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DE10128832A1 - Vektor und dessen Verwendung in gentherapeutischen Verfahren - Google Patents

Vektor und dessen Verwendung in gentherapeutischen Verfahren

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DE10128832A1
DE10128832A1 DE2001128832 DE10128832A DE10128832A1 DE 10128832 A1 DE10128832 A1 DE 10128832A1 DE 2001128832 DE2001128832 DE 2001128832 DE 10128832 A DE10128832 A DE 10128832A DE 10128832 A1 DE10128832 A1 DE 10128832A1
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DE
Germany
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plasmid vector
cell
vector according
gene
gene therapy
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Withdrawn
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DE2001128832
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Jochen Reis
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Priority to PCT/EP2002/006234 priority patent/WO2002102417A1/de
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen insbesondere für die somatische Gentherapie geeigneten Vektor, pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend diesen Vektor sowie Verwendungen des Vektors.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, insbesondere einen Plasmidvektor für gentherapeutische Zwecke, insbesondere für die somatische Gentherapie, pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend diesen Plasmidvektor sowie Verwendungen und Verfahren unter Einsatz dieses Plasmidvektors.
  • Gentherapeutische Verfahren sind Verfahren zur Korrektur von erblich bedingten Erkrankungen unter Einsatz gentechnologischer Methodik durch Ersetzen eines oder mehrerer defekter Gene, durch zusätzliches Einbringen des normalen Gens oder durch Einbringen eines Gens, das die Wirkung des defekten Genes kompensiert. Gentherapeutische Verfahrensweisen befinden sich gegenwärtig noch im Experimentalstadium am Tier. Es wird zwischen der Keimbahn- Gentherapie und der somatischen Gentherapie unterschieden. Im Zuge der Keimbahn-Gentherapie wird der genetische Defekt im frühen Embryonalstadium behoben, so dass auch die Keimzellen des Individuums betroffen werden und die veränderte genetische Information an die Nachkommen weitergegeben wird. Die somatische Gentherapie behebt genetische Defekte dagegen allein in den Körperzellen entwickelter Organismen zum Beispiel durch Übertragen eines Normalfunktion aufweisenden Genes. Das an die Nachkommen weitergegebene Erbgut enthält daher nach wie vor den genetischen Defekt. Üblicherweise werden im Rahmen der somatischen Gentherapie zunächst zu behandelnde Körperzellen dem Körper entnommen, anschließend die gewünschten genetischen Veränderungen in den Zellen in vitro durchgeführt, und zwar in der Regel durch Transformation der Zielzellen mit dem gentherapeutisch eingesetzten Gen transformierte Zellen selektioniert und anschließend in den Patienten reimplantiert.
  • Voraussetzung für jede erfolgreiche Gentherapie ist die Kenntnis der molekularen Ursachen des zu behandelnden Defektes. Voraussetzung ist auch die Bereitstellung einer möglichst hohen Anzahl mit dem erwünschten Gen transformierter Zellen. Die Transformation, das heißt das Einschleusen genetischen Materials in die Zellen geschieht üblicherweise mittels chemisch-physikalischer Methoden, zum Beispiel Mikroinjektion von DNA, oder durch Verwendung von Vektoren, zum Beispiel Retroviren, Adenoviren, Herpes simplex-Viren, DNA-aufweisenden Liposomen oder Plasmidvektoren.
  • So sind zum Beispiel aus der WO 99/66061, der WO 99/04026, der WO 96/37623 oder der WO 96/14332 virale Vektoren bekannt, die für den Einsatz in gentherapeutischen Verfahren vorgeschlagen werden und in der Lage sind, genetisches Material in Zielzellen einzuführen.
  • Aus der WO 99/59546 sind polymere Genträger bekannt, die Nucleinsäuren in Zellen einführen können. Die WO 98/40502 beschreibt Peptid- oder Protein-haltige Zusammensetzungen, die neben einem Transfektionsagens auch Nucleinsäuren enthalten und für gentherapeutische Verfahren verwendet werden können.
  • Die US 5,804,604 und US 5,64,980 beschreiben die Verwendung eines Plasmides für gentherapeutische Zwecke. Dieses Plasmid codiert ein Fusionsprotein, umfassend einen basischen Bereich des HIV-TAT- Transportproteins (HIV: humaner Immundefizienzvirus) und den Papillomavirus E2-Repressor. Das aus dem TAT-Transportproteinteil und dem E2- Repressorprotein gebildete Fusionsprotein dient gleichsam als Transportvehikel für das Einschleusen interessierender Peptide, Makromoleküle oder kleinerer Moleküle wie Nucleinsäuren oder Polysaccharide in Zielzellen.
