DE10101792B4 - Verfahren zum Nachweis von Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis und Verwendung von Antikörpern - Google Patents

Abstract

Verfahren zum Nachweis von Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis beim menschlichen oder tierischen Körper, wobei Stuhl des Körpers gewonnen und in diesem vorhandenes SLPI, ein Fragment oder ein Komplex davon durch Inkontaktbringen mit immunologischen Mitteln nachgewiesen wird.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis und die Verwendung von Antikörpern.
• Pankreatische Erkrankungen, wie Pankreaskarzinom oder chronische Pankreatitis, stellen ebenso wie gastrointestinale Erkrankungen, also zum Beispiel gastrische Läsionen oder entzündliche Darmerkrankungen; ernsthafte Gefährdungen des menschlichen und tierischen Körpers dar. Eine frühzeitige und möglichst spezifische Diagnose derartiger Krankheiten ist für eine erfolgversprechende Therapie unerlässlich. Bisher werden fast alle Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes mit invasiven Methoden (Endoskopie, Koloskopie, ERCP, etc.) mit Gewebeprobenentnahme, unterstützt durch bildgebende Verfahren (Sonografie, Röntgenologie, Computertomografie, etc.) als Standardmethoden diagnostiziert. In der Vorphase dieser Untersuchungen haben sich einige Labormethoden als Routinemethoden etabliert, die Aufschluss über eine Insuffizienz bestimmten innerer Organe wie zum Beispiel des Pankreas geben können. Diese Labormethoden sind jedoch meist aufwendig und müssen oft an frischem Material (Magensaft, Pankreassaft, Duodenalsaft, etc.) innerhalb einer kurzen Zeit durchgeführt werden, da durch die enzymatische Zusammensetzung des Probenmaterials sonst ein Nachweis spezifischer Faktoren oft nicht mehr gelingt (dies gilt vor allem für Enzym-Substrat-Reaktionen). Werden bestimmte Parameter im Serum der Patienten bestimmt, sind diese Werte oft nicht in gewünschtem Maße zuverlässig (große intra- und interindividuelle Schwankungen) und zeigen eine extrem geringere Sensitivität.
• Bei einigen wenigen Erkrankungen (chronische Pankreatitis, Helicobacter pylori-Infektion des Magens, bakterielle Darmfehlbesiedlung, etc.) haben sich in jüngster Zeit auch Atemteste (zum Beispiel ¹³C-Harnstoffatemtest, H₂-Glucoseatemtest, ¹³C-Triglycerid-Atemtest, etc.) etablieren können, deren Durchführung aber bisher nur an wenigen Zentren möglich ist, da entsprechend teures Equipment (zum Beispiel Massenspektrometer) zur Verfügung muss, und deren Kosten, bedingt durch zum Beispiel teure ¹³C-Markierung, nicht mehr weiter gesenkt werden können.
• Daher eignen sich diese Methoden meist auch nicht zur Aufnahme in entsprechende Vorsorge-Screening-Programme.
• Bisher gibt es nur ganz wenige diagnostische Tests, mit denen bestimmte Erkrankungen im Stuhl der Patienten nachgewiesen werden können. Dazu zählt zum Beispiel der Hämoccult-Test zum Nachweis okulten Blutes im Stuhl als Screening-Methode für das Darmkarzinom, der Nachweis von Pankreas-Elastase im Stuhl zur Diagnose der chronischen Pankreatitis und der jüngst entwickelte Helicobacter pylori-Stuhl-Test zum Nachweis der Helicobacter pylori-Infektion im Magen. Bei den letzten beiden Tests wird der Nachweis mittels Antikörpertechnologie durchgeführt.
• Bezüglich des Tests für die Pankreaselastase lässt sich feststellen, dass der Test zwar ein brauchbares Verfahren zur Diagnose der schweren exokrinen Pankreasinsuffizienz ist, milde bis mäßige Funktionseinschränkungen jedoch relativ schlecht nachweist.
• Eine sichere Methode zur nicht-invasiven Differenzierung malignomverdächtiger Pankreasveränderungen steht nach wie vor nicht zur Verfügung. Als Kandidaten für die nicht-invasive Diagnostik des Pankreaskarzinoms sind vor allem Marken in der Diskussion, die bestimmte Genmutationen nachweisen (K-Ras, p16, p53). Da die einzelnen Gene im zeitlichen Verlauf der Entstehung eines Karzinoms unterschiedlich in Aktion treten, sind sie auch mit einer unterschiedlichen Wahrscheinlichkeit mit dem Entstehen eines Karzinoms assoziiert.
