DE10217814A1

DE10217814A1 - Neue tricyclische Mercaptane, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel

Info

Publication number: DE10217814A1
Application number: DE10217814A
Authority: DE
Inventors: Uwe Klausmeier; Jochen Heinicke
Original assignee: IBFB Pharma GmbH
Current assignee: IBFB Pharma GmbH
Priority date: 2002-04-22
Filing date: 2002-04-22
Publication date: 2003-11-13
Also published as: WO2003089441A1; AU2003232486A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Tricyclische Mercaptane, deren Tautomere, Stereoisomere, physiologisch verträgliche Salze mit anorganischen und organischen Basen und Säuren und dergleichen, die als Metalloproteinase (MMP)-Inhibitoren eine Zukunft haben. Sie können als Arzneimittel Verwendung finden zur Behandlung von Rheuma, unspezifischen Entzündungsreaktionen, unter anderem bei Sonnenbrand und bei Allergien. Ein Einsatz in der Krebstherapie erscheint möglich.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft tricyclische Mercaptane der allgemeinen Formel I

deren Tautomere, deren Stereoisomere, deren Gemische, deren Prodrugs und deren Salze, insbesondere deren physiologisch verträgliche Salze mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen, welche wertvolle Eigenschaften aufweisen.
In der obigen allgemeinen Formel I bedeuten:
n die Zahlen 0 oder 1,
R1 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,
A ein anellierter 5- bis 7-gliedriger Cycloalkylring oder ein über zwei Kohlenstoffatome gebundener 5- bis 7-gliedriger Cycloheteroalkylring mit einem Sauerstoff- oder Schwefelatom, oder ein über zwei Kohlenstoffatome gebundener Heteroaromat.
Unter dem vorstehend erwähnten Heteroaromat ist ein 6-gliedriger Heteroaromat, enthaltend ein, zwei oder drei Stickstoffatome oder ein 5-gliedriger Heteroaromat, enthaltend eine gegebenenfalls durch eine C1-C3-Alkylgruppe substituierte Iminogruppe, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine gegebenenfalls durch eine C1- C3-Alkylgruppe substituierte Iminogruppe und ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder ein oder zwei Stickstoffatome zu verstehen, wobei der Heteroaromat im Kohlenstoffgerüst durch einen wie unten definierten Rest R2 mono-, di- oder trisubstituiert sein kann und die Substituenten gleich oder verschieden sei können.
R2 bedeutet ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatom, eine geradkettige oder verzweigte C₁-C₆-Alkylgruppe, eine C₁-C₃-Alkylthiogruppe, einen Cyano-, Trifluormethyl-, Benzyl- oder Phenylrest, wobei diese Aromaten gegebenenfalls mit einer C1- C3-Alkylgruppe oder einem Halogenatom (Fluor, Chlor, Brom oder Iod) oder einem Rest der allgemeinen Formeln -OR3, -COR3, -SO2R3, -OCOR4, -COOR4, - CONR4R5, -SO2NR4R5 oder -NR4R5 substituiert sein können, worin bedeuten:
R3 Wasserstoff, eine geradkettige oder verzweigte C1-C4-Alkylgruppe oder eine C3- C6-Cycloalkylgruppe; R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder ein gegebenenfalls durch Methoxy mono-, di- oder trisubstituiertes Benzyl, eine geradkettige oder verzweigte C1-C4-Alkylgruppe, oder R4 und R5 bilden gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6-gliedrigen Ring, der als weiteres Heteroatom Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff enthalten und gegebenenfalls im Kohlenstoffgerüst mit einer geradkettigen oder verzweigten C1-C4-Alkylgruppe oder einem Benzylrest substituiert sein kann; oder
R2 bedeutet, wenn A Thieno ist, außerdem einen anellierten C4-C7-Cycloalkylring, der ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom enthalten kann, wobei das Stickstoffatom gegebenenfalls mit einer geradkettigen oder verzweigten C1-C4- Alkylgruppe, einem Phenyl- oder Benzylrest substituiert sein kann und die Aromaten gegebenenfalls mit einer C1-C3-Alkyl-, einer C1-C3-Alkoxygruppe oder einem Halogenatom (Fluor, Chlor, Brom oder Iod) substituiert sein können.
Die erfindungsgemäßen Tricyclen der allgemeinen Formel I enthalten ein asymmetrisches Kohlenstoffatom im Thiazolo- bzw. Thiazinoring. Darüber hinaus können bei entsprechender Substitution weitere Asymmetriezentren vorhanden sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen der allgemeinen Formel I in Form ihrer Racemate, ihrer Enantiomeren und gegebenenfalls in Form ihrer Diastereomeren sowie der möglichen Gemische aus diesen.
Die erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formel I können gegebenenfalls nach an sich bekannten Methoden (vgl. z. B. Allinger, N. L. und Elliel E. L. in "Topics in Stereochemistry" Vol. 6, Wiley Interscience, 1971) in ihre Enantiomere und/oder Diastereomere aufgetrennt werden.
Die Enantiomerentrennung erfolgt vorzugsweise durch Chromatographie an chiralen Phasen oder durch Umkristallisieren aus einem optisch aktiven Lösungsmittel oder durch Umsetzung mit einer mit der racemischen Verbindung diastereomere Derivate (z. B. Salze, Ester, Disulfide) bildenden chiralen Substanz, insbesondere Carbonsäuren und ihre aktivierten Derivate, Trennen des auf diese Weise erhaltenen Diastereomerengemisches (z. B. durch Chromatographie und/oder Kristallisation) und anschließende Freisetzung der reinen Enantiomeren mit einem geeigneten Reagens.
Bei Verbindungen der allgemeinen Formel I mit zwei Asymmetriezentren kann zunächst das vorliegende Diastereomerengemisch nach an sich bekannten Methoden (z. B. Säulenchromatographie und/oder Kristallisation) in die reinen Diastereomeren aufgetrennt und anschließend wie oben erwähnt diese Diastereomeren in die entsprechenden Enantiomeren getrennt werden.
Alternativ können dem Fachmann an sich bekannte Methoden der asymmetrischen Synthese bzw. enantiomerenreine Synthesebausteine eingesetzt werden.
Gegenstand vorliegender Erfindung sind ferner Prodrugs der Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen die Mercaptofunktion mit einem in vivo abspaltbaren Rest substituiert ist. Beispiele für in vivo abspaltbare Reste sind Acylgruppen, Acyloxycarbonylgruppen, Alkoxycarbonylgruppen, Carbamoylgruppen, Phosphatreste. Ferner kommen auch die Disulfide, Isothiuroniumsalze, Thiosulfate (BUNTE-Salze) von Verbindungen der allgemeinen Formel I als in vivo in die freien Mercaptane überführbare Prodrugs in Betracht.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der obigen allgemeinen Formel I mit n sowie R1 bis R5 wie vorstehend definiert und A ist ein anellierter fünf bis siebengliedriger Cycloalkylring oder ein über zwei Kohlenstoffatome gebundener fünf- bis siebengliedriger Cycloheteroalkylring mit einem Schwefelatom, oder ein über zwei Kohlenstoffatome gebundener Heteroaromat.
Unter dem vorstehend erwähnten Heteroaromat ist ein 6-gliedriger Heteroaromat, enthaltend ein oder zwei Stickstoffatome, oder ein 5-gliedriger Heteroaromat, enthaltend ein Schwefelatom zu verstehen, wobei der Heteroaromat im Kohlenstoffgerüst durch einen wie oben definierten Rest R2 mono- oder disubstituiert sein kann und die Substituenten gleich oder verschieden sei können.
Die erstmals hergestellten Verbindungen könnten als MMP-Inhibitoren Bedeutung erlangen.