  • Die WO 87/02989 beschreibt das HIV TAT-3 Protein sowie Plasmide, die dieses Protein codierende Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Es wird offenbart, dass das rekombinante TAT-3 Protein für die Diagnose und Therapie von HIV-Infektionen dienen kann.
  • Schließlich offenbart Schwarze et al. (Science (1999) 285, 1569-1572 die intraperitoneale Injektion eines das HIV-TAT-Protein umfassenden Fusionsproteins in Mauszellen.
  • Die beschriebenen im Rahmen der Gentherapie eingesetzten Transformationsverfahren weisen den Nachteil vergleichsweise geringer Effizienz auf. Die für einen gentherapeutisch erfolgversprechenden Ansatz notwendige Zahl transformierter Zellen lässt sich kaum oder gar nicht erreichen. Die beschriebenen Verfahren weisen zudem häufig auch den Nachteil auf, dass die Expressionsrate in den transformierten Zellen nicht hoch genug ist, um einen therapeutischen Effekt erwarten zu lassen. Als besonders nachteilig erweist sich, dass manche Gewebe oder Organe wie das Gehirn für Stoffwechselprodukte nur schwer zu erreichen und aufgrund der Blut/Hirn- Schranke auch nicht von anderen Organen mit Proteinen versorgt werden können. Gerade in solchen Geweben oder Organen ist eine somatische Gentherapie besonders problematisch.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die die für ein erfolgreiches gentherapeutisches Verfahren notwendige hohe Transformations- und Expressionsrate interessierender Gene gewährleisten.
  • Die vorliegende Erfindung löst das ihr zu Grunde liegende Problem durch die Bereitstellung eines Vektors für gentherapeutische Zwecke, umfassend mindestens eine eine Translokationssequenz codierende Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nucleotidsequenz codierend für das HSV VP22-Protein (HSV-VP22: Elliott und O'Hare Cell (1997) 88, 223-233), einer Nucleotidsequenz codierend die HIV-TAT-Proteintransduktionsdomäne und einer Nucleotidsequenz codierend das Antennipedia-Peptid (Antennipedia: Derozzi et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 10444-10450, Helix der Homeodomäne: RQIKIWFGNRRMKWKK), SEQ ID Nr. 4).
  • Insbesondere ist ein derartiger Vektor als Plasmidvektor, viraler Vektor oder Liposom ausgeführt. Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines Plasmidvektors für gentherapeutische Zwecke umfassend in operativer Verknüpfung und in 5'- zu 3'-Orientierung mindestens einen konstitutiv exprimierenden Promotor, mindestens eine eine Ribosomenbindestelle (RBS) codierende Nucleotidsequenz, mindestens eine das HIV-TAT-Leitpeptid codierende Nucleotidsequenz, insbesondere codierend die 11 Aminosäuren YGRKKRRQRRR (SEQ ID Nr. 1), eine NotI-Clonierungsstelle für die Insertion einer gentherapeutisch sinnvollen Nucleotidsequenz, insbesondere eines gentherapeutisch sinnvollen Genes, und eine Polyadenylierungsstelle.
  • Der vorstehend beschriebene, auch als pCURE bezeichnete, Plasmidvektor der Erfindung zeichnet sich durch eine die HIV-TAT-Leader (beziehungsweise Leitpeptid) Sequenz codierende Nucleotidsequenz aus, die unmittelbar und übergangslos im Leseraster an einer zum Beispiel ein therapeutisch sinnvolles Protein oder Proteinfragment codierenden Nucleotidsequenz angeknüpft ist, so dass im Verlauf der Transkription und Translation ein die HIV-TAT Leitpeptidsequenz aufweisendes Fusionsprotein in der Zielzelle, das heißt der zu transformierenden beziehungsweise transformierten Zelle gebildet wird. Der erfindungsgemäß vorgesehene Einsatz der Translokations-Leader-Sequenz (Leitpeptidsequenz oder Translokationssignal) von 11 Aminosäuren, also der Protein-Transduktionsdomäne des HIV-TAT-Proteins, ermöglicht dem in einer Zielzelle gebildeten Fusionsprotein überraschenderweise den Export aus der transformierten Zelle und den Import in mindestens eine weitere Zelle, insbesondere auch das Überwinden der Blut-Hirn-Schranke. Das vom erfindungsgemäßen Vektor codierte Fusionsprotein eignet sich also zum interzellulären Transport. Der Einsatz des erfindungsgemäßen Plasmidvektors führt erfindungsgemäß auch zu einer erhöhten Anzahl von transformierten Zellen mit intaktem Protein pro mit DNA transformierter Zelle. Der erfindungsgemäße Plasmidvektor trägt darüber hinaus eine mit der Leitsequenz verknüpfte Translationsinitationssequenz, nämlich eine die RBS-Sequenz (Riosomenbindestelle) codierende Nucleotidsequenz und alle weiteren für die Transkription erforderlichen Elemente, wie einen konstitutiv exprimierenden Promotor, zum Beispiel der CMV-Promotor (Blumenkohlmosaikvirus) für die ubiquitäre Expression, eine Polyadenylierungsstelle, vorzugsweise die Polyadenylierungsstelle von SV40 sowie mindestens ein Terminationssignal.