• So können zum Beispiel K-Ras Mutationen schon in einem prämalignen Stadium, also in einem Stadium des „Entstehens" eines Karzinoms, nachgewiesen werden, während die Tumor-Suppressor-Gene p16 und p53 bei vorhandenem Karzinom inaktiviert sind. Gerte, die früh an der Entstehung des Karzinoms beteiligt sind, haben allerdings den Nachteil, dass sie auch in Vorstufen der Tumorentstehung, sogenannten „prämalignen" Zuständen und bei Patienten mit chronischer Pankreatitis ohne Tumor nachgewiesen werden können, was ihre Vorhersagekraft wiederum einschränkt. Deshalb ist eine Kombination verschiedener dieser Tumormarker beziehungsweise anderer spezifischer Marker für das Pankreaskarzinom anzustreben.
• Dasselbe gilt für den als Verlaufsparameter genutzten Nachweis von CA 19-9, einem Tumormarker der in Patientenserum als Verlaufs-Marker und Rezidiv-Indikator bestimmt wird. Studien zeigen, dass eben auch 5/7 Patienten mit einer chronischen Pankreatitis erhöhte CA 19-9 Serumwerte haben, und nach einer erfolgten Operation eines Pankreaskarzinoms eine Normalisierung der Serum CA 19-9 Spiegel nur in 10–29% der Fälle eintritt.
• Bisher steht ein kommerzieller Kit zum Nachweis von K-Ras mittels PCR-Technik zur Verfügung (Elucigene K-Ras7; Zeneca Diagnostics), doch ist diese Technik zeitaufwendig und teuer und erfordert wie alle molekularbiologischen Methoden einen sehr sorgfältigen (sterilen) Umgang mit dem Untersuchungsmaterial und der Durchführung des Testverfahrens, um DNA-Kontaminationen aus der Umwelt zu vermeiden, die den Nachweis falsch negativ oder falsch positiv beeinflussen können.
• Als ein weiterer Marken zur Diagnose des Pankreaskarzinoms bietet sich die Bestimmung von Carboxypeptidase A (CPA) an. Dieses Enzym wird ausschließlich im Pankreas als Vorläufer („Proenzym") Procarboxypeptidase A (PCPA) gebildet. Durch Abspaltung des Propeptids wird das Enzym in aktive Carboxypeptidase überführt.
• PCPA wird im Serum von Pankreastumorpatienten erhöht nachgewiesen. Außerdem wird Carboxypeptidase A vom gesunden Pankreas im Vergleich mit anderen Pankreasenzymen (Elastase, Amylase, etc.) nur in geringem Maße sezerniert (ca. 5% Anteil an der Enzymsekretion). Es ist deshalb zu erwarten, dass eine krankhafte Veränderung des Pankreas (Pankreatitis, Pankreaskarzinom) zum Abfall des Enzyms unter die Nachweisgrenze und/oder zu einem Anstieg des „unreifen" Proenzyms (PCPA) führt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Carboxypeptidase A die Darmpassage unbeschadet übersteht und im Stuhl zu quantifizieren ist.
• Es gibt bisher keinen kommerziellen Nachweiskit zur Bestimmung von CPA beziehungsweise PCPA in Körperflüssigkeiten oder Stuhl.
• Insgesamt lässt sich feststellen, dass eine sichere, nicht-invasive Diagnostik chronischer Veränderungen bei den meisten gastrointestinalen Erkrankungen nach wie vor nicht zur Verfügung steht.
• Die DE 41 07 765 A1 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von einem hochspezifischen Pankreas-Elastase 1-Antikörper, der sowohl mit Körperflüssigkeiten als auch mit Stuhl reagiert. Ein gemäß dieses Verfahrens gewonnener Antikörper eignet sich zur Diagnose der chronischen und akuten Pankreatitis im Stuhl.
• SLPI (Secretory Leukocyte Proteinase Inhibitor), ein 11,7 kDa großes Protein mit Protease-inhibitorischer Funktion, ist aus Si-Tahar (Gastroenterology 118 (2000), 1061–1071) als mögliches therapeutisches Agens gegen intestinale schädigende Einflüsse wie mikrobielle Infektionen bekannt.
