DE60130465T2

DE60130465T2 - Mutierte muskelspezifische enhancer

Info

Publication number: DE60130465T2
Application number: DE60130465T
Authority: DE
Inventors: James S. Ann Arbor CHAMBERLAIN; Stephen D. Seattle HAUSCHKA
Original assignee: University of Washington; University of Michigan System; University of Michigan Ann Arbor
Current assignee: University of Washington; University of Michigan System; University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 2000-07-14
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2021-07-14
Also published as: US20110097761A1; ATE373095T1; EP1303617B1; WO2002006495A3; AU2294102A; DE60130465D1; WO2002006495A2; EP1303617A2; HK1055444A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und bezieht sich auf Nukleinsäurezusammensetzungen und Expressionssysteme, die muskelspezifische Regulatorelemente umfassen, und in vitro Methoden für die Expression heterologer DNA-Sequenzen in Zellen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung mutante muskelspezifische Enhancer, genetische Kassetten und Vektoren, die für die Gentherapie nützlich sind, Diagnoseassays und weitere Genexpressionssysteme bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es gibt noch eine Reihe von Herausforderungen bei der Entwicklung effektiver Gentherapieprotokolle für Muskeln, im besonderen Maße bei der Überwindung der Schwierigkeiten des Erreichens einer effizienten Überbringung von Genen zu diesem großen und diffusen Gewebe. Die direkte intramuskuläre Injektion verschiedener Vektoren, Adenoviren und adeno-assoziierte Viren einschließend, kann zu einer effizienten Transduktion der Zellen in der Nähe des Ortes der Injektion führen. Die limitierte Diffusion dieser Vektoren innerhalb des Zielgewebes würde jedoch eine große Anzahl von Injektionen erfordern, um große Muskeln zu behandeln.
Um diese Probleme zu lösen, wurden eine Reihe von Verfahren für die systemische Verabreichung von viralen Vektoren entwickelt, einschließlich des direkten adenoviral-vermittelten Gentransfers in Skelettmuskelcapillarendothel und des Gentransfers in Nerven und Muskeln durch isolierte Extremitäteninfusion oder während der Replantation. Des Weiteren wurde durch Greelish et al. ein Verfahren zur Verstärkung der vaskulären Permeabilisierung beschrieben, welches die virale Penetration zu den Mus kelzellen erleichtert [Greelish, et al., Nat. Med., 5:439–443(1999)]. All diese Methoden führen jedoch zu einem Gentransfer in eine große Anzahl von nicht-muskulären Zellen. Jegliche resultierende ectopische Expression kann toxisch sein und ebenfalls eine systemische Immunantwort, die gegen den viralen Vektor oder das Transgen selbst gerichtet ist, induzieren oder verstärken.
Weitere Probleme bei der Gentherapie, genauso wie bei in vitro Expressionssystemen (z.B. in kultivierten Muskelzellen für diagnostische Assays), sind die geringen Expressionsniveaus der gewünschten Gene mit gegenwärtig zur Verfügung stehenden Expressionssystemen. Was deshalb benötigt wird sind regulatorische Elemente, welche gewebespezifisch (z.B. muskelzellenspezifisch) sind, welche mit Expressionsvektoren kompatibel sind, und welche in der Lage sind eine hohe Expression des Genes von Interesse anzutreiben.
Amacher, S.L. et al. 1993 ("Multiple regulatory elements contribute differentially to muscle creatine kinase enhancer activity in skeletal and cardiac muscle", Molecular and cellular biology Band 13, Nr. 5, 2753–2764) und Apone und Hauschka 1995 ("Muscle gene E-box control elements", JBC 270(36), 21420–21427) offenbaren Experimente, die durchgeführt wurden um besser die Komplexität der muskelspezifischen Genregulation zu verstehen, wobei eine Reihe verschiedener Expressionskonstrukte verwendet wurden, d.h. sie enthielten künstliche Gene die vier aufeinander folgende MCK-L oder MCK-R Sites enthielten, die mit dem Thymidinkinasepromotor und dem Chloramphenicolacetyltransferasereporter (CAT) fusioniert wurden, genauso wie (+enh206)TKCAT, welches das gesamte Wildtyp-206-Basenpaar Enhancerfragment stromaufwärts des TK-Promotors enthält.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und bezieht sich auf Nukleinsäurezusammensetzungen und Expressionssysteme, die muskelspezifische Regulatorelemente umfassen, und in vitro Methoden für die Expression heterologer DNA Sequenzen in Zellen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung mutante muskelspezifische Enhancer, genetische Kassetten und Vektoren, die in der Gentherapie nützlich sind, diagnostische Assays und weitere Genexpressionssysteme bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Nukleinsäure umfasst, wobei die Nukleinsäure eine Region mit etwa 85–100% Identität mit der SEQ ID Nr.: 5 oder SEQ ID Nr.: 6 aufweist, wobei die Region notwendigerweise mindestens zwei MCK-R-Kontrollelemente, ausgewählt aus den SEQ ID Nr.: 30–45 umfasst, und wobei die besagte Region funktionell mit einer heterologen DNA Sequenz verbunden ist. In verschiedenen Ausführungsformen sind die MCK-R Kontrollelemente verschiedene Sequenzen (z.B. SEQ ID Nr.: 30 und SEQ ID Nr.: 41). In anderen Ausführungsformen sind die MCK-R Kontrollelemente gleicher Sequenz. In bevorzugten Ausführungsformen sind die MCK-R Kontrollelemente beide Sequenzen umfassend SEQ ID Nr.: 30.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung, die Nukleinsäure umfasst ein erstes und ein zweites Kontrollelement, wobei das erste und das zweite Kontrollelement durch die Struktur AACAXXTGCY definiert ist, wobei X gleich G oder C, und Y gleich T oder A ist. Die Nukleinsäure umfasst des Weiteren ein heterologes Gen, welches funktionell mit dem ersten und zweiten Kontrollelement verbunden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung, wie in Anspruch 1 definiert, bereit, umfassend eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst und wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente umfasst, wobei die Enhancerregion in der Lage ist mit der SEQ ID Nr.: 5 unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die mutante muskelspezifische Enhancerregion eine mutante Muskelkreatinkinase-Enhancersequenz. In bevorzugten Ausführungsformen haben die mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen eine höhere Transkriptionsaktivität als eine Enhancerregion, umfassend die SEQ ID Nr.: 2 oder andere Wildtypsequenzen (z.B. in einem Transkriptionsassay). In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist die höhere Aktivität etwa eine doppelt so hohe Aktivität auf (z.B. sowohl in in vitro als auch in in vivo Expressionsassays). In einigen Ausführungsformen ist die mutante muskelspezifische Enhancerregion ausgewählt aus SEQ ID Nr.: 3–6, 16–19 und 24–27. In bestimmten Ausführungsformen enthält die mutante muskelspezifische Enhancerregion keine MCK-L Region.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung bereit, wobei die Nukleinsäure eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst und wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente, wie in Anspruch 1 und als S5-Sequenz (z.B SEQ ID Nr.: 46) definiert, umfasst. In einigen Ausführungsformen enthält der mutante muskelspezifische Enhancer kein MEF2-Kontrollelement. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der mutante muskelspezifische Enhancer eine mutante Muskelkreatinkinase(MCK)-Enhancerregion aus einem Tier (z.B. einem Säugetier). Obgleich die vorliegende Erfindung nicht durch die Art des Tieres limitiert ist, so schließen in einigen Ausführungsformen die Tiere einen Menschen, eine Ratte oder eine Maus ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. In bevorzugten Ausführungsformen hat der mutante muskelspezifische Enhancer eine Länge von weniger als 250 Basenpaaren. In anderen bevorzugten Ausführungsformen hat der mutante muskelspezifische Enhancer eine Länge von weniger als 230 Basenpaaren. In besonders bevorzugten Ausführungsformen hat der mutante muskelspezifische Enhancer eine Länge von weniger als 210 Basenpaaren. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen hat der mutante muskelspezifische Enhancer eine Länge von weniger als 170 Basenpaaren.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung bereit, wobei die Nukleinsäure eine mutante muskelspezifische Enhancerregion und einer Promotorregion umfasst, wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente umfasst, wie in Anspruch 1 definiert. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Promotorregion eine Muskelkreatinkinasepromotorregion. In anderen Ausführungsformen ist die Promotorregion in der Lage mit der SEQ ID Nr.: 12 unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren. In einigen Ausführungsformen ist die Promotorregion ausgewählt aus den SEQ ID Nr.: 11–13, 20, 21, 28 und 29. In einigen Ausführungsformen ist die Promotorregion aus einer muskelkreatinkinaseregulatorischen Sequenz. In bestimmten Ausführungsformen ist die Promotorregion eine muskelspezifische Promotorsequenz. In bestimmten Ausführungsformen ist die Promotorregion kürzer als 400 Basenpaare in der Länge. In einigen Ausführungsformen hat die Promotorregion eine Länge von weniger als 200 Basenpaaren. In anderen Ausführungsformen ist die Länge der Promotorregionen geringer als 100 Basenpaare. In einigen Ausführungsformen ist die Länge der Promotorregion kürzer als 90 Basenpaare.
In einigen Ausführungsformen beträgt die in vitro Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion mehr als 3% eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay (siehe Beispiel 5 als ein Beispiel für einen geeigneten Transkriptionsassay). In anderen Ausführungsformen ist die in vitro Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen größer als 7% eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay. In verschiedenen Ausführungsformen ist die in vitro Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion etwa 8% eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay. Die in vivo Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion ist größer als 4% eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay. Die in vivo Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion ist größer als 6% eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay. Die in vivo Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion ist mindestens 12% eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay. In noch anderen Ausführungsformen der Erfindung beträgt die in vitro Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen 8% oder mehr (z.B. 9%, 10%, 11%, ... 100% ...) eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay. Die in vivo Transkriptionsaktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion ist 12% oder mehr (z.B. 12%, 13%, 14%, ... 100%, ...) eines CMV-Enhancers in einem Transkriptionsassay. In bestimmten Ausführungsformen ist das Verhältnis der Muskel-zu-Leber heterologen Genexpression von Vektoren, die eine mutante muskelspezifische Enhancerregion verwenden, 600:1 (z.B. wenn es auf Niveaus heterologer Genexpression eines CMV-Enhancer enthaltenden Virus normalisiert ist).
Die vorliegende Erfindung stellt eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung bereit, wobei die Nukleinsäure eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst und wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente umfasst, wie in Anspruch 1 beansprucht. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure des Weiteren eine Intronsequenz. In anderen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure des Weiteren eine Polyadenylisierungssignalsequenz. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure eine heterologe DNA Sequenz. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure des Weiteren Nukleinsäuresequenzen, ausgewählt aus Promotorregionen, Intronregionen, Polyadenylisierungsregionen, heterologen DNA Regionen, und Kombinationen dieser.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung bereit, wobei die Nukleinsäure eine mutante muskelspezifische Enhancerregion aufweist, die funktionell an eine heterologe DNA Sequenz gebunden ist, und wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente umfasst, wie in Anspruch 1 beansprucht. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht auf die Identität des heterologen Genes festgelegt ist, umfasst in einigen bevorzugten Ausführungsformen die heterologe DNA Sequenz das Volllängendystrophingen oder die cDNA Sequenz des Dystrophingenes. In anderen Ausführungsformen umfasst die heterologe DNA Sequenz ein verkürztes Dystrophin-Mini-Gen. In bestimmten Ausführungsformen ist die heterologe DNA Sequenz ausgewählt aus dem Volllängendystrophingen, der cDNA Sequenz des Dystrophingenes, dem BMD-Minigen, dem ΔH2-R19 Minigen, dem Laminin-α2, dem Utrophin, dem Sarcoglycan (Alpha, Beta, Gamma, Delta und Epsilon Sarcoglycan), dem Calpain-3, dem Faktor VIIT, dem Faktor IX und dem Emerin.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung bereit, wobei die Nukleinsäure einen Expressionsvektor und eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst und wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontroll elemente umfasst, wie im Anspruch 1 beansprucht. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Vektor einen Adenovirus. In anderen Ausführungsformen umfasst der Vektor einen Helfer-abhängigen Adenovirus. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Vektor einen Adeno-assoziierten Virus. In einigen Ausführungsformen umfasst der Vektor den Lentivirus.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung bereit, wobei die Nukleinsäure einen Expressionsvektor und eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst, die funktionell an eine heterologe DNA Sequenz gebunden ist und wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente umfasst, wie in Anspruch 1 beansprucht. Der Vektor ist in der Lage die heterologe DNA Sequenz in einem Objekt zu exprimieren. Der Vektor ist in der Lage Zellen zu transfizieren (z.B. Muskelzellen in vitro). In bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor in der Lage Zellen stabil zu transfizieren. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die stabile Transfektion mindestens 3 Monate. In anderen Ausführungsformen beträgt die stabile Transfektion mindestens 4 Monate.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure umfassende Zusammensetzung bereit, wobei die Nukleinsäure eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst, wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion zwei Kontrollelemente umfasst (z.B. zwei Kontrollelemente die von der Sequenz her einander identisch sind), wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei jedes in der Lage ist MCK-Transkriptionsfaktoren (z.B. MCK-spezifische Transkriptionsfaktoren) zu binden. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die beiden identischen Kontrollelemente MCK-R Kontrollelemente. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht auf die Identität des MCK-Transkriptionsfaktors beschränkt und festgelegt ist, umfassen die MCK-Transkriptionsfaktoren in bestimmten Ausführungsformen MRF4, myf5, MyoD, Myogenin und Kombinationen oder Varianten davon (z.B. Hono- und Heterodimere und Multimere).
