DE69930118T2 - Verfahren zur herstellung von proteinen in transformierten hefezellen - Google Patents

Description

• GEBIET DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression von Proteinen in transformierten Hefezellen, DNA-Konstrukte und Vektoren zur Verwendung in einem derartigen Verfahren und mit den Vektoren transformierte Hefezellen.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Es ist bekannt, transformierte Hefestämme zur Expression von Proteinen zu verwenden, siehe z.B. die Europäischen Patentanmeldungen Nr. 0088632A, 0116201A, 01233294A, 0123544A, 0163529A, 0123289A, 0100561A, 0189998A und 0195986A, PTC-Patentanmeldungen Nr. WO 95/01421, 95/02059 und WO 90/10075 und US-Patent Nr. 4,546,082.
• Es ist ein allgemeines Merkmal der vorstehenden Verfahren, dass das Hefeherstellungsplasmid ein Gen für einen Antibiotikummarker enthält. Ein derartiges Markergen stammt von den anfänglichen Klonierungsschritten in E.coli, wo es zum Durchmustern auf transformierte Hefezellen oder zum Aufrechterhalten von als Vektoren verwendeten Plasmiden verwendet wurde. Es wurde nicht angenommen, dass die Antibiotikummarkergene einen negativen Einfluss auf das Züchten der transformierten Hefezelle aufweisen, und es war deshalb allgemeine Praxis, keine Schritte zu unternehmen, eine derartige DNA zu deletieren. Zudem wird die Charakterisierung des Plasmidkonstrukts gewöhnlich durch Isolierung von Plasmiden von den transformierten Hefezellen und Transformation des isolierten Plasmids in E. coli, gefolgt von Antibiootikumselektion durchgeführt. Es war für praktische Zwecke folglich günstig, dass Antibiotikumresistenzmarkergen zu bewahren.
• Obwohl sowohl Forschungslaboratorien als auch industrielle Produktionsanlagen durch sehr strenge Sicherheitsvorschriften kontrolliert werden, besteht immer ein geringes Risiko, dass ein paar Zellen versehentlich in die Umgebung abgegeben werden. Auf Grund ihrer stark komplizierten Natur überleben derartige genetisch manipulierte Mikroorganismen nur eine sehr kurze Zeitdauer, und das Risiko des Schädigens der Umwelt ist extrem gering. Dies ist natürlich der Grund, warum derartige transformierte Mikroorganismen zur Verwendung sowohl in der Forschung als auch in Arbeitsvorgängen in großem Maßstab anerkannt waren.
• Auch wenn die Zellen schnell sterben, können die das Antibiotikumresistenzgen enthaltenden Plasmide immer noch versehentlich in die Umgebung abgegeben werden, und es besteht ein theoretisches Risiko, dass Resistenz gegen Antibiotika in Bakterien eingebracht wird, wenn das Plasmid spontan aufgenommen wird.
• Antibiotika sind zur Behandlung von menschlichen und tierischen Bakterieninfektionen von großer Wichtigkeit. Falls möglich, sollte jegliches Risiko einer potentiellen Umweltkontamination mit einem Gen, das Resistenz gegen Antibiotika verleiht, minimiert werden.
• Es besteht deshalb Bedarf nach der Entwicklung von noch sichereren Verfahren als die bis heute verwendeten Verfahren, und es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, derartige verbesserte Verfahren bereit zu stellen.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Exprimieren von heterologen Proteinen oder Polypeptiden in Hefe, wobei der zur Herstellung verwendete Hefetransformantstamm einen Expressionsvektor enthält, in welchem ein in den anfänglichen Klonierungsschritten verwendetes Antibiotikummarkergen durch in-vitro-Modifikation vor der Transformation des Hefewirts nicht funktionell gemacht wurde. Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA-Sequenzen und Ex pressionsvektoren zur Verwendung in einem derartigen Verfahren und transformierte Hefezellen.
• Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombmanten Hefeexpressionsvektor, der Bakterienzellen keine Antibiotikumresistenz verleihen kann und ein Gen, das für ein heterologes Gen kodiert, und ein Antibiotikumresistenzmarkergen, das durch in-vitro-Modifikation nicht funktionell gemacht wurde, umfasst.
• Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Polypeptids oder Proteins, wobei das Verfahren das Züchten eines Hefestamms, umfassend einen Vektor, der Bakterienzellen keine Antibiotikumresistenz verleihen kann und ein Gen, das für ein heterologes Gen kodiert, und ein Antibiotikumresistenzmarkergen umfasst, wobei das Markergen durch in-vitro-Modifikation vor der Transformation des Hefewirts nicht funktionell gemacht wurde, und Isolieren des gewünschten Produkts aus dem Kulturmedium.
• Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst typischerweise das Züchten eines Hefestamms, enthaltend ein Hefeexpressionsplasmid, wobei in diesem Plasmid ein funktionelles Antibiotikummarkergen, das zu anfängliche Klonierungsschritte verwendet wird, in Bakterien durch in-vitro-Deletion eines Teils des Markergens oder des gesamten Markergens vor dem Einfügen in den zur Expression und Sekretion des gewünschten Polypeptids oder Proteins verwendeten Hefewirt nicht funktionell gemacht wurde.
• Die Deletion des Antibiotikummarkergens wird vorzugsweise durch Einfügen von geeigneten Restriktionsspaltungsstellen an jeder Seite des Antibiotikumresistenzmarkergen durchgeführt, worauf das Markergen durch in-vitro-Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen deletiert wurde.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch transformierte Hefestämme, umfassend einen Vektor, der Bakterienzellen keine Antibiotikumresistenz verleihen kann und ein Gen, das für ein heterologes Gen kodiert, und ein Antibiotikumresistenzmarkergen, das durch in-vitro-Modifikation vor der Transformation des Hefewirts nicht funktionell gemacht wurde, umfasst.
• Der Hefestamm ist vorzugsweise ein Saccharomyces-Stamm und insbesondere ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae.
• Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Antibiotikummarkergen" oder „Antibiotikumresistenzmarkergen" ein Gen, das die phenotypische Selektion von transformierten Bakterienzellen und Plasmidamplifikation erlaubt.
• Die am häufigsten verwendeten Antibiotikumresistenzmarkergene in E. coli sind die Ampicillin(AMP)-, Chloramphenicol-, Neomycin-, Kanamycin- und Tetracylinresistenz-verleihenden Markergene.
• Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „nicht funktionelles Markergen, dass das Markergen entweder deletiert oder durch Deletion eines Teils des Gens nicht funktionell gemacht wurde. Es ist bevorzugt, dass das Gen vollständig deletiert wird.
• Wie hier verwendet, bedeutet „in-vitro-Modifikation" Modifikationsschritte", die auf dem Vektor außerhalb der Zellumgebung durchgeführt werden.
• Wie hier verwendet, bedeutet „Bakterienzellen keine Antibiotikumresistenz verleihen können", dass die Antibiotikumresistenzgene in jeglichen Organismen auf Grund der beschriebenen Genmanipulation nicht funktionell sind.
• Wie hier verwendet bedeutet „Hefewirt" einen Hefeorganismus, der mit dem Hefeexpressionsplasmid oder Vektor zu transformieren oder transfektieren ist.
• KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• Die vorliegende Erfindung wird weiter mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht, wobei
• 1 das Expressionsplasmid pAK729 zeigt, das ein Gen enthält, das einen Insulinvorläufer unter Expressionskontrolle einer TPI-Promoter- und einer TPI-Terminatorsequenz von S. cerevisiae und einer Signalleadersequenz, die aus dem yAP3-Signalpeptid und einem synthetischen LA19-Leaderpeptid besteht, exprimiert. Die Konstruktion von pAK729 ist in WO 97/22705 beschrieben. Das Plasmid enthält auch die AMP-R-Sequenz von pBR322/pUC13, einschließlich das Ampicillinresistenzgen und den Ursprung der DNA-Replikation in E. coli;
• 2 die Plasmidabbildung des pAK729.5-Plasmids zeigt, das zur Bildung des NN729.5 Stamms verwendet wird, welchem das AMP-Gen vor der Deletion des Amp-Gens fehlt;
• 3 die Plasmidabbildung des pAK729.6-Plasmids zeigt, dass zur Bildung des NN729.6 Stamms verwendet wird, welchem das AMP-Gen vor der Deletion des Amp-Gens fehlt;
• 4 die Plasmidabbildung des pAK729.6-Δamp-Plasmids zeigt, in welchem das Amp-Gen deletiert wurde;
• 5 die Plasmidabbildung des pAK729.7-Plasmids zeigt, dass zur Bildung des NN729.7 Stamms verwendet wird, welchem das AMP-Gen vor der Deletion des Amp-Gens fehlt; und
• 6 die Plasmidabbildung des pKV228-Plasmids zeigt, das durch Ersetzen der EcoRIO(940)-Xbal (1403)-Kodierungssequenz in pAK729 (1) mit einer MFalpha*-Arg³⁴GLP-1_(7-37) Kodierungssequenz modifiziert wurde.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUND DER ERFINDUNG
• Die in-vitro-Deletion des Antibiotikumresistenzmarkergens wird entweder durch Verwendung von verfügbaren Restriktionsstellen oder durch Einbringung von geeigneten Restriktionsstellen durch Verwendung von PCR, stellenspezifische Mutagenese oder andere bekannte Techniken zur Manipulation von DNA-Sequenzen, gefolgt von der Behandlung mit den geeigneten Restriktionsenzymen durchgeführt.