• Aus der WO 94/06454 A2 ist die Verwendung von SLPI als prophylaktisches Agens gegenüber einer HIV-Infektion bekannt. In der WO 99/17800 A1 ist die Verwendung von SLPI in pulverisierter Form als pharmazeutisches Agens beschrieben. Die dort speziell beschriebene pulverisierte Darreichungsform dient dem Einsatz von SLPI im Rahmen einer Inhalationstherapie. Aus der US 5,633,227 geht die Verwendung von SLPI zur Behandlung von Asthma oder allergischer Rhinitis hervor. Aus der JP 07103977 A gehen immunologische Sandwich-Tests für SLPI oder SLPI-Elastase-Komplexe hervor, wobei SLPI Fragmente mit den Aminosäureresten 1 bis 54 und 55 bis 107 erkannt werden. Es wird beschrieben, dass mittels des beschriebenen Systems Erkrankungen der Atemwege nachgewiesen werden können. Aus der JP 03279862 A gehen ebenfalls Antikörperbasierte Testverfahren für SLPI hervor.
• Aus der WO 00/77166 A2 ist die Verwendung einer SLPI codierenden cDNA für den Nachweis von Colitis in Proben aus dem Gastrointestinaltrakt von Mäusen bekannt.
• Aus der JP 07103977 A ist ein immunologischer Nachweis für SLPI bei Atemwegserkrankungen bekannt.
• Für SLPI ist bekannt, dass dieses Protein inhibitorische Aktivität gegenüber Chymotrypsintyp-Proteasen (wie pankreatische Elastase) und Trypsintyp-Proteasen aufweist. Für die erstgenannte Aktivität ist bekannt, dass diese dem C-terminalen Bereich und die zweitgenannte Aktivität dem N-terminalen Bereich von SLPI zuzuordnen ist. Die US 5,851,983 beschreibt auf der Basis dieser Erkenntnisse hergestellte verkürzte und Fusionsproteine sowie pharmazeutische Anwendungsmöglichkeiten derselben. Schließlich offenbart die WO 96/08275 A1 weitere Fragmente von SLPI und deren Einsatz zur Inhibierung von Tryptasen.
• Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem liegt also darin, einfach durchzuführende, schonende, kostengünstige sowie schnell durchzuführende Nachweisverfahren für Pankreaskarzinom und chronische Pankreatitis bereitzustellen.
• Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis einer Krankheit eines menschlichen oder tierischen Körpers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom und chronischer Pankreatitis, wobei Stuhl des menschlichen oder tierischen Körpers gewonnen und SLPI (Sekretorischer Leukozyten-Protease-Inhibitor), Fragmente oder Komplexe davon durch Inkontaktbringen mit immunologischen Mitteln nachgewiesen wird, insbesondere, wobei die Konzentration an SLPI, Fragmenten oder Komplexen davon im Stuhl bestimmt wird. Erfindungsgemäß konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass unter Einsatz immunologischer Mittel, insbesondere monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein Nachweis der genannten Krankheiten im Stuhl des menschlichen oder tierischen Körpers möglich ist, indem die Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit von SLPI, Komplexen oder Fragmenten davon, insbesondere die Konzentration an vorhandenem SLPI, im Vergleich zu nicht erkrankten Kontrollpersonen bestimmt wird.
• An chronischer Pankreatitis oder Pankreaskarzinom erkrankte Patienten lassen sich erfindungsgemäß dadurch diagnostizieren, dass in ihrem Stuhl SLPI auftritt, insbesondere in erhöhter Konzentration gegenüber Gesunden. Der Stuhl von gesunden menschlichen oder tierischen Körpern weist sehr wenig oder kein SLPI auf. Erfindungsgemäß kann mittels der vorliegenden Erfindung im Stuhl von Patienten nicht nur chronische Pankreatitis oder Pankreaskarzinom bestimmt, sondern überdies auch der Erkrankungsgrad mittels einer SLPI-Konzentrationsbestimmung quantifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die SLPI-Konzentrationen im Stuhl mit den dort vorhandenen Konzentrationen an Elastase-1 korrelieren. Es konnte insbesondere gezeigt werden, dass bei Patienten mit chronischer Pankreatitis die SLPI-Konzentrationen im Stuhl mit den Elastase-l-Konzentrationen und dass auch die SLPI-Konzentration bei gesunden Kontrollpersonen mit den Elastase-l-Konzentrationen dieser Personen korreliert. Gleiches gilt für die SLPI-Konzentration von Patienten mit Pankreaskarzinom, die demgemäß ebenfalls mit den Elastase-l-Konzentrationen dieser Patienten korreliert.
