DE10101324C1 - 1-Dimercaptoalkylchinazolin-2,4-(1H,3H)-dione als Matrix-Metalloproteinase(MMP)-Inhibitoren - Google Patents
1-Dimercaptoalkylchinazolin-2,4-(1H,3H)-dione als Matrix-Metalloproteinase(MMP)-InhibitorenInfo
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Abstract
Die Erfindung hat die Aufgabe, neue chemische Substanzen nichtproteinogener Struktur aufzufinden und zu untersuchen, die eine Matrix-Metalloproteinase(MMP)-inhibierende Wirkung zeigen. DOLLAR A Die Aufgabe wird gelöst durch die Synthese von dimercaptoalkylsubstituierten Chinazolin-2,4(1H,3H)-dionen. DOLLAR A Verbindungen dieser Substanzklasse zeigen überraschend deutliche und damit pharmakologisch interessante MMP-inibierende Wirkung.
Description
Die Erfindung betrifft dimercaptoalkylsubstituierte Chinazolin-2,4(1H,3H)-dione der
allgemeinen Formeln I,
worin bedeuten:
R1 = Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom, Iod), Hydroxy, Carboxy
R2 = Wasserstoff, Methyl
n = 1, 2
sowie deren Tautomere und Salze und ihren Einsatz als Matrix Metalloproteinase (MMP)-Inhibitoren.
R1 = Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom, Iod), Hydroxy, Carboxy
R2 = Wasserstoff, Methyl
n = 1, 2
sowie deren Tautomere und Salze und ihren Einsatz als Matrix Metalloproteinase (MMP)-Inhibitoren.
Chinazoline, Chinazolinone und Chinazolindione sind Gegenstand einer intensiven
pharmazeutischen Forschung. Ihre Eignung als Wirkstoffe und Synthesebausteine
ist unbestritten.
Die therapeutische Wirksamkeit schwefelsubstituierter Chinazolindione, speziell von
3-(Mercaptoalkyl)chinazolin2,4(1H,3H)-dionen als Pharmazeutika ist von Leistner
u. a. erkannt worden (DD 298 784). Es wurde festgestellt, dass eine immunstimulato
rische und antivirale Wirksamkeit von Vertretern dieser Substanzgruppe gegeben
ist.
Wenig ist bisher über die Synthese und nichts über die Wirkungen von dimercap
toalkylsubstituierten Chinazolin-2,4(1H,3H)-dionen bekannt.
Verbindungen mit einem Dimercaptoalkylsubstituenten am N1-Stickstoff des China
zolin-2,4(1H,3H)-dionsystems entsprechend den allgemeinen Formeln I sind in der
Fachliteratur bislang nicht beschrieben.
Auf dem Gebiet der Entwicklung effizienter, niedermolekularer und nichtproteinoge
ner MMP Inhibitoren wird weltweit intensiv geforscht. Es ist bekannt, dass physiolo
gisch die enzymatische Aktivität der MMPs unter einer strikten, abgestimmten Re
gulation zwischen Aktivierung und Hemmung steht. Hierzu existieren im Organis
mus spezielle Proteine, die sog. Tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases
(TIMP's), die in der Lage sind, die Aktivität von MMPs schnell und effizient zu hem
men (Nagase, H. et all: Engineering of selective TIMPs. 1-11; In: Inhibition of Matrix
Metalloproteinases - Therapeutic Application (Eds. Greenwald RA., Zucker, S.,
Golub, LM.) Ann NY Acad Sci 878 (1999). Eine ungebremste enzymatische Aktivität
dieser Enzyme führt besonders bei den rheumatischen Erkrankungen zum Abbau
der Knorpelsubstanz und - pathologisch bedeutsam - zu chronisch-schmerzhaften
Veränderungen an den Gelenken (Goldbach-Mansky, R. et al.: Active synovial ma
trix metalloproteinase-2 is associated with radiographic erosions in patients with
early synovitis. Arthritis Res 2 (2000) 145-153).