• Vier modifizierte NN729-Stämme wurden konstruiert, um zu beurteilen, ob verschiedene Deletionen im Plasmid die Insulinvorläuferfermentationsausbeute oder Stammstabilität während einer Dauerfermentation beeinflussen könnten (Tabelle I). Die Stämme wurden mit dem ursprünglichen NN729-Stamm in Bezug auf die Fermentationsausbeute und die Fermentationsstabilität verglichen (Tabelle II). Zudem wurden drei modifizierte Hefestämme, die die GLP-1-Variante Arg³⁴GLP-1_(7-37) herstellen, konstruiert, um zu beurteilen, ob verschiedene Deletionen im das AMP-Gen enthaltenden Plasmid pKV228 die Arg³⁴GLP-1_(7-37)-Fermentationsausbeute beeinflussen könnten (Tabelle III).
• Alle Plasmide und Stämme, in welchen das AMP-Gen und möglicherweise umgebende Sequenzen deletiert wurden, sind als „ΔAMP" bezeichnet.
• Die modifizierten Hefestämme wurden durch Transformation der modifizierten pAK729- oder pKV228-Plasmide hergestellt, in welchen das APM-Markergen und möglicherweise andere DNA-Sequenzen von dem ursprünglichen Plasmid in den Stamm von S. cerevisiae MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Δtpi Δtpi,pep 4-3/pep 4-3) oder ME1719 (MATa/αΔyap3::ura3/Δyap3::URA3pep4-3/pep4-3Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 eu2/leu2 Δura3/Δure3) deletiert wurden.
• Die modifizierten Plasmide wurden durch Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymstellen, die schon im Plasmid vorlagen, oder durch Einfügen von geeigneten Restriktionsenzymstellen in einer derartigen Weise, dass das AMP-Gen deletiert werden kann, hergestellt. Die modifizierten Plasmide können vor der Transformation in S. cerevisiae (Stamm MT663) in vitro in einer derartigen Weise manipuliert werden, dass das AMP-BGen deletiert oder nicht funktionell gemacht wird und demzufolge dem resultierenden Hefestamm das AMP-Gen fehlt. Folglich wird das potentielle Risiko der Umweltkontamination mit dem AMP-Gen während der Hinterlegung der Hefezellen minimiert.
• Die modifizierten pAK729- oder pKV228-Plasmide wurden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, einer Agaruseelektrophorese unterzogen, isoliert, religiert-und anschließend in kompetente MT663- bzw. kompetente ME1719-Zellen von S. cerevisiae aus WO 98/01535 transformiert.
• Das durch das Verfahren der Erfindung hergestellte Protein oder Polypeptid kann jedes beliebige heterologe Protein oder Polypeptid sein, das vorteilhafterweise in einer Hefezelle hergestellt werden kann. Beispiele für derartige Proteine sind Aprotenin, Gewebefaktorpfadhemmer oder andere Proteasehemmer, Insulin, Insulinvorläufer oder Insulinanaloga, insulinartiger Gewebefaktor I oder II, Human- oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Gewebeplasminogenaktivator, transformierender Gewebefaktor a oder b, Glucagon, glucagonartiges Peptid 1 (GLP-1), glucagonartiges Peptid 2 (GLP-2), GRPP, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, plättchenabgeleiteter Gewebefaktor und Enzyme wie Lipasen.
• Der Begriff „ein Vorläufer von Insulin" oder „ein Vorläufer eines Insulinanalogons" ist als einkettiges Polypeptid, einschließlich Proinsulin, zu verstehen, das durch einen oder mehrere anschließende chemische und/oder enzymatische Pro zesse zu einem zweikettigen Insulin oder Insulinanalogonmolekül mit der korrekten Einführung der drei Disulfidbrücken, wie sie in natürlichem Humaninsulin zu finden ist, umgewandelt werden kann. Die Insulinvorläufer enthalten typischerweise ein modifiziertes C-Peptid, das die A- und B-Kette von Insulin verbrückt. Zudem fehlt den bevorzugten Insulinvorläufern der B(30)-Aminosäurest. Besonders bevorzugte Insulinvorläufer sind diejenigen, die z.B. in EP 163529 und in der PCT-Anmeldungen Nr. 95/00550 und 95/07931 beschrieben sind. Beispiele für Insuline sind Humaninsulin, vorzugsweise des(B30)-Humaninsulin und Schweineinsulin. Bevorzugte Insulinanaloga sind solche, in welchen ein oder mehrere der natürlichen Aminosäurereste, vorzugsweise einer, zwei oder drei durch einen anderen kodierbaren Aminosäurerest ersetzt wurden. Folglich kann in Position A21 ein parentales Insulin statt Asn einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr oder Val, insbesondere einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Gly, Ala, Ser und Thr, aufweisen. Gleichermaßen kann in Position B28 ein parentales Insulin statt Pro einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Asp, Lys usw. aufweisen, und in Position B29 kann ein parentales Insulin statt Lys die Aminosäure Pro aufweisen.