• Die Erfindung ist unter anderem deswegen überraschend, als dass gezeigt werden konnte, dass SLPI im Darmtrakt nicht in jedem Fall sofort abgebaut wird. Vielmehr kann bei Patienten mit chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom SLPI im Stuhl nachgewiesen werden.
• Die Erfindung betrifft also insbesondere Verfahren zum immunologischen Nachweis von pankreatischen Erkrankungen durch Detektion von SLPI im Stuhl von menschlichen oder tierischen Körpern.
• Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "immunologische Mittel" insbesondere der Einsatz von Antikörpern zum Nachweis von Antigenen, insbesondere SLPI, SLPIhaltigen Komplexen, zum Beispiel Protein-Protein-Komplexen homo- oder heteromerer Zusammensetzung oder SLPI-Fragmenten verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff SLPI im Folgenden auch dessen Komplexe zum Beispiel mit anderen Proteinen, wie ein SLPI-Elastase-1-Komplex, oder Fragmente von SLPI, zum Beispiel C- oder N-terminate Fragmente, verstanden. Solche Fragmente können zum Beispiel Aminosäurereste 1 bis 54 (N-terminales Fragment), oder 55 bis 107 (C-terminales Fragment), aufweisen. Hinsichtlich der vorgenannten Positionsangaben wird auf die US 5,851,983 und die dort in SEQ ID Nr. 4 angegebene Nummerierung verwiesen.
• Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff Antikörper sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper sowie Fragmente davon verstanden, solange diese spezifisch SLPI, SLPI-haltige Komplexe, zum Beispiel SLPI-Elastase-l-Komplexe, oder SLPI-Fragmente erkennen und binden. In bevorzugter Ausführung binden die Antikörper oder Fragmente davon keine anderen Antigene. Selbstverständlich können die Antikörper oder Fragmente modifiziert sein, zum Beispiel mit anderen Molekülen oder Teilen davon konjugiert, assoziiert oder kovalent oder nichtkovalent gebunden sein, zum Beispiel mit Farbmarkierungen, radioaktiven Markierungen, messbare Reaktionen auslösenden Enzymen, wie Phosphatasen, Peroxidasen, Enzymsubstraten, fluoreszierenden Substanzen, chemiluminiszenten Substanzen, cytotoxischen Agentien, Spacern, Trägerstoffen oder ähnliches. Die markierten, konjugierten oder nicht-modifizierten Antikörper können in löslicher oder immobilisierter Form, zum Beispiel auf Trägermatrices oder Kügelchen, vorliegen. Zum Beispiel können die enzymmarkierten Antikörper in einem zweiten Enzymamplifikationssystem eingesetzt werden.
• Dabei wird in bevorzugter Ausführung unter dem Einsatz immunologischer Mittel das Inkontaktbringen einer Probe, das heißt von Stuhl, insbesondere homogenisierten Stuhls, mit einem immunologischen Agens verstanden, umfassend wenigstens einen Antikörper, der spezifisch das Antigen, also SLPI, erkennt.
• Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von Antikörpern gegen SLPI zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von SLPI im Stuhl eines menschlichen oder tierischen Körpers. Erfindungsgemäß ist es so möglich, unter Verwendung des Antikörpers gegen SLPI Pankreaskarzinom oder chronische Pankreatitis im Stuhl nachzuweisen.
• Das Verfahren unter Einsatz immunologischer Mittel kann bevorzugt als Sandwich-ELISA, indirekter oder kompe titiver ELISA ausgeführt sein, wobei besonders bevorzugt HTP-Verfahren (high through put) eingesetzt werden.
• Im Rahmen eines Sandwich-ELISAs ist die Bereitstellung mindestens zwei verschiedener monoklonaler Antikörper nötig, die vorzugsweise gegen unterschiedliche Epitope, alternativ aber auch gleiche Epitope, von SLPI gerichtet sind. Die mindestens zwei Antikörper können in homogenen oder heterogenen System zum Beispiel löslich und/oder an einen Träger gebunden vorliegen.
• Dabei ist es selbstverständlich auch möglich, die immunologischen Mittel als System aus drei unterschiedlichen Antikörpern auszuführen, wobei einer der Antikörper in heterogener Phase vorliegt und die beiden anderen Antikörper löslich sind. Einer der beiden löslichen Antikörper ist markiert, während der andere unmarkiert ist. Der lösliche Antikörper ist in dieser Ausführungsform gegen den nicht markierten Antikörper gerichtet.