Ein weiteres Beispiel für die pathologische Wirkung von MMPs ist bei der Invasion
und Metastasierung von Tumoren gegeben. Freigesetzte und aktivierte MMPs
schneiden einen Weg durch das dichtes kollagenes Bindegewebe und insbesondere
auch durch die Basalmembran der Gefäße und ermöglichen es dadurch den Krebs
zellen aus dem Tumorverband auszuwandern, in das Gefäßsystem einzuwandern
und an anderer Stelle Tochtergeschwülste zu bilden. MMPs spielen eine weitere
entscheidende Rolle bei der Blutgefäßversorgung des wachsenden Tumors, indem
sie den Weg für die neugebildeten Blutgefäße durch das kollagene Bindegewebe
freischneiden und somit für diese Vaskularisation des wachsenden Tumors verant
wortlich sind (Shapiro, SD.: Matrix metalloproteinase degradation of extracellular
matrix: biological consequences. Current Opinion in Cell Biology 10 (1998) 602-
608).
Als weiteres relevantes medizinisches Ergebnis unzureichend gebremster Wirkung
von MMPs ist das UV-induzierte Erythem zu nennen, das u. a. als Folge einer intensi
ven Sonnenbestrahlung auftritt. Durch die energiereichen UV-Strahlen des Sonnen
lichtes bzw. von Bräunungsgeräten werden u. a. die inaktiven Prokollagenasen in der
bestrahlten Haut aktiviert, die in der Folge Kollagen des Bindegewebes und der Blut
kapillaren spalten und dadurch für die Symptome eines Sonnenbrandes verantwort
lich zeichnen.
Bei diesen exemplarisch aufgezeigten pathologischen Wirkungen der ungebremsten
enzymatischen Aktion von MMPs, können deren Folgeerscheinungen durch stabile
MMP-Inhibitoren verhindert bzw. wesentlich gemildert werden. Es ist faszinierend,
die Vorstellung zu realisieren, diese Enzyme durch spezifische Inhibitoren gezielt zu
hemmen, um dadurch zum Beispiel eine fortschreitende Knorpeldestruktion bei Er
krankungen des rheumatischen Formenkreises zu unterbrechen, oder das Wachs
tum bzw. die Metastasierung von Tumoren zu verhindern.
Es sind bereits zahlreiche Verfahren zur Gewinnung von Verbindungen mit MMP-
inhibierender Wirkung bekannt. Diese Wirkstoffe der ersten Generation besitzen in
aller Regel eine proteinogene Struktur und weisen eine strukturelle Verwandtschaft
zu natürlichen Inhibitoren auf, bei denen es sich um spezielle Proteine handelt. Die
se proteinogenen oder pseudoproteinogenen Substratanaloga besitzen als Struktu
relement eine zinkbindende Gruppe, die das Zinkion im aktiven Zentrum der MMPs
chelatisiert.
Bezüglich einer therapeutischen Anwendung weisen alle derartigen proteinogenen
bzw. nichtproteinogenen Wirkstoffe eine Reihe von Nachteilen auf, wie ungenügen
de Resorbierbarkeit, in aller Regel kurze Halbwertszeiten, eine nur geringe Stabili
tät, sowie häufig unerwünschte Nebenwirkungen (Inhibition of Matrix Metallopro
teinases - Therapeutic Application (Eds. Greenwald, RA., Zucker, S., Golub, LM.)
Ann NY Acad Sci 878 (1999)).