• Der Ausdruck „ein kodierbarer Aminosäurerest" bezeichnet wie hier verwendet einen Aminosäurerest, der durch den genetischen Code kodiert werden kann, d.h. ein Triplett („Codon") von Nukleotiden.
• Die verwendeten DNA-Konstrukte können durch etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, Seite 1859-1869, oder das Verfahren, beschrieben von Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, Seite 801-805, synthetisch hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoamiditverfahren werden Oligonukleotide z.B. in einer automatischen DNA-Syntheseapparatur synthetisiert, gereinigt, verdoppelt und unter Bildung des synthetischen DNA-Konstrukts ligiert. Ein gegenwärtig bevorzugter Weg der Herstellung des DNA-Konstrukts erfolgt durch Po lymerasekettenreaktion (PCR), z.B. wie beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
• Die für das gewünschte Protein kodierende DNA kann auch genomischen oder cDNA-Ursprungs sein, z.B. durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Durchmustern auf DNA-Sequenzen, die das gesamte oder einen Teil des Polypeptids der Erfindung kodieren, durch Hybridisierung unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken erhalten werden (vergleiche Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
• Schließlich kann die das gewünschte Protein kodierende DNA gemischten synthetischen und genomischen, gemischtem synthetischen und cDNA- oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein, der gemäß Standardtechniken durch Aushärten von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet) hergestellt wird, wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten DNA-Konstrukts entsprechen.
• Der rekombinante Expressionsvektor kann ein autonom replizierender Vektor, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom sein. Der Vektor kann beliebige Mittel zum Gewährleisten der Selbstreplikation enthalten. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welches) er integriert wurde repliziert wird. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder ein Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte in das Genom der Wirtszelle einzubringende DNA enthalten, oder ein Transposon sein.
• Der rekombinante Expressionsvektor kann eine DNA-Sequenz enthalten, die das gewünschte Protein oder Polypeptid in funktionsfähig an eine geeignete Promotersequenz gebundener Form kodiert. Der Promoter kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die in Hefe Transkriptionsaktivität zeigt, und von Genen abgeleitet werden, die Proteine entweder homolog oder heterolog für Hefe kodieren. Der Promoter ist vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das ein für Hefe homologes Protein kodiert. Beispiele für geeignete Promoter sind die M α1-, TPI-, ADH- oder PGK-Promoter von Saccharomyces cerevisiae.
• Die das gewünschte Protein oder Polypeptid kodierende DNA-Sequenz kann auch an einen geeigneten Terminator, z.B. den TPI-Terminator funktionsfähig gebunden sein (vergleiche T. Alber und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982 Seite 419-434).
• Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung umfasst auch eine DNA-Sequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in Hefe zu replizieren. Beispiele für derartige Sequenzen sind die Hefeplasmid-Replikationsgene REP 1-3 mit 2μ und der Replikationsursprung. Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker, z.B. das TPI-Gen von Schizosaccharomyces pompe, wie beschrieben von P.R. Russel, Gene 40, 1985, Seite 125-130, umfassen.
• Schließlich enthält der Expressionsvektor vorzugsweise eine Signal-/Leadersequenz zum Gewährleisten der Sekretion des gewünschten Proteins oder Polypeptids in das Kulturmedium. Eine Signalsequenz ist eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid (ein „Sekretionspeptid") kodiert, das als Bestandteil eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen Sekretionspfad einer Zelle, in welche es synthetisiert wird, lenkt. Das größere Polypeptid wird im Allgemeinen abgespalten, um das Sekretionspeptid während des Durchgangs durch den Sekretionspfad zu entfernen.