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine in vitro Methode zur Expression eines heterologen Genes in einer Muskelzelle, wie in Anspruch 16 beansprucht, bereit.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich in einer Methode zur Expression eines heterologen Genes in einem Objekt, umfassend: a) Bereitstellung, i) eines Objektes, wobei das Objekt Muskelzellen umfasst, und ii) eines Expressionsvektors, umfassend eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst, die funktionell mit einer heterologen Gensequenz verbunden ist und wobei die mutante muskelspezifische Enhancerregion mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente umfasst, und b) in Kontakt bringen des Vektors mit dem Objekt unter solchen Bedingungen, dass das heterologe Gen exprimiert wird. Das Objekt leidet an einem Mangelzustand (z.B. einer muskulären Dystrophie) und das heterologe Gen umfasst das Volllängendystrophingen, die cDNA Sequenz des Dystrophin Genes oder ein verkürztes Dystrophin-Minigen.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich in einer Methode umfassend a) Bereitstellung, i) eines Objektes; und ii) eines Expressionsvektors umfassend eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine heterologe Gensequenz umfasst, die funktionell mit einem ersten und einem zweiten Kontrollelement verbunden ist, wobei das erste und das zweite Kontrollelement durch die Struktur AACAXXTGCY, definiert ist, wobei X G oder C ist und Y T oder A ist; und b) Einführung des Expressionsvektors in das Objekt unter solchen Bedingungen, dass das Gen von Interesse expremiert wird.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die SEQ ID Nr.: 1, welche ein 3357 Basenpaarfragment der Maus-MCK-transkriptionsregulatorischen Region ist, welche sich von –3350 bis +7 (Genbankzugangsnummer AF188002) erstreckt.
2 zeigt die SEQ ID Nr.: 2 (eine Wildtypmaus-Enhancerregion), SEQ ID Nr.: 3 (2R Mausmutanten- Enhancerregion), SEQ ID Nr.: 4 (S5 Mausmutanten Enhancerregion), SEQ ID Nr.: 5 (2RS5 Mausmutanten-Enhancerregion), und SEQ ID Nr.: 6 (verkürzte 2RS5 Mausmutanten-Enhancerregion). Die Nummerierung in der Figur entspricht der Nummerierung für das in 1 gezeigte 3355 Basenpaarfragment.
3 zeigt die SEQ ID Nr.: 7 (die regulatorische Sequenz, welche für die Konstruktion der CK4 genetischen Kassette verwendet wurde), SEQ ID Nr.: 8 (die regulatorische Sequenz, die für die Konstruktion der CK6 genetischen Kassette verwendet wurde), SEQ ID Nr.: 9 (die regulatorische Sequenz, die für die Konstruktion der CK5 genetischen Kassette verwendet wurde) und SEQ ID Nr.: 10 (die regulatorische Sequenz, die für die Konstruktion der CK2 genetischen Kassette verwendet wurde).
4 zeigt die SEQ ID Nr.: 11 (eine MCK Mauspromotorregion, die sich von –944 bis +7 erstreckt), SEQ ID Nr.: 12 (eine MCK Mauspromotorregion, die sich von –358 bis +7 erstreckt) und SEQ ID Nr.: 13 (eine MCK Mauspromotorregion, die sich von –80 bis +7 erstreckt).
5 zeigt die SEQ ID Nr.: 14, welche die 5'-Flanke des humanen Muskelkreatingenes (CKMM) (Genbankzugangsnummer M21487) ist.
6a zeigt ein Nukleotidalignment eines Teils der Wildtypmaus-MCK-Enhancerregion (SEQ ID Nr.: 2) mit einem Teil der humanen CKMM 5' flankierenden Sequenz (SEQ ID Nr.: 14). 6b zeigt ein Alignment eines Teils der Wildtyp MCK Promotorregion (SEQ ID Nr.: 12) mit einem Teil der humanen CKMM 5' flankierenden Sequenz (SEQ ID Nr.: 14).
7 zeigt die SEQ ID Nr.: 15 (ein Wildtyp humanes Homolog der Mauswildtyp-Enhancerregion gezeigt in SEQ ID Nr.: 2), SEQ ID Nr.: 16 (eine 2R mutante humane Enhancerregion), SEQ ID Nr.: 17 (eine S5 mutante humane Enhancerregion), SEQ ID Nr.: 18 (eine 2RS5 mutante humane Enhancerregion), SEQ ID Nr.: 19 (eine 2RS5 verkürzte mutante humane Enhancerregion), SEQ ID Nr.: 20 (eine humane Promotorregion), und SEQ ID Nr.: 21 (eine humane Promotorregion).
8a zeigt eine Restriktionskarte der 3355 Basenpaar MCK regulatorischen Regionen, wie in SEQ ID Nr.: 1 veranschaulicht. 8b zeigt eine 206 Basenpaar MCK Enhancerregion (SEQ ID Nr.: 2). Diese Figur zeigt ebenfalls grafisch die Sequenzveränderungen entsprechend den 2R und S5 Mutationen, genauso wie den Ort der 41 Basenpaarverkürzung (beginnend bei der CK5 Deletion). Die Worte rechte E-Box und linke E-Box in dieser Figur sind Synonyme für MCK-R und MCK-L. Diese Figur zeigt ebenfalls andere verschiedene Kontrollelemente, die in dieser Enhancerregion vorliegen.
9a zeigt verschiedene genetische Kassetten mit MCK regulatorischen Regionen (siehe Beispiel 2 für die Konstruktion dieser genetischen Kassetten). 9b zeigt eine genetische Kassette (die Promotor-lacZ-Boxen), die in einen rekombinanten adenoviralen Vektor inseriert ist, so dass die Transkription von dem viralen linken ITR weg verläuft.
10a zeigt die Beta-Galactosidase Expressionsstufen in dendritischen Zellen, die entweder mit einer CMV genetischen Kassette oder den CK5 und CK6 genetischen Kassetten transfiziert wurden. 10b zeigt die Dauer der Expression von Muskeln, in die adCK6lacz Partikel injiziert wurden.
11 zeigt die SEQ ID Nr.: 22, ein Rattenmuskelkreatingen, Exon 1 und eine Promotorregion (Zugangsnummer M27092).
12a zeigt ein Nukleotidalignment eines Teils der Wildtypmaus-MCK-Enhancerregion (SEQ ID Nr.: 2) mit einem Teil des Rattenmuskelkreatingens (Exon 1 und Promotor), veranschaulicht in SEQ ID Nr.: 22. 12b zeigt ein Nukleotidalignment eines Teils der Wildtypmaus-MCK-Promotorregion (SEQ ID Nr.: 12) mit einem Teil des Rattenmuskelkreatingenes (Exon 1 und Promotor) veranschaulicht in SEQ ID Nr.: 22.
13 zeigt die SEQ ID Nr.: 23 (eine Wildtyprattenenhancerregion) SEQ ID Nr.: 24 (eine 2R Rattenenhancerregion) SEQ ID Nr.: 25 (eine S5 mutante Rattenenhancerregion), SEQ ID Nr.: 26 (eine 2RS5 mutante Rattenenhancerregion), SEQ ID Nr.: 27 (eine 2RS5 verkürzte mutante Rattenenhancerregion), SEQ ID Nr.: 28 (eine Rattenpromotorregion), und SEQ ID Nr.: 29 (eine Rattenpromotorregion).
14a zeigt den pBluescript II KS-Plasmid. 14b zeigt einen Teil des Shuttlevektors pAdlox.
15 zeigt das Rückgrad sub360, das verwendet wurde um H5.01CBLacZ (ebenfalls bekannt als AdCMVBantLacZ und AdCBLacz) zu konstruieren.
16 zeigt die SEQ ID Nr.: 30–45, welche verschiedene MCK-R Sequenzen sind, und SEQ ID Nr.: 46, die S5 Sequenz.
16 zeigt ebenfalls SEQ ID Nr.: 47 (die minxt Intronsequenz).
17 zeigt den pAdBg1II Plasmid.
DEFINITIONEN
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend eine Reihe von Begriffen definiert:
Der Begriff „MCK Transkriptionsfaktor", wie hier verwendet, bezieht sich auf Transkriptionsfaktoren, die an MCK Enhancerregionensequenzen binden. MCK spezifische Transkriptionsfaktoren schließen beispielsweise ein, ohne darauf beschränkt zu sein, MRF4, myf5, MyoD, und Myogenin. Der Begriff „MCK-spezifischer Transkriptionsfaktor" bezieht sich auf Transkriptionsfaktoren, die für MCK-Gene einzigartig sind. Transkriptionsfaktoren schließen die verschiedenen Formen ein, mit denen die Faktoren mit den Genen Wechselwirken um biologische Aktivität bereit zu stellen, Hetero- und Homodimere und Multimere einschließend. Transkriptionsfaktoren müssen nicht direkt an eine regulatorische Region binden, sie können aber an die regulatorische Region mittels einer Interaktion mit beispielsweise einem zweiten Faktor, wobei der zweite Faktor an die regulatorische Region gebunden ist, gebunden sein. Transkriptionsfaktoren und Transkriptionsfaktorkomplexe können an eine einzelne regulatorische Sequenz (z.B. ein Enhancer) gebunden sein oder können an eine Vielzahl (z.B. distale) regulatorische Sequenzen binden. Obgleich die Enhancer, die durch die Transkriptionsfaktoren gebunden werden, typischerweise in der 5'-stromaufwärts regulatorischen Regionen der Gene gefunden werden, können bestimmte Enhancer innerhalb der Gene (z.B. innerhalb von Introns oder Exons) oder 3' des Genes gefunden werden.
Der Begriff „Probe", wie hier verwendet, wird in seinem breitesten Sinne verwendet um eine Probe oder eine Kultur, die aus jeglicher Quelle erhalten wurde, genauso wie biologische und Umweltproben einzuschließen. Biologische Proben können von Tieren (einschließlich Menschen) erhalten werden und schließen Flüssigkeiten, Festkörper, Gewebe und Gase ein. Biologische Proben schließen Blutprodukte, wie z.B. Plasma, Serum und ähnliches ein.
Der Begriff „Gen" bezieht sich auf eine DNA Sequenz, die Kontroll- und Kodierungssequenzen umfasst, die für die Herstellung eines Polypeptids oder seiner Vorstufe notwendig sind. Das Polypeptid kann durch eine Volllängenkodierungssequenz oder durch einen Teil der Kodierungssequenz kodiert sein, solange wie die gewünschte enzymatische Aktivität erhalten bleibt. Der Begriff „Gen" schließt sowohl cDNA als auch genomische Formen eines gegebenen Genes ein.
Der Begriff „Wildtyp" bezieht sich auf ein Gen, Genprodukt oder eine andere Sequenz, welche die Charakteristiken des Genes oder Genproduktes aufweist wenn sie aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert wurde. Ein Wildtypgen ist ein solches, welches in einer Population am häufigsten beobachtet wird und somit zufällig als die „normale" oder „Wildtyp"-Form des Genes bezeichnet wird. Im Unterschied dazu bezieht sich der Begriff „modifiziert" oder „mutant" auf ein Gen, Genprodukt oder eine andere Sequenz welche die Modifikationen in der Sequenz und oder funktionalen Eigenschaften (z.B. geänderte Charakteristiken) zeigt, wenn es mit dem Wildtypgen oder Genprodukt verglichen wird. Es sei angemerkt, das natürlich vorkommende Mutanten isoliert werden können; diese werden durch die Tatsache identifiziert, dass sie geänderte Charakteristiken im Vergleich zu dem Wildtypgen oder Genprodukt aufweisen.