Weitere Entwicklungen auf diesem Gebiet erbrachten beispielsweise Phosphona
mid-Inhibitoren, Piperazin-Inhibitoren, Sulfonamid-Inhibitoren, Carbamat-Inhibitoren,
Diazepin-Inhibitoren, Tetracyclin-Inhibitoren und nicht zuletzt Hydroxamat-
Inhibitoren (Skotnick,i JS. et al.: Design and synthetic considerations of matrix met
alloproteinase inhibitors, 61-72 In: Inhibition of Matrix Metalloproteinases - Thera
peutic Application (Eds. Greenwald, RA., Zucker, S., Golub, LM.) Ann NY Acad Sci
878 (1999)). Die meisten dieser entwickelten Inhibitoren weisen zwar in vitro beein
druckende Hemmwirkungen und Spezifitäten auf, zeigten aber bei in vivo Anwen
dungen im Tierversuch und beim Menschen eine Reihe von schwerwiegenden
Nachteilen. Im Vordergrund stehen hierbei zytotoxische Reaktionen auf eine Viel
zahl von Zellen, eine schlechte Bioverfügbarkeit und unerwünschte Nebenwirkun
gen, insbesondere eine negative Beeinflussung des Bewegungsapparates.
Es besteht daher ein dringender Bedarf an Arzneimitteln mit nichtproteinogener
Struktur, welche die Nachteile der Wirkstoffe, die bisher am Markt sind, nicht aufwei
sen. Insbesondere besteht Bedarf an neuen Wirkstoffen mit MMP-inhibierender Wir
kung, die ausreichend stabil und gut resorbierbar sind, bessere pharmakokinetische
Eigenschaften besitzen und vor allen Dingen keine unerwünschten Nebenwirkungen
und zytotoxische Reaktionen aufweisen.
Die Erfindung hat deshalb die Aufgabe, neue chemische Substanzen nichtproteino
gener Struktur aufzufinden, die eine MMP-inhibierende Wirkung zeigen. Es ist weiter
Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen als auch
entsprechende Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, welche diese Verbindungen
enthalten.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
Die erfindungsgemäßen, erstmals hergestellten Verbindungen der allgemeinen For
meln Ia und Ib aus der Klasse der dimercaptoalkylsubstituierten Chinazolin-
2,4(1H,3H)-dione zeigen überraschende, deutliche und damit pharmakologisch in
teressante MMP-inhibierende Wirkungen, welche aus bisher bekannten Struk
tur-Wirkungsbeziehungen nicht ableitbar sind.
Durch Testung dieser Inhibitoren entsprechend der allgemeinen Formeln Ia, und Ib
an unterschiedlichen humanen MMPs (MMP-2, rekombinante katalytische Domäne
der MMP-3, MMP-8, MMP-9, rekombinante katalytische Domäne der MMP-14) wird
die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen belegt.
Die erfindungsgemäßen Dimercaptane der allgemeinen Formeln I werden aus den
entsprechenden angular anellierten, partiell hydrierten Thiazolo[3,2-a]- bzw.
[1,3]Thiazino[3,2-a]-chinazolinonen der allgemeinen Formeln IIa, IIb bzw. IIc
worin bedeuten:
R1 = Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom, Iod), Carboxy
R2 = Wasserstoff. Methyl
durch säure- oder basekatalysierte Hydrolyse erhalten.
R1 = Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom, Iod), Carboxy
R2 = Wasserstoff. Methyl
durch säure- oder basekatalysierte Hydrolyse erhalten.
Die tricyclischen Mercaptane der allgemeinen Formeln II wiederum werden durch
Umsetzung der entsprechenden tricyclischen Halogenvorstufen der allgemeinen
Formeln III
worin bedeuten:
R1 = Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom, Iod), Carboxy
R2 = Wasserstoff, Methyl
R3 = Chlor, Brom, Jod, Tosyl
nach Umsetzung mit einem schwefelübertragenden Agens, vorzugsweise Thioharn stoff, in einem inerten Lösungsmittel und anschließende schonende Verseifung der isolierten Zwischenstufen, vorzugsweise der Isothiuroniumsalze, erhalten.
R1 = Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom, Iod), Carboxy
R2 = Wasserstoff, Methyl
R3 = Chlor, Brom, Jod, Tosyl
nach Umsetzung mit einem schwefelübertragenden Agens, vorzugsweise Thioharn stoff, in einem inerten Lösungsmittel und anschließende schonende Verseifung der isolierten Zwischenstufen, vorzugsweise der Isothiuroniumsalze, erhalten.