• Die Sekretionssignal Sequenz kann jedes beliebige Signalpeptid kodieren, das ein effizientes Leiten des exprimierten Polypeptids in den Sekretionspfad der Zelle gewährleistet. Das Signalpeptid kann ein naturlich vorkommendes Signalpeptid oder ein funktioneller Teil davon oder ein synthetisches Signalpeptid sein. Nützliche Signalpeptide für Hefewirtszellen werden von den Genen des a-Faktors von Saccharomyces cerevisiae und der Invertase von Saccharomyces cerevisiae, dem Signalpeptid der Mäusespeichelamylase (vergleiche O. Hagenbüchle et al., Nature 289, 1981, Seite 634-646), einem modifizierten Carboxypeptidasesignalpeptid (vergleiche L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, Seite 887-897), dem BAR1-Signalpeptid von Hefe (vergleiche WO 87/02670) oder dem Signalpeptid der Hefeaspartamprotease 3 (YAP3) (vergleiche M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, Seite 127-137) erhalten.
• Für eine effiziente Sekretion in Hefe kann eine ein Leaderpeptid kodierende Sequenz auch stromabwärts der Signalsequenz und stromaufwärts der das Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz eingefügt werden. Die Funktion des Leaderpeptids ist, es dem exprimierten Polypeptid zu erlauben, von dem endoplasmischen Retikulum zur Golgi-Apparatur und weiter zu einem Sekretionsvesikulum zur Sekretion in das Kulturmedium geleitet zu werden (d.h. Exportation des Polypeptids durch die Zellwand oder zumindest durch die Zellmembran in den periplasmischen Raum der Hefezelle). Das Leaderpeptid kann der a-Faktor-Leader von Hefe sein (wobei die Verwendung davon z.B. in US 4,546,082 , EP 16 201 , EP 123 294 , EP 123 544 und EP 162 529 beschrieben ist). Alternativ dazu kann das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid sein, das ein in der Natur nicht zu findendes Leaderpeptid ist. Synthetische Leaderpeptide können wie in WO 89/02463 oder WO 92/11378 und von Kyeldsen et al. in „Protein Expression and Purification 9, 331-336 (1997) beschrieben konstruiert werden.
• Der Ausdruck „Leaderpeptid" ist so zu verstehen, dass er ein Peptid in Form einer Propeptidsequenz angibt, dessen Funktion es ist, es dem heterologen Protein zu erlauben, sekretiert zu werden, um von dem endoplasmatischen Retikulum zur Golgi-Apparatur und weiter zu einem Sekretionsvesikulum zur Sekretion in das Medium geleitet zu werden (d.h. Exportation des exprimierten Proteins oder Polypeptids durch die Zellmembran und die Zellwand, falls vorliegend, oder zumindest durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum einer Zelle mit einer Zellwand).
• Die Verfahren, die zum Ligieren der für das gewünschte Protein oder Polypeptid, den Promoter bzw. den Terminator kodierenden DNA-Sequenzen und zu deren Einfügen in die für die Hefereplikation nötige Information enthaltende geeignete Hefevektoren verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt (vergleiche z.B. Sambrook et al., vorstehend genannt). Es ist klar, dass der Vektor konstruiert werden kann, indem entweder zuerst ein DNA-Konstrukt hergestellt wird, das die gesamte für das Polypeptid der Erfindung kodierende DNA-Sequenz enthält, hergestellt wird und dieses Fragment anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt wird, oder indem DNA-Fragmente, enthaltend die genetische Information für die einzelnen Elemente (wie das Signal-, Leader- oder heterologe Protein), sequentiell eingefügt werden, gefolgt von Ligierung.
• Der in den Verfahren der Erfindung verwendete Hefeorganismus kann jeder beliebige geeignete Hefeorganismus sein, der beim Züchten zufrieden stellende Mengen des gewünschten Proteins oder Polypeptids herstellt. Beispiele für geeignete Hefeorganismen können die Stämme, ausgewählt aus den Hefespezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pompe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia klyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. und Geotrichum fermentas, vorzugsweise die Hefespezies Saccharomyces cerevisiae sein.
• Die Transformation der Hefezellen kann z.B. durch Protoplastformation, gefolgt von Transformation in einer an sich bekannten Weise bewirkt werden. Das zum Züchten der Zellen verwendete Medium kann jedes beliebige herkömmliche Me dium sein, das zum Wachsen von Hefeorganismen geeignet ist. Das sekretierte heterologe Protein, wobei ein deutlicher Anteil davon im Medium in korrekt verarbeiteter Form vorliegt, kann aus dem Medium durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Abtrennen der Hefezellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats durch ein Salz, z.B. Ammoniumsulfat, gefolgt von Reinigung durch eine Vielfalt an chromatographischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Affmitätschromatographie oder dergleichen, gewonnen werden. Wird das Protein in den periplasmatischen Raum sekretiert, werden die Zellen enzymatisch oder mechanisch gespalten.