Auf dem Gebiet der Entwicklung effizienter, niedermolekularer und nichtproteinogener MMP Inhibitoren wird weltweit intensiv geforscht. Es ist bekannt, dass physiologisch die enzymatische Aktivität der MMPs unter einer strikten, abgestimmten Regulation zwischen Aktivierung und Hemmung steht. Hierzu existieren im Organismus spezielle Proteine, die sog. Tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases (TIMP's), die in der Lage sind, die Aktivität von MMPs schnell und effizient zu hemmen (Nagase, H. et al.; Engineering of selective TIMPs. 1-11; In: Inhibition of Matrix Metalloproteinases - Therapeutic Application (Eds. Greenwald RA, Zucker, S., Golub, LM.) Ann NY Acad Sci 878 (1999). Eine ungebremste enzymatische Aktivität dieser Enzyme führt besonders bei den rheumatischen Erkrankungen zum Abbau der Knorpelsubstanz und - pathologisch bedeutsam - zu chronisch-schmerzhaften Veränderungen an den Gelenken (Goldbach-Mansky, R. et al.: Active synovial matrix metalloproteinase-2 is associated with radiographic erosions in patients with early synovitis. Arthritis Res 2 (2000) 145-153).

Ein weiteres Beispiel für die pathologische Wirkung von MMPs ist bei der Invasion und Metastasierung von Tumoren gegeben. Freigesetzte und aktivierte MMPs schneiden einen Weg durch dichtes kollagenes Bindegewebe und insbesondere auch durch die Basalmembran der Gefäße und ermöglichen es dadurch den Krebszellen aus dem Tumorverband auszuwandern, in das Gefäßsystem einzuwandern und an anderer Stelle Tochtergeschwülste zu bilden. MMPs spielen eine weitere entscheidende Rolle bei der Blutgefäßversorgung des wachsenden Tumors, indem sie den Weg für die neugebildeten Blutgefäße durch das kollagene Bindegewebe freischneiden und somit für diese Vaskularisation des wachsenden Tumors verantwortlich sind (Shapiro, SD.: Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Current Opinion in Cell Biology 10 (1998) 602-608).