Der Begriff „Oligonukleotid", wie hier verwendet, definiert ein Molekül, welches zwei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide, gewöhnlich mehr als drei (3), und typischerweise mehr als zehn (10) und bis zu einhundert (100) oder mehr (obgleich bevorzugt zwischen zwanzig und dreißig), umfasst. Die genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, welche ihrerseits von der endgültigen Funktion oder Verwendung des Oligonukleotids abhängen. Die Oligonukleotide können auf jegliche Art und Weise generiert werden, einschließlich der chemischen Synthese, der DNA Replikation, der reversen Transkription oder einer Kombination davon.
Der Begriff „regulatorische Sequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine genetische Sequenz oder ein Element, das einige Aspekte der Expression von Nukleinsäuresequenzen kontrolliert. Ein Promotor ist z.B. ein regulatorisches Element, das den Start der Transkription einer funktionell verbundenen kodierenden Region ermöglicht. Andere regulatorische Elemente sind Enhancer, Splice-Signale, Polyadenylisierungssignale, Terminierungssignale etc.
Transkriptionskontrollsignale in Eucaryoten schließen „Promotor" und „Enhancer"-Elemente ein. Promotoren und Enhancer bestehen aus kurzen DNA-Sequenzbausteinen, die spezifisch mit zellulären Proteinen Wechselwirken, die in die Transkription involviert sind. Die vorliegende Erfindung betrachtet modifizierte Enhancerregionen. In einer Ausführungsform ist die modifizierte Enhancerregion eine mutante muskelspezifische Enhancerregion, wobei die Wildtypsequenzregion, die ein endogenes MCK-R-Kontrollelement enthält, so modifiziert wurde, dass sie eine zusätzliche MCK-Sequenz enthält. Es ist nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung durch die Größe der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion begrenzt ist. Mit anderen Worten, die flankierenden Sequenzen an beiden Seiten der MCK-R-Kontrollelemente können verschiedene Längen aufweisen. Typischerweise ist eine mutante muskelspezifische Enhancerregion der vorliegenden Erfindung weniger als 500 Basen, mehr bevorzugt weniger als 400 Basen, noch mehr bevorzugt weniger als 300 und am meisten bevorzugt 210 Basen oder weniger (z.B. 206 oder 165) lang.
Der Begriff „heterologe DNA Sequenz" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für die Zelle, in welche sie eingeführt wird, nicht endogen ist. Heterologe DNA schließt eine Nukleotidsequenz ein, welche an eine Nukleinsäuresequenz ligiert ist oder derart manipuliert wurde, das sie an diese ligiert werden konnte und an die sie in der Natur nicht ligiert ist oder an die sie in der Natur an einem anderen Ort ligiert ist. Heterologe DNA schließt ebenfalls eine Nukleotidsequenz ein, die natürlicherweise in der Zelle gefunden wird, in welche sie eingeführt wird und welche einige Modifikationen in Bezug auf die natürlich vorkommende Sequenz aufweist. Ein Beispiel für eine heterologe DNA der vorliegenden Erfindung ist eine heterologe regulatorische Sequenz, wie ein heterologer Promotor, welcher nicht in der Säugerzelle gefunden wird, in welche sie eingeführt wird. Die vorliegende Erfindung betrachtet jedoch ebenfalls endogene (auch sogenannte „homologe") Promotoren, die in funktioneller Kombination mit den heterologen Genen von Interesse stehen.
Der Begriff „rekombinanter DNA Vektor", wie hier verwendet, bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche eine gewünschte codierende Sequenz und entsprechende DNA-Sequenzen aufweisen, die für die Expression der funktionell verbundenen codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus (z.B. ein Säugetier) notwendig sind. DNA-Sequenzen, die für die Expression in Prokaryoten notwendig sind, schließen einen Promotor, optional eine Operatorsequenz, einen Ribosomenbindungsort und mögliche andere Sequenzen ein. Für eukaryotische Zellen ist bekannt, dass die Promotoren, Polyadenylisierungssignale und Enhancer verwenden.
Der Begriff „in funktioneller Kombination", „in funktioneller Anordnung" und „funktionell verbunden", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung von Nukleinsäuresequenzen auf eine solche Art, das ein Nukleinsäuremolekül produziert wird, welches in der Lage ist die Transkription eines gegebenen Gens und/oder der die Synthese eines gewünschten Proteinmoleküls zu regeln. Der Begriff bezieht sich ebenfalls auf die Verknüpfung von Aminosäuresequenzen auf solche Art, dass ein funktionales Protein produziert wird.
Der Begriff „genetische Kassette", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Fragment oder ein DNA Segment, welches eine bestimmte Gruppierung genetischer Elemente enthält. Eine genetische Kassette kann beispielsweise einen Promotor und einen Enhancer einschließen und kann aus einen Vektor oder Plasmid als eine einzelne Einheit entfernt oder in diesen inseriert werden.
Der Begriff „Plasmidrückgrad", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Stück einer DNA, welche mindestens einen Replikationsausgangspunkt und ein selektierbares Markergen (z.B. ein Antibiotikaresistenzgen) aufweist, welches die Selektion der bakteriellen Wirte ermöglicht, welche den Plasmid enthalten; das Plasmidrückrad kann ebenfalls eine Polylinker-Region einschließen um die Insertion eines genetischen Elementes in das Plasmid zu erleichtern. Wenn ein bestimmtes Plasmid derart modifiziert wurde, das es nicht Plasmidelemente enthält (z.B. Insertion von Ad Sequenzen und/oder eines eukaryotischen Genes von Interesse), dann wird der Plasmidteil der Sequenzen als das Plasmidrückgrad bezeichnet.
„Hybridisations"-Methoden schließen das Anlagern einer komplementären Sequenz an die Zielnukleinsäure (die zu detektierende Sequenz) ein. Die Fähigkeit von zwei Nukleinsäurepolymeren, die komplementäre Sequenzen enthalten, einander zu finden und mittels Basenpaarwechselwirkung sich aneinander zu lagern ist ein gut bekanntes Phänomen.
Das „Gegenstück" einer Nukleinsäuresequenz, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, welches in „antiparalleler Assoziation" vorliegt, wenn es mit der Nukleinsäuresequenz so angelagert ist, dass das 5' Ende einer Sequenz mit dem 3'-Ende der anderen gepaart ist. Die Komplementarität muss nicht perfekt sein; stabile Duplexe können Fehlbasenpaarungen oder ungepaarte Basen enthalten. Der Fachmann des Standes der Technik der Nukleinsäuretechnologie kann die Duplexstabilität empirisch bestimmen, unter Berücksichtigung einer Vielzahl von Variablen, einschließlich beispielsweise der Länge der Oligonukleotide, der Basenzusammensetzung und der Sequenz der Oligonukleotide, der Ionenstärke und der Häufigkeit der fehlgepaarten Basenpaare.
Der Begriff „Homologie" bezieht sich auf den Grad der Komplementarität. Es kann teilweise Homologie oder vollständige Homologie (d.h. Identität) vorliegen. Eine teilweise komplementäre Sequenz ist eine solche, die zumindest teilweise eine vollständig komplementäre Sequenz von der Hybridisierung an eine Zielnukleinsäure abhält und wird unter Verwendung des funktionellen Begriffes „im Wesentlichen Homolog" bezeichnet. Die Unterdrückung der Hybridisierung der vollständig komplementären Sequenz an die Zielsequenz kann unter Verwendung eines Hybridisationsassays (Southern- oder Northern-Blot, Lösungshybridisation und ähnliches) unter Bedingungen geringer Stringenz untersucht werden. Eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder Probe wird um die Bindung konkurrieren und die Bindung (d.h. die Hybridisation) einer vollständig homologen an das Ziel unter Bedingungen geringer Stringenz unterdrücken. Das bedeutet nicht, dass die Bedingungen geringer Stringenz solche sind, dass eine nicht-spezifische Bindung zugelassen wird; Bedingungen geringer Stringenz erfordern, dass die Bindung von zwei Sequenzen aneinander über eine spezifische (d.h. selektive) Wechselwirkung stattfindet. Das Fehlen einer nicht-spezifischen Bindung kann unter Verwendung eines zweiten Ziels, welchem sogar ein teilweiser Grad der Komplementarität (z.B. weniger als 30% Identität) fehlt, untersucht werden; in Abwesenheit einer nicht-spezifischen Bindung wird die Probe nicht an das zweite nicht-komplementäre Ziel hybridisieren.
Es ist bekannt, dass eine Vielzahl an äquivalenten Bedingungen verwendet werden können um von Bedingungen geringer Stringenz erfasst zu sein; Faktoren wie die Länge und die Art (DNA, RNA, die Basenzusammensetzung) der Probe und die Art des Ziels (DNA, RNA, die Basenzusammensetzung, vorliegen in Lösung oder immobilisiert, etc.) und die Salzkonzentration und andere Komponenten (z.B. die Anwesenheit oder Abwesenheit von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglycol) werden in Betracht gezogen und die Hybridisationslösung kann variieren um Bedingungen für eine Hybridisation mit geringer Stringenz zu generieren, die zu den oben genannten Bedingungen unterschiedlich, jedoch äquivalent sind. Des Weiteren sind Bedingungen bekannt, welche die Hybridisation unter Bedingungen hoher Stringenz fördern (z.B. die Erhöhung der Temperatur der Hybridisation und/oder Waschschritte, die Verwendung von Formamid in der Hybridisationslösung, etc.) (siehe die Definition für „Stringenz" weiter unten).
Der Begriff „Stringenz", wie hier verwendet, wird im Bezug auf die Bedingungen der Temperatur, der Innenstärke und der Anwesenheit von anderen Verbindungen, wie organische Lösungsmittel, verwendet, unter welchen die Nukleinsäurehybridisationen durchgeführt werden. Der Fachmann des Standes der Technik versteht, dass „stringente" Bedingungen durch die Variation der Parameter, die gerade beschrieben wurden, entweder individuell oder gemeinsam, geändert werden können. Unter „hochstringenten" Bedingungen findet die Nukleinsäurebasenpaarung nur zwischen den Nukleinsäurefragmenten statt, welche eine hohe Frequenz der komplementären Rasensequenzen aufweisen (z.B. Hybridisation unter „hochstringenten" Bedingungen kann zwischen Homologen mit etwa 85–100% Identität, vorzugsweise etwa 70–100% Identität, stattfinden). Unter mittleren stringenten Bedingungen findet die Nukleinsäurenbasenpaarung zwischen Nukleinsäuren mit einer mittleren Frequenz der komplementären Rasensequenzen statt (z.B. Hybridisation unter „mittleren Stringenz"-Bedingungen kann zwischen Homologen mit etwa 50–70% Identität stattfinden). Somit werden die Bedingungen einer „schwachen" oder „geringen" Stringenz häufig erfordert bei Nukleinsäuren, die aus Organismen erhalten wurden, die genetisch verschiedenartig sind, da die Frequenz der komplementären Sequenzen üblicherweise gering ist.
Der Begriff „Markierung", wie hier verwendet, bezieht sich auf jegliches Atom oder Molekül welches verwendet werden kann um ein detektierbares (vorzugsweise quantifizierbares) Signal bereitzustellen und welches an eine Nukleinsäure oder ein Protein befestigt werden kann. Marker können Signale bereitstellen, welche nachweisbar sind mittels Fluoreszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Gravimetrie, Röntgenbeugungsanalyse oder Absorption, Magnetismus, enzymatischer Aktivität und ähnlichem.
Der Begriff „Transfektion", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Einführung einer fremden DNA in eukaryotische Zellen. Die Transfektion kann mittels einer Reihe von aus dem Stand der Technik bekannten Mitteln vollzogen werden, einschließlich des Kalziumphosphat-DANN-co-Prezipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Polybren-vermittelter Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomenfusion, Lipofektion, Protoplastenfusion, retroviraler Infektion und der Biolistik.
Der Begriff „stabile Transfektion" oder „stabil transfiziert" bezieht sich auf die Einführung und Integration von fremder DNA in das Genom der transfizierten Zelle. Der Begriff „stabiler Transfektant" bezieht sich auf eine Zelle, in welche fremde DNA in die genomische DNA stabil integriert wurde.
