CN108866205A

CN108866205A - 基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物

Info

Publication number: CN108866205A
Application number: CN201810824002.0A
Authority: CN
Inventors: 郑健; 刘杰; 过立农; 昝珂; 马双成
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明公开了基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物，上游引物为：5'‑TCTGGCTCTTAGGCTTCG‑3'，下游引物为：5'‑GTTGTCTTCCTGGCTGTT‑3'。基于该特异性引物扩增快速鉴别菲牛蛭的方法，主要步骤如下：（1）对待测样品进行总DNA的提取，得到提取的基因组DNA；（2）以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述上游引物、下游引物进行聚合酶链式反应扩增；（3）对步骤（2）所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像，实现对菲牛蛭的特异性鉴别，为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。

Description

基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物。

背景技术

菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)俗称金边蚂蟥，别名马尼拟医蛭，其化学成分主要有多种脂肪酸、氨基酸及微量元素等，有效成分主要是水蛭素、菲牛蛭素A、菲牛蛭素B，除此之外菲牛蛭还含有一些其他的生物活性成分，如抗凝多肽、纤维蛋白溶解酶、透明质酸酶、血管扩张剂、抗血小板聚集活性成分、抑菌活性成分等。菲牛蛭的药理作用主要有抗血小板聚集与抗凝血作用，抑制血栓形成作用，降脂作用，抗肿瘤作用，促进血管新生作用，综合菲牛蛭的有效成分、药理作用、作用机制以及分子生物学相关资料为进一步开发利用菲牛蛭奠定了基础，菲牛蛭作为一种新型药物出现，为防治心血管疾病，尤其为高脂血症患者带来曙光。

不同水蛭品种的活性成分及药效活性往往存在差异，以宽体金线蛭和菲牛蛭为例，两者的活性成分有很大区别，且菲牛蛭比目前广泛应用的宽体金线蛭具有更优的药效活性。菲牛蛭又称金边蚂蟥，其身体两侧的金边为其鉴定特征，但是菲牛蛭死后及其干品金边消失，不易分辨、鉴定，市场上水蛭品种杂多，其中不乏一些进口水蛭药材品种，如何将菲牛蛭与其它品种区分开来，对于合理使用菲牛蛭至关重要。

云南省于2013年将菲牛蛭收录到《云南省中药材标准》中，广西壮族自治区的壮药二卷中也收录了菲牛蛭，推动了菲牛蛭药材的标准化进程。目前，对于菲牛蛭品种的鉴别方法主要有垂直平板十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，基因序列及分子进化分析法等。

目前，对菲牛蛭药材的鉴定方法主要依靠性状鉴别和分子生物学鉴定手段，性状鉴别对鉴定人员的专业性要求很高，且不同炮制方法、储存条件都会给菲牛蛭药材的鉴定带来较大困难，目前的分子生物学鉴定手段为DNA条形码的方法，需将通用引物的扩增产物进行测序，并对测序序列进行比对分析，耗时较长，并且要求操作人员熟悉分子生物专业知识并熟悉专业软件的使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物，有效得将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分，为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物，其特征在于，上游引物为：5'-TCTGGCTCTTAGGCTTCG-3'，下游引物为：5'-GTTGTCTTCCTGGCTGTT-3'。

上述引物在快速鉴别菲牛蛭中的应用。

本发明还提供一种采用上述引物快速鉴别菲牛蛭的方法，主要步骤如下：

(1)对待测样品进行总DNA的提取，得到提取的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用上述上游引物、下游引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；

(3)对步骤(2)所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像，实现对菲牛蛭的特异性鉴别。

按上述方案，步骤(3)中，根据凝胶成像的结果对菲牛蛭进行特异性鉴别，在有效提取待测样品DNA模板的前提下，当观察到单一明亮电泳条带，则鉴定待测样品为菲牛蛭；当未观察到单一明亮电泳条带，则鉴定待测样品不是菲牛蛭。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

菲牛蛭及其相近种多以吸血为生，现有技术中通过通用引物进行鉴别容易受到菲牛蛭吸食血液的干扰，影响测序结果，且测序需要的周期比较长，而且测序序列的分析需具有专业知识且了解专业软件。本发明提供一对菲牛蛭的特异性引物，通过特异性扩增达到区分菲牛蛭与其他品种的目的，可以通过观察凝胶电泳的结果是否产生条带而比较直观的体现鉴定结果，同时减少了测序以及测序结果比对分析的时间。本发明通过菲牛蛭特异性引物鉴定菲牛蛭减少了药检人员的操作时间，压缩检验时间，提高检验效率，同时降低理论针对检验人员的专业限制。