Die Vorstufen der allgemeinen Formeln III sind literaturbekannt (Leistner et al.).
10 mmol der literaturbekannten Verbindung (R,S)-1-Brommethyl-1,2-dihydro-5H-
thiazolo[3,2-a]chinazolin-5-on (allg. Formel IIIa, R1 = R2 = Wasserstoff, R3 = Brom)
werden in 30 ml Monomethylglycol eingetragen und mit 12 mmol Thioharnstoff unter
DC- bzw. HPLC-Kontrolle bei einer Badtemperatur von ca. 100°C bis zum
vollständigen Umsatz erhitzt. Wenn beim Abkühlen keine Kristallisation einsetzt, wird
mit Essigester bis zur Trübung versetzt und das sich dann abscheidende
Isothiuroniumsalz abgetrennt. Dieses wird in 1 N NaOH unter Zusatz von 10% (v/v)
Ethanol und unter Stickstoffatmosphäre bei einer Badtemperatur von 50°C verseift.
Der Reaktionsverlauf wird DC- bzw. HPLC-chromatographisch verfolgt. Nach
beendeter Reaktion wird mit Eisessig unter Eiskühlung angesäuert, der sich bildende
Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und bei Bedarf aus
Ethanol oder Essigester/Heptan umkristallisiert.
Farblose Kristalle
F.: 157-61°C (EtOH)
Ausbeute: 35%
C11H10N2OS2 (250)
MS m/e (%B): M+ 250 (45), 203 (100)
Farblose Kristalle
F.: 157-61°C (EtOH)
Ausbeute: 35%
C11H10N2OS2 (250)
MS m/e (%B): M+ 250 (45), 203 (100)
5 mmol des nach a.) erhaltenen 1-Mercaptomethyl-1,2-dihydro-5H-thiazolo[3,2-
a]chinazolin-5-on werden in eine aus 0,6 ml konz. Schwefelsäure, 1,5 ml Eisessig
und 66 ml Wasser bereitete Säuremischung eingetragen und am Rückfluß unter
chromatografischer Kontrolle bis zum vollständigen Umsatz erhitzt. Der nach dem
Erkalten (evtl. mit Wasser verdünnen) ausgefallene Niederschlag wird abgetrennt,
mit Wasser gewaschen und nach dem Trocknen umkristallisiert.
Farblose Kristalle
F.: 190-95°C
Ausbeute: 40%
C11H12N2O2S2 (268)
IR (KBr, in cm-1): 2558 (SH), 1687 (C=O), 1607 (C=O)
MS m/e (%B): 268 M+ (5%), 221 (15%), 178 (25%), 163 (100%)
Farblose Kristalle
F.: 190-95°C
Ausbeute: 40%
C11H12N2O2S2 (268)
IR (KBr, in cm-1): 2558 (SH), 1687 (C=O), 1607 (C=O)
MS m/e (%B): 268 M+ (5%), 221 (15%), 178 (25%), 163 (100%)
Die Verbindung wird analog Beispiel 1 Teil a) (mit Methylglycol/i-Propanol/DMF
1 : 1 : 2 als Lösungsmittel für die Isothiuroniumsalzsynthese) aus der literaturbekannten
Verbindung (R,S)-2-Brommethyl-1,2-dihydro-5H-thiazolo[3,2-a]chinazolin-5-on (allg.
Formel IIIb, R1 = R2 = Wasserstoff, R3 = Brom) erhalten.
Farblose Kristalle
F.: 145-50°C
Ausbeute: 63%
C11H10N2OS2 (250)
MS m/e (%B): M+ 250 (48%), 203 (100%), 178 (85%)
Farblose Kristalle
F.: 145-50°C
Ausbeute: 63%
C11H10N2OS2 (250)
MS m/e (%B): M+ 250 (48%), 203 (100%), 178 (85%)
Die Verbindung wird analog Beispiel 1 Teil b) aus (R,S)-2-Mercaptomethyl-1,2-
dihydro-5H-thiazolo[3,2-a]chinazolin-5-on durch saure Hydrolyse erhalten.