  • Der erfindungsgemäße Plasmidvektor ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, gemäß der der Vektor ohne inserierte Fremd-DNA eine Größe von lediglich 3,4 kbp aufweist, extrem klein und kann daher auch große gentherapeutisch sinnvolle Gene oder Genabschnitte aufnehmen. Die Insertion der gentherapeutisch sinnvollen Gene oder Genabschnitte erfolgt durch die erfindungsgemäß bevorzugte vorteilhafterweise nur einmal im Vektor vorkommende NotI- Schnittstelle, die unmittelbar hinter der das Leitpeptid codierenden Nucleotidsequenz liegt beziehungsweise mit dieser überlappt.
  • Erfindungsgemäß ist in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass das Plasmid mit entwicklungs- oder gewebespezifischen oder regulierbaren regulatorischen Elementen, zum Beispiel Promotoren oder Enhancern versehen wird, die mittels einer multiplen Clonierungsstelle in den Vektor eingefügt werden.
  • Erfindungsgemäß ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, eine multiple Clonierungsstelle im erfindungsgemäßen Plasmidvektor vorzusehen, insbesondere diese zwischen einem Promotor und einer Ribosomenbindungsstelle einzufügen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "gentherapeutische Zwecke" verstanden, dass der erfindungsgemäße Vektor, insbesondere Plasmidvektor, für jegliche gentherapeutische Zwecke eingesetzt werden kann, insbesondere für das Einführen von körperfremden oder körpereigenen Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA- Sequenzen, in Zielzellen. Erfindungsgemäß können als Zielzellen beliebige Zellen des menschlichen oder tierischen Körpers, zum Beispiel eines Säugetierkörpers verstanden werden. Es kann sich dabei um Embryonal-, Stamm-, Körper- oder Keimbahnzellen jeglichen Entwicklungsstadiums handeln. Die Erfindung betrifft also auch die Verwendung des Vektors, insbesondere Plasmidvektors, sowohl für die Somazell-Gentherapie als auch für die Keimbahn- Gentherapie. Die Erfindung erfasst jedoch auch die Verwendung des Vektors, insbesondere Plasmidvektors, für andere als gentherapeutische Zwecke, zum Beispiel für Forschungszwecke oder für gendiagnostische Zwecke.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "operativ miteinander verknüpft" verstanden, dass die miteinander verknüpften Elemente so miteinander verknüpft sind, dass sie bestimmungsgemäß zusammenwirken können, zum Beispiel dass operativ miteinander verknüpfte Transkriptionselemente eine korrekte Transkription gewährleisten. Operativ miteinander verknüpfte Transkriptions- und Translationselemente ermöglichen eine korrekte Expression, das heißt insbesondere Transkription und Translation, zu einem funktionsfähigen Translationsprodukt.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter gentherapeutisch sinnvollen Nucleotidsequenzen, zum Beispiel auch Gene, Genabschnitte oder andere strukturelle Genombereiche verstanden, deren Einfügen in eine Zielzelle aus therapeutischer Sicht sinnvoll ist. Die zu inserierenden Nucleotidsequenzen, insbesondere Gene, können endogen oder exogen zu der Zielzelle sein. Es kann sich dabei um Nucleotidsequenzen handeln, die zur Komplementation oder Korrektur von Gendefekten im behandelten Körper dienen. Es können darunter jedoch auch ein oder mehrere Genabschnitte verstanden werden, die dem Ausschalten von Zielgenen in Zielzellen dienen, beispielsweise mittels homologer Rekombination. Gentherapeutisch sinnvolle Nucleotidsequenzen, insbesondere Gene oder Genabschnitte, können auch Antisinn-Konstrukte sein, die der Transkriptionsinhibition in der Zielzelle dienen und damit die Expression bestimmter Proteine verhindern oder reduzieren. Für die Insertion in den vorliegenden Plasmidvektor geeignete Gene oder Genabschnitte können natürlich auch Protein codierende oder nicht- Protein codierende Bereiche sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter gentherapeutisch sinnvollen Proteinen Genprodukte verstanden, die in natürlicher Form, das heißt Wildtypform, oder modifizierter Form in Zielzellen nach Einfügen mittels gentechnologischer Methoden exprimiert werden. Derartige gentherapeutisch sinnvolle