• Das Verfahren unter Einsatz immunologischer Mittel erfordert die Inkubation homogenisierten und gegebenenfalls verdünnten, Stuhls mit mindestens zwei verschiedenen Antikörpern, die spezifisch für SLPI sind. In bevorzugter Ausführungsform ist einer der beiden Antikörper an eine Festphase gebunden, wobei dies in üblicher Weise geschieht. Der weitere Antikörper liegt vorteilhafterweise in löslicher Form vor und trägt in bevorzugter Ausführungsform eine Markierung. Werden erfindungsgemäß weitere Antikörper verwendet, so trägt in bevorzugter Ausführungsform nur einer von diesen eine Markierung.
• Es kann vorgesehen sein, dass entweder ein unspezifisch mit SLPI bindefähiger Antikörper oder besonders bevorzugt ein spezifisch mit SLPI bindefähiger Antikörper an eine feste Phase gebunden wird. Dieser an die Festphase gebunde ne Antikörper wird anschließend mit dem Stuhl und, gegebenenfalls nach einem Waschschritt, einem zweiten Antikörper inkubiert, der spezifisch mit SLPI bindefähig ist, in einer löslichen Form vorliegt und eine Markierung trägt. Sofern der an die Festphase gebundene Antikörper ein unspezifisch mit SLPI bindefähiger Antikörper ist, binden an der Festphase nicht nur SLPI, sondern auch andere Antigene. Der zweite Antikörper, der jedoch spezifisch mit SLPI bindet, reagiert nun spezifisch nur mit SLPI beziehungsweise dem Komplex aus SLPI und erstem Antikörper, so dass nur SLPI-Moleküle spezifisch einen markierten Antikörper tragen und so nach Trennung der festen von der flüssigen Phase quantifiziert werden können.
• Es kann vorgesehen sein, im Rahmen eines Sandwich-ELISAs einen nicht markierten SLPIspezifischen ersten Antikörper zum Beispiel an einen Träger zu binden, die Testlösung beziehungsweise -suspension hinzuzugeben, wobei das in der Testlösung oder -suspension vorhandene SLPI von dem ersten Antikörper gebunden wird. Anschließend wird eine zweiter markierter Antikörper gegen SLPI hinzugegeben, der spezifisch mit SLPI oder dem Komplex aus SLPI und erstem Antikörper reagiert. Mittels der Markierung des zweiten Antikörpers kann unter Einsatz einer Eichlösung die Menge an SLPI bestimmt werden.
• Wird an die Festphase ein an SLPI spezifisch bindender erster Antikörper fixiert, so wird an der Festphase auch nur SLPI spezifisch gebunden. Bei der Inkubation mit dem zweiten löslichen Antikörper reagiert auch dieser ausschließlich mit SLPI. Nach Trennung der festen von der flüssigen Phase kann über die Markierung des zweiten Antikörpers eine genaue Quantifizierung von SLPI vorgenommen werden.
• Das Verfahren kann vorsehen, dass eine Mikrotiterplatte mit einem ersten spezifisch oder unspezifisch an SLPI bindenden Antikörper überzogen wird, dass anschließend der Stuhl mit der beschichteten Mikrotiterplatte in Kontakt gebracht und, nach Abwaschen ungebundener Bestandteile, ein markierter, zum Beispiel Biotin-markierter, zweiter Antikörper gegen SLPI zu der Mikrotiterplatte gegeben wird, wobei die Mikrotiterplatte unter Bedingungen inkubiert wird, dass der zweite Antikörper an SLPI binden kann. Anschließend wird die feste von der flüssigen Phase getrennt und entweder die Markierung direkt nachgewiesen oder, bei Verwendung eines enzymmarkierten zweiten Antikörpers, ein Substrat hinzugegeben, und die Umsetzung des Substrates quantitativ bestimmt. So kann vorgesehen sein, dass der mit Biotin markierte zweite Antikörper in einer nächsten Inkubation mit einem Konjugat von Peroxidase (POD) und Streptavidin reagiert. Die Peroxidase ist in der Lage, das Substrat ABTS(2, 2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)Di-amoniumsalz) zu oxidieren. Oxidiertes ABTS kann anschließend photometrisch bestimmt werden.
• In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird der erste Antikörper an einer Trägermatrix, zum Beispiel einer Vlies-, Gewebs- oder Membranstruktur, derart gebunden, dass er nicht wie üblicherweise den Boden der Vertiefung einer ELISA-Immunoplatte darstellt, sondern direkt in die Matrix eingebunden ist. Bevorzugte Matrizes sind Hohlfaser-Membranen oder mikroporöse Flachmembranen, die in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung auch mit Ionenaustauschergruppen versehen sein können.