Farblose Kristalle
F.: 147-51°C
Ausbeute: 83%
C11H12N2O2S2 (268)
IR (KBr, in cm-1): 2547 (SH), 1696 (C=O), 1609 (C=O)
MS m/e (%B): 268 M+ (10%), 235 (60%), 201 (30%), 163 (40%), 132 (100%)
Farblose Kristalle
F.: 147-51°C
Ausbeute: 83%
C11H12N2O2S2 (268)
IR (KBr, in cm-1): 2547 (SH), 1696 (C=O), 1609 (C=O)
MS m/e (%B): 268 M+ (10%), 235 (60%), 201 (30%), 163 (40%), 132 (100%)
Die Verbindung wird analog Beispiel 2 Teil a) (das Isothiuroniumsalz wurde mit i-
Propanol gefällt) aus der literaturbekannten Verbindung (R,S)-3-Brommethyl-2,3-
dihydro-1H,6H-[1,3]thiazino[3,2-a]chinazolin-6-on (allg. Formel IIIc, R1 = R2 =
Wasserstoff, R3 = Brom) erhalten.
Farblose Kristalle
F.: 172-75°C
Ausbeute: 46%
C12H12N2OS2 (264)
MS m/e (%B): M+ 264 (35%), 231 (100%), 199 (30%)
Farblose Kristalle
F.: 172-75°C
Ausbeute: 46%
C12H12N2OS2 (264)
MS m/e (%B): M+ 264 (35%), 231 (100%), 199 (30%)
Die Verbindung wird analog Beispiel 1 Teil b) aus (R,S)-3-Mercaptomethyl-2,3-
dihydro-1H,6H-[1,3]thiazino[3,2-a]chinazolin-6-on durch saure Hydrolyse erhalten.
Farblose Kristalle
F.: 125-28°C
Ausbeute: 40%
C12H14N2O2S2 (282)
IR (KBr, in cm-1): 2553 (SH), 1700 (C=O), 1606 (C=O)
MS m/e (%B): 282): M+ 282 (5%), 249 (45%), 215 (35%), 163 (100%)
Farblose Kristalle
F.: 125-28°C
Ausbeute: 40%
C12H14N2O2S2 (282)
IR (KBr, in cm-1): 2553 (SH), 1700 (C=O), 1606 (C=O)
MS m/e (%B): 282): M+ 282 (5%), 249 (45%), 215 (35%), 163 (100%)
Die MMP-inhibierende Wirkung der Substanzen wird wie folgt bestimmt:
MMP-2 (Gelatinase) wird von kultivierten dermalen Fibroblasten in beträchtlichen
Mengen in das Kulturmedium abgegeben und ist daher leicht zugänglich. Die sezer
nierte und inaktive Proform des Enzyms kann durch Trypsinaktivierung oder durch
Behandlung mit organischen Quecksilberverbindungen in die enzymatisch aktive
Form überführt werden.
Hierzu werden humane dermale Fibroblasten nach etablierten Standardmethoden
gewonnen und kultiviert und der zellfreie Kulturüberstand mit Trypsin behandelt.
Trypsin wird danach mit einem spezifischen Inhibitor (TLCK) inaktiviert und die aktive
MMP-2 durch Affinitätschromatographie an Gelatine-Sepharose und anschließender
Gelfiltration an Sepharose teilgereinigt. Die Identifizierung und Charakterisierung von
MMP-2 erfolgte durch die Verfügbarkeit eines kommerziellen Immuntests.
Ausgehend von den guten Erfahrungen, die wir mit dem Einsatz der katalytischen
Domäne der MMP-8 in den kinetischen Messungen machen konnten, wurden in
analoger Weise noch zwei weitere rekombinante Expressionen etabliert, die der hu
manen membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP; MMP-14) und die der
humanen MMP-3 (Stromelysin-1). Es handelt sich bei beiden Enzymen um jeweils
exemplarische Vertreter von Untergruppen der humanen Matrix Metalloproteinasen.