Als weiteres relevantes medizinisches Ergebnis unzureichend gebremster Wirkung von MMPs ist das UV-induzierte Erythem zu nennen, das u. a. als Folge einer intensiven Sonnenbestrahlung auftritt. Durch die energiereichen UV-Strahlen des Sonnenlichtes bzw. von Bräunungsgeräten werden u. a. die inaktiven Prokollagenasen in der bestrahlten Haut aktiviert, die in der Folge Kollagen des Bindegewebes und der Blutkapillaren spalten und dadurch für die Symptome eines Sonnenbrandes verantwortlich zeichnen.

Bei diesen exemplarisch aufgezeigten pathologischen Wirkungen der ungebremsten enzymatischen Aktion von MMPs, können deren Folgeerscheinungen durch stabile MMP-Inhibitoren verhindert bzw. wesentlich gemildert werden. Es ist faszinierend die Vorstellung zu realisieren, diese Enzyme durch spezifische Inhibitoren gezielt zu hemmen, um dadurch zum Beispiel eine fortschreitende Knorpeldestruktion bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises zu unterbrechen, oder das Wachstum bzw. die Metastasierung von Tumoren zu verhindern.

Es sind bereits zahlreiche Verfahren zur Gewinnung von Verbindungen mit MMP- inhibierender Wirkung bekannt. Diese Wirkstoffe der ersten Generation besitzen in aller Regel eine proteinogene Struktur und weisen eine strukturelle Verwandtschaft zu natürlichen Inhibitoren auf, bei denen es sich um spezielle Proteine handelt. Diese proteinogenen oder pseudoproteinogenen Substratanaloga besitzen als Strukturelement eine zinkbindende Gruppe, die das Zinkion im aktiven Zentrum der MMPs chelatisiert.

Bezüglich einer therapeutischen Anwendung weisen alle derartigen proteinogenen bzw. nichtproteinogenen Wirkstoffe eine Reihe von Nachteilen auf, wie ungenügende Resorbierbarkeit, in aller Regel kurze Halbwertszeiten, eine nur geringe Stabilität, sowie häufig unerwünschte Nebenwirkungen (Inhibition of Matrix Metalloproteinases - Therapeutic Application (Eds. Greenwald, RA., Zucker, S., Golub, Litt) Ann NY Acad Sci 878 (1999)).

Weitere Entwicklungen auf diesem Gebiet erbrachten beispielsweise Phosphonamid-Inhibitoren, Piperazin-Inhibitoren, Sulfonamid-Inhibitoren, Carbamat-Inhibitoren, Diazepin-Inhibitoren, Tetracyclin-Inhibitoren und nicht zuletzt Hydroxamat-Inhibitoren (Skotnick, i JS. et al.: Design and synthetic considerations of matrix metalloproteinase inhibitors. 61-72 In: Inhibition of Matrix Metalloproteinases - Therapeutic Application (Eds. Greenwald, RA., Zucker, S., Golub, LM.) Ann NY Acad Sci 878 (1999)). Die meisten dieser entwickelten Inhibitoren weisen zwar in vitro beeindruckende Hemmwirkungen und Spezifitäten auf, zeigten aber bei in vivo Anwendungen im Tierversuch und beim Menschen eine Reihe von schwerwiegenden Nachteilen. Im Vordergrund standen hierbei zytotoxische Reaktionen auf eine Vielzahl von Zellen, eine schlechte Bioverfügbarkeit und unerwünschte Nebenwirkungen, insbesondere eine negative Beeinflussung des Bewegungsapparates.

Die Erfindung verfolgt das Ziel, dem dringenden Bedarf an Arzneimitteln mit nichtproteinogener Struktur zu entsprechen, welche die Nachteile der Wirkstoffe, die bisher am Markt sind, nicht aufweisen. Insbesondere besteht Bedarf an neuen Wirkstoffen mit MMP-inhibierender Wirkung, die ausreichend stabil und gut resorbierbar sind, bessere pharmakokinetische Eigenschaften besitzen und vor allen Dingen keine unerwünschten Nebenwirkungen und zytotoxische Reaktionen aufweisen.

Die Erfindung hat deshalb die Aufgabe, neue chemische Substanzen nichtproteinogener Struktur aufzufinden, die eine MMP-inhibierende Wirkung zeigen. Es ist weiter Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen als auch entsprechende Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, welche diese Verbindungen enthalten.

Die neuen tricyclischen Mercaptane der allgemeinen Formel I zeigen überraschende, deutliche MMP-inhibierende Wirkungen, welche aus bisher bekannten Struktur-Wirkungsbeziehungen nicht ableitbar sind.

Durch Testung der neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I an unterschiedlichen humanen MMPs (MMP-2, rekombinante katalytische Domäne der MMP-3, rekombinante katalytische Domäne der MMP-8, MMP-9, rekombinante katalytische Domäne der MMP-14) werden die Wirksamkeit und z. T. auch Spezifitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen belegt. Spezifische Inhibitoren würden besonders beim Einsatz als Arzneimittel nur die gewünschten Zielenzyme beeinflussen und nicht das ausbalancierte Zusammenspiel der anderen MMPs stören und somit mögliche unerwünschte Nebenwirkungen vermeiden helfen.

