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DE10128832A1 - Vector and its use in gene therapy processes - Google Patents

Vector and its use in gene therapy processes

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DE10128832A1
DE10128832A1 DE2001128832 DE10128832A DE10128832A1 DE 10128832 A1 DE10128832 A1 DE 10128832A1 DE 2001128832 DE2001128832 DE 2001128832 DE 10128832 A DE10128832 A DE 10128832A DE 10128832 A1 DE10128832 A1 DE 10128832A1
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vector according
gene
gene therapy
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DE2001128832
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Jochen Reis
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Individual
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen insbesondere für die somatische Gentherapie geeigneten Vektor, pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend diesen Vektor sowie Verwendungen des Vektors.The present invention relates to a vector particularly suitable for somatic gene therapy, pharmaceutical compositions containing this vector and uses of the vector.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, insbesondere einen Plasmidvektor für gentherapeutische Zwecke, insbesondere für die somatische Gentherapie, pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend diesen Plasmidvektor sowie Verwendungen und Verfahren unter Einsatz dieses Plasmidvektors. The present invention relates to a vector especially a plasmid vector for gene therapy purposes, in particular for somatic Gene therapy, pharmaceutical compositions containing this plasmid vector and uses and Method using this plasmid vector.

Gentherapeutische Verfahren sind Verfahren zur Korrektur von erblich bedingten Erkrankungen unter Einsatz gentechnologischer Methodik durch Ersetzen eines oder mehrerer defekter Gene, durch zusätzliches Einbringen des normalen Gens oder durch Einbringen eines Gens, das die Wirkung des defekten Genes kompensiert. Gentherapeutische Verfahrensweisen befinden sich gegenwärtig noch im Experimentalstadium am Tier. Es wird zwischen der Keimbahn- Gentherapie und der somatischen Gentherapie unterschieden. Im Zuge der Keimbahn-Gentherapie wird der genetische Defekt im frühen Embryonalstadium behoben, so dass auch die Keimzellen des Individuums betroffen werden und die veränderte genetische Information an die Nachkommen weitergegeben wird. Die somatische Gentherapie behebt genetische Defekte dagegen allein in den Körperzellen entwickelter Organismen zum Beispiel durch Übertragen eines Normalfunktion aufweisenden Genes. Das an die Nachkommen weitergegebene Erbgut enthält daher nach wie vor den genetischen Defekt. Üblicherweise werden im Rahmen der somatischen Gentherapie zunächst zu behandelnde Körperzellen dem Körper entnommen, anschließend die gewünschten genetischen Veränderungen in den Zellen in vitro durchgeführt, und zwar in der Regel durch Transformation der Zielzellen mit dem gentherapeutisch eingesetzten Gen transformierte Zellen selektioniert und anschließend in den Patienten reimplantiert. Gene therapy methods are methods for Correction of hereditary diseases under Use of genetic engineering methodology by replacement one or more defective genes additional introduction of the normal gene or by Introduce a gene that has the effect of the defective Genes compensated. Gene therapy Procedures are currently still in the Experimental stage in animals. It is between the germline Gene therapy and somatic gene therapy distinguished. In the course of germline gene therapy, the genetic defect in the early embryonic stage fixed so that the germ cells of the individual be affected and the changed genetic Information is passed on to the offspring. The somatic gene therapy eliminates genetic defects on the other hand, more developed in the body cells Organisms, for example, by transferring one Genes with normal function. That to the The inheritance passed on to offspring therefore still contains from the genetic defect. Usually in As part of somatic gene therapy body cells taken from the body, then the desired genetic Changes in cells are carried out in vitro, namely usually by transforming the target cells with the gene used for gene therapy transformed cells selected and then in the Patients reimplanted.

Voraussetzung für jede erfolgreiche Gentherapie ist die Kenntnis der molekularen Ursachen des zu behandelnden Defektes. Voraussetzung ist auch die Bereitstellung einer möglichst hohen Anzahl mit dem erwünschten Gen transformierter Zellen. Die Transformation, das heißt das Einschleusen genetischen Materials in die Zellen geschieht üblicherweise mittels chemisch-physikalischer Methoden, zum Beispiel Mikroinjektion von DNA, oder durch Verwendung von Vektoren, zum Beispiel Retroviren, Adenoviren, Herpes simplex-Viren, DNA-aufweisenden Liposomen oder Plasmidvektoren. The prerequisite for any successful gene therapy is knowledge of the molecular causes of the treating defect. This is also a requirement Providing the highest possible number with the desired gene of transformed cells. The Transformation, that is, introducing genetic Material in the cells usually happens using chemical-physical methods to Example microinjection of DNA, or by use of vectors, for example retroviruses, adenoviruses, Herpes simplex viruses, DNA-containing liposomes or plasmid vectors.

So sind zum Beispiel aus der WO 99/66061, der WO 99/04026, der WO 96/37623 oder der WO 96/14332 virale Vektoren bekannt, die für den Einsatz in gentherapeutischen Verfahren vorgeschlagen werden und in der Lage sind, genetisches Material in Zielzellen einzuführen. For example, from WO 99/66061, the WO 99/04026, WO 96/37623 or WO 96/14332 viral vectors known for use in gene therapy methods are proposed and are able to put genetic material in Introduce target cells.

Aus der WO 99/59546 sind polymere Genträger bekannt, die Nucleinsäuren in Zellen einführen können. Die WO 98/40502 beschreibt Peptid- oder Protein-haltige Zusammensetzungen, die neben einem Transfektionsagens auch Nucleinsäuren enthalten und für gentherapeutische Verfahren verwendet werden können. WO 99/59546 describes polymeric gene carriers known to introduce nucleic acids into cells can. WO 98/40502 describes peptide or Protein-containing compositions next to one Transfection agent also contain nucleic acids and be used for gene therapy procedures can.