Beide Proteine können stabil und in katalytisch aktiver Form aus inclusion bodies
transformierter Escherichia coli-Zellen renaturiert werden. Ebenso wie bei der re
kombinanten MMP-8 entfällt somit die nachträgliche Aktivierung der Enzyme, was die
Reproduzierbarkeit der kinetischen Messungen verbessert. Die Reinheit der rekom
binanten Enzymdomänen lag bei wenigstens 70%.
Die Klonierung und Expression der katalytischen Domänen orientierte sich an fol
genden Publikationen: Lichte A, Kolkenbrock H, Tschesche H; The recombinant ca
talytic domain of membrane type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) induces
activation of progelatinase A and progelatinase A complexed with TIMP-2. FEBS Lett
(1996), 397, 277-282 und Ye Q, Johnson LL, Hupe DJ, Baragi V: Purification and
characterization of the human stromelysin catalytic domain expressed in Escherichia
coli. Biochemistry (1992), 31, 11231-11235.
Die Nutzung der katalytischen Domäne der MMP-8 als weiteres Testenzym wurde
deshalb gewählt, da es eine hohe Stabilität besitzt und darüber hinaus als aktives
Enzym vorliegt und deshalb nicht aktiviert werden braucht, was als eine der häufig
sten Fehlerursachen in Frage kommt, da die zur Aktivierung genutzten Quecksilber
verbindungen häufig mit dem Testsystem bzw. dem Enzym interferieren und dadurch
die Messergebnisse verfälschen können. Die Klonierungsstrategie richteten wir da
nach aus, dass wir statt des Gesamtenzyms nur dessen enzymatisch aktive katalyti
sche Domäne in E. coli klonierten. Mit der konstruierten katalytischen Domäne der
MMP-8, erzielten wir ein stabiles, enzymatisch aktives und hochreines Enzym, wel
ches für die Routineuntersuchungen der inhibitorischen Aktivität der synthetisierten
Inhibitoren sehr gut geeignet war und die Messergebnisse der einzelnen Messserien
absolut vergleichbar waren.
Die Klonierung und Expression der rekombinanten katalytischen Domäne der MMP-
8 wurde entsprechend den Angaben von SCHNIERER et al. (Schnierer S, Kleine 1,
Gote T, Hillemann A Knäuper V, Tschesche H: The recombinant catalytic domain of
human neutrophil collagenase lacks type I collagen substrate specificity. Biochem
Biophys Res Comm (1993) vol. 191 No. 2, 319-326) durchgeführt.
Native MMP-9 wurde reproduzierbar und in guter Ausbeute und Reinheit aus huma
nem Buffy Coat gewonnen. Hierzu wird Buffy Coat mit 10% (v/v) Triton X-100 auf
eine Endkonzentration von 0,4% gebracht, 30 min. auf Eis geschüttelt und dann 1 Vol.
2-fach Bindungspuffer (40 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl2, 1 M NaCl, 0,2%
(v/v) Triton X-100) hinzugefügt und weitere 30 min. auf Eis geschüttelt.
Die Lösung wird 15 min. bei 16000 Upm an einem SS-34 Rotor bei 4°C abzentrifu
giert und über Glaswolle filtriert. Das Filtrat wird mit Gelatine-Agarose, welche mit
Bindungspuffer äquilibriert wurde, gebatcht und 1 Std. auf Eis geschüttelt.
Die beladene Gelatine-Agarose wird in eine Säule überführt und mit mindestens 10 Vol.
Bindungspuffer proteinfrei gespült. Die Elution der gebundenen MMP-9 erfolgt
mit 2 Gelvolumen Bindungspuffer plus 5% (v/v) DMSO.
Das Eluat kann zum Puffer-Austausch und gleichzeitiger Abtrennung geringer Verun
reinigungen an MMP-2 über eine Gelfiltration an Sephadex G-75 aufgetrennt werden.
Hierzu wird der Puffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0,1%
(v/v) Triton X-100) verwendet.