Die erfindungsgemäßen Mercaptane der obigen allgemeinen Formel I können durch Umsetzung der analogen Jodide, Bromide, Chloride oder Tosylate der allgemeinen Formel II,

worin A, n, R1, R2, R3, R4, R5 wie eingangs erwähnt definiert sind und
X = Chlor, Brom, Iod, Tosyl, Mesyl
mit einem schwefelübertragenden Agens, vorzugsweise Thioharnstoff, in einem inerten Lösungsmittel und anschließende schonende Verseifung der isolierten Zwischenstufen, vorzugsweise der Isothiuroniumsalze, hergestellt werden.

Tricyclische Vorstufen der allgemeinen Formel II können durch Cyclisierung der entsprechenden N3-allyl- bzw. butenyl-substituierten Pyrimidin-2(1H)-thion-4(3H)-one der allgemeinen Formel III

worin A, n, R1, R2, R3, R4, R5 wie eingangs erwähnt definiert sind,
mit Brom in Eisessig oder N-Bromsuccinimid in THF erhalten werden.

Der Zugang zu Zwischenstufen der allgemeinen Formel III erfolgt in Analogie zu Chinazolin-2,4(1H,3H)-dion-Synthesen ausgehend von den zu den entsprechenden Anthranilsäurederivaten analogen Vorstufen.

Beispielsweise wird ein Aminocarbonsäurederivat der allgemeinen Formel IV

worin A, R2, R3, R4, R5 wie eingangs erwähnt definiert sind und Y = -OH, -NH₂, -OR6 mit R6 = Alkyl oder Alkenyl von C1 bis C4, verzweigt und unverzweigt sein kann, umgesetzt mit einem Isothiocyanat der allgemeinen Formel V

worin n = 0 oder 1 und R1 = Wasserstoff oder Methyl sein können. Die hierbei zunächst entstehenden Thioharnstoffe cyclisieren thermisch und/oder basenkatalysiert zu den entsprechenden N3-allyl- bzw. butenyl-substituierten Pyrimidin-2(1H)-thion- 4(3H)-onen der allgemeinen Formel III.

Ferner kann beispielsweise auch ein Isothiocyanat der allgemeinen VI

worin A, R2, R3, R4, R5 wie eingangs erwähnt definiert sind und
R6 = Alkyl oder Alkenyl von C1 bis C4, verzweigt und unverzweigt sein kann mit einem Amin der allgemeinen Formel VII

worin n = 0 oder 1 und R1 = Wasserstoff oder Methyl bedeuten können umgesetzt werden. Die hierbei zunächst entstehenden Thioharnstoffe cyclisieren wie oben beschrieben zu den entsprechenden N3-allyl- bzw. butenyl-substituierten Pyrimidin- 2(1H)-thion-4(3H)-onen der allgemeinen Formel III.

Desweiteren können die Zwischenstufen der allgemeinen Formel III auch durch Aminolyse von Vorstufen der allgemeinen Formel IV, worin A, R2, R3, R4, R5 wie eingangs erwähnt definiert sind und Y = -OR6 mit R6 = Alkyl oder Alkenyl von C1 bis C4, verzweigt und unverzweigt ist mit einem ungesättigten Amin der allgemeinen Formel VII und anschließende Umsetzung mit einem die Thiocarbonylgruppe einführenden Reagenz wie Thiophosgen oder Xanthogenat nach an sich bekannten Verfahren erhalten werden.

Die Ausgangsverbindungen bzw. Zwischenstufen der allgemeinen Formeln II bis VII sind teilweise kommerziell erhältlich, teilweise literaturbekannt oder dem Fachmann nach literaturbekannten Verfahren zugänglich.

Der Aufbau der erfindungsgemäßen tricyclischen Systeme ist dabei einerseits möglich ausgehend vom Ring A, d. h. heterocyclischen Anthranilsäureanaloga, deren Darstellungsvarianten verschiedentlich beschrieben wurden. Als zusammenfassende Literatur siehe z. B.: Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl) Thieme Verlag, Stuttgart, Bd. E 8b (1994) S. 1 ff. und Bd. E 8a (1993) S. 668 ff. (Thiazole); Bd. E 6a (1994) S. 556 ff. (Pyrrole); Bd. E 8b (1994) S. 399 ff. (Pyrazole); Bd. E 6 (1994) S. 186 ff. (Thiophene); Bd. 9b/I (1998) S. 8 ff. (Pyrimidine); Bd. 9b/I (1998) S. 250 ff. (Pyrazine); O. Meth-Cohn (Ed.), Comprehensive heterocyclic Chemistry, Pergamon Press, Oxford, 1996; The Chemistry of heterocyclic Compounds, Wiley Interscience, New York, Bd. I (1950) u. ff.