• Das gewünschte Protein oder Polypeptid kann als N-terminal verlängertes Fusionsprotein wie beschrieben in WO 97/22706 exprimiert und sekretiert werden. Die N-terminale Verlängerung kann dann von dem gewonnenen Protein in vitro entweder durch chemische oder enzymatische Spaltung wie auf dem Fachgebiet bekannt entfernt werden. Es ist bevorzugt, die Spaltung durch Verwendung eines Enzyms durchzuführen. Beispiele für derartige Enzyme sind Trypsin oder Protease I von Achromobacter lyticus.
• Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in den folgenden Beispielen beschrieben, die in keinster Weise den beanspruchten Umfang der Erfindung beschränken sollen.
• Beispiel 1
• Hefeplasmid pAK729, das zur Expression eines Insulinvorläufers (eines N-terminal verlängerten B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Insulinvorläufers, siehe WO 97/22706) konstruiert wurde, enthält zwei ApaLI-Enzymrestriktionsstellen ApaLI (4477) und ApsLI (5723) (siehe 1). Diese Restriktionsstellen befinden sich an jeder Seite des AMP-Markergens. Die Entfernung der 1246 Nukleotide zwischen den zwei ApaLI-Stellen in pAK729 entfernt das AMP-Markergen und etwas zusätzliche von E. coli abgeleitete Plasmid-DNA.
• Das pAK729-Plasmid wurde mit ApsLI-Restriktionsenzym verdaut, einer Agaroseelektrophorese unterzogen, isoliert, religiert und anschließend in kompetente Zellen von S. cerevisiae (MT663, siehe EP B0163529) transformiert, um den transformierten Hefestamm NN729.1-ΔAMP zu erhalten. Das modifizierte Expressionsplasmid wurde von dem Hefestammn NN729.1-ΔAMP reisoliert, und DNA-Sequenzen wurden nach der PCR-Bildung verifiziert, gefolgt von Subklonen der die Deletion ausübenden DNA-Region. Gleichermaßen wurden die DNA-Sequenzen, die den Insulinvorläufer kodieren, auf Plasmid-DNA, die vom Hefestamm NN729.1-ΔAMP reisoliert wurde, verifizier.
• Hefestamm NN729.1-ΔAMP wurde in YPD-Medium bei 30°C für eine Dauer von 22 Stunden gezüchtet. Die Fermentationsausbeute des Insulinvorläufers wurde durch RP-HPLC bestimmt.
• Beispiel 2
• Enzymrestriktionsstellen, Xhol (5676) und Xhol (5720), wurden in das pAK729-Plasmid durch PCR eingebracht. Ausgewählte DNA-Sequenzen des erhaltenen pAK729-Plasmids wurden anschließend verifiziert. Die Restriktionsplasmidabbildung von pAK729.5 ist in 2 dargestellt. Das DNA-Fragment zwischen den Restriktionsenzymstellen Xhol (5676) und Xhol (5720) kann von Plasmid pAK729.5 deletiert werden, indem 44 Nukleotide deletiert werden, die im AMP-Gen lokalisiert sind.
• Plasmid pAK729.5 wurde mit Xhol-Restriktionsenzymen verdaut, einer Agaroseelektrophorese unterzogen, isoliert, religiert und anschließend in kompetente MT663-Zellen von S. cerevisiae unter Erhalt des Hefetransformanten NN729.5-ΔAMP transformiert. Das modifizierte Expressionsplasmid wurde von dem Hefe stamm NN729.5-ΔAMP reisoliert, und DNA-Sequenzen wurden nach PCR-Bildung, gefolgt von Subklonen der DNA-Region, die die Deletion ausübten, verifiziert. Gleichermaßen wurden die DNA-Sequenzen, die den Insulinvorläufer kodieren, auf Plasmid-DNA, die vom Hefestamm NN729.5-ΔAMP reisoliert wurde, verifiziert. Es stellte sich heraus, dass die Deletion der 44 Nukleotide pAK729.5- ΔAMP in Bezug auf das Zerstören von β-Lactamaseaktivität so effizient war, wie eine vollständige Deletion des AMP-Gens.
• Hefestamm NN729.5-ΔAMP wurde in YPD-Medium bei 30°C für eine Dauer von 72 Stunden gezüchtet. Die Fermentationsausbeute des Insulinvorläufers wurde durch RP-HPLC bestimmt.