Die US 5,804,604 und US 5,64,980 beschreiben die Verwendung eines Plasmides für gentherapeutische Zwecke. Dieses Plasmid codiert ein Fusionsprotein, umfassend einen basischen Bereich des HIV-TAT- Transportproteins (HIV: humaner Immundefizienzvirus) und den Papillomavirus E2-Repressor. Das aus dem TAT-Transportproteinteil und dem E2- Repressorprotein gebildete Fusionsprotein dient gleichsam als Transportvehikel für das Einschleusen interessierender Peptide, Makromoleküle oder kleinerer Moleküle wie Nucleinsäuren oder Polysaccharide in Zielzellen. US 5,804,604 and US 5,64,980 describe the Use of a plasmid for gene therapy Purposes. This plasmid encodes a fusion protein comprehensive a basic area of HIV-TAT Transport protein (HIV: human Immunodeficiency virus) and the papillomavirus E2 repressor. The end the TAT transport protein part and the E2 Repressor protein formed fusion protein is used as a transport vehicle for the infeed peptides, macromolecules of interest or smaller molecules such as nucleic acids or Polysaccharides in target cells.

Die WO 87/02989 beschreibt das HIV TAT-3 Protein sowie Plasmide, die dieses Protein codierende Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Es wird offenbart, dass das rekombinante TAT-3 Protein für die Diagnose und Therapie von HIV-Infektionen dienen kann. WO 87/02989 describes the HIV TAT-3 protein as well as plasmids encoding this protein Have nucleic acid sequences. It is revealed that the recombinant TAT-3 protein for the Diagnosis and therapy of HIV infections can serve.

Schließlich offenbart Schwarze et al. (Science (1999) 285, 1569-1572 die intraperitoneale Injektion eines das HIV-TAT-Protein umfassenden Fusionsproteins in Mauszellen. Finally, Schwarze et al. (Science (1999) 285, 1569-1572 the intraperitoneal Injection of a virus comprising the HIV-TAT protein Fusion protein in mouse cells.

Die beschriebenen im Rahmen der Gentherapie eingesetzten Transformationsverfahren weisen den Nachteil vergleichsweise geringer Effizienz auf. Die für einen gentherapeutisch erfolgversprechenden Ansatz notwendige Zahl transformierter Zellen lässt sich kaum oder gar nicht erreichen. Die beschriebenen Verfahren weisen zudem häufig auch den Nachteil auf, dass die Expressionsrate in den transformierten Zellen nicht hoch genug ist, um einen therapeutischen Effekt erwarten zu lassen. Als besonders nachteilig erweist sich, dass manche Gewebe oder Organe wie das Gehirn für Stoffwechselprodukte nur schwer zu erreichen und aufgrund der Blut/Hirn- Schranke auch nicht von anderen Organen mit Proteinen versorgt werden können. Gerade in solchen Geweben oder Organen ist eine somatische Gentherapie besonders problematisch. The described in the context of gene therapy transformation processes used show the Disadvantage of comparatively low efficiency. The for a gene therapy promising Appropriate number of transformed cells leaves hardly reach each other or not at all. The The methods described also frequently have the disadvantage on that the expression rate in the transformed cells is not high enough to accommodate one to expect therapeutic effect. As special it turns out that some tissues or Organs like the brain for metabolic products only difficult to reach and due to the blood / brain Do not use any other organs Proteins can be supplied. Especially in such Tissues or organs is somatic gene therapy particularly problematic.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die die für ein erfolgreiches gentherapeutisches Verfahren notwendige hohe Transformations- und Expressionsrate interessierender Gene gewährleisten. The present invention is therefore the underlying technical problem, means and procedures to provide those for a successful gene therapy procedure necessary high Transformation and expression rate of genes of interest guarantee.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zu Grunde liegende Problem durch die Bereitstellung eines Vektors für gentherapeutische Zwecke, umfassend mindestens eine eine Translokationssequenz codierende Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nucleotidsequenz codierend für das HSV VP22-Protein (HSV-VP22: Elliott und O'Hare Cell (1997) 88, 223-233), einer Nucleotidsequenz codierend die HIV-TAT-Proteintransduktionsdomäne und einer Nucleotidsequenz codierend das Antennipedia-Peptid (Antennipedia: Derozzi et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 10444-10450, Helix der Homeodomäne: RQIKIWFGNRRMKWKK), SEQ ID Nr. 4). The present invention solves this lying problem by providing a Vector for gene therapy purposes, comprehensive at least one translocation sequence coding nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence coding for the HSV VP22 protein (HSV-VP22: Elliott and O'Hare Cell (1997) 88, 223-233), a nucleotide sequence encoding the HIV-TAT protein transduction domain and a nucleotide sequence encoding that Antennipedia peptide (Antennipedia: Derozzi et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 10444-10450, Helix der Home domain: RQIKIWFGNRRMKWKK), SEQ ID No. 4).