Als Beispiele für spezielle Zugänge zu Synthesebausteinen des Typs A (heterocyclische β-Enaminocarbonsäuredeivate) werden genannt: R. W Sabnis, nen, The Gewald Synthesis, Sulfur Reports 96 (1994) S. 1 ff. (Thiophene); R. W. Sabnis, D. W Ragnekar, N. D. Sonawane, 2 Aminothiophenes by the Gewald Reaction, J. Heterocyclic Chem. 36 (1999) 333 ff. (Thiophene); Briel, D, Maschke, T, Wagner, G., Synthese von Thieno[3,3-d]- und [3,4-d]pyrimidinen durch alternative Ringschlussreaktionen, Pharmazie 47 (1992) 577 ff. (Thiophene); Dave, C. G., Synthesis and Reactions of Fluoroaryl Substituted 2-Amino-3-cyanopyrroles and Pyrrolo[2,3- d]pyrimidines, J. Heterocyclic Chem. 36 (1999) 729 ff. (Pyrrole); Lim, M., Klein, R. S., Fox, J. J., A New Synthesis of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidines via 3-Amino-2- carboalkoxypyrroles, J. Org. Chem. 44 (1979) 3826 ff. (Pyrrole); Hanning, E., Beyer, G., Laban, G., Pharmazie 41 (1986) 381 ff. (Pyrazole); Bridson, P. K., Wang, X., 1- Substituted Xanthines, Synthesis 1995 S. 855 ff. (Imidazole).

Andererseits sind auch verschiedene Synthesen für heterocyclisch anellierte Pyrimidine bekannt, bei denen der Aufbau des Grundsystems ausgehend von entsprechend substituierten Pyrimidinen erfolgt, z. B.: EI Ahl, A. A. S. u. a., A One-Pot Synthesis of Pyrido[2,3-d]- and Quinolino[2,3-d]pyrimidines, Heterocycles 55 (2001) 1315 ff.; Falch, E., Synthesis and Structure Determination of Thiazolo- and Thiazinopteridinones, Acta Chemiea Scandinavica B 31 (1977) 167 ff; Cottam, H. B. u. a., Substituted Xanthines, Pteridinediones and Related Compounds as Potential Antiinflammatory Agents. Synthesis and Biological Evaluation of Inhibitors of Tumor Necrosis Factor α, J. Med. Chem. 39 (1996) 2 ff.; Bhuyan, Studies on Uracils: A Facile One- Pot Synthesis of Pyrazolo[3,4-d]pyrimidines, Tetrahedron Lett. 43 (2002) 895 ff.

Bei den vorstehend beschriebenen bzw. zitierten Umsetzungen können gegebenenfalls vorhandene reaktive Gruppen durch übliche Schutzgruppen (siehe z. B. Greene, T. W, Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Aufl. 1991 Wiley & Sons, New York) geschützt werden. Hierbei sind für den Fachmann die Notwendigkeit und Art der benötigten Schutzgruppe aus Substitutionsmuster und Reaktionstyp erkennbar.

Ferner kann der Fachmann erkennen, ob Art und Reihenfolge der beschriebenen bzw. zitierten Syntheseschritte zum Zwecke der Optimierung der Bildung der erfindungsgemäßen Tricyclen in Abhängigkeit vom konkreten Substitutionsmuster variiert werden können.

Die Erfindung soll nachstehend an Beispielen näher erläutert werden, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Herstellung von (R,S)-2-Mercaptomethyl-2,3,6,7,8,9-hexahydro-5H-benzo[4,5]thieno[2,3-d]thiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on

(Formel I, n = 0, R1 = H, A = Thieno mit R2 = anellisrter Cyclohexylring)
10 mmol der literaturbekannten Verbindung (R,S)-2-Brommethyl-2,3,6,7,8,9- hexahydro-5H-benzo[4,5]thieno[2,3-d]thiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on, allgemeine Formel II mit n = 0, R1 = H, A = Thieno mit R2 = anellierter Cyclohexylring und X = Br (Vgl. Smolanka, I. V. u. a., Chem. Heterocycl. Compd. (Engl. Transl.) EN; 9; 1973; 1169-1170) werden in 30 ml THF/Ethanol 1 : 1 eingetragen und mit 12 mmol Thioharnstoff unter DC- bzw. HPLC-Kontrolle bei einer Badtemperatur von ca. 100°C bis zum vollständigen Umsatz erhitzt. Wenn beim Abkühlen keine Kristallisation einsetzt, wird mit Essigester bis zur Trübung versetzt und das sich dann abscheidende Isothiuroniumsalz abgetrennt. Dieses wird in 1 N NaOH unter Zusatz von etwas Ethanol und unter Stickstoffatmosphäre bei einer Badtemperatur von 50°C verseift. Der Reaktionsverlauf wird DC- bzw. HPLC-chromatographisch verfolgt. Nach beendeter Reaktion wird mit 1N HCl unter Eiskühlung angesäuert, der sich bildende Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und bei Bedarf aus Ethanol oder Essigester/Heptan umkristallisiert.
Farblose Kristalle
F.: 163-167°C
Ausbeute: 81%
C₁₃H₁₄N₂OS₃ (310)
MS m/e (%B): M⁺ 310 (100), 282 (38), 263 (20)

Beispiel 2

(R,S)-2-Mercaptomethyl-7-phenyl-2,3-dihydro-5H-thiazolo[3,2-a]thieno[2,3- d]pyrimidin-5-on