Proteine können beliebige Proteine sein, die zum Beispiel in defekter Form in der Zelle vorkommen oder dort gar nicht exprimiert werden und mittels der Gentherapie in die Zelle eingebracht werden können, es können aber auch Proteine sein, die in der Zielzelle auch natürlicherweise nicht vorkommen, gleichwohl aber therapeutisch dort erwünscht sind. Derartige Proteine können auch als Proteinfragmente oder Fusionsproteine ausgeführt sein und gegebenenfalls Modifikationen, zum Beispiel posttranslationelle Modifikationen, aufweisen. Von besonderem Interesse sind Gene, die in der Zielzelle abwesende, in verringerter Menge oder in mutanter Form vorhandene Proteine codieren. Derartige Proteine können insbesondere Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Lymphokine, Cytokine, Rezeptoren und ähnliches ein. Insbesondere kann es sich um Faktor VIII, tPA oder den Molybdän-Cofaktor handeln. Die Molybdän-Cofaktor-Defizienz ist eine schwere neurologische bisher nicht therapierbare und schließlich letale Erkrankung. Hier reichen kleinste Mengen an intaktem Cofaktor und somit auch an Biosynthese- Enzymen für einen klinisch unauffälligen Phänotyp aus. Hauptsyntheseort ist die Leber, die relativ gut erreichbar ist. Die hier gebildeten Enzyme können aufgrund der erfindungsgemäßen Vorgehensweise unter Verwendung des erfindungsgemäß eingesetzten Translokationssignales exportiert und auch vom Gehirn aufgenommen werden. Weitere Beispiele für zu inserierende Gene sind Gene die für Hämoglobin, Interleukin-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, GM- CSF, G-CSF, M-CSF, menschlichen Wachstumsfaktor, Insulin, Faktor IX, LDL-Rezeptoren, Tumornecrosefaktor, PDGF, EGF, NGF, IL-1ra, EPO, TPO, Beta- Globin sowie biologisch aktive Muteine dieser Proteine codieren.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass das Plasmid ein Resistenzgen, insbesondere ein bakterielles Resistenzgen enthält, zum Beispiel das Ampicillinresistenzgen. Die Erfindung sieht in einer weiteren Ausführungsform vor, dass das Resistenzgen mindestens eine Schnittstelle zum Linearisieren und Inaktivieren des Resistenzgenes aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Plasmidvektor einen Expressionsverstärker, insbesondere Enhancer aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, dass das Plasmid einen Replikationsursprung, nutzbar insbesondere für die Plasmidanzucht in Bakterien, aufweist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform auch Wirtszellen oder Zellen einer Zellkultur, enthaltend mindestens einen Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung. Eine derartige Wirtszelle kann unter anderem eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine tierische Zelle, zum Beispiel eine Säuger- oder Insektenzelle oder eine menschliche Zelle sein.
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur genetischen Modifizierung einer Zelle, zum Beispiel einer tierischen oder menschlichen Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Vektor, insbesondere Plasmidvektor, gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die eine Aufnahme des Vektors, insbesondere Plasmidvektors, in die Zelle, insbesondere das Genom der Zelle erlauben.
  • Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung genetisch modifizierter Zellen, wobei die genetisch zu modifizierenden Zellen mit einem Vektor, insbesondere Plasmidvektor, der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht und dabei transient oder stabil transformiert werden.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Vektors, insbesondere Plasmidvektors, der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Präparates, insbesondere eines pharmazeutischen Präparates für die Gentherapie, insbesondere die somatische Gentherapie.
  • Die Erfindung betrifft daher auch Präparate, insbesondere pharmazeutische Präparate, enthaltend mindestens einen Vektor, insbesondere Plasmidvektor, der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
  • Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele, der dazugehörigen Figuren und Sequenzprotokolle näher erläutert.