附图说明

图1为基于COI序列建立的NJ树。

图2为特异性扩增电泳检测结果图，其中，M：Maker(DL2000)；K：阴性对照(H₂O)；1～20：编号SZ-1～SZ-20样品。

图3为不同退火温度下编号SZ-10、SZ-14、SZ-18菲牛蛭样品的电泳检测条带结果，其中每个温度下从左到右依次是编号SZ-10、SZ-14、SZ-18。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，所涉及主要仪器和试剂如下：ABI Veriti PCR仪(ThernoFisher公司)，EPS-301电泳仪(Amersham公司)，GelDoc XR+全自动凝胶成像系统(BIORAD公司)；动物血液组织基因组提取试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit(货号69504，QIAGEN公司)，2×TaqMaster Mix缓冲液(货号GK8006，GENEray公司)，DNA染料GelRed(货号41003，Biotium公司)，琼脂糖(Biowest公司)，三羟甲基氨基甲烷Tris-base(Sigma公司)，通用COI引物5'-TAAGAGGTTTACCACCGTTAT-3'和5'-GTAGATGAAG TAGTTGACCCAA-3'(上海捷瑞生物工程有限公司)。

下述实施例中，水蛭新鲜样品分别收集自广东省、云南省、广西壮族自治区，药材干品收集自安国、亳州、广州清平药材市场。其中样品SZ-4、SZ-7、SZ-8、SZ-10、SZ-14、SZ-17、SZ-20均由中国食品药品检定研究院郑健研究员鉴定为菲牛蛭Poecilobdellamanillensis，样品信息见表1。

表1水蛭样品信息表

下述实施例中，测序峰图使用CodonCode Aligner 3.7.1软件(CodonCode Co.,USA)校对拼接，去除引物区段；将所有序列利用MEGA 5.0软件(molecular evolutionarygenetics analysis)分析比对；采用NJ树(Neighbor-Joining Tree)法建立系统发育树，通过bootstrap(1000次重复)对各分支进行支持率检验。

实施例1

基于分子生物学特异性扩增鉴别菲牛蛭的一对特异性引物，上游引物为：5'-TCTGGCTCTTAGGCTTCG-3'，下游引物为：5'-GTTGTCTTCCTGGCTGTT-3'，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

采用上述引物快速鉴别菲牛蛭的方法，待测样品分别选择表1中编号SZ-1～SZ-20水蛭样品，进行平行实验，鉴别编号SZ-1～SZ-20水蛭样品是否为菲牛蛭；具体步骤如下：

(1)总DNA的提取：取待测样品20～30mg，干品用MM400球磨仪粉碎，新鲜样品用手术剪剪碎，利用QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit基因组提取试剂盒进行DNA提取；

(2)聚合酶链式反应：PCR反应体系20μL包括2×Taq Master Mix缓冲液10μL，上下游引物2.5μmol/L各0.4μL，DNA模板50ng 1μL，灭菌的双蒸水8.2μL。PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。

(3)对步骤(2)所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像。50×TAE电泳缓冲液的配制：取三羟甲基氨基甲烷242g，冰醋酸57.1mL，EDTA-Na2·2H2O 37.2g，加入适量去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000mL，作为贮存液，进行凝胶电泳时稀释50倍成工作液。琼脂糖凝胶的浓度2％(质量体积比)，配置琼脂糖凝胶40mL加入DNA染料GelRed 3μL和步骤(2)所得反应产物3μL，电泳检测电压为3～5V/cm，电泳时间30min。凝胶电泳检测结果均如图2所示，其中编号SZ-1、SZ-4、SZ-8、SZ-10、SZ-14、SZ-17、SZ-18、SZ-19、SZ-20共9个样品均观察单一明亮条带，鉴定为菲牛蛭；其它编号的待测样品均未观察单一明亮条带，鉴定为非菲牛蛭。

验证：将通用引物COI(5'-TAAGAGGTTTACCACCGTTAT-3'和5'-GTAGATGAAGTAGTTGACCCAA-3')的扩增产物进行凝胶电泳检测，20批样品(编号SZ-1～SZ-20样品)的电泳检测结果均显示为单一明亮条带，将20批COI引物的扩增产物送英潍捷基(赛默飞世尔科技有限公司)进行测序。

水蛭样品COI序列的测序序列使用CodonCode Aligner 3.7.1软件(CodonCodeCo.,USA)校对拼接，去除引物区段，得到20批水蛭样品的COI序列长度为656bp。将所有序列利用MEGA 5.0软件(molecular evolutionary genetics analysis)分析比对。采用NJ树(Neighbor-Joining Tree)法建立系统发育树，通过bootstrap(1 000次重复)对各分支进行支持率检验，得到基于COI序列建立的NJ树如图1所示。SZ-4、SZ-8、SZ-10、SZ-14、SZ-17、SZ-20共6个样品经鉴定为菲牛蛭，图1中SZ-1、SZ-4、SZ-8、SZ-10、SZ-14、SZ-17、SZ-18、SZ-19、SZ-20共9个样品聚为一支，且COI序列完全一致，序列结果为：ACTCTATATTTGATTCTAGGGGCTTGGGCAGCTATATTAGGCTCCTCTATAAGAACTATTATTCGAATTGAGTTATCTCAACCAGGTAGGTTTCTTGGGGATGATCAACTTTATAATTCTTTAATTACTGCACATGGACTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATTTTAATCGGTGGGTTTGGTAATTGACTTTTACCGTTAATAATTGGTGCCCCAGATATGGCTTTTCCACGATTAAATAATTTTAGGTTTTGATTATTACCACCTTCATTAACTATATTAGTAAGATCATCAATAATTGAATCCGGTGTTGGTACAGGATGGACTATTTATCCACCATTAGCTGATAGAGTTTCTCACTCAGGACCTTGTGTAGATATAGCTATCTTTTCATTGCATATAGCTGGTGCATCATCTATTTTAGGTTCTTTAAATTTTATTTCTACTATTATTAATATGCGAACTAATGGTATAAGTAATGAACGAGTTCCATTATTTGTTTGATCTGTTGTAATTACTACTATCTTATTATTACTTTCATTACCTGTATTAGCAGCAGCTATTACAATGTTATTAACTGATCGTAATTTAAATACTTCATTTTTTGATCCAATGGGTGGTGGAGATCCAGTATTATTTCAACACTTATT，因此可以确定这9个样品为菲牛蛭，其他11个样品的COI序列均与菲牛蛭样品存在碱基差异，其中SZ-2与菲牛蛭间的碱基差异最小，为63个碱基，因此可以确定其他11个样品为非菲牛蛭品种。由此，该结论与本实施例1相一致。