(Formel I, n = 0, R1 = H, A = thieno mit R2 = Phenyl)
10 mmol des analog dem Edukt von Beispiel 1 erhaltenen (R,S)-2-Brommethyl-7-phenyl-2,3-dihydro-5H-thiazolo[3,2-a]thieno[2,3-d]pyrimidin-5-on (Formel I, n = 0, R1 = H, A = thieno mit R2 = Phenyl, X = Br, farblose Kristalle, F: 192-194°C (Isopropanol)) werden mit Thioharnstoff in Monomethylglycol/DMF 9 : 1 in Suspension analog der Vorschrift in Beispiel 1 umgesetzt und ebenfalls analog Beispiel 1 in das Mercaptan überführt.
Hellbeiges Pulver.
F.: 165-170°C (Isopropanol)
Ausbeute: 53%
C₁₅H₁₂N₂OS₂ (333)
MS m/e (%B): M⁺ 332 (32), 298 (48),

Beispiel 3

(R,S)-6-Mercaptomethyl-6,7-dihydro-thiazolo[3,2-a]thieno[3,2-d]pyrimidin-9-on

(Formel I, n = 0, R1 = H, A = thieno)
10 mmol des analog dem Edukt von Beispiel 1 erhaltenen (R,S)-6-Brommethyl-6,7- dihydro-thiazolo[3,2-a]thieno[3,2-d]pyrimidin-9-on (Formel II, n = 0, R1 = H, A = thieno, X = Br, ockerfarbener Feststoff, F. 150-155°C (Zers., aus EtOH/EtOAc)), werden analog der Vorschrift in Beispiel 1 umgesetzt.
Farbloser Feststoff.
F.: 124°C (Ethanol)
Ausbeute: 36%
C₉H₈N₂OS₃ (256)
MS m/e (%B): M⁺ 256(62), 209 (100), 181 (29)

Beispiel 4

(R,S)-6-Methyl-6-mercaptomethyl-6,7-dihydro-thiazolo[3,2-a]thieno[3,2- d]pyrimidin-9-on

(Formel I, n = 0, R1 = Methyl, A = thieno)
10 mmol des analog dem Edukt von Beispiel 1 erhaltenen (R,S)-6- Brommethyl-6- methyl-6,7-dihydro-thiazolo[3,2-a]thieno[3,2-d]pyrimidin-9-on (Formel II, n = 0, R1 = Methyl, A = thieno, X = Br, rosafarbener Feststoff, F. 150-153°C (Ethanol)), werden analog der Vorschrift in Beispiel 1 umgesetzt.
Farbloser Feststoff.
F.: 102-104°C (Ethanol)
Ausbeute: 39%
C₁₀H₁₀N₂OS₃ (270)
MS m/e (%B): M⁺ 270(43), 237 (13), 223 (100)

Präparation von Matrix-Metalloproteinase-2 (MMP-2)

MMP-2 (Gelatinase) wird von kultivierten dermalen Fibroblasten in beträchtlichen Mengen in das Kulturmedium abgegeben und ist daher leicht zugänglich. Die sezernierte und inaktive Proform des Enzyms kann durch Trypsinaktivierung oder durch Behandlung mit organischen Quecksilberverbindungen in die enzymatisch aktive Form überführt werden.
Hierzu werden humane dermale Fibroblasten nach etablierten Standardmethoden gewonnen und kultiviert und der zellfreie Kulturüberstand mit Trypsin behandelt. Trypsin wird danach mit einem spezifischen Inhibitor (TLCK) inaktiviert und die aktive MMP-2 durch Affinitätschromatographie an Gelatine-Sepharose und anschließender Gelfiltration an Sepharose teilgereinigt. Die Identifizierung und Charakterisierung von MMP-2 erfolgte durch die Verfügbarkeit eines kommerziellen Immuntests.

Präparation der humanen Kollagenase MMP-9

Native MMP-9 wurde reproduzierbar und in guter Ausbeute und Reinheit aus humanem Buffy Coat gewonnen. Hierzu wird Buffy Coat mit 10% (v/v) Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 0,4% gebracht, 30 min. auf Eis geschüttelt und dann 1 Vol. 2- fach Bindungspuffer (40 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 1 M NaCl, 0,2% (v/v) Triton X-100) hinzugefügt und weitere 30 min. auf Eis geschüttelt.
Die Lösung wird 15 min. bei 16 000 Upm an einem SS-34 Rotor bei 4°C abzentrifugiert und über Glaswolle filtriert. Das Filtrat wird mit Gelatine-Agarose, welche mit Bindungspuffer äquilibriert wurde, gebatcht und 1 Std. auf Eis geschüttelt.
Die beladene Gelatine-Agarose wird in eine Säule überführt und mit mindestens 10 Vol. Bindungspuffer proteinfrei gespült. Die Elution der gebundenen MMP-9 erfolgt mit 2 Gelvolumen Bindungspuffer plus 5% (v/v) DMSO.
Das Eluat kann zum Puffer-Austausch und gleichzeitiger Abtrennung geringer Verunreinigungen an MMP-2 über eine Gelfiltration an Sephadex G-75 aufgetrennt werden. Hierzu wird der Puffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM CaCl₂, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100) verwendet.
Das so gewonnene Eluat enthält MMP-9 in den drei bekannten Zustandsformen: Monomer, Homodimer, Heterodimer. Die Reinheit des Enzyms beträgt ca. 90%, wobei die restlichen Fremdproteine Fibronektin und äußerst geringe Mengen an TIMP's sind.
Das latente Enzym wird durch 30-60 min. Inkubation bei 37°C mit 1/100 Vol. Trypsin (10 mg/ml) aktiviert. Trypsin wird durch Zugabe von 1 mM PMSF oder mit einem spezifischen Inhibitor (TLCK) gehemmt.

