Für natives AT III kann keine signifikante Hemmung des Tumorwachstums nachgewiesen werden (T/C = 0,94 oder 6% Hemmung des Tumorvolumens im Vergleich zur Kontrollgruppe)(siehe Fig. 2).

Abbildungen

Fig. 1 Therapie der humanen Pankreaskarzinom Zelllinle BxPC3 im Tumormausmodel (SCID-Maus) mit nativem und latentem AT III (60 mg/kg KG) versus Kontrolle (60 mg/kg KG BSA = Bovines Serum Albumin). Herstellung von antiangiogen wirksamem T/C = Quotient aus Tumorvolumen der Therapiegruppe geteilt durch Tumorvolumen der Kontrollgruppe (BSA). Antithrombin III aus der humanen Pankreaskarzinom zelllinie BxPC-3
Fig. 2 Hemmung der Angiogenese mit humanem antiangiogen wirksamen Antithrombin III, Therapie der humanen Pankreaskarzinom Zelllinie ASPC-1 im Tumormausmodel (SCID-Maus) mit nativem und latentem AT III (60 mg/kg KG) versus Kontrolle (NaCL 0,9%). T/C = Quotient aus Tumorvolumen der Therapiegruppe geteilt durch Tumorvolumen der Kontrollgruppe (NaCl).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von antiangiogen wirksamem AT III, gekennzeichnet durch die Schritte

- Kultivierung der Tumorzellinie bis zur Konfluenz

- Inkubation mit serumfreiem Medium für 48 Stunden

- Zugabe von 1 mg/ml nativem humanen AT III

- Inkubation für 48 Stunden

- Gewinnung des Mediumüberstandes

- Durchführung des bFGF stimulierten Endothelzellproliferations-Assay

- Analyse des antiangiogen wirksamem AT III durch Western-Blot-Analyse und Harnstoffgradienten-Gelanalyse

- Purifikation mit Heparin-Sepharose-Säule und Anionen- Austausch-Säule

2. Verwendung des Verfahren gemäß Anspruch 1 zur in vitro Identifizierung und Herstellung neuer negativer und positiver Regulatoren der Angiogenese

3. Verwendung des Verfahren gemäß Anspruch 1 zur in vitro Identifizierung verschiedener Tumorzelllinien auf ihre Fähigkeit hin, Proteine in ihrer Konformation so zu verändern, daß sie als negative oder positive Regulatoren der Angiogenese wirksam sind

4. Verwendung von koagulationsaktivem Antithrombin III zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen, insbesondere Angiogenese-abhängige Erkrankungen.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet dass, onkologische Erkrankungen behandelt werden

6. Verwendung nach Anspruch 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet dass, Erkrankungen mit soliden Tumoren und Leukämien behandelt werden

7. Verwendung nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet dass koagulationsaktives Antithrombin III intravenös, subcutan, intraperitonial, intrathekal, intravesikal (Instillation in die Blase) und topisch verwendet wird

8. Verwendung nach den Ansprüchen 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet dass koagulationsaktives Antithrombin III als Aerosol verwendet wird.

9. Antiangiogen wirksames Antithrombin III gekennzeichnet durch Verfahren gemäß Anspruch 1