Der Begriff „lang anhaltende Expression", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Expression über mehr als sechs (3) Monate und weiter bevorzugt mehr als ein (6) Monate, nach der Transfektion von Zellen in einem immunkompetenten (d.h. nicht immunsupprimierten) Tier.
Der Begriff „Gen von Interesse", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Gen, welches in einen Vektor oder ein Plasmid inseriert ist und dessen Expression in einer Wirtszelle gewünscht ist. Gene von Interesse schließen Gene ein, welche therapeutischen Wert haben, genauso wie Reportergene. Eine Vielzahl solcher Gene wird betrachtet, einschließlich solcher Gene von Interesse, welche ein Protein codieren, welches eine therapeutische Funktion bereitstellt. Es ist nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung durch die Gene von Interesse, welche ein bestimmtes Protein mit therapeutischer Funktion codieren, beschränkt ist. Eine Vielzahl solcher Gene wird betrachtet, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, dass Bilirubin-UDP-Glucuronosyltransterasegen, das Dystrophingen (welches in der Lage ist, den in Muskeln von MD-Patienten ersichtlichen Defekt zu korrigieren), das Utrophingen, das CFTR-Gen (ist in der Lage, den in Mukoviszidose-Patienten sichtbaren Defekt zu korrigieren), die Gene, welche Enzyme codieren (insbesondere Enzyme, welche mit Enzym-defizienten Krankheiten oder Krankheiten assoziiert sind, für welche bekannt ist, dass sie durch Enzymdefekte verursacht werden) und Gene, welche Blutgerinnungsfaktoren, Angiogenesisfaktoren, Anti-Angiogenesisfaktoren, Tumorsuppressoren und Suizidgene, für welche das Herpes Thymidinkinasegen ein Beispiel ist, codieren. Gene von Interesse können sowohl endogen, als auch heterolog sein.
Der Begriff „Reportergen" weist auf eine Gensequenz hin, welche ein Reportermolekül (einschließlich ein Enzym) codiert. Ein „Reportermolekül" ist in irgendeinem beliebigen Detektionssystem nachweisbar, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Enzyme (z.B. ELISA, genauso wie enzymbasierte histochemische Assays, Fluoreszenz, radioaktive und lumineszente Systeme. In einer Ausführungsform betrachtet die vorliegende Erfindung das E. coli β-Galactosidasegen (erhältlich von Pharmacia Biotech, Pistacataway, NJ), das grün fluoreszierende Protein (GFP) (kommerziell erhältlich von Clontech, Palo Alto, CA) das humane plazentaralkalische Phosphatase-Gen und das Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)-Gen; andere Reportergene sind im Stand der Technik bekannt und können verwendet werden (z.B. um den Transfektionserfolg leicht nachzuverfolgen).
Die Begriffe „Nukleinsäuremolekül codierend", „DNA-Sequenz codierend" und „DNA codierend", wie hier verwendet, beziehen sich auf die Anordnung oder Sequenz von Desoxyribonukleotiden entlang eines Stranges einer Desoxyribonukleinsäure. Die Anordnung dieser Desoxyribonukleotide legt die Anordnung der Aminosäuren entlang der Polypeptid(Protein)-Kette fest. Die DNA-Sequenz codiert somit für die Aminosäuresequenz.
Der Begriff „Transkriptionsassay", wie hier verwendet, bezieht sich auf Assays, welche für den Nachweis des Niveaus der Expression, welche durch einen Enhancer und/oder Promotor bereitgestellt werden, verwendet werden können. Beispiele für geeignete Assays schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, dass Assay wie es in Beispiel 3 und 5 unten beschrieben wird. Der Fachmann des Standes der Technik erkennt, dass es eine breite Zahl an Transkriptionsassays gibt, welche für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Geeignete Assays schließen solche ein, welche den Nachweis und/oder den Vergleich von Genexpressionsprodukten (z.B. Reporterprodukte, mRNA, Prote in und ähnliches) von Expressionssystemen, die funktionell mit Enhancern und Promotoren verbunden sind, erlauben.
Der Begriff „Transkriptionsaktivität", wie hier verwendet, bezieht sich auf das gemessene Niveau der Transkriptionsaktivität, welches in der Lage ist, durch einen Enhancer und/oder eine Promotorregion angetrieben worden zu sein, beispielsweise das Messen des Niveaus eines Reportergenes (z.B. Betagalactosidase), das in einem Transkriptionsassay produziert wurde. Beispiele für Transkriptionsaktivitäten, die in einem Trankskriptionsassay nachgewiesen wurden, sind aus den Tabellen 1 und 2 unten ersichtlich.
Der Begriff „MCK-R Kontrollelemente", wie hier verwendet, bezieht sich auf solche Kontrollelemente (z.B. Enhancersequenzen), wie sie typischerweise in Muskelkreatinkinaseregulatorischen Sequenzen mit der Konsensussequenz AA-CAc/gc/gTGCa/t gefunden werden. Beispiele von MCK-R Kontrollelementen schließen die SEQ ID Nr.: 30–45 ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Der Begriff „Muskelzelle", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Zelle, die aus einem Muskelgewebe erhalten wurde, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Zellen aus Skelettmuskeln, glatten Muskeln (z.B. vom Verdauungstrakt, der Harnblase und den Blutgefäßen), und Herzmuskeln. Der Begriff schließt in vitro, ex vivo und in vivo Muskelzellen ein. So kann beispielsweise ein isolierter Cardiomyocyt eine Muskelzelle darstellen, als würde es eine Zelle sein, wie sie im Muskelgewebe in einem Objekt in vivo vorliegt. Dieser Begriff schließt ebenfalls sowohl terminal differenzierte als auch nicht differenzierte Muskelzellen ein, wie z.B. Myocyten, Myotuben, Myoblasten, Cardiomyocyten und Cardiomyoblasten.
Der Begriff „muskelspezifisch", wie hier verwendet, in Bezug auf ein regulatorisches Element (z.B. eine Enhancerregion, Promotorregion) bedeutet, dass die durch diese Regionen getriebene Transkriptionsaktivität hauptsächlich in Muskelzellen oder Gewebe (z.B. 20:1) vorliegt im Vergleich zu der Aktivität dieser regulatorischen Sequenzen in anderen Geweben. Ein Assay für die Feststellung der Muskelspezifizität einer regulatorischen Region ist in Beispiel 5 unten bereitgestellt (Messung von Beta-Galactosid in Muskelzellen und Leberzellen aus einer Maus, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurde).
Der Begriff „mutante muskelspezifische Enhancerregion", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Wildtypmuskelspezifische Enhancerregion, welche modifiziert wurde (z.B. Deletion, Insertion, Addition, Substitution) und insbesondere modifiziert wurde, um ein zusätzliches MCK-R Kontrollelement zu enthalten.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und bezieht sich auf muskelspezifische Regulatorelemente, Nukleinsäuren und Vektoren, welche muskelspezifische Regulatorelemente umfassen, und in vitro Methoden für die Expression heterologer Gensequenzen in Zellen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf mutante Muskelkreatinkinaseenhancer und muskelspezifische genetische Kassetten mit einer reduzierten Größe (im Vergleich zu Wildtypsequenzen) für die Expression heterologer Gensequenzen in Zellen. Die verbesserten muskelspezifischen Enhancerregionen (und Kassetten) können beispielsweise sowohl bei Anwendungen in der Gentherapie, als auch beim Arzneimittel-Screening oder in diagnostischen Anwendungen neben weiteren in vitro und in vivo Anwendungen verwendet werden.
I. Muskelkreatinkinasegen, regulatorische Regionen und Kontrollelemente
Kreatinkinase katalysiert die Regeneration von ATP aus Kreatinphosphat und stellt Energie für die Kontraktion in allen Muskeln des gestreiften Typs bereit. Das Muskelkreatinkinase(MCK)Gen ist in allen gestreiften Muskeln hochaktiv. MCK ist die am meisten vorliegende nicht-mitochondriale mRNA, welche in allen Skelettmuskelfasertypen exprimiert wird und ist ebenfalls hochaktiv in Herzmuskeln. Das MCK-Gen wird nicht in Myoblasten exprimiert, wird jedoch transkriptionell aktiviert, wenn die Myoblasten bei der terminalen Differenzierung in Myocyten übergehen. MCK genregulatorische Regionen zeigen gestreifte muskelspezifische Aktivität und wurden in vitro und in vivo charakterisiert. Die am meisten bekannten regulatorischen Regionen in dem Maus-MCK-Gen schließen einen 206 Basenpaar muskelspezifischen Enhancer ein, der etwa 1,1 kb 5' von dem Transkriptionsstartort bei der Maus (d.h. SEQ ID Nr.: 2) lokalisiert ist und einen 358 Basenpaar proximalen Promotor (d.h. SEQ ID Nr.: 12) ein [Shield, et al., Mol. Cell. Biol., 16:5058 (1996)].
Der 206 Basenpaarenhancer enthält eine Reihe von Sequenzmotiven, einschließlich zwei Klassen von E-Boxen (MCK-L und MCK-R), CarG und AT-reiche Sites. Ähnliche E-Boxensequenzen wurden in den Enhancern der humanen, Ratten- und Kaninchen MCK-Gene gefunden [siehe Trask, et al., Nucleic Acids Res., 20:2313 (1992)]. Für Mutationen des MCK-R Kontrollelementes wurde gezeigt, dass sie eine dramatische Verringerung der Transkriptionsaktivität eines Reportergenes verursachen. Für das MCK-R Kontrollelement ist bekannt, dass es durch verschiedene gewebespezifische Transkriptionsfaktoren (z.B. MRF4, myf5, MyoD und Myogenin) und andere universelle Faktoren (z.B. E12, E47 und E2-2) gebunden wird.
II. Mutante muskelspezifische Enhancerregionen
Die vorliegende Erfindung stellt mutante muskelspezifische Enhancerregionen bereit. In einigen Ausführungsformen wurden Mutanten durch die Insertion eines zusätzlichen MCK-R Kontrollelementes in eine Wildtypenhancersequenz, welche normalerweise nur ein MCK-R Kontrollelement enthält, konstruiert (so dass die resultierende Sequenz mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente hat). In einigen Ausführungsformen ersetzt das inserierte MCK-R Kontrollelement das endogene MCK-L Kontrollelement. In anderen Ausführungsformen sind zwei oder mehr MCK-R Kontrollelemente inseriert und das endogene MCK-R Kontrollelement ist entfernt. In einigen Ausführungsformen sind die beiden oder mehr MCK-R Kontrollelemente inseriert und sowohl die endogene MCK-R Sequenz, als auch das MCK-L Kontrollelement ist entfernt. Es ist nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung durch die Anzahl der Basen zwischen dem endogenen MCK-R Kontrollelement und dem inserierten MCK-R Kontrollelement (oder dem Abstand zwischen den beiden oder mehr inserierten MCK-R Kontrollelementes) beschränkt ist. Es ist bevorzugt, dass der Abstand zwischen den MCK-R Sequenzen weniger als 150, vorzugsweise weniger als 100, weiter bevorzugt weniger als 50, am meisten bevorzugt weniger als 20 (z.B. 17 Basen) beträgt.
In einigen Ausführungsformen wurden diese mutanten muskelspezifischen Enhancer aus Muskelkreatinkinaseenhancerregionen abgeleitet (z.B. der 206 Basenpaar-Mausenhancer, SEQ ID Nr.: 2). Der 206 Basenpaar-Mausenhancer (SEQ ID Nr.: 2) wurde durch den Ersatz der linken E-Box (MCK-L) durch eine rechte E-Box (MCK-R) modifiziert, um eine mutante muskelspezifische Enhancerregion der vorliegenden Erfindung (z.B. 2R Mausmutantenenhancerregionen) zu generieren. Die MCK-R Region, die verwendet wurde, um die linke E-Box zu ersetzen, ist eine Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nr.: 30–45 (siehe 16). Bevorzugte mutante muskelspezifische Enhancerregionen ersetzen die linke E-Box mit der SEQ ID Nr.: 31 (um die SEQ ID Nr.: 3 zu bilden). Eine ähnliche etwa 200 Basenpaarwildtypenhancerregion des Menschen (SEQ ID Nr.: 15) wurde durch den Ersatz der linken E-Box durch MCK-R modifiziert, um eine mutante muskelspezifische Enhancerregion (z.B. 2R humane Enhancerregionen) zu generieren. Das MCK-R Kontrollelement, welches verwendet wurde, um die linke E-Box zu ersetzen, ist eine Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nr.: 30–45 (siehe 16). Bevorzugte mutante muskelspezifische Enhancerregionen ersetzen die linke E-Box mit SEQ ID Nr.: 31 (um die SEQ ID Nr.: 16 zu bilden). Eine weitere ähnliche etwa 200 Basenpaarwildtypenhancerregion in Ratten (SEQ ID Nr.: 23) kann durch den Ersatz der linken E-Box durch eine MCK-R modifiziert werden, um eine mutante muskelspezifische Enhancerregion (z.B. 2R mutante Rattenenhancerregionen) zu generieren. Die MCK-R Region, die verwendet wird, um die linke E-Box zu ersetzen, ist beispielsweise eine Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nr.: 30–45 (siehe 16). Bevorzugte mutante muskelspezifische Enhancerregionen ersetzen die linke E-Box mit SEQ ID Nr.: 31 (um SEQ ID Nr.: 24 zu bilden).