Klonierung und Expression der katalytischen Domäne der MMP-8

Die Nutzung der katalytischen Domäne der MMP-8 als weiteres Testenzym wird deshalb gewählt, da es eine hohe Stabilität besitzt und darüber hinaus als aktives Enzym vorliegt und deshalb nicht aktiviert zu werden braucht, was als eine der häufigsten Fehlerursachen in Frage kommt, da die zur Aktivierung genutzten Quecksilberverbindungen häufig mit dem Testsystem bzw. dem Enzym interferieren und dadurch die Messergebnisse verfälschen können. Die Klonierungsstrategie richten wir danach aus, dass statt des Gesamtenzyms nur dessen enzymatisch aktive katalytische Domäne in E. coli kloniert wird. Mit der konstruierten katalytischen Domäne der MMP-8, erzielen wir ein stabiles, enzymatisch aktives und hochreines Enzym, welches für die Routineuntersuchungen der inhibitorischen Aktivität der synthetisierten Inhibitoren sehr gut geeignet und die Messergebnisse der einzelnen Messserien absolut vergleichbar werden läßt.
Die Klonierung und Expression der rekombinanten katalytischen Domäne der MMP-8 wurde entsprechend den Angaben von SCHNIERER et al. (Schnierer S. Kleine T, Gote T, Hillemann A Knäuper V, Tschesche H: The recombinant catalytic domain of human neutrophil collagenase lacks type I collagen substrate specificity. Biochem Biophys Res Comm (1993) vol. 191 No. 2, 319-326) durchgeführt.

Quantitativer Fluoreszenz-Assay für Matrix-Metalloproteinasen

Durch enzymatische Spaltung des synthetischen Substrates Mca-Pro-Leu-Gly-Leu- Dpa-Ala-Arg-NH₂ durch die jeweilige Kollagenase, wird die fluoreszente Gruppe Mca vom internen Quencher Dpa getrennt. Dabei erfolgt eine starke Zunahme der Fluoreszenz im Messansatz, die am Fluorimeter quantifiziert werden kann (λ_ex 328 nm, λ_em 393 nm) und innerhalb der ersten Minuten linear verläuft. Eine gewisse Spezifität des Tests für Matrix-Metalloproteinasen ergibt sich einerseits aus der Aminosäuresequenz -Pro-Leu-Gly-Leu- im Substrat und andererseits durch die gewählten Inkubationsbedingungen. Matrix-Metalloproteinasen spalten das Substrat an der Bindung Gly- Leu. Gemessen wird die proteolytische Restaktivität vorinkubierter Ansätze von Enzym und Inhibitor, wobei die Substrat- und Enzymkonzentration konstant gehalten und die Inhibitorkonzentration variiert wurde. Es wurden für jeden getesteten Inhibitor drei Messreihen mit unterschiedlicher Substratkonzentration aufgenommen. Aus der zeitabhängigen Fluoreszenzzunahme wird die Enzymaktivität in Fluoreszenzeinheiten pro min berechnet. Die Bestimmung der K_i-Werte erfolgte graphisch nach der Methode von DIXON (1953) durch Auftragung der reziproken Reaktionsgeschwindigkeit 1/v (y-Achse) gegen Inhibitorkonzentration (x-Achse).

Assay

1984 µl Messpuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 0,05% Brij 35)
2 µl Inhibitorlösung in DMSO, bzw. DMSO allein (nichtinhibierender Ansatz)
4 µl Enzym (MMP-2 oder MMP-9 oder katalytische Domäne der MMP-8)

- 5 min. Vorinkubation des Enzym-Inhibitor-Gemischs bei Raumtemperatur unter Rühren
- Start der Reaktion mit 10 µl Substrat gelöst in DMSO
- Aufzeichnung der zeitabhängigen Fluoreszenzzunahme über 2 min.