Das so gewonnene Eluat enthält MMP-9 in den drei bekannten Zustandsformen: Mo
nomer, Homodimer, Heterodimer. Die Reinheit des Enzyms beträgt ca. 90%, wobei
die restlichen Fremdproteine Fibronektin und äußerst geringe Mengen an TIMP's
sind.
Das latente Enzym wird durch 30-60 min. Inkubation bei 37°C mit 1/100 Vol. Tryp
sin (10 mg/ml) aktiviert. Trypsin wird durch Zugabe von 1 mM PMSF oder mit einem
spezifischen Inhibitor (TLCK) gehemmt.
Durch enzymatische Spaltung des synthetischen Substrates Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-
Dpa-Ala-Arg-NH2 durch die jeweilige Kollagenase, wird die fluoreszente Gruppe Mca
vom internen Quencher Dpa getrennt. Dabei erfolgt eine starke Zunahme der Fluo
reszenz im Messansatz, die am Fluorimeter quantifiziert werden kann (λex 328 nm,
λem 393 nm) und innerhalb der ersten Minuten linear verläuft. Eine gewisse Spezifität
des Tests für Matrix-Metalloproteinasen ergibt sich einerseits aus der Aminosäurese
quenz -Pro-Leu-Gly-Leu- im Substrat und andererseits durch die gewählten Inkuba
tionsbedingungen. Matrix-Metalloproteinasen spalten das Substrat an der Bindung
Gly-Leu. Gemessen wird die proteolytische Restaktivität vorinkubierter Ansätze von
Enzym und Inhibitor, wobei die Substrat- und Enzymkonzentration konstant gehalten
und die Inhibitorkonzentration variiert wurde. Es wurden für jeden getesteten Inhibitor
drei Messreihen mit unterschiedlicher Substratkonzentration aufgenommen.
1984 µl Messpuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2
, 0,05%
Brij 35)
2 µl Inhibitor, gelöst in DMSO, bzw. DMSO allein (nichtinhibierender Ansatz)
4 µl Enzym (MMP-2 oder MMP-9 oder katalytische Domäne der MMP-8)
2 µl Inhibitor, gelöst in DMSO, bzw. DMSO allein (nichtinhibierender Ansatz)
4 µl Enzym (MMP-2 oder MMP-9 oder katalytische Domäne der MMP-8)
- - 5 min. Vorinkubation des Enzym-Inhibitor-Gemischs bei Raumtemperatur unter Rühren
- - Start der Reaktion mit 10 µl Substrat gelöst in DMSO
- - Aufzeichnung der zeitabhängigen Fluoreszenzzunahme über 2 min.
Claims (7)
1. Dimercaptoalkylsubstituierte Chinazolin-2,4-(1H,3H)-dione der allgemeinen
Formeln Ia und Ib
worin bedeuten
R1 = Wasserstoff, Methyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom) Hydroxy, Carboxy
R2 = Wasserstoff, Methyl
n = 1, 2
sowie deren Tautomere und Salze.
worin bedeuten
R1 = Wasserstoff, Methyl, Methoxy, Dimethoxy, Hal (Hal = Fluor, Chlor, Brom) Hydroxy, Carboxy
R2 = Wasserstoff, Methyl
n = 1, 2
sowie deren Tautomere und Salze.
2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel Ia,
dadurch gekennzeichnet, dass
eine vorgegebene Menge der entsprechenden Ausgangsverbindung IIIa in Monomethylglycol eingetragen wird und mit
Thioharnstoff unter DC- oder HPLC-Kontrolle bei einer Badtemperatur von ca. 100° C bis zum vollständigen Umsatz erhitzt wird,
das sich abscheidende Isothiuroniumsalz abgetrennt wird,
dieses in 1 N NaOH unter Zusatz von Ethanol bei einer Badtemperatur von ca 50° C verseift wird,
mit Eisessig unter Kühlung versetzt wird
der gebildete Niederschlag separiert
und an sich bekannter Weise mit Wasser gewaschen und aus Ethanol umkristalli siert wird,
die erhaltene Substanz in eine Säuremischung eingetragen wird, die aus Schwefelsäure, Eisessig und Wasser besteht,
die Mischung erhitzt wird bis zum vollständigen Umsatz,
der nach dem Erkalten ausgefallene Niederschlag abgetrennt
und in an sich bekannter Weise gereinigt wird.