Eine weitere Modifikation, welche durchgeführt werden kann, um mutante muskelspezifische Enhancerregionen der vorliegenden Erfindung zu generieren, ist die Insertion der S5 Sequenz (SEQ ID Nr.: 46) in eine Wildtyp-Maus-, humane- oder Ratten-Enhancersequenz (SEQ ID Nr.: 2, SEQ ID Nr.: 15 und SEQ ID Nr.: 23) wie in 8b gezeigt. Die Durchführung solcher Modifikationen generiert S5 mutante maus-, menschen- und rattenmuskel-spezifische Enhancerregionen (z.B. SEQ ID Nr.: 4, SEQ ID Nr.: 17 und SEQ ID Nr.: 25).
Eine bevorzugte Modifikation der Wildtyp-Maus-, Menschen- und Ratten-Enhancersequenzen (SEQ ID Nr.: 2, 15 und 23) besteht darin, die linke E-Box durch MCK-R Kontrollelemente zu ersetzen und die S5 Sequenz (SEQ ID Nr.: 46) zu inserieren wie in 8b gezeigt. Nochmals ist das verwendete MCK-R Kontrollelement ausgewählt aus SEQ ID Nr.: 30–45. Beispiele von mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen mit beiden Modifikationen (d.h. 2RS5 muskelspezifischen Enhancerregionen) schließen die SEQ ID Nr.: 5 (Maus), SEQ ID Nr.: 18 (Mensch) und SEQ ID Nr.: 26 (Ratte) ein.
Alle mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen der vorliegenden Erfindung können weitere zu den hinzugefügten Sequenzen oder entfernten Sequenzen aufweisen. Beispielsweise können die mutanten muskelspezifischen Enhancer zusätzlich Sequenzen aufweisen, die natürlicher Teil eines Muskelkreatinkinasegens sind, welche die Enhancerregionen flankieren (siehe 1, SEQ ID Nr.: 1, welches Nukleotide vor und nach der Lokalisierung der Wildtyp 206 Basenpaarenhancerregion (von 2094 bis 2300 in SEQ ID Nr.: 1) zeigt). Die mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen können ebenfalls ein Teil der entfernten Sequenz (z.B. die 3' 41 Basenpaare) haben. Beispiele für solche mutanten verkürzten 2RS5 Sequenzen (z.B. SEQ ID Nr.: 5, 18 und 26) mit entfernten 3' 41 Basenpaaren, die mutierte verkürzte 2RS5 muskelspezifische Enhancerregionen (z.B. SEQ ID Nr.: 6, 19 und 27) generieren, werden bereitgestellt.
Jegliche der oben beschriebenen wildtyp- oder mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen können weiter modifiziert werden, um zusätzliche Mutanten zu produzieren. Diese zusätzlichen Mutanten schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, muskelspezifische Enhancerregionen mit Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verschiedener Nukleotide oder Nukleotidana loge, solange wie die Transkriptionsaktivität der Enhancerregion aufrechterhalten bleibt. Eine Anleitung dafür, welche und wie viele Nukleotidbasen substituiert werden können, inseriert oder deletiert werden können, ohne, dass die Transkriptionsaktivität aufgehoben wird, kann unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Computerprogrammen herausgefunden werden, beispielsweise der DNAStar Software oder GCG (Univ. of Wisconsin) oder kann empirisch unter Verwendung der durch vorliegende Erfindung bereitgestellten Assays ermittelt werden.
Ob eine Änderung in der Nukleinsäuresequenz (z.B. eine Substitution, Addition, Deletion) einer muskelspezifischen Enhancerregion zu einer nützlichen mutanten muskelspezifischen Enhancerregion (z.B. für das Antreiben der Transkription eines heterologen Genes) führt, kann leicht festgestellt werden. Eine Methode schließt die Insertion der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion in ein adenovirales Konstrukt (z.B. AdCK6lacZ, Ersetzen der SEQ ID Nr.: 5 mit beispielsweise einer Variation von SEQ ID Nr.: 5) und die Messung der Menge der Transkription, die sich in vivo oder in vitro ergibt mittels den Nachweis der Expression der Beta-Galactosid-Produktion (siehe Beispiel 5 unten), ein. Eine ähnliche Technik, um Varianten zu finden/zu testen, besteht darin, die Kandidatensequenz in eine genetische Kassette zu inserieren (z.B. CK6, CK4 oder CK5 anstelle der bereits vorhandenen Enhancersequenz) und diese in ein Shuttle-Plasmid (z.B. pAdBg1II) zu inserieren. Dieses Plasmidkonstrukt kann dann in eine Zellkultur in vitro transfiziert werden und das Niveau der Transkriptionsaktivität durch den Nachweis des Reportergenes (Beta-Galactosidase, siehe Beispiel 3) überwacht werden.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen, die in den SEQ ID Nr.: 3–6, 16–19 und 24–27 gelistet sind, beschränkt, sondern schließt insbesondere Nukleinsäuresequenzen ein, welche in der Lage sind, mit den mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen SEQ ID Nr.: 3–6, 16–19 und 24–27 und Teilen davon zu hybridisieren (z.B. in der Lage sind unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren). Dem Fachmann des Standes der Technik ist bekannt, dass verschiedene Hybridisationsstärken gewünscht sein können. Bei spielsweise, wenn höhere Stringenzen bevorzugt sind, um die nicht-spezifische Bindung zwischen den mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen der SEQ ID Nr.: 3–6, 16–19 und 24–27 und anderen Nukleinsäuersequenzen zu eliminieren oder zu reduzieren, geringe Stringenzen können bevorzugt sein, um eine große Anzahl von Nukleinsäuresequenzen zu detektieren, welche verschiedene Homologien zu den Nukleotidsequenzen von SEQ ID Nr.: 3–6, 16–19 und 24–27 haben.
III. Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrachtet die Verwendung von Expressionsvektoren mit den Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung. Vektoren, die geeignet für die Verwendung in den Methoden und mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind, sollten beispielsweise in der Lage sein, die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Kassetten entsprechend zu verpacken und zu tragen. Eine Anzahl von geeigneten Vektoren sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden: 1) Adenovirale Vektoren; 2) Adenovirale Vektoren der zweiten Generation; 3) Guttierte adenovirale Vektoren; 4) Adeno-assoziierte Virusvektoren; 5) Lentivirale Vektoren.
Der Fachmann des Standes der Technik erkennt und erkennt an, dass andere Vektoren für die Verwendung mit den Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind. In der Tat ist die vorliegende Erfindung nicht vorgesehen auf die Verwendung der genannten Vektoren als solche beschränkt zu sein, alternative Mittel für die Auslieferung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung werden in Betracht gezogen. In verschiedenen Ausführungsformen sind beispielsweise die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit Retrovirusvektoren und Herpesvirusvektoren, Plasmiden, Cosmiden, künstlichen Hefechromosomen, mechanischen, elektrischen und chemikalischen Transfektionsmethoden und ähnlichem assoziiert. Beispielhafte Verabreichungsherangehensweisen werden weiter unten diskutiert.
1. Adenovirale Vektoren
Selbstfortpflanzende Adenoviren(Ad)-Vektoren wurden im großen Maßstab für die Verabreichung fremder Gene an eine Vielzahl von Zelltypen in vitro und in vivo verwendet. „Selbstfortpflanzende Viren" sind solche, welche durch Transfektion eines einzelnen DNA Stücks (das rekombinante virale Genom) in eine einzelne Verpackungszelllinie zur Herstellung infektiöser Viren produziert werden kann; selbstfortpflanzende Viren erfordern nicht die Verwendung von einem Helfervirus für die Fortpflanzung. Wie bei vielen Vektoren haben auch die adenoviralen Vektoren Beschränkungen in Bezug auf die Größe der heterologen Nukleinsäure, die sie an die Zellen verabreichen können. Beispielsweise beträgt die Kapazität des Adenovirus etwa 8–10 kb, die Kapazität eines Adeno-assoziierten Virus ist etwa 4,8 kb und die Kapazität des Lentivirus ist etwa 8,9 kb. Somit stellen die Mutanten der vorliegenden Erfindung kürzere regulatorische Sequenzen (z.B. kürzer als Wildtypsequenzen) bereit, was die Trägerkapazität solcher Vektoren verbessert.
2. Adenovirale Vektoren der zweiten Generation
Um den mit den Ad Vektoren der ersten Generation in Zusammenhang stehenden viralen Replikationsproblemen Rechnung zu tragen, wurden Ad Vektoren der sogenannten „zweiten Generation" entwickelt. Ad Vektoren der zweiten Generation entfernen die frühen Regionen des Ad Genoms (E2A, E2B und E4). Stark modifizierte Ad Vektoren der zweiten Generation generieren mit geringerer Wahrscheinlichkeit replikationskompetente Viren während der Vektorherstellung im großen Maßstab und der vollständige Stillstand der Ad Genomreplikation sollte die späte Genreplikation aufheben. Die Immunantwort des Wirtes gegen die späten Viralproteine wird somit reduziert [siehe Amalfitano et al., „Production and Characterization of Improved Adenovirus Vectors With the E1, E2b, and E3 Genes Deleted," J. Virol. 72:926–933 (1998)]. Die Eliminierung von E2A, E2B und E4 Genen aus dem Ad Genom stellt ebenfalls eine größere Klonierungskapazität bereit. Die Entfernung von zwei oder mehr dieser Gene aus dem Ad Genom erlaubt beispielsweise die Verabreichung von Volllängen oder cDNA Dystrophingenen mittels Ad Vektoren [Kumar-Singh et al, Hum. Mol. Genet., 5:913, (1996)].
3. Guttierte adenovirale Vektoren
„Guttierte" oder helferabhängige Ad Vektoren enthalten cis-wirkende DNA Sequenzen, welche die adenovirale Replikation und Verpackung antreiben, die aber keine viralen codierenden Sequenzen enthalten [siehe Fisher et al. „Recombinant Adenovirus Deleted of All Viral Genes for Gene Therapy of Cystic Fibrosis," Virology 217:11–22 (1996) und Kochanek et al. "A New Adenoviral Vector: Replacement of All Viral Coding Sequences With 28 kb of DNA Independently Expressing Both Full-length Dystrophin and Beta-galactosidase" Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:5731–5736 (1996)]. Guttierte Vektoren sind defekte Viren, die mittels Replikation in Anwesenheit eines Helfervirus, welcher alle notwendigen viralen Proteine in trans bereitstellt, hergestellt werden. Da guttierte Vektoren keinerlei virale Gene enthalten, ist eine Expression viraler Proteine nicht möglich.
Die Entwicklungen der letzten Zeit haben das Gebiet der guttierten Vektorproduktion vorangebracht [siehe Hardy et al., „Construction of Adenovirus Vectors Through Cre-Iox Recombination," J. Virol. 71:1842–1849 (1997) und Hartigan-O'Conner et al., „Improved Production of Gutted Adenovirus in Cells Expressing Adenovirus Preterminal Protein and DNA Polymerase," J. Virol. 73:7835–7841 (1999)]. Guttierte Ad Vektoren sind in der Lage, maximal bis zu etwa 37 kb exogener DNA aufzunehmen, jedoch sind 28–30 kb eher typisch. Beispielsweise kann ein guttierter Ad Vektor das Volllängendystrophin oder die cDNA aufnehmen, jedoch ebenfalls Expressionskassetten oder Modulatorproteine.
4. Adeno-assoziierte Virusvektoren
Adeno-assoziierte Virusvektoren (AAV) sind defekte Viren, welche lediglich in Anwesenheit von Ad replizieren. Es ist bekannt, dass Helfervirusgene scheinbar die Synthese von zellulären Proteinen, die in die AAV-Replikation involviert sind, maximieren.