Insbesondere ist ein derartiger Vektor als Plasmidvektor, viraler Vektor oder Liposom ausgeführt. Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines Plasmidvektors für gentherapeutische Zwecke umfassend in operativer Verknüpfung und in 5'- zu 3'-Orientierung mindestens einen konstitutiv exprimierenden Promotor, mindestens eine eine Ribosomenbindestelle (RBS) codierende Nucleotidsequenz, mindestens eine das HIV-TAT-Leitpeptid codierende Nucleotidsequenz, insbesondere codierend die 11 Aminosäuren YGRKKRRQRRR (SEQ ID Nr. 1), eine NotI-Clonierungsstelle für die Insertion einer gentherapeutisch sinnvollen Nucleotidsequenz, insbesondere eines gentherapeutisch sinnvollen Genes, und eine Polyadenylierungsstelle. In particular, such a vector is as Plasmid vector, viral vector or liposome executed. The The present invention solves this lying technical problem in particular by the Providing a plasmid vector for gene therapy purposes comprehensively in operative connection and in 5 'to 3' orientation at least one constitutively expressing promoter, at least one coding for a ribosome binding site (RBS) Nucleotide sequence, at least one of the HIV-TAT leader peptides coding nucleotide sequence, in particular coding the 11 amino acids YGRKKRRQRRR (SEQ ID No. 1), one NotI cloning site for insertion of a gene therapy useful nucleotide sequence, especially of a gene that makes sense in terms of gene therapy, and a polyadenylation site.

Der vorstehend beschriebene, auch als pCURE bezeichnete, Plasmidvektor der Erfindung zeichnet sich durch eine die HIV-TAT-Leader (beziehungsweise Leitpeptid) Sequenz codierende Nucleotidsequenz aus, die unmittelbar und übergangslos im Leseraster an einer zum Beispiel ein therapeutisch sinnvolles Protein oder Proteinfragment codierenden Nucleotidsequenz angeknüpft ist, so dass im Verlauf der Transkription und Translation ein die HIV-TAT Leitpeptidsequenz aufweisendes Fusionsprotein in der Zielzelle, das heißt der zu transformierenden beziehungsweise transformierten Zelle gebildet wird. Der erfindungsgemäß vorgesehene Einsatz der Translokations-Leader-Sequenz (Leitpeptidsequenz oder Translokationssignal) von 11 Aminosäuren, also der Protein-Transduktionsdomäne des HIV-TAT-Proteins, ermöglicht dem in einer Zielzelle gebildeten Fusionsprotein überraschenderweise den Export aus der transformierten Zelle und den Import in mindestens eine weitere Zelle, insbesondere auch das Überwinden der Blut-Hirn-Schranke. Das vom erfindungsgemäßen Vektor codierte Fusionsprotein eignet sich also zum interzellulären Transport. Der Einsatz des erfindungsgemäßen Plasmidvektors führt erfindungsgemäß auch zu einer erhöhten Anzahl von transformierten Zellen mit intaktem Protein pro mit DNA transformierter Zelle. Der erfindungsgemäße Plasmidvektor trägt darüber hinaus eine mit der Leitsequenz verknüpfte Translationsinitationssequenz, nämlich eine die RBS-Sequenz (Riosomenbindestelle) codierende Nucleotidsequenz und alle weiteren für die Transkription erforderlichen Elemente, wie einen konstitutiv exprimierenden Promotor, zum Beispiel der CMV-Promotor (Blumenkohlmosaikvirus) für die ubiquitäre Expression, eine Polyadenylierungsstelle, vorzugsweise die Polyadenylierungsstelle von SV40 sowie mindestens ein Terminationssignal. The one described above, also called pCURE designated plasmid vector of the invention yourself through one of the HIV-TAT leaders (respectively Nucleotide sequence coding for the leading peptide) sequence from that immediately and seamlessly in the reading frame for example, a therapeutically useful one Protein or protein fragment coding Nucleotide sequence is attached, so that in the course of Transcription and translation an the HIV-TAT Fusion protein having a leading peptide sequence in the Target cell, that is the one to be transformed or transformed cell is formed. The proposed use of the Translocation leader sequence (leading peptide sequence or Translocation signal) of 11 amino acids, i.e. the Protein transduction domain of HIV-TAT protein, enables that formed in a target cell Fusion protein surprisingly exports from the transformed cell and import in at least another cell, especially that Overcoming the blood-brain barrier. That from The vector-encoded fusion protein according to the invention is therefore suitable for intercellular transport. The use of the leads plasmid vector according to the invention according to the invention also to an increased number of transformed cells with intact protein pro with DNA transformed cell. The invention The plasmid vector also carries one with the leader sequence linked translation initiation sequence, namely a the RBS sequence (riosome binding site) coding nucleotide sequence and all others for the Transcription required elements, such as one constitutively expressing promoter, for example the CMV (cauliflower mosaic virus) promoter for ubiquitous expression, a Polyadenylation site, preferably the polyadenylation site of SV40 and at least one termination signal.

Der erfindungsgemäße Plasmidvektor ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, gemäß der der Vektor ohne inserierte Fremd-DNA eine Größe von lediglich 3,4 kbp aufweist, extrem klein und kann daher auch große gentherapeutisch sinnvolle Gene oder Genabschnitte aufnehmen. Die Insertion der gentherapeutisch sinnvollen Gene oder Genabschnitte erfolgt durch die erfindungsgemäß bevorzugte vorteilhafterweise nur einmal im Vektor vorkommende NotI- Schnittstelle, die unmittelbar hinter der das Leitpeptid codierenden Nucleotidsequenz liegt beziehungsweise mit dieser überlappt. The plasmid vector according to the invention is in one particularly preferred embodiment, according to the Vector without inserted foreign DNA a size of only 3.4 kbp, extremely small and can hence also large genes that are meaningful in gene therapy or Record gene segments. The insertion of the genetically meaningful genes or gene segments is carried out by the preferred according to the invention Advantageously, only once occurring in the vector Interface that is immediately behind the that The nucleotide sequence encoding the leading peptide or overlapped with it.