eine vorgegebene Menge der entsprechenden Ausgangsverbindung IIIa in Monomethylglycol eingetragen wird und mit
Thioharnstoff unter DC- oder HPLC-Kontrolle bei einer Badtemperatur von ca. 100° C bis zum vollständigen Umsatz erhitzt wird,
das sich abscheidende Isothiuroniumsalz abgetrennt wird,
dieses in 1 N NaOH unter Zusatz von Ethanol bei einer Badtemperatur von ca 50° C verseift wird,
mit Eisessig unter Kühlung versetzt wird
der gebildete Niederschlag separiert
und an sich bekannter Weise mit Wasser gewaschen und aus Ethanol umkristalli siert wird,
die erhaltene Substanz in eine Säuremischung eingetragen wird, die aus Schwefelsäure, Eisessig und Wasser besteht,
die Mischung erhitzt wird bis zum vollständigen Umsatz,
der nach dem Erkalten ausgefallene Niederschlag abgetrennt
und in an sich bekannter Weise gereinigt wird.
3. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel Ib
dadurch gekennzeichnet, dass
eine vorgegebene Menge der entsprechenden Ausgangsverbindung IIIb mit Thioharnstoff in Methylglycol/i-Propanol/DMF 1 : 1 : 2 als Lösungsmittel im siedenden Wasserbad erwärmt werden
nach Abkühlen das entstandene Isothiuroniumsalz abgetrennt wird,
dieses in 1 N NaOH unter Zusatz von Ethanol bei einer Badtemperatur von ca. 50° C verseift wird, wobei IIb entsteht
dieses sauer hydrolysiert wird und
nach Abkühlen der Niederschlag, bestehend aus Ib, vom Lösungsmittel abgetrennt wird.
eine vorgegebene Menge der entsprechenden Ausgangsverbindung IIIb mit Thioharnstoff in Methylglycol/i-Propanol/DMF 1 : 1 : 2 als Lösungsmittel im siedenden Wasserbad erwärmt werden
nach Abkühlen das entstandene Isothiuroniumsalz abgetrennt wird,
dieses in 1 N NaOH unter Zusatz von Ethanol bei einer Badtemperatur von ca. 50° C verseift wird, wobei IIb entsteht
dieses sauer hydrolysiert wird und
nach Abkühlen der Niederschlag, bestehend aus Ib, vom Lösungsmittel abgetrennt wird.
4. Verwendung von Verbindungen der Formel Ia als Matrix-Metalloproteinase-
Inhibitoren.
5. Verwendung von Verbindungen der Formel Ib als Matrix-Metalloproteinase-
Inhibitoren.
6. Verwendung von Verbindungen der Formel Ia als MMP-Inhibitoren nach An
spruch 4,
dadurch gekennzeichnet, dass
1-(1',3'-Dimercapto-prop-2'-yl)-chinazolin-2,4(1H,3H)-dion
eingesetzt wird.
7. Verwendung von Verbindungen der Formel IIa als MMP-Inhibitoren nach An
spruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass
(R,S)-1-(2',3'-Dimercapto-prop-1'-yl)-chinazolin-2,4(1H,3H)-dion und/oder (R,S)-1-
(3',4'-Dimercapto-but-1'-yl)-chinazolin-2,4(1H,3H)-dion
eingesetzt werden.
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2001
- 2001-01-13 DE DE10101324A patent/DE10101324C1/de not_active Expired - Fee Related
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- 2001-12-20 US US10/250,988 patent/US20040044013A1/en not_active Abandoned
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- 2001-12-20 AU AU2001298054A patent/AU2001298054A1/en not_active Abandoned
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