AAV Vektoren vermeiden die Immunantwort eines Wirtes und erreichen eine durchgehende Genexpression, in dem sie die Antigenpräsentation der professionellen APCs, wie dendritischen Zel len, des Wirtes vermeiden. Die meisten AAV Genome in Muskelgewebe liegen in der Form großer kreisförmiger Multimere vor. AAV's sind jedoch lediglich in der Lage, etwa 5 kb exogene DNA zu tragen.
5. Lentivirale Vektoren
Vektoren, die auf Lentiviren vom Menschen oder der Katze basieren, haben einen weiteren Vektor entstehen lassen, der für gentherapeutische Anwendungen nützlich ist. Auf dem Lentivirus basierende Vektoren infizieren sich nicht teilende Zellen als Teil ihres normalen Lebenszykluses und werden durch Expression eines verpackungsfähigen Vektorkonstruktes in einer Zelllinie, welche virale Proteine exprimiert, hergestellt. Die kleine Größe der lentiviralen Partikel beschränkt die Menge an exogener DNA, die sie in der Lage sind zu tragen, auf etwa 10 kb.
6. Retroviren
Vektoren, die auf dem Moloney Mäuseleukämievirus (MMLV) und anderen Retroviren basieren, haben sich als nützlich für die gentherapeutischen Anwendungen herausgestellt. Diese Vektoren modifizieren die sich aktiv teilenden Zellen stabil als Teil ihres normalen Lebenszykluses und integrieren in Wirtszellenchromosomen. Die Retroviren können mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden (z.B. in der Gentherapie), beispielsweise im Kontext der Infektion und Transduktion von Muskelvorgängerzellen wie Myoblasten, Satellitenzellen oder anderen Muskelstammzellen.
Die DNA Konstrukte der vorliegenden Erfindung können mittels einer Vielzahl an gut bekannten Methoden konstruiert werden und die Ligationsordnung der Teile kann variieren. Die DNA Konstrukte können durch separate Ligation der mutanten muskelspezifischen Enhancerregion, Promotorregion und heterologen DNA Sequenz in jeglichen gewünschten Vektor zur Verabreichung an Zellen (z.B. Gentherapie) hergestellt werden, oder es kann ein Zwischenvektor verwendet werden bei der Konstruktion des Vektors, der für die Verabreichung an die Zellen verwendet wird. Die verschiedenen Komponenten (z.B. mutante MCK muskelspezifische En hancerregionen, Promotorregionen, heterologe DNA Sequenz, Introns etc.) können bereits ligiert sein, um eine genetische Kassette (siehe oben) zu bilden, welche in jeglichen gewünschten Vektor inseriert werden kann (solange wie der Vektor die erforderliche Kapazität hat).
IV. Heterologe DNA Sequenzen
Die vorliegende Erfindung betrachtet die Verwendungen von mutanten MCK Enhancern und genetischen Kassetten (welche die mutanten Enhacer einschließen), um die Expression verschiedener therapeutischer Nukleinsäuresequenzen (z.B. heterologe Gene), die für das Empfängerobjekt nützlich sind, anzutreiben. Geeignete therapeutische Nukleinsäuresequenzen für die vorliegende Erfindung schließen jegliche Nukleinsäuresequenzen ein, deren Expression in der Lage ist, durch mutante MCK Enhacer und genetische Kassetten, wie oben beschrieben, angetrieben zu werden. Beispielsweise Nukleinsäuresequenzen, welche ein Protein codieren, welches defekt ist oder in einem Empfängerobjekt fehlt, oder ein heterologes Gen, welches ein Protein codiert, welches einen gewünschten biologischen oder therapeutischen Effekt (z.B. eine antibakterielle, antivirale oder antitumor Funktion) hat. Andere geeignete therapeutische Nukleinsäuren schließen solche ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, welche Proteine codieren, die für die Behandlung von endokrinen, metaloischen, hematologischen, cardiovasculären, neurologischen, skelettmuskulären, urologischen, pulmonalen, und Immunkrankheiten verwendet werden, einschließlich solcher Krankheiten wie Entzündungskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, chronische und infektiöse Krankheiten wie AIDS, Krebs, Hypercholestemie, Insulinkrankheiten wie Diabetes, Wachstumskrankheiten, verschiedene Blutkrankheiten einschließlich verschiedener Enemien, Thalassemiien und Hämophilie; genetische Defekte wie beispielsweise zystische Fibrose, Gaucher's Krankheit, Hurler's Krankheit, Adenosin Deaminase (ADA) Defizienz und Emphysema.
In einigen Ausführungsformen codiert die therapeutische oder diagnostische Nukleinsäuresequenz für ein Antigenprotein. Das Antigen kann ein natives Protein oder Proteinfragment, oder ein synthetisches Protein oder Proteinfragment oder Peptid ein schließen. Beispiele für Antigene sind solche, ohne darauf beschränkt zu sein, die in der Lage sind, eine Immunantwort gegen virale oder bakterielle Hepatitis, Influenza, Diphtherie, Tetanus, Keuchhusten, Masern, Mumps, Röteln, Polio, Pneumococcus, Herpes, Atemwegs-Syncytial-Virus, Hemophilusinfluenza des Typs b, Chlamydien, Windpockenvirus oder Tollwut hervorzurufen. Die Nukleinsäuresequenz kann ebenfalls ein normales Muskelgen sein, welches bei einer muskulären Krankheit (z.B. muskuläre Dystrophein wie muskuläre Duchenne muskuläre Dystrophie, Gliedmaßen-Hüft-muskuläre Dystrophie, Landouzy-Dejerine-muskuläre Dystrophie, Becker's muskuläre Dystrophie, Augenmyopathie und myotonische muskuläre Dystrophie) betroffen ist. Bei solchen muskulären Dystrophien kann die Nukleinsäure ein heterologes Gen sein, welches das Volllängendystrophingen (oder die cDNA Sequenz), das BMD-Minigen, das ΔH2-R19-Minigen, Laminin-α2, Utrophin, α-Sarcoglycan und Emerin codiert. BMD-Minigen bezieht sich auf Dystrophin cDNAs, welche im Inneren Verkürzungen aufweisen, die spezifischen Exons des Genes entsprechen, insbesondere eine Deletion der Sequenzen, die durch die Exons 17–48 codiert werden [Amalfitano et al., in Lucy J, and Brown S. (eds): Dystrophin, Gene, Protein, and Cell Biology (Cambridge University Press, 1997), Kapitel 1, 1–26]. ΔH2-R19 bezieht sich auf eine spezifische Dystrophin cDNA, welche im Inneren Deletionen enthält, die spezifischen funktionalen Domänen des Gens entsprechen, insbesondere eine Deletion der Sequenzen, die für das "Gelenk 2" bis einschließlich der „Spectrin-ähnlichen Wiederholung" 19 codieren [siehe Amalfitano et al.].
Nukleinsäuresequenzen können ebenfalls Antisense-Moleküle (z.B. für die Blockierung der Expression eines abnormalen Muskelgenes) sein. Die Nukleinsäuresequenz kann ebenfalls für Proteine codieren, die in der Blutbahn oder im lymphatischen System bei Säugern zirkulieren. Beispiele für zirkulierende Proteine schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, Insulin, Peptidhormone, Hemoglobin, Wachstumsfaktoren, Leberenzyme, Gerinnungsfaktoren und Enzyme, Ergänzungsfaktoren, Cytokine, Gewebenecrosisfaktoren und Erythropoetin. Heterologe Gene können ebenfalls Gene einschließen, die für Proteine codieren, die in Muskelzellen in vitro oder in vivo produziert werden (z.B. kom merziell produziert werden). Die verbesserten Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung können beispielsweise in bereits existierenden, funktionierenden Muskelexpressionssystemen verwendet werden, um das Niveau der Proteinproduktexpression von einem Gen von Interesse zu verbessern. Die vorliegende Erfindung betrachtet die Verwendung jeglicher Gene von Interesse (heterologer oder endogener).
V. Arzneimittel-Screening unter Verwendung mutanter muskelspezifischer Enhancerregionen
Die mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen der vorliegenden Erfindung können in Arzneimittel-Screens verwendet werden. In einer Screening-Methode wird ein Expressionsvektor, der eine mutante muskelspezifische Enhancerregion umfasst, die funktionell mit einem heterologen Gen verbunden ist, welches einen Faktor (z.B. ein Enzym, ein Protein, ein Antisensemolekül) mit einer bekannten Funktion (z.B. Alkoholdehydrogenase) codiert, in vitro mit einer Gewebekulturprobe (z.B. eine muskelzellenenthaltende Gewebekultur) in Kontakt gebracht, so dass das heterologe Gen exprimiert wird. Eine Kandidatenverbindung wird zusammen mit einem Substrat für die Enzyme (z.B. Ethanol) hinzugefügt und ein paralleler Assay ohne die Kandidatenverbindung wird durchgeführt und das Niveau der Enzymaktivität wird detektiert (z.B. die Menge an Substrat, welches über den Zeitraum verbleibt). Die Ergebnisse beider Assays werden miteinander verglichen, um die Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Aktivität des Enzyms festzustellen. In einigen Ausführungsformen wird die verbesserte Expression, die durch die mutanten regulatorischen Regionen der vorliegenden Erfindung bereit gestellt werden, einfach verwendet, um ein sensitiveres Assay für die Feststellung der Wirkung einer Kandidatenverbindung (z.B. eines Arzneimittels) auf die biologische Aktivität eines Faktors, der durch ein Gen codiert wird, welches funktionell mit den regulatorischen Sequenzen verbunden ist, festzustellen. In anderen Ausführungsformen kann die Kandidatenverbindung einen Faktor aufweisen, von dem erwartet wird, dass er die Genexpression des heterologen Genes verändert und der Assay detektiert den Grad und/oder die Fähigkeit der Kandidatenverbindung die Aktivität des exprimierten Faktors zu reduzieren. Solche Assays können ebenfalls in vivo verwendet werden, wobei eine Zelle oder ein Gewebe, welches das Gen von Interesse exprimiert, das funktionell mit den regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung verbunden ist, einer Kandidatenverbindung ausgesetzt ist (z.B. eine Kandidatenverbindung, die in die Blutbahn injiziert wird oder in Muskelgewebe injiziert wird).
In einer weiteren Screening-Methode werden die Kandidatenverbindungen auf die Fähigkeit untersucht, die Aktivität der mutanten muskelspezifischen Enhancerregionen zu behindern. Beispielsweise ist ein Expressionsvektor, der eine mutante muskelspezifische Enhancerregion aufweist, funktionell mit einem Reportergen (z.B. Betagalactosidase) verbunden und wird in vitro mit einer Gewebekulturprobe in Anwesenheit der Kandidatenverbindungen (z.B. Arzneimittel, Transkriptionsfaktor-Lockmittel-Oligonukleotide, Transkriptionsfaktor-Bindungspartner, Kandidatenkinase- oder Phosphatase-regulatorische Moleküle und ähnliches) in Kontakt gebracht. Parallel dazu wird ein Kontrollassay ohne die Kandidatenverbindungen durchgeführt. Das Niveau des Reportergenes wird dann in beiden Proben gemessen (siehe Beispiel 3 unten) und die Ergebnisse miteinander verglichen, um die Wirkung der Kandidatenverbindung festzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrachtet viele andere Mittel von Screening-Verbindungen. Die oben bereit gestellten Beispiele werden lediglich zur Illustrierung verschiedener zur Verfügung stehenden Techniken präsentiert. Der Fachmann des Standes der Technik weiß, dass viele andere Screening-Methoden verwendet werden können.
VII. Verabreichung der Gene
Die Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf eine solche Weise, dass ein heterologes Gen exprimiert wird, kann auf vielen verschiedenen Wegen erfolgen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (z.B. genetische Kassetten, virale Konstrukte) können in Säugerzellen in vitro durch eine Vielzahl an physikalischen Methoden, einschließlich der Transfektion, der direkten Mikroinjektion, der Elektroporation und der co-Prezipitation mit Kalziumphosphat eingeführt werden. Während diese für die Transfektion von Zellen in Kulturen zufrieden stellend sind, sind die meisten dieser Techniken jedoch nicht praktikabel für die Verabreichung von Genen in Zellen unversehrter Tiere. Die vorliegende Erfindung betrachtet virale Vektoren, genauso wie nicht virale Vektoren, welche die Nukleinsäurezusammensetzung von Anspruch 1 umfassen.
EXPERIMENTELLER TEIL
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der Erfindung zu demonstrieren und des Weiteren zu illustrieren und sind nicht so auszulegen, dass sie den Schutzbereich der Erfindung limitieren.