实施例2

对实施例1中的特异性引物进行了退火温度的考察，共考察了45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃共6个退火温度，根据考察结果，确定49℃为引物7特异性扩增菲牛蛭序列的最佳退火温度。具体步骤如下：

(1)总DNA的提取：随机选取编号SZ-10、SZ-14、SZ-18的三批样品，取待测样品20～30mg，干品用MM400球磨仪粉碎，新鲜样品用手术剪剪碎，利用QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit基因组提取试剂盒进行DNA提取；

(2)聚合酶链式反应：PCR反应体系20μL包括2×Taq Master Mix缓冲液10μL，上下游引物25μmol/L各0.4μL，DNA模板50ng/μL1μL，灭菌的双蒸水8.2μL。PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，(45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃)退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。

(3)对步骤(2)所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像。50×TAE电泳缓冲液的配制：取三羟甲基氨基甲烷242g，冰醋酸57.1mL，EDTA-Na₂·2H₂O 37.2g，加入适量去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000mL，作为贮存液，进行凝胶电泳时稀释50倍成工作液。琼脂糖凝胶的浓度2％(质量体积比)，配置琼脂糖凝胶40mL加入DNA染料GelRed 3μL，电泳检测电压为3～5V/cm，电泳时间30min。

其中，随机选取的编号SZ-10、SZ-14、SZ-18的3批菲牛蛭样品分别在45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃六个退火温度下的扩增产物凝胶电泳检测结果如图3所示，在退火温度为49℃时，电泳检测结果中条带最明显，综合考虑，确定49℃为菲牛蛭特异性引物7的最佳退火温度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

＜110＞中国食品药品检定研究院

＜120＞基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物

＜160＞5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>1

tctggctctt aggcttcg 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>2

gttgtcttcc tggctgtt 18

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>3

taagaggttt accaccgtta t 21

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>4

gtagatgaag tagttgaccc aa 22

<210>5

<211>656

<212>DNA

<213>菲牛蛭

<400>5

actctatatt tgattctagg ggcttgggca gctatattag gctcctctat aagaactatt 60

attcgaattg agttatctca accaggtagg tttcttgggg atgatcaact ttataattct 120

ttaattactg cacatggact tattataatt ttttttatag taatacctat tttaatcggt 180

gggtttggta attgactttt accgttaata attggtgccc cagatatggc ttttccacga 240

ttaaataatt ttaggttttg attattacca ccttcattaa ctatattagt aagatcatca 300

ataattgaat ccggtgttgg tacaggatgg actatttatc caccattagc tgatagagtt 360

tctcactcag gaccttgtgt agatatagct atcttttcat tgcatatagc tggtgcatca 420

tctattttag gttctttaaa ttttatttct actattatta atatgcgaac taatggtata 480

agtaatgaac gagttccatt atttgtttga tatgttgtaa ttactactat cttattatta 540

ctttcattac ctgtattagc agcagctatt acaatgttat taactgatcg taatttaaat 600

acttcatttt ttgatccaat gggtggtgga gatccagtat tatttcaaca cttatt 656

Claims

1.基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物，其特征在于，上游引物为：5'-TCTGGCTCTTAGGCTTCG-3'，下游引物为：5'-GTTGTCTTCCTGGCTGTT-3'。

2.权利要求1所述特异性引物在制备鉴别菲牛蛭试剂中的应用。

3.基于分子生物学特异性扩增快速鉴别菲牛蛭的方法，其特征在于，主要步骤如下：

（1）对待测样品进行总DNA的有效提取，得到提取的基因组DNA；

（2）以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述上游引物、下游引物进行聚合酶链式反应扩增；

（3）对步骤（2）所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像，实现对菲牛蛭的特异性鉴别。

4.根据权利要求3所述基于分子生物学特异性扩增快速鉴别菲牛蛭的方法，其特征在于，步骤（3）中，根据凝胶成像的结果对菲牛蛭进行特异性鉴别，当观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品为菲牛蛭；当未观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品不是菲牛蛭。