Erfindungsgemäß ist in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass das Plasmid mit entwicklungs- oder gewebespezifischen oder regulierbaren regulatorischen Elementen, zum Beispiel Promotoren oder Enhancern versehen wird, die mittels einer multiplen Clonierungsstelle in den Vektor eingefügt werden. According to the invention is preferred Embodiment provided that the plasmid with developmental or tissue specific or regulatable regulatory elements, for example Promoters or enhancers provided by means of a multiple cloning site in the vector be inserted.

Erfindungsgemäß ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, eine multiple Clonierungsstelle im erfindungsgemäßen Plasmidvektor vorzusehen, insbesondere diese zwischen einem Promotor und einer Ribosomenbindungsstelle einzufügen. According to the invention is in a particularly preferred Embodiment provided a multiple Cloning site in the plasmid vector according to the invention to provide, especially this between a promoter and insert a ribosome binding site.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "gentherapeutische Zwecke" verstanden, dass der erfindungsgemäße Vektor, insbesondere Plasmidvektor, für jegliche gentherapeutische Zwecke eingesetzt werden kann, insbesondere für das Einführen von körperfremden oder körpereigenen Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA- Sequenzen, in Zielzellen. Erfindungsgemäß können als Zielzellen beliebige Zellen des menschlichen oder tierischen Körpers, zum Beispiel eines Säugetierkörpers verstanden werden. Es kann sich dabei um Embryonal-, Stamm-, Körper- oder Keimbahnzellen jeglichen Entwicklungsstadiums handeln. Die Erfindung betrifft also auch die Verwendung des Vektors, insbesondere Plasmidvektors, sowohl für die Somazell-Gentherapie als auch für die Keimbahn- Gentherapie. Die Erfindung erfasst jedoch auch die Verwendung des Vektors, insbesondere Plasmidvektors, für andere als gentherapeutische Zwecke, zum Beispiel für Forschungszwecke oder für gendiagnostische Zwecke. In connection with the present invention under the term "gene therapy purposes" understood that the vector according to the invention, especially plasmid vector, for any gene therapy purposes can be used, in particular for the introduction of foreign bodies or endogenous nucleic acid sequences, especially DNA Sequences, in target cells. According to the invention arbitrary cells of the human being as target cells or animal body, for example one Mammal body to be understood. It can happen around embryonic, stem, body or germline cells act at any stage of development. The The invention therefore also relates to the use of the vector, especially plasmid vector, both for the Somazell gene therapy as well as for the germline Gene therapy. However, the invention also covers the Use of the vector, in particular Plasmid vector, for purposes other than gene therapy, for Example for research purposes or for genetic diagnostic purposes.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "operativ miteinander verknüpft" verstanden, dass die miteinander verknüpften Elemente so miteinander verknüpft sind, dass sie bestimmungsgemäß zusammenwirken können, zum Beispiel dass operativ miteinander verknüpfte Transkriptionselemente eine korrekte Transkription gewährleisten. Operativ miteinander verknüpfte Transkriptions- und Translationselemente ermöglichen eine korrekte Expression, das heißt insbesondere Transkription und Translation, zu einem funktionsfähigen Translationsprodukt. In connection with the present invention under the term "operatively linked" understood that the linked Elements are linked together so that they can interact as intended, for example that operatively linked Transcription elements correct transcription guarantee. Operatively linked Transcription and translation elements enable one correct expression, that is in particular Transcription and translation, to a functional Translation product.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter gentherapeutisch sinnvollen Nucleotidsequenzen, zum Beispiel auch Gene, Genabschnitte oder andere strukturelle Genombereiche verstanden, deren Einfügen in eine Zielzelle aus therapeutischer Sicht sinnvoll ist. Die zu inserierenden Nucleotidsequenzen, insbesondere Gene, können endogen oder exogen zu der Zielzelle sein. Es kann sich dabei um Nucleotidsequenzen handeln, die zur Komplementation oder Korrektur von Gendefekten im behandelten Körper dienen. Es können darunter jedoch auch ein oder mehrere Genabschnitte verstanden werden, die dem Ausschalten von Zielgenen in Zielzellen dienen, beispielsweise mittels homologer Rekombination. Gentherapeutisch sinnvolle Nucleotidsequenzen, insbesondere Gene oder Genabschnitte, können auch Antisinn-Konstrukte sein, die der Transkriptionsinhibition in der Zielzelle dienen und damit die Expression bestimmter Proteine verhindern oder reduzieren. Für die Insertion in den vorliegenden Plasmidvektor geeignete Gene oder Genabschnitte können natürlich auch Protein codierende oder nicht- Protein codierende Bereiche sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter gentherapeutisch sinnvollen Proteinen Genprodukte verstanden, die in natürlicher Form, das heißt Wildtypform, oder modifizierter Form in Zielzellen nach Einfügen mittels gentechnologischer Methoden exprimiert werden. Derartige gentherapeutisch sinnvolle Proteine können beliebige Proteine sein, die zum Beispiel in defekter Form in der Zelle vorkommen oder dort gar nicht exprimiert werden und mittels der Gentherapie in die Zelle eingebracht werden können, es können aber auch Proteine sein, die in der Zielzelle auch natürlicherweise nicht vorkommen, gleichwohl aber therapeutisch dort erwünscht sind. Derartige Proteine können auch als Proteinfragmente oder Fusionsproteine ausgeführt sein und gegebenenfalls Modifikationen, zum Beispiel posttranslationelle Modifikationen, aufweisen. Von besonderem Interesse sind Gene, die in der Zielzelle abwesende, in verringerter Menge oder in mutanter Form vorhandene Proteine codieren. Derartige Proteine können insbesondere Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Lymphokine, Cytokine, Rezeptoren und ähnliches ein. Insbesondere kann es sich um Faktor VIII, tPA oder den Molybdän-Cofaktor handeln. Die Molybdän-Cofaktor-Defizienz ist eine schwere neurologische bisher nicht therapierbare und schließlich letale Erkrankung. Hier reichen kleinste Mengen an intaktem Cofaktor und somit auch an Biosynthese- Enzymen für einen klinisch unauffälligen Phänotyp aus. Hauptsyntheseort ist die Leber, die relativ gut erreichbar ist. Die hier gebildeten Enzyme können aufgrund der erfindungsgemäßen Vorgehensweise unter Verwendung des erfindungsgemäß eingesetzten Translokationssignales exportiert und auch vom Gehirn aufgenommen werden. Weitere Beispiele für zu inserierende Gene sind Gene die für Hämoglobin, Interleukin-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, GM- CSF, G-CSF, M-CSF, menschlichen Wachstumsfaktor, Insulin, Faktor IX, LDL-Rezeptoren, Tumornecrosefaktor, PDGF, EGF, NGF, IL-1ra, EPO, TPO, Beta- Globin sowie biologisch aktive Muteine dieser Proteine codieren. In connection with the present invention are among those useful in gene therapy Nucleotide sequences, for example also genes, gene segments or understood other structural genomic areas whose Insert into a target cell from therapeutic Point of view makes sense. The ones to be advertised Nucleotide sequences, especially genes, can be endogenous or be exogenous to the target cell. It can happen are nucleotide sequences which are used for Complementation or correction of gene defects in the treated Serve bodies. However, it can also include a or several gene segments are understood that serve to switch off target genes in target cells, for example by means of homologous recombination. Gene therapy useful nucleotide sequences, in particular genes or gene segments, can also Be anti-sense constructs that the Serve transcription inhibition in the target cell and thus the Prevent expression of certain proteins or to reduce. For insertion in the present Suitable genes or gene segments can be plasmid vector of course also protein coding or not Protein coding areas. In connection with the present invention Proteins useful for gene therapy understood that in natural form, that is Wild type form, or modified form in target cells Inserting using genetic engineering methods be expressed. Such gene therapy sensible Proteins can be any proteins that are used for Example in defective form in the cell or not expressed there at all and by means of gene therapy into the cell can, but it can also be proteins that are in the target cell naturally not occur, but nevertheless therapeutically desired there are. Such proteins can also be used as Protein fragments or fusion proteins can be executed and if necessary modifications, for example post-translational modifications. Of genes that are of particular interest in the Target cell absent, in reduced amount or in encode existing proteins in mutant form. such Proteins can contain hormones, Growth factors, enzymes, lymphokines, cytokines, receptors and similar one. In particular, it can be a factor VIII, tPA or the molybdenum cofactor. The Molybdenum cofactor deficiency is severe and so far not neurologically treatable lethal disease. The smallest quantities are sufficient here intact cofactor and thus also on biosynthesis Enzymes for a clinically unremarkable phenotype out. The main synthesis site is the liver, which is relative is easily accessible. The enzymes formed here can due to the procedure of the invention using the used according to the invention Translocation signals exported and also from Brain. More examples of too inserting genes are genes for hemoglobin, Interleukin-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, GM- CSF, G-CSF, M-CSF, human growth factor, Insulin, factor IX, LDL receptors, Tumor necrosis factor, PDGF, EGF, NGF, IL-1ra, EPO, TPO, beta Globin as well as biologically active muteins of these Encode proteins.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass das Plasmid ein Resistenzgen, insbesondere ein bakterielles Resistenzgen enthält, zum Beispiel das Ampicillinresistenzgen. Die Erfindung sieht in einer weiteren Ausführungsform vor, dass das Resistenzgen mindestens eine Schnittstelle zum Linearisieren und Inaktivieren des Resistenzgenes aufweist. In a further preferred embodiment the invention proposes that the plasmid Resistance gene, especially a bacterial resistance gene contains, for example, the ampicillin resistance gene. The invention sees in another Embodiment that the resistance gene at least one Interface for linearizing and deactivating of the resistance gene.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Plasmidvektor einen Expressionsverstärker, insbesondere Enhancer aufweist. In a further embodiment, that the plasmid vector is an expression enhancer, has enhancers in particular.

In einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, dass das Plasmid einen Replikationsursprung, nutzbar insbesondere für die Plasmidanzucht in Bakterien, aufweist. In a further embodiment, it is preferred that the plasmid has an origin of replication, usable especially for plasmid cultivation in Bacteria.

Die Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform auch Wirtszellen oder Zellen einer Zellkultur, enthaltend mindestens einen Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung. Eine derartige Wirtszelle kann unter anderem eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine tierische Zelle, zum Beispiel eine Säuger- oder Insektenzelle oder eine menschliche Zelle sein. The invention relates in a further Embodiment also host cells or cells of one Cell culture containing at least one plasmid vector of the present invention. Such Host cell can include a bacterial cell, a yeast cell, an animal cell, for example a mammalian or insect cell, or be human cell.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur genetischen Modifizierung einer Zelle, zum Beispiel einer tierischen oder menschlichen Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Vektor, insbesondere Plasmidvektor, gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die eine Aufnahme des Vektors, insbesondere Plasmidvektors, in die Zelle, insbesondere das Genom der Zelle erlauben. The invention also relates to methods for genetic modification of a cell, for example one animal or human cell, comprising the Contacting the cell with a vector, especially plasmid vector, according to the present Invention under conditions that include a recording of the Vector, in particular plasmid vector, into the cell, especially allow the genome of the cell.

Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung genetisch modifizierter Zellen, wobei die genetisch zu modifizierenden Zellen mit einem Vektor, insbesondere Plasmidvektor, der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht und dabei transient oder stabil transformiert werden. The invention therefore also relates to methods for Production of genetically modified cells, whereby the genetically modified cells with one Vector, especially plasmid vector, the brought into contact with the present invention while doing so be transformed transiently or stably.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Vektors, insbesondere Plasmidvektors, der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Präparates, insbesondere eines pharmazeutischen Präparates für die Gentherapie, insbesondere die somatische Gentherapie. The invention also relates to the use of a Vector, in particular plasmid vector, the present invention for the manufacture of a Preparation, in particular a pharmaceutical preparation for gene therapy, especially somatic Gene therapy.

Die Erfindung betrifft daher auch Präparate, insbesondere pharmazeutische Präparate, enthaltend mindestens einen Vektor, insbesondere Plasmidvektor, der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. The invention therefore also relates to preparations in particular containing pharmaceutical preparations at least one vector, in particular plasmid vector, of the present invention, optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen. Further advantageous embodiments of the invention result from the subclaims.

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele, der dazugehörigen Figuren und Sequenzprotokolle näher erläutert. The invention is based on the following Examples, the associated figures and Sequence listings explained in more detail.

Das Sequenzprotokoll stellt dar:
SEQ ID Nr. 1 die 33 die HIV-TAT-Leitpeptidsequenz codierenden Nucleotide,
SEQ ID Nr. 2 die davon codierten 11 Aminosäuren der HIV-TAT-Leitpeptidsequenz,
SEQ ID Nr. 3 die 49 Nucleotide enthaltende Nucleotidsequenz des die RBS, die HIV-TAT-Region und NotI-Clonierungsstelle umfassenden Bereichs von pCURE und
SEQ ID Nr. 4 zeigt die Aminosäuresequenz der Helix der Homeodomäne von Antennipedia. The sequence listing shows:
SEQ ID No. 1 the 33 nucleotides encoding the HIV-TAT lead peptide sequence,
SEQ ID No. 2 the 11 amino acids of the HIV-TAT lead peptide sequence encoded thereof,
SEQ ID No. 3 the nucleotide sequence containing 49 nucleotides of the region of pCURE and comprising the RBS, the HIV-TAT region and the NotI cloning site
SEQ ID No. 4 shows the amino acid sequence of the helix of the home domain from Antennipedia.

Die Figuren zeigen: The figures show:

Fig. 1 eine grafische Darstellung des Plasmids pCURE Fig. 1 is a graphic representation of the plasmid pCURE

Fig. 2 eine in situ Färbung einer erfindungsgemäß transformierten Gehirnhälfte und eine Kontrolle und Fig. 2 is an in situ staining of a transformed according to the invention of the brain and a control and

Fig. 3 Dünnschnitte von Leber und Gehirn (jeweils Negativkontrolle und erfindungsgemäß transformiert). Fig. 3 thin sections of the liver and brain (each negative control and transformed according to the invention).

Beispiel 1example 1 Herstellung des Plasmids pCUREPreparation of the plasmid pCURE

Der Expressionsvektor pcDNA 3.1 (-) von Invitrogen (Kat.-Nr. V 795-20) wurde mit EcoRV und NaeI gespalten. Anschließend wurde das Plasmid religiert und die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 in die NotI-Stelle inseriert. The expression vector pcDNA 3.1 (-) from Invitrogen (Cat.No. V 795-20) was with EcoRV and NaeI split. The plasmid was then religated and the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 3 in the NotI position advertised.

Fig. 1 stellt grafisch das Plasmid pCURE in PVU I- linearisierter Form (von links nach rechts in 5'- zu 3'-Orientierung) dar. Die in Fig. 1 verwendeten Abkürzungen bedeuten:
PCMV = CMV-Promotor zur zelltypunabhängigen Expression (Quelle: pcDNA3.1(-));
MCS = Multiple Clonierungsstelle für gewebespezifische Promotoren: NheIU, PmeI, DraII, ApaI, XbaI, XhoI;
RBS = Ribosomale Bindungsstelle mit Startcodon;
TAT = TAT leader-Sequenz als Translokationssignal für interzellulären Transport;
NotI = Insertionsstelle (Clonierungsstelle) für zum Beispiel therapeutisch sinnvolle cDNA;
SV40pA = SV40 Polyadenylierungssignal und Transkriptionstermination;
pMB1 = Replikationsursprung (origin of replication) ("pUC-derived") für Plasmidanzucht in Bakterien;
amp = Ampicillin-Resistenzgen;
PvuI = Schnittstelle zum Linearisieren und Inaktivieren der Amplicillin-Resistenz;
pCURE1 = hat ohne inserierte DNA eine Größe von 3,4 kbp. Fig. 1 graphically illustrates the plasmid pCURE in PVU I- linearized form (from left to right in 5 'to 3' orientation) are the abbreviations used in Figure 1 represent..:
P CMV = CMV promoter for cell type-independent expression (source: pcDNA3.1 (-));
MCS = multiple cloning site for tissue-specific promoters: NheIU, PmeI, DraII, ApaI, XbaI, XhoI;
RBS = ribosomal binding site with start codon;
TAT = TAT leader sequence as a translocation signal for intercellular transport;
NotI = insertion site (cloning site) for, for example, therapeutically useful cDNA;
SV40pA = SV40 polyadenylation signal and transcription termination;
pMB1 = origin of replication ("pUC-derived") for plasmid cultivation in bacteria;
amp = ampicillin resistance gene;
PvuI = interface for linearizing and inactivating amplicillin resistance;
pCURE1 = has a size of 3.4 kbp without inserted DNA.