In der nachfolgenden experimentellen Offenbarung werden die folgenden Abkürzungen verwendet: N (normal); M (molar); mM (Millimolar); μM (Mikromolar); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); pmol (Pikomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm); 1 oder L (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); und Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
BEISPIEL 1
Herstellung von mutanten Maus-MCK-Enhancern
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von verschiedenen mutanten Maus-MCK-Enhancern. 8b zeigt den 206 Basenpaarwildtyp-MCK-stromaufwärts-Enhancer mit den unterstrichenen Proteinbindungssites. Diese 206 Basenpaarwildtypsequenz ist ebenfalls in 2 als SEQ ID Nr.: 2 (Wildtypmausenhancer) dargestellt. Diese Wildtypsequenz wurde mutiert, wie schematisch in 8b dargestellt, um den 2RS5 mutanten Enhancer zu kreieren. Insbesondere wurde die Wildtypenhancersequenz (SEQ ID Nr.: 2) durch Ersatz der linken E-Box mit einer zusätzlichen rechten E-Box mutiert (d.h. die 2R-Mutation, siehe 8b). Die Sequenz wurde weiter durch Hinzufügung der S5 Sequenzinsertion, gezeigt in 8b, mutiert. Diese beiden Mutationen kreierten zusammen die 2R5S mutante Enhancersequenz, die in 2 als SEQ ID Nr.: 5 gezeigt ist. Diese 2R5S mutante Sequenz wurde weiter mutiert, in dem die am meisten 3' 41 Basenpaare entfernt wurden (markieren die „CK5-Deletion" in 8b). Die Sequenz dieser verkürzten 2R5S Mausenhancermutante ist in 2 als SEQ ID Nr.: 6 gezeigt. Es können standardmolekularbiologische Klonierungstechniken verwendet werden. Alternativ können solche Konstrukte im Ganzen synthetisch hergestellt werden.
BEISPIEL 2
Herstellung von MCK genetischen Kassetten
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung verschiedener MCK genetischer Kassetten. Zunächst wurde die Sequenz eines genomischen Fragmentes der Mausmuskelkreatinkinase (MCK) regulatorischen Region festgelegt, die sich von –3350 bis +7 Basenpaare in Bezug auf den Transkriptionsstartort erstreckt. Diese Sequenz wird als SEQ ID Nr.: 1 (siehe 1) bezeichnet und wurde bei der GenBank unter der Zugangs Nr. AF188002 eingereicht. Die entsprechende Restriktionskarte für diese Sequenz ist in 8a gezeigt.
Diese vollständige 3357 Basenpaarsequenz (SEQ ID Nr.: 1) wurde für die Herstellung der CK3 genetischen Kassette verwendet. Die CK3 genetische Kassette schließt die SEQ ID Nr.: 1 ein, die an eine Minx-Intronsequenz (SEQ ID Nr.: 47), nukleares Ziel-Beta-GAL und eine SV40-Polyadenylisierungssequenz ligiert ist (wie in 9a dargestellt). Die CK2 genetische Kassette ist zu der CK3 identisch, mit der Ausnahme, dass sie nur die Region –1256 bis +7 (SEQ ID Nr.: 10) einschließt, die mit dem Minx-Intron, dem nuklearen Ziel-Beta-GAL und dem SV40-Polyadenylisierungssignal ligiert sind (wie in 9a dargestellt). Die CK5 genetische Kassette wurde hergestellt durch Ligierung der verkürzten 2R52 mutanten MCK Enhancersequenz (SEQ ID Nr.: 6) an die Promotorsequenz, die sich von –944 bis +7 (SEQ ID Nr.: 11) erstreckt und die CK5 Sequenz (SEQ ID Nr.: 9) bildet, die mit der Minx-Sequenz (SEQ ID Nr.: 47), dem nuklearen Ziel-Beta-GAL und einem SV40-Polyadenylisierungssignal ligiert wurde (wie in 9a gezeigt). Die CK6 genetische Kassette wurde hergestellt durch Ligierung der 2R52 mutanten MCK Enhancersequenz (SEQ ID Nr.: 5) an die Promotorsequenz, die sich von –358 bis +7 (SEQ ID Nr.: 12) erstreckt und die CK6 Sequenz (SEQ ID Nr.: 8) bildet, die an die Minx-Sequenz (SEQ ID Nr.: 47) das nukleare Ziel-Beta-GAL und ein SV40-Polyadenylisierungssignal ligiert wurde (wie in 9a gezeigt). Die CK4 genetische Kassette wurde hergestellt durch Ligierung der 2R52 mutanten MCK Enhancersequenz (SEQ ID Nr.: 5) an die Promotorsequenz, die sich von –80 bis +7 (SEQ ID Nr.: 13) erstreckt und die CK4 Sequenz (SEQ ID Nr.: 7) bildet, die mit der Minx-Sequenz (SEQ ID Nr.: 47), dem nuklearen Ziel-Beta-GAL und einem SV40-Polyadenylisierungssignal ligiert wurde (wie in 9a gezeigt). Das CMV genetische Konstrukt ist der CMV-Promotor (–525 bis +1 in Bezug auf den Transkriptionsstartort). Dieser CMV-Promotor wurde an ein Minx-Intron (SEQ ID Nr.: 47), ein nukleares Ziel-Beta-GAL und ein Polyadenylisierungssignal ligiert (wie in 9a gezeigt).
BEISPIEL 3
In vitro Aktivität von MCKlacZ genetischen Kassetten
Dieses Beispiel beschreibt die in vitro Aktivität der verschiedenen oben hergestellten MCKlacZ genetischen Kassetten. Jede dieser genetischen Kassetten (CK3, CK2, CK5, CK6, CK4 und CMV) wurden in das Plasmid pBluescript II (Stratagene, siehe 14a) oder das adenovirale Shuttle-Plasmid pAdBg1II (siehe 17) inseriert und ihnen erlaubt, MM14 myogene Zellen zu transfizieren. Es wurde der adenovirale Vektor pAdBg1II verwendet, zusätzlich zu pBlueScritpt II, so dass die genetischen Kassetten durch dieselben Sequenzen flankiert wurden, die in einem rekombinanten Adenovirus vorliegen würden (0–1 adenovirale Karteneinheiten stromaufwärts und 9–16 Karteneinheiten stromabwärts), da beschrieben wurde, dass dort eine cis-wirkende Suppression der MCK Aktivität durch virale Sequenzen, die die E1 Region in Adenoviren der ersten Generation flankieren, vorliegt.
Das Plasmid pAdBg1II wurde wie folgt hergestellt. Das Plasmid pEHX-L3 wurde mit EcoRI und BgIII verdaut und ein 5,2 kb Fragment isoliert, welches die adenovirale Sequenz von 9 bis 16 m.u. und das Plasmidrückgrad (abgeleitet von pAT153) enthält.
Die adenovirale Sequenz von 0 bis 1 m.u. wurde von dem ursprünglichen pEXH-L3 unter Verwendung der PCR amplifiziert, um an dem Nhel Ort unmittelbar stromabwärts von dem EcoRl Ort und einem Bg1II Ort an dem 3'-Ende zu inserieren. Dieses PCR Fragment und das EcoR1/Bg1 II 5,2 kb Fragment wurden ligiert, um das Plasmid pAdBg1II herzustellen.

Um die MM14 myogenen Zellen zu kultivieren, wurden sich aktiv teilende Zellen alle 12 Stunden mit Ham's F10-Medium, angereichert mit 0,141 g/Liter Kalziumchloriddihydrat, 15% Pferdeserum und 2 ng/ml humanen rekombinanten basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), genährt. Zellen mit einer Dichte von 3–5 × 10⁵ pro 100-mm Schale wurden mit 8 μg des zu testenden Plasmids zusammen mit 2 μg eines Placentar-alkalisch-Phosphatase-Referenzplasmids pSV2APAP mittels Kalziumphosphatprezipitation transfiziert. Durch Entzug von FGF und Reduktion des Serums auf 1,5% wurden die Zellen zur Differenzierung induziert und 30 Stunden später in tris-gepufferter Saline, enthaltend 0,5% Triton X-100, lysiert. Die Extrakte wurden auf β-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung des Fluoreszenzsubstrates 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosid in Verbindung mit dem Hoeffer TKO-Fluorometer untersucht. Die Extrakte wurden ebenfalls auf Placentar-alkalische Phosphatase untersucht, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren. Die Ergebnisse dieses Assays sind in Tabelle 1 dargestellt. Mit Blick auf die genetischen Kassetten, die in beiden Plasmiden (CK3, CK6 und CK4) untersucht wurden, weisen die Ergebnisse darauf hin, dass das produzierte Niveau an Beta-Galactosidase Aktivität sich in den beiden Plasmidkonstrukten nicht signifikant unterschied (d.h. keine Suppression durch die flankierenden viralen Sequenzen in pAdBg1II). TABELLE 1

In vitro Aktivität der MCKlacZ genetischen Kassetten
Genetische Kassette	pBlueScript II	pAdBg III
CK 3	1,4 ± 0,3	1,4 ± 0,3
CK 2	1,5 ± 0,4	Nicht untersucht
CK 5	1,4 ± 0,4	Nicht untersucht
CK 6	7,9 ± 4,0	Nicht untersucht
CK 4	3,2 ± 0,9	2,7 ± 0,6
CMV	= 100	61 ± 21

BEISPIEL 4
Herstellung von AdCK5lacZ, AdCK6lacZ, AdCMVlacZ, und H5.010CBlacZ
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von AdCK5lacZ, AdCK6lacZ, AdCMVlacZ und H5.010CBlacZ. Die rekombinanten MCK Adenoviren AdCK5lacZ und AdCK6lacZ wurden unter Verwendung der cre-lox-Methode hergestellt. In Kürze zusammengefasst, die genetischen Kassetten CK5 und CK6 (oben beschrieben) wurden zwischen die SacII und ClaI Orte des Shuttle-Vektors pAdlox (siehe 14b) und zusammen mit dem rekombinanten Adenovirus ψ8 kloniert. Das sich daraus ergebende Plasmid wurde in 293-Zellen transfiziert, die Cre-Rekombinase produzieren. Nachdem das gewünschte Konstrukt durch cre-vermittelte Rekombination generiert wurde, wurden die isolierten Klone identifiziert mittels Plaque-Reinigung und Southern-Analyse. Bei den rekombinanten Viren ersetzen die Transgene die E1 Sequenzen von den Nukleotiden 359–3328 und die E3 Sequenzen wurden von den Nukleotiden 28133–30818 entfernt. AdCMVlacZ wurde hergestellt durch Insertion der CMV genetischen Kassette aus 9a in den BglII-Ort von pAdBglII (siehe 17). Dieses Plasmid wurde dann in 293-Zellen mit d17001 cotransfiziert und die Rekombinanten wurden Plaque-gereinigt. H5.010CBlacZ ist ein Adenovirustyp 5 Vektor mit einer Deletion in der E1 Region (1 bis 9 Karteneinheiten) und einer E3 Deletion. Es wurde in dem sub360-Rückgrad durchgeführt (siehe 15). Die genetische Kassette besteht aus einem CMV Enhancer, der an ein Hühner-Beta-Actinpromotor, verbunden mit einem Kernziel-Beta-GAL-Gen, gefolgt von einem SV40-Polyadenylisierungssignal, gebunden ist. Die Orientierung der genetischen Kassette ist eine solche, dass der CMV Enhancer dicht an dem linken ITR des adenoviralen Rückgrades lokalisiert ist, mit dem SV40-Poly-A-Ort, der ganz dicht am rechten ITR lokalisiert ist.
BEISPIEL 5
In vivo Aktivität von MCKlacZ genetischen Kassetten
Dieses Beispiel beschreibt die in vivo Aktivität der MCKlacZ genetischen Kassetten. Insbesondere wurden pAdBg1 II Plasmide mit verschiedenen genetischen Kassetten (CK3, CK5, CK6, CK4 und CMV) und adenovirale Vektoren (AdCK5lacZ, AdCK6lacZ und H5.010CBlacZ) in C57B1/10mdx-Mäuse injiziert.