• Beispiel 3
• Die Enzymrestriktionsstelle AatII (4982) wurde in das pAK729-Plasmid durch PCR eingebracht. Ausgewählte DNA-Sequenzen des erhaltenen pAK729.6-Plasmids wurden anschließend verifiziert. Die Restriktionsplasmidabbildung von pAK729.6 ist in 3 dargestellt. In pAK729.6 kann das DNA-Fragment zwischen den Restriktionsenzymstellen AatII (4982) und AatII (5978) deletiert werden, indem 996 Nukleotide von dem Plasmid entfernt werden. Dies entfernt das gesamte AMP-Gen und den gesamten Promoter.
• Das pAK729.6-Plasmid wurde mit DNA-Restriktionsenzym AatII verdaut, einer Agaroseelektrophorese unterzogen, isoliert, religiert und anschließend in kompetente MT663-Zellen von S. cerevisiae transformiert. Das modifizierte Expressionsplasmid wurde von dem Hefestamm NN729.6-ΔAMP reisoliert, und DNA-Sequenzen wurden nach PCR-Bildung, gefolgt von Subklonen der DNA-Region, die die Deletion ausübte, verifiziert. Gleichermaßen wurden die DNA-Sequenzen, die den Insulinvorläufer kodieren, auf Plasmid-DNA, die vom Hefestamm NN729.6-ΔAMP reisoliert wurde, verifiziert. Das Plasmid NN729.6-ΔAMP, dem das AMP-Gen fehlt, ist in 4 dargestellt.
• Hefestamm NN729.6-ΔAMP wurde in YPD-Medium bei 30°C für eine Dauer von 72 Stunden gezüchtet. Die Fermentationsausbeute des Insulinvorläufers wurde durch RP-HPLC bestimmt.
• Beispiel 4
• Die neue Enzymrestriktionsstelle AatII (3801) im pAK729.7-Plasmid wurde in das ursprüngliche pAK729.7-Plasmid durch PCR eingebracht. Ausgewählte DNA-Sequenzen des pAK729.7-Plasmids wurden anschließend verifiziert. In pAK729.7 kann das DNA-Fragment zwischen den Restriktionsenzymstellen AatII (3801) und AatII (5978) deletiert werden, indem 2177 Nukleotide von dem Expressionsplasmid entfernt werden. Das pAK729.7-Plasmid wurde derart konstruiert, dass sowohl das AMP-Gen als auch der Replikationsursprung von E. coli deletiert werden konnten. Die Restriktionsplasmidabbildung von pAK729,7 ist in 5 dargestellt.
• Das pAK729.7-Plasmid wurde mit DNA-Restriktionsenzym AatII verdaut, einer Agaroseelektrophorese unterzogen, isoliert, religiert und anschließend in kompetente MT663-Zellen von S. cerevisiae transformiert. Das modifizierte Expressionsplasmid wurde von dem Hefestamm NN729.7-ΔAMP reisoliert, und DNA-Sequenzen wurden nach PCR-Bildung, gefolgt von Subklonen der DNA-Region, die die Deletion ausübte, verifiziert. Gleichermaßen wurden die DNA-Sequenzen, die den Insulinvorläufer kodieren, auf Plasmid-DNA, die vom Hefestamm NN729.7-ΔAMP reisoliert wurde, verifiziert. Hefestamm NN729.7-ΔAMP wurde in YPD-Medium bei 30°C für eine Dauer von 72 Stunden gezüchtet. Die Fermentationsausbeute des Insulinvorläufers wurde durch RP-HPLC bestimmt.
• Tabelle I Grundriss von NN729-Stämmen auf der Basis von pAK729-Plasmiden mit nicht funktionellem oder deletiertem AMP-Gen

  
• Die neuen NN729-ΔAMP-Stämme wurden mit dem ursprünglichen NN729-Stamm in Bezug auf Fermentationsausbeute des Insulinvorläufers verglichen (Tabelle II).
• Tabelle II Fermentationsausbeute von NN729-ΔAMP-Stämmen, transformiert mit Plasmiden mit nicht funktionellem oder deletiertem AMP-Gen

  
• Es erscheint aus dem Vorstehenden, dass die Hefestämme, umfassend ein Expressionsplasmid mit einem teilweise oder vollständig deletierten AMP-Markergen, um 10-20 mol-% mehr des Insulinvorläufers verglichen mit dem ursprünglichen Hefestamms, umfassend ein Expressionsplasmid, enthaltend das AMP-Gen, exprimieren.