  • Das Sequenzprotokoll stellt dar:
    SEQ ID Nr. 1 die 33 die HIV-TAT-Leitpeptidsequenz codierenden Nucleotide,
    SEQ ID Nr. 2 die davon codierten 11 Aminosäuren der HIV-TAT-Leitpeptidsequenz,
    SEQ ID Nr. 3 die 49 Nucleotide enthaltende Nucleotidsequenz des die RBS, die HIV-TAT-Region und NotI-Clonierungsstelle umfassenden Bereichs von pCURE und
    SEQ ID Nr. 4 zeigt die Aminosäuresequenz der Helix der Homeodomäne von Antennipedia.
  • Die Figuren zeigen:
  • Fig. 1 eine grafische Darstellung des Plasmids pCURE
  • Fig. 2 eine in situ Färbung einer erfindungsgemäß transformierten Gehirnhälfte und eine Kontrolle und
  • Fig. 3 Dünnschnitte von Leber und Gehirn (jeweils Negativkontrolle und erfindungsgemäß transformiert).
    • Beispiel 1 Herstellung des Plasmids pCURE
  • Der Expressionsvektor pcDNA 3.1 (-) von Invitrogen (Kat.-Nr. V 795-20) wurde mit EcoRV und NaeI gespalten. Anschließend wurde das Plasmid religiert und die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 in die NotI-Stelle inseriert.
  • Fig. 1 stellt grafisch das Plasmid pCURE in PVU I- linearisierter Form (von links nach rechts in 5'- zu 3'-Orientierung) dar. Die in Fig. 1 verwendeten Abkürzungen bedeuten:
    PCMV = CMV-Promotor zur zelltypunabhängigen Expression (Quelle: pcDNA3.1(-));
    MCS = Multiple Clonierungsstelle für gewebespezifische Promotoren: NheIU, PmeI, DraII, ApaI, XbaI, XhoI;
    RBS = Ribosomale Bindungsstelle mit Startcodon;
    TAT = TAT leader-Sequenz als Translokationssignal für interzellulären Transport;
    NotI = Insertionsstelle (Clonierungsstelle) für zum Beispiel therapeutisch sinnvolle cDNA;
    SV40pA = SV40 Polyadenylierungssignal und Transkriptionstermination;
    pMB1 = Replikationsursprung (origin of replication) ("pUC-derived") für Plasmidanzucht in Bakterien;
    amp = Ampicillin-Resistenzgen;
    PvuI = Schnittstelle zum Linearisieren und Inaktivieren der Amplicillin-Resistenz;
    pCURE1 = hat ohne inserierte DNA eine Größe von 3,4 kbp.
  • Fig. 1 kann entnommen werden, dass zwischen PCMMV, also dem CMV-Promotor und der ribosomalen Bindungsstelle eine multiple Clonierungsstelle MCS angeordnet ist. In 3'-Richtung davon folgen eine TAT- leader-Sequenz, eine NotI-Insertionsstelle sowie die SV40pA Polyadenylierungsstelle.
    • Beispiel 2 Herstellung des Plasmids pCURElacZ
  • pCURElacZ wurde konstruiert durch Clonierung des lacZ-Gens aus E.coli in die NotI-Schnittstelle von pCURE (Fig. 1). Das resultierende Plasmid pCURElacZ enthält die Aminosäuren 8 bis 1023 der E.coli beta-Galaktosidase, die Xgal zu einem blauen Farbstoff umsetzen. Diese katalytische Domäne liegt im Leseraster hinter der HIV-TAT-Translokations- Leader-Sequenz, welche einen interzellulären Transport ermöglicht.
    • Beispiel 3 Intraperitoneale Applikation in Mäusen
  • pCURElacZ wurde im mg-Maßstab steril und pyrogenfrei aus dem E.coli-Stamm JM109 isoliert (Qiagen endomaxiprep kit) und nach Konzentrationsbestimmung auf 150 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, eingestellt (dieser Puffer dient auch als Injektionslösung für die Kontrollmäuse).
  • Die Injektionen mit pCURElacZ erfolgten an gesunden Mäusen. Neugeborenen Mäusen wurden 50 µg pCURElacZ in 50 µl Phosphatpuffer direkt in die Leber gespritzt. Nach 96 h wurden die Tiere getötet und verschiedene Organe entnommen. Hirn, Leber, Herz und Lunge wurden in toto in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C bis zur weiteren Analyse aufbewahrt.