Fig. 1 kann entnommen werden, dass zwischen PCMMV, also dem CMV-Promotor und der ribosomalen Bindungsstelle eine multiple Clonierungsstelle MCS angeordnet ist. In 3'-Richtung davon folgen eine TAT- leader-Sequenz, eine NotI-Insertionsstelle sowie die SV40pA Polyadenylierungsstelle. Fig. 1 it can be seen that a multiple cloning site MCS is located between P CMMV, so the CMV promoter and the ribosomal binding site. A TAT leader sequence, a NotI insertion site and the SV40pA polyadenylation site follow in the 3 'direction.

Beispiel 2Example 2 Herstellung des Plasmids pCURElacZPreparation of the plasmid pCURElacZ

pCURElacZ wurde konstruiert durch Clonierung des lacZ-Gens aus E.coli in die NotI-Schnittstelle von pCURE (Fig. 1). Das resultierende Plasmid pCURElacZ enthält die Aminosäuren 8 bis 1023 der E.coli beta-Galaktosidase, die Xgal zu einem blauen Farbstoff umsetzen. Diese katalytische Domäne liegt im Leseraster hinter der HIV-TAT-Translokations- Leader-Sequenz, welche einen interzellulären Transport ermöglicht. pCURElacZ was constructed by cloning the E. coli lacZ gene into the NotI site of pCURE ( Fig. 1). The resulting plasmid pCURElacZ contains amino acids 8 to 1023 of E. coli beta-galactosidase, which convert Xgal to a blue dye. This catalytic domain lies in the reading frame behind the HIV-TAT translocation leader sequence, which enables intercellular transport.

Beispiel 3Example 3 Intraperitoneale Applikation in MäusenIntraperitoneal application in mice

pCURElacZ wurde im mg-Maßstab steril und pyrogenfrei aus dem E.coli-Stamm JM109 isoliert (Qiagen endomaxiprep kit) und nach Konzentrationsbestimmung auf 150 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, eingestellt (dieser Puffer dient auch als Injektionslösung für die Kontrollmäuse). pCURElacZ became sterile on a mg scale and isolated from the E.coli strain JM109 (Qiagen endomaxiprep kit) and after concentration determination adjusted to 150 mM phosphate buffer, pH 7.0 (This buffer also serves as a solution for injection for the control mice).

Die Injektionen mit pCURElacZ erfolgten an gesunden Mäusen. Neugeborenen Mäusen wurden 50 µg pCURElacZ in 50 µl Phosphatpuffer direkt in die Leber gespritzt. Nach 96 h wurden die Tiere getötet und verschiedene Organe entnommen. Hirn, Leber, Herz und Lunge wurden in toto in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C bis zur weiteren Analyse aufbewahrt. The injections with pCURElacZ were made in healthy Mice. Newborn mice were exposed to 50 µg pCURElacZ in 50 µl phosphate buffer directly into the liver injected. After 96 h the animals were sacrificed and various organs removed. Brain, liver, heart and lungs were in total in liquid nitrogen frozen and at -70 ° C until further analysis kept.

Obengenannte Organe wurden in Xgal-Färbelösung (Stratagene Xgal in situ detection kit) bei 37°C über Nacht inkubiert und nach Einbettung in Paraffin für Dünnschnitte von 10-40 µm verwendet. The above organs were in Xgal staining solution (Stratagene Xgal in situ detection kit) at 37 ° C incubated overnight and after embedding in Paraffin used for thin sections of 10-40 µm.

Darstellung der ErgebnissePresentation of the results

Fig. 2 zeigt in toto gefärbte Gehirnhälften nach Xgal-Inkubation. Links: Injektion von 50 µg pCURElacZ. Rechts: Injektion von 50 µl Phosphatpuffer (Negativkontrolle). FIG. 2 shows brain halves stained in total after Xgal incubation. Left: injection of 50 µg pCURElacZ. Right: Injection of 50 µl phosphate buffer (negative control).

Fig. 3 zeigt paraffin-fixierte Dünnschnitte der entsprechenden Organe. a) und b) Lebergewebe: a) Negativkontrolle b) Injektion von pCURElacZ. c) und d) Gehirn: c) Negativkontrolle d) Injektion von pCURElacZ. Fig. 3 shows paraffin-fixed thin sections of the corresponding organs. a) and b) Liver tissue: a) Negative control b) Injection of pCURElacZ. c) and d) brain: c) negative control d) injection of pCURElacZ.

Deutlich ist zu erkennen, dass die erfindungsgemäßen Vektoren erfolgreich in das Gewebe transferiert, dort exprimiert und die Genprodukte in nicht transfizierte Organe, insbesondere das Gehirn, transportiert wurden. SEQUENZPROTOKOLL

It can clearly be seen that the vectors according to the invention were successfully transferred into the tissue, expressed there and the gene products were transported into non-transfected organs, in particular the brain. SEQUENCE LISTING

Claims (22)