Sechs Wochen alte C57B1/10mdx-Mäuse (ein Dystrophinnegativer Stamm), die von einer Aufzuchtskolonie von der Universität von Michigan erhalten wurden, wurden mittels intraperitonealer Injektion von Avertin (200 mg/kg Tribromethanol, 200 mg/kg tert-amyl-Alkohol in PBS) anästhesiert und das Haar wurde von dem chirurgischen Ort mit Klippern entfernt. Die intramuskuläre (im) virale Injektion mit 1 × 10⁹ pfu in einem Volumen von 25 μl wurde in den Tibialis Anterior Muskel transdermal injiziert. Für intramuskuläre Plasmid-DNA-Injektionen wurde in die Haut ein Schnitt gemacht, um den Rectus Femoralis Muskel freizulegen und 50 μg Endotoxin freies Plasmid wurde in einem Volumen von 25 μl PBS injiziert und die Haut mit Wundklipsen geschlossen. Alle intramuskulären Injektionen wurden mit einer 30-Gauge-Nadel, die mit einem Plastikrohr ausgestattet war, durchgeführt, um sicherzugehen, dass die Tiefe der Injektion 2 mm beträgt. Für intravenöse Injektionen wurde 3 Wochen alten mdx-Mäusen 2 × 10⁹ pfu in die Schwanzvene mit einer 30-Gange-Nadel injiziert. Alle Tiere wurden für die Analyse 5 Tage nach der viralen oder DNA-Verabreichung geopfert.

Für den Nachweis der Beta-Galactosidase Aktivität in den Muskeln wurde der gesamte Tibialis Anterior Muskel für etwa 5 Minuten in 3,7% Formaldehyd in PBS fixiert, in verschiedene Stücke mit nicht mehr als 3 mm Stärke geschnitten, mit PBS gewaschen und für 12 Stunden bei 37° C mit X-gal (0,1% 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl β-D-Galactosid in 5mM Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 2 mM MgCl₂) gefärbt. Die Proben wurden dann über Nacht in 3,7% Formaldehyd und 0,5% Glutaraldehyd fixiert, in Glycomethacrylat eingebettet, in 4 μm dicke Stücke geteilt und mit Hematoxylin und Eosin gegengefärbt. Für den Nachweis der Beta-Galactosidase Aktivität in der Leber wurde das herausge schnittene Gewebe im flüssigen Stickstoff-gekühlten Isopentan durchgefroren und cryosektioniert in 7 μm Stärke. Die Schnitte wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur in 0,5% Glutaraldehyd in PBS fixiert und dann mit X-gal gefärbt. Die Proteinextrakte für die enzymatischen Analysen wurden hergestellt durch Homogenisierung von blitzgefrorenem Gewebe in einer 10 vol RIPA-Lösung (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,1% SDS, 0,5% Desoxycholat), welche durch die Zugabe von 5 mM EDTA, 1mM Pefabloc SC, 0,5 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Aprotinin und 0,7 μg/ml Pepstatin modifiziert wurde. Nach der Zugabe von Triton-X-100 auf eine Endkonzentration von 0,5%, wurden die Proben auf Eis für 15 Minuten inkubiert und für 10 Minuten bei 30000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden bei –70° C aufbewahrt und wie oben beschrieben untersucht. Die Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2

In vivo Aktivität der MCKlacZ genetischen Kassetten
	Aktivität in Muskeln	Aktivität in Muskeln	Aktivität in der Leber
Genetische Kassette	pAdB III Plasmid	Adenovirale Partikel	Adenovirale Partikel
CK3	4,1 ± 1,3	Nicht untersucht	Nicht untersucht
CK5	4,1 ± 0,8	0,8 ± 0,2	0,006 ± 0,004
CK6	9,6 ± 3,3	12 ± 6	0,02 ± 0,02
CK4	6,3 ± 2,1	Nicht untersucht	Nicht untersucht
CMV	= 100	100 ± 59	= 100

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, gaben die pAdBg1II Konstrukte, welche die flankierenden adenoviralen Sequenzen enthalten, sogar eine höhere Expression in injizierten Muskeln (in vivo) als in transienten Transfektionen (in vitro, siehe Tabelle 1) im Vergleich zu dem CMV Enhancer. Wie ebenfalls in Tabelle 2 dargestellt, wurde gefunden, dass die mit AdCK6lacZ injizierten Muskeln eine Beta-Galactosidase Aktivität bei 12% des Niveaus exprimierten, wie es für H5.010CBlacZ beobachtet wurde. Für AdCK5lacZ wurde festgestellt, dass es wesentlich weniger aktiv ist, die Expression von etwa 1% führend, soviel wie die Beta-Galactosidase Aktivität wie H5.010CBlacZ. Jedoch ist dieses Expressionsniveau immer noch vier Größenordnungen höher als das, welches für dieselbe CK5 genetische Kassette beobachtet wurde, nachdem diese mittels direkter intramuskulärer Injektion der Plasmid DNA verabreicht wurde. Dieser Unterschied dient der Unterstreichung der unglaublichen Effizienz dieser adenoviralen Genverabreichung.
Nach der intravenösen Injektion von H5.010CBlacZ wurden in der Leber sehr hohe Expressionsniveaus beobachtet, bei der die Mehrzahl der Kerne mit X-gal positiv gefärbt war. Das Lebergewebe der Tiere, welches denselben Titer an AdCK5lacZ und AdCK6lacZ erhielten, zeigten keine nachweisbaren X-gal-Färbung, obgleich sehr geringe Niveaus an Beta-Galactosidase Aktivität mittels quantitativen enzymatischen Assays von Leberextrakten nachgewiesen wurde (wie in Tabelle 2 gezeigt). Nach der Normalisierung zu der Aktivität von H5.010CBlacZ in jedem Gewebe waren die Verhältnisse der Muskelaktivität zu der Leberaktivität für AdCK5lacZ und AdCK6lacZ 133:1 und 600:1. Die extrem geringe Aktivität dieser MCK Vektoren im Lebergewebe spiegelt den hohen Grad der Gewebespezifizität wieder, da die Leber den größten Teil des intravenös verabreichten Virus absorbiert.
BEISPIEL 6
CK5 und CK6-Beta-Galactosidaseexpression in humanen dendritischen Zellen
Dieses Beispiel beschreibt die Transfektion von humanen dendritischen Zellen mit AdCK5lacZ und AdCK6lacZ und den Test auf Beta-Galactosidaseexpression. Humane dendritische Zellen wurden aus peripheralen Blut-mononuklearen Zellen (PBMC) erhalten. In aller Kürze, PBMC wurde aus Leukapheresisproben normaler Spender nach der Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenseparation isoliert, gewaschen und in XVIVO-15-Medium resuspendiert. Drei Milliliter des Mediums, welches 4,8 × 10⁶ Zellen enthält, wurden in einer Grube einer Sechs-Grubenplatte für 2 Stunden inkubiert, die nicht anhaftenden Zellen wurden entfernt und es wurden 3 ml frischen Mediums enthaltend 100 ng/ml GM-CSF und 50 ng/ml IL-4 hinzu gegeben. Nach 7 Tagen wurden die Zellen von dem Substrat durch Schaben abgelöst und es wurden 2,5 × 10⁵ Zellen in 300 μl frisches, Cytokin-enthaltendes Medium ausplattiert. Dann wurden virale Partikel (2,5 × 10⁸) hinzugefügt. Nach 16 Stunden wurden die Zellen in Medium gewaschen, in frischem Medium resuspendiert und in den Inkubator zurückgebracht. Drei Tage nach dem Beginn der Infektion wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen und in RIPA, enthaltend 0,5% Triton X-100 und Proteaseinhibitor, lysiert, wie oben beschrieben. Die Extrakte wurden auf Beta-Galactosidase Aktivität unter Verwendung des fluorogenen Substrats 4-MUG untersucht, wie oben beschrieben. Eine Einheit wurde als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 μmol 4-MUG in 4-MU in einer Minute bei 37° C umzuwandeln. Alle Messungen wurden normalisiert auf die Menge an Beta-gal, die durch dendritische Zellen produziert wurde, welche mit dem Virus infiziert wurden, der nicht lacZ enthält. Die Anwesenheit der adenoviralen Genome in den Extrakten wurde durch quantitative PCR unter Verwendung eines Perkin-Elmer 7700 zur Amplifizierung von Sequenzen der L2 Region des Virus bestätigt. Es wurde ein "Taqman"-Assay verwendet mit vorwärts-L2-Primer 5'-CGCAACGAAGCTATGTCCAA (SEQ ID Nr.: 48), rückwärts-L2-Primer 5'-GCTTGTAATCCTGCTCTTCCTTCTT (SEQ ID Nr.: 49) und der Hybridisationsprobe für die Quantifikation Vic-CAGGTCATCGCGCCGGAGATCTA-Tamra (SEQ ID Nr.: 50). Für die Extrakte wurde gezeigt, dass sie zwei bis acht Genome pro lysierte Zelle enthielten.
Die Transgen-Expression von diesen Viren war etwa 1000-fach geringer als die, die mit AdCMVlacZ beobachtet wurde (siehe 10a). In der Tat war die Expression von den CK-Promotor enthaltenden Viren nicht signifikant unterschiedlich gegenüber den für die Kontrollviren beobachteten (Ad-deltaEl – ein rekombinanter Adenovirus, der durch homologe Rekombination zwischen pAdBgIII und dem Ad5 Virus sub360 hergestellt wurde), denen das lacZ Transgen fehlte.
BEISPIEL 7
Zeitablauf der Beta-Galactosidase Expression von AdCK6lacZ
Dieses Beispiel beschreibt die Untersuchung des Zeitablaufs der Beta-Galactosidase Expression von AdCK6lacZ nach der intramuskulären Injektion in C57B 1/10mdx-Mäuse. Im Unterschied zu dem früher beschriebenen schnellen Verlust der transgenen Expression von adenoviralen Vektoren, welche virale Promotoren enthalten, wurde zwischen dem dritten Tag und dem ersten Monat nach der viralen Injektion kein signifikanter Abfall der Beta-Galactosidase Expression beobachtet (10b). In der Tat wurde ein unerwarteter Trend in Richtung einer erhöhten Genexpression während des ersten Monats nach der Injektion beobachtet. Die Beta-Galactosidase Expression begann zwei Monate nach der Injektion abzufallen und war nach etwa vier Monaten auf die Hälfte abgefallen (siehe 10b).
Sequenzliste

Claims

Eine Zusammensetzung enthaltend eine Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Region mit etwa 85–100% Identität zu der SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 aufweist, wobei die Region unbedingt mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente aufweist, wobei die Kontrollelemente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 30–45 und wobei die Region funktionell mit einer heterologen DNS Sequenz verbunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mutante muskelspezifische Enhancerregion eine mutante Muskelkreatinkinaseenhancersequenz aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Muskel-spezifische Enhancerregion eine Transkriptionsaktivität aufweist, die mindestens 50% über der einer Wildtyp Muskel-spezifischen Enhancerregion liegt, wobei die Wildtyp Muskel-spezifische Enhancerregion die SEQ ID NO: 2 aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Muskel-spezifische Enhancerregion des Weiteren die SEQ ID NO: 46 aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mutante Muskel-spezifische Enhancerregion eine Länge von weniger als 250 Basenpaaren aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mutante Muskel-spezifische Enhancerregion eine Länge von weniger als 170 Basenpaaren aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure des Weiteren eine Promotorregion aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorregion eine Muskelkreatinkinasepromotorregion aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorregion eine Länge von weniger als 100 Basenpaaren aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure des Weiteren eine heterologe DNS Sequenz aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe DNS Sequenz die cDNS Dystrophiengensequenz aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure des Weiteren einen Expressionsvektor aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor ausgewählt ist aus Adenovirus, Helfer-abhängigen Adenovirus, Adeno-assoziierten Virus, Lentivirus und Plasmiden.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jedes der Kontrollelemente in der Lage ist MCK-spezifische Transkriptionsfaktoren zu binden.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die MCK-spezifischen Transkriptionsfaktoren ausgewählt sind aus MRF4, myf5, MyoD und Myogenin.
Ein in vitro Verfahren für die Expression eines heterologen Gens in einer Muskelzelle, aufweisend: a) Bereitstellung i) einer Muskelzelle und ii) eines Expressionsvektors der eine Nukleinsäure aufweist, wobei die Nukleinsäure eine Region mit etwa 85–100% Identität zu der SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 aufweist, wobei die Region unbedingt mindestens zwei MCK-R Kontrollelemente aufweist, wobei die Kontrollelemente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 30–45 und wobei die Region funktionell mit einer heterologen DNS Sequenz verbunden ist und b) Kontaktieren des Expressionsvektors mit der Muskelzelle in vitro unter solchen Bedingungen, dass die heterologe DNS Sequenz exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die mutante Muskel-spezifische Enhancerregion des Weiteren die SEQ ID NO: 46 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe DNS Sequenz die cDNS Dystrophiengensequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression höher ist gegenüber einem Vektor, dem die Region fehlt.