  • Obengenannte Organe wurden in Xgal-Färbelösung (Stratagene Xgal in situ detection kit) bei 37°C über Nacht inkubiert und nach Einbettung in Paraffin für Dünnschnitte von 10-40 µm verwendet.
  • Darstellung der Ergebnisse
  • Fig. 2 zeigt in toto gefärbte Gehirnhälften nach Xgal-Inkubation. Links: Injektion von 50 µg pCURElacZ. Rechts: Injektion von 50 µl Phosphatpuffer (Negativkontrolle).
  • Fig. 3 zeigt paraffin-fixierte Dünnschnitte der entsprechenden Organe. a) und b) Lebergewebe: a) Negativkontrolle b) Injektion von pCURElacZ. c) und d) Gehirn: c) Negativkontrolle d) Injektion von pCURElacZ.
  • Deutlich ist zu erkennen, dass die erfindungsgemäßen Vektoren erfolgreich in das Gewebe transferiert, dort exprimiert und die Genprodukte in nicht transfizierte Organe, insbesondere das Gehirn, transportiert wurden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Vektor für gentherapeutische Zwecke, umfassend mindestens eine eine Translokationssequenz codierende Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nucleotidsequenzen codierend für das HSV VP22-Protein, die HIV-TAT Proteintransduktionsdomäne oder das Antennipedia-Peptid.
2. Vektor nach Anspruch 1, der ein Plasmidvektor, ein viraler Vektor oder ein Liposom ist.
3. Plasmidvektor für gentherapeutische Zwecke nach Anspruch 2, umfassend operativ miteinander verknüpft in 5'- zu 3'-Richtung mindestens einen konstitutiv exprimierenden Promotor, eine eine Ribosomenbindestelle codierende Nucleotidsequenz, eine das HIV-TAT-Leitpeptid mit den Aminosäuren YGRKKRRQRRR (SEQ ID Nr. 1)codierende Nucleotidsequenz, eine NotI-Clonierungsstelle für die Insertion einer gentherapeutisch sinnvollen Nucleotidsequenz und eine Polyadenylierungsstelle.
4. Plasmidvektor nach Anspruch 3, wobei der konstitutiv exprimierende Promotor der CMV-Promotor ist.
5. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei die Polyadenylierungsstelle die SV40pA-Stelle ist.
6. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei zwischen dem konstitutiv exprimierenden Promotor und der die Ribosomenbindestelle codierenden Nucleotidsequenz eine multiple Clonierungsstelle für die Insertion mindestens eines regulatorischen Elementes lokalisiert ist.
7. Plasmidvektor nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein gewebespezifischer Promotor ist.
8. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei der Plasmidvektor 3,4 kb groß ist.
9. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei in der NotI-Clonierungsstelle im Leseraster zu dem HIV-TAT-Leitpeptid eine gentherapeutisch sinnvolle Nucleotidsequenz inseriert ist.
10. Plasmidvektor nach Anspruch 9, wobei die gentherapeutisch sinnvolle Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Faktor VIII- Gen, tPA-Gen und Molybdän-Cofaktor-Gen.
11. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei der Plasmidvektor ein Resistenzgen enthält.
12. Plasmidvektor nach Anspruch 11, wobei das Resistenzgen das ampR-Gen ist.
13. Plasmidvektor nach Anspruch 11 oder 10, wobei das Resistenzgen mindestens eine Schnittstelle zum Linearisieren und Inaktivieren des Resistenzgens aufweist.
14. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 13, wobei der Plasmidvektor einen Enhancer aufweist.
15. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 2 bis 14, wobei der Plasmidvektor einen Replikationsursprung für die Plasmidanzucht in Bakterien enthält.
16. Wirtszelle, enthaltend einen Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 15.
17. Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei die Wirtszelle eine bakterielle Zelle, eine Insektenzelle, eine Säugerzelle oder eine menschliche Zelle ist.
18. Verfahren zur genetischen Modifizierung einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 unter Bedingungen, die geeignet sind, die Aufnahme des Vektors in die Zelle zu bewirken.
19. Verfahren zum Einführen genetischer Informationen in eine Zelle, umfassend das Einfügen der genetischen Informationen in einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Plasmidvektor unter Bedingungen, die geeignet sind, die Aufnahme der genetischen Information in die Zelle zu bewirken.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Zelle eine bakterielle, menschliche oder tierische Zelle ist.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
22. Verwendung eines Plasmidvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 15 für die Herstellung eines Präparates für die somatische Gentherapie.
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