• Beispiel 5
• Arg³⁴GLP-1_(7-37)-Expression in Hefe unter Verwendung der Plasmide mit nicht funktionellem oder deletiertem AMP-Resistenzgen
• Die EcoRI(940)-Xbal(1403)-Sequenz der pAK729-Konstrukte, kodierend LA19 X5 M13, veranschaulicht in 1-5, wurden mit einer MFalpha*-Arg³⁴GLP-1_(7-37)-Kodierungssequenz für das vorliegende Beispiel ersetzt (6). Eine Modifikation des MFalpha*-pre-pro-Leaderpeptids (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 1982, Seite 933), in welchem Leu in Position 82 und Asp in Position 83 mit Met bzw. Ala durch Einbringen der Ncol-Spaltungsstelle in die DNA-Sequenz substituiert wurden, wurde in diesen Konstrukten angewandt. Die Leadersequenz wurde als MFalpha* (Kjeldsen T. et al. 1996) bezeichnet. Das MFα1-Signal-MFα*-Leaderpeptidsequenz schließt das zweibasische Kex2b-Erkennungsmotiv (Lys-Arg), das den Leader von der Kodierungssequenz für Arg³⁴GLP-1_(7-37) abtrennt, ein. Das Peptid Arg³⁴GLP-1_(7-37) ist eine Human-GLP-1_(7-37)-Variante (S. Mojsov, et al., J. Biol.Chem. 261, 1998, Seite 11880-11889), wobei der natürliche Aminosäurerest in Position 34 mit einem Arg-Rest ersetzt ist.
• Drei Arg³⁴GLP-1_(7-37)-Expressionsplasmide wurden mit AMP-Resistenzgenspaltungen wie für NN729.1 (Beispiel 1), NN729.5 (Beispiel 2) und NN729.6 (Beispiel 3) beschrieben konstruiert und anschließend in kompetente ME 1719-Zellen (siehe WO 98/0135 von S. cerevisiae unter Erhalt der Hefetransformanten YES2046, YES2079 bzw. YES2085 transformiert.
• Der Wirtsstamm, der zum Exprimieren von Arg³⁴GLP-1_(7-37) verwendet wurde, ist ein Diploidstamm und weist Phenotypen auf, welchen zwei Asparatylproteasen, d.h. (1) Hefeaspartylprotease 3 (YAP3), die die C-terminale Seite von mono- oder dibasischen Aminosäureresten abspalten (Egel-Mitani, et al., YEAST 6: 127-137, 1990) und (2) vaskuolare Protease A, die für die Aktivierung von anderen Proteasen wie Protease B, Carboxypeptidase Y, Aminopeptidase I, RNase, alkalische Phosphatase, Säuretrehalase und Exopolyphosphatase verantwortlich ist, fehlen. Außerdem wurde das Triosephosphatisomerasegen (TPI) gespalten, wodurch es für Phenotypen möglich wird, dass sie Glucose in Transformanten verwenden, die auf glucosehaltigem Medium wachsen. Der genetische Hintergrund von ME1719 ist MATa/a Dyap3::ura3/Dyap3::URA3 pep4-3/pep4-3 tpi::LEU2/Dtpi::LEU2 leu2/leu2 Dura3/Dura3.
• Die modifizierten Expressionsplasmide pKV301, pKV307 und pKV304 wurden von den Hefestämmen reisoliert, und DNA-Sequenzen wurden nach der PCR-Bildung, gefolgt von Subklonen der DNA-Region, die die Deletion ausüben, verifiziert. Gleichermaßen wurden die DNA-Sequenzen, die Arg³⁴GLP-1_(7-37) kodieren, auf Plasmid-DNA, die von den Hefestämmen reisoliert wurde, verifiziert. Tabelle III zeigt einen Vergleich zwischen modifizierten und nicht modifizierten Stämmen.
• Tabelle III Grundriss von YES-Stämmen auf der Basis von Plasmiden mit nicht funktionellem oder deletiertem AMP-Resistenzgen zur Expression von Arg³⁴GLP-1_(7-37)

  
• Die Ausbeuten wurden von Fermentationen im Labormaßstab mit 5 ml in YPD für eine Dauer von 72 Stunden bei 30°C verglichen. Die Ausbeuten wurden unter Verwendung von HPLC beurteilt.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Polypeptids oder Proteins in Hefe, umfassend das Züchten eines ein Hefeexpressionsvektorplasmid enthaltenden Hefestamms unter geeignete Bedingungen, wobei in dem Plasmid ein funktionelles antibiotisches Markergen, das zu anfänglichen Klonschritten in Bakterien verwendet wird, durch eine in-vitro-Deletion eines Teils des Markergens oder des gesamten Markergens vor dem Einfügen in den Hefewirt nicht-funktionell gemacht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Einfügen von geeigneten Restriktionsstellen um das antibiotische Resistenzmarkergen und Deletieren des Markergens durch eine in-vitro-Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen.
3. Verfahren nach Anspruch 1-2, wobei der Hefestamm ein Saccharomyces-Stamm, vorzugsweise ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae ist.