1. Vektor für gentherapeutische Zwecke, umfassend mindestens eine eine Translokationssequenz codierende Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nucleotidsequenzen codierend für das HSV VP22-Protein, die HIV-TAT Proteintransduktionsdomäne oder das Antennipedia-Peptid. 1. Vector for gene therapy purposes, comprehensive at least one translocation sequence coding nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences coding for the HSV VP22 protein, the HIV-TAT Protein transduction domain or the Antennipedia peptide. 2. Vektor nach Anspruch 1, der ein Plasmidvektor, ein viraler Vektor oder ein Liposom ist. 2. The vector of claim 1, which is a plasmid vector, is a viral vector or a liposome. 3. Plasmidvektor für gentherapeutische Zwecke nach Anspruch 2, umfassend operativ miteinander verknüpft in 5'- zu 3'-Richtung mindestens einen konstitutiv exprimierenden Promotor, eine eine Ribosomenbindestelle codierende Nucleotidsequenz, eine das HIV-TAT-Leitpeptid mit den Aminosäuren YGRKKRRQRRR (SEQ ID Nr. 1)codierende Nucleotidsequenz, eine NotI-Clonierungsstelle für die Insertion einer gentherapeutisch sinnvollen Nucleotidsequenz und eine Polyadenylierungsstelle. 3. plasmid vector for gene therapy purposes after Claim 2, comprising operative with each other links at least one in the 5 'to 3' direction constitutively expressing promoter, a one Ribosome binding site coding nucleotide sequence, a the HIV-TAT lead peptide with the amino acids YGRKKRRQRRR (SEQ ID No. 1) coding Nucleotide sequence, a NotI cloning site for the Insertion of a gene therapy sensible Nucleotide sequence and a polyadenylation site. 4. Plasmidvektor nach Anspruch 3, wobei der konstitutiv exprimierende Promotor der CMV-Promotor ist. 4. A plasmid vector according to claim 3, wherein the constitutively expressing promoter is the CMV promoter. 5. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei die Polyadenylierungsstelle die SV40pA-Stelle ist. 5. plasmid vector according to one of claims 3 or 4, where the polyadenylation site is the SV40pA site is. 6. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei zwischen dem konstitutiv exprimierenden Promotor und der die Ribosomenbindestelle codierenden Nucleotidsequenz eine multiple Clonierungsstelle für die Insertion mindestens eines regulatorischen Elementes lokalisiert ist. 6. plasmid vector according to one of claims 3 to 5, being between the constitutively expressing Promoter and the one coding for the ribosome binding site Nucleotide sequence a multiple cloning site for the insertion of at least one regulatory Element is localized. 7. Plasmidvektor nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein gewebespezifischer Promotor ist. 7. A plasmid vector according to claim 6, wherein the at least one regulatory element tissue-specific promoter. 8. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei der Plasmidvektor 3,4 kb groß ist. 8. plasmid vector according to one of claims 3 to 7, the plasmid vector is 3.4 kb in size. 9. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei in der NotI-Clonierungsstelle im Leseraster zu dem HIV-TAT-Leitpeptid eine gentherapeutisch sinnvolle Nucleotidsequenz inseriert ist. 9. plasmid vector according to one of claims 3 to 8, being in the NotI cloning site in the reading frame a gene therapy for the HIV-TAT lead peptide meaningful nucleotide sequence is inserted. 10. Plasmidvektor nach Anspruch 9, wobei die gentherapeutisch sinnvolle Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Faktor VIII- Gen, tPA-Gen und Molybdän-Cofaktor-Gen. 10. A plasmid vector according to claim 9, wherein the Gene therapy useful nucleotide sequence is selected from the group consisting of factor VIII Gene, tPA gene and molybdenum cofactor gene. 11. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei der Plasmidvektor ein Resistenzgen enthält. 11. plasmid vector according to any one of claims 3 to 10, the plasmid vector being a resistance gene contains. 12. Plasmidvektor nach Anspruch 11, wobei das Resistenzgen das ampR-Gen ist. 12. A plasmid vector according to claim 11, wherein the resistance gene is the amp R gene. 13. Plasmidvektor nach Anspruch 11 oder 10, wobei das Resistenzgen mindestens eine Schnittstelle zum Linearisieren und Inaktivieren des Resistenzgens aufweist. 13. A plasmid vector according to claim 11 or 10, wherein the resistance gene has at least one interface to the Linearize and inactivate the resistance gene having. 14. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 13, wobei der Plasmidvektor einen Enhancer aufweist. 14. Plasmid vector according to one of claims 3 to 13, the plasmid vector being an enhancer having. 15. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 2 bis 14, wobei der Plasmidvektor einen Replikationsursprung für die Plasmidanzucht in Bakterien enthält. 15. plasmid vector according to any one of claims 2 to 14, the plasmid vector being a Origin of replication for plasmid cultivation in bacteria contains. 16. Wirtszelle, enthaltend einen Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 15. 16. Host cell containing a plasmid vector after one of claims 3 to 15. 17. Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei die Wirtszelle eine bakterielle Zelle, eine Insektenzelle, eine Säugerzelle oder eine menschliche Zelle ist. 17. The host cell of claim 16, wherein the Host cell a bacterial cell, an insect cell, is a mammalian cell or a human cell. 18. Verfahren zur genetischen Modifizierung einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 unter Bedingungen, die geeignet sind, die Aufnahme des Vektors in die Zelle zu bewirken. 18. Procedure for the genetic modification of a A cell comprising contacting the cell with a vector according to any one of claims 1 to 15 under conditions that are suitable for inclusion of the vector into the cell. 19. Verfahren zum Einführen genetischer Informationen in eine Zelle, umfassend das Einfügen der genetischen Informationen in einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Plasmidvektor unter Bedingungen, die geeignet sind, die Aufnahme der genetischen Information in die Zelle zu bewirken. 19. Procedure for introducing genetic Information in a cell, including inserting the genetic information into a vector after a of claims 1 to 15 and contacting the Cell with the plasmid vector under conditions that are suitable to include the genetic To bring information into the cell. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Zelle eine bakterielle, menschliche oder tierische Zelle ist. 20. The method according to any one of claims 18 or 19, where the cell is a bacterial, human or animal cell. 21. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. 21. Pharmaceutical composition containing a vector according to any one of claims 1 to 15, optionally together with a pharmaceutical compatible carrier. 22. Verwendung eines Plasmidvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 15 für die Herstellung eines Präparates für die somatische Gentherapie. 22. Use of a plasmid vector according to one of the Claims 1 to 15 for the manufacture of a Preparations for somatic gene therapy.
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