Hemmung von humanen MMPs durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren der allgemeinen Formel I

Claims

1. Neue tricyclische Mercaptane der allgemeinen Formel I

deren Tautomere, Stereoisomere, Gemische, Prodrugs und Salze, wobei in der Formel I die Indices bedeuten:
n = 0, 1
R1 = H, CH3
A = anellierter fünf- bis siebengliedriger Cycloalkylring oder ein anellierter fünf- bis siebengliedriger Cycloheteroalkylring mit einem Sauerstoff- oder Schwefelatom oder ein
über zwei Kohlenstoffatome gebundener Heteroaromat, dieser
sechsgliedrig mit einem, zwei oder drei Stickstoffatomen als Heteroatomen oder
fünfgliedrig mit einem Stickstoffatom, das durch eine C1- bis C3- Alkylgruppe substituiert sein kann oder
fünfgliedrig mit einem Sauerstoff- oder Schwefelatom oder
fünfgliedrig mit einem Stickstoffatom, das durch eine C1- bis C3- Alkylgruppe substituiert sein kann sowie einem Sauerstoff- oder einem Schwefelatom oder
fünfgliedrig mit zwei Stickstoffatomen als Heteroatomen, wobei die C- Atome im Heteroaromaten durch einen wie nachstehend definierten Rest R2 mono-, di- oder trisubstituiert sein und die Substituenten gleich oder verschieden sein können
R2 = Fluor, Chlor, Brom, Iod, Alkyl C1 bis C6 geradkettig oder verzweigt, Alkylthio C1 bis C3, Cyano, Trifluormethyl, Benzyl, Phenyl, wobei die beiden letztgenannten aromatischen Reste wie folgt substituiert sein können:
Alkyl C1 bis C3, Halogen F, Cl, Br, I, OR3, COR3, SO2R3, OCOR4, COOR4, CONR4R5, SO2NR4R5, NR4R5 mit
R3 = H, Alkyl C1 bis C4 geradkettig oder verzweigt, Cycloalkyl C3 bis C6, Phenyl
R4/R5 = unabhängig voneinander H, Benzyl, letzteres unsubstituiert oder durch Methoxy mono-, di- oder trisubstituiert, Alkyl C1 bis C4 geradkettig oder verzweigt oder
R4/R5 = als geradkettige Alkylgruppe gemeinsam einen Ring bildend mit dem Stickstoffatom einen fünfgliedrigen Ring, der ein weiteres Heteroatom N, O, S enthalten kann,
mit dem Stickstoffatom sowie einem weiteren Stickstoffatom oder einem Sauerstoffatom oder einem Schwefelatom einen sechsgliedrigen Heterocyclus
wobei Fünf und Sechsring im Kohlenstoffgerüst mit Alkyl C1 bis C4 geradkettig oder verzweigt oder mit Benzyl substituiert sein können
R2 = für den Fall, daß A Thieno ist, außerdem einen anellierten C4- bis C7- Cycloalkylring, der ein Sauerstoff, ein Schwefel- oder ein Stickstoffatom enthalten kann, wobei das Stickstoffatom unsubstituiert oder substituiert ist mit Alkyl C1 bis C4, Phenyl oder Benzyl, wobei die beiden letztgenannten Aromaten mit Alkyl C1 bis C3, Alkoxy C1 bis C3 oder Halogen F, Cl, Br, I substituiert sind.

2. Verbindungen der allgemeinen Formel I in Form ihrer Racemate, Enantiomere, Prodrugs, Salze, Diastereomere sowie deren Gemische.

3. Verbindungen der allgemeinen Formel I als
(R,S)-2-Mercaptomethyl-2,3,6,7,8,9-hexahydro-5H-benzo[4,5]thieno[2,3- d]thiazolo[3,2-a] pyrimidin-5-on
(R,S)-2-Mercaptomethyl-7-phenyl-2,3-dihydro-5H-thiazolo[3,2-a]thieno[2,3- d]pyrimidin-5-on
(R,S)-6-Mercaptomethyl-6,7-dihydro-thiazolo[3,2-a]thieno[3,2-d]pyrimidin-9-on
(R,S)-6-Methyl-6-mercaptomethyl-6,7-dihydro-thiazolo[3,2-a]thieno[3,2- d]pyrimidin-9-on
(R,S)-2-Mercaptomethyl-2,3,6,9-tetrahydro-5H,7H-thiazolo[3,2- a]thiopyrano[4',3':4,5]-thieno[2,3-d]pyrimidin-5-on
(R,S)-2-Mercaptomethyl-2,3-dihydro-5H-pyrido[3,2-d]thiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on
(R,S)-8-(3,5-dimethoxybenzyl)-2-mercaptomethyl-2,3-dihydro-5H-pyrido[3,2- d]thiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on
(R,S)-7-Mercaptomethyl-7,8-dihydro-10H-thiazolo[2,3-b]pteridin-10-on
(R,S)-6-Mercaptomethyl-7,8-dihydro-6H,1-H-thieno[3',2':4,5]pyrimido[2,1- b][1,3]thiazin-10-on
(R,S)-6-Mercaptomethyl-1,6-dimethyl-6,7-dihydropyrrolo[3,2-d]thiazolo[3,2- a]pyrimidin-9(1H)-on
(R,S)-2-Mercaptomethyl-2,3,5a,6,7,8,9,9a-oktahydro-5H-thiazolo[2,3-b]chinazolin- 5-on (R,S)-6-Mercaptomethyl-2,6-dimethyl-6,7-dihydropyrazolo[4,3-d]thiazolo[3,2- a]pyrimidin-9(2H)-on.

4. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 3 als Matrix- Metalloproteinase-(MMP)-Inhibitoren.