• Polyklonale Antikörper lassen sich herstellen, indem Tiere mit isolierter und vollständig gereinigtem SLPI oder Fragmenten davon immunisiert werden und so Antiseren mit polyklonalen Antikörpern in an sich bekannter Weise erhalten werden. Monoklonale Antikörper werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt. Die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper gegen SLPI können im Handel erhältliche Antikörper sein.
• Bevorzugten ist vorgesehen, dass bei dem Nachweis von SLPI im Stuhl des Patienten gleichzeitig auch die Elastase 1-Konzentration nachgewiesen wird. Die menschliche pankreatische Elastase-1 übersteht die Passage durch den Darm unbeschadet und kann im Stuhl als Protein quantifiziert werden. Die Elastase-1-Konzentration im Stuhl spiegelt die exokrine Pankreasfunktion wieder. Werte größer 200 μg Elastase/pro Gramm Stuhl weisen auf eine normale exokrine Pankreasfunktion und Werte kleiner 200 μg Elastase/pro Gramm Stuhl weisen auf eine exokrine Pankreasinsuffizienz hin. Bei einer akuten Pankreatitis wird in der akuten Entzündungsphase Elastase-1 in das Serum abgegeben, so dass eine Quantifizierung der Elastase im Serum die Diagnose oder den Ausschluss dieser Krankheit erlaubt. Eine hohe Konzentration an Elastase-1 im Serum deutet daher auf eine Pankreatitis hin.
• Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
• Das Verfahren wird anhand des folgenden Beispiels und der dazugehörigen Figuren näher erläutert.
• Die Figuren zeigen:
• 1 ein Histogramm zur SLPI-Konzentration im Stuhl und
• 2 ein Histogramm zur Elastase-l-Konzentration im Stuhl.
• Nachweis von SLPI im Stuhl von Patienten mit chronischer Pankreatitis
• Von 42 Patienten ohne chronische Pankreatitis, 6 Patienten mit Pankreaskarzinom und 19 Patienten mit chronischer Pankreatitis wurden jeweils 100 mg Stuhl gewonnen, abgewogen und mit Extraktions-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2, mit Detergenz und Natriumazid) extrahiert und verdünnt.
• Die Extraktion wird durchgeführt, indem die Stuhlprobensuspension bei Raumtemperatur mehrfach kräftig mit einem Reagenzglasschüttelgerät gemixt wird. Die Stühle müssen gut homogenisiert sein, um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten. Nach mindestens fünf Minuten Extraktion wird noch einmal abschließend gemixt. Nach Absetzen der Partikel werden die Stuhlprobenextrakte wie folgt verdünnt.
• Die Verdünnung der Probenextrakte erfolgte zur Messung von SLPI in einer Verdünnung von 1:100 und zur vergleichenden Messung von Elastase-1 mit einer Verdünnung von 1:500.
• Die SLPI-Konzentrationen im Stuhl wurden mittels eines SLPI-ELISAs (Quantikine^®, Kat. Nr. DP 100, 6/99) der Firma R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Deutschland) bestimmt.
• Dieser ELISA setzt eine 96 Vertiefungen umfassende Polystyrolmikrotiterplatte ein, die mit monoklonalen gegen menschliches SLPI gerichteten Antikörper aus der Maus beschichtet ist. Nach Pipettieren des Extraktes in die Vertiefungen wird SLPI durch den immobilisierten monoklonalen Antikörper gebunden. Nach Abwaschen ungebundener Substanzen wird ein mit einem Enzym verbundener poly klonaler Antikörper, der spezifisch für menschliches SLPI ist, in die Vertiefungen gegeben (polyklonaler Antikörper gegen menschliches SLPI, verbunden mit Meerrettich-Peroxidase). Nach Abwaschen ungebundener Antikörper-Enzymreagenzien wird eine Substratlösung in die Vertiefungen gegeben und die Farbentwicklung als Maß für gebundenes SLPI gemessen.
• Die Konzentration an pankreatitischer Elastase-1 wurde mittels eines Elastase-l-ELISAs der Firma ScheBo-Tech^® (Giessen, Deutschland, Kat. Nr. 07, April 2000, EP 0 547 059 B1 ) bestimmt.
• Es ergaben sich folgende in den 1 und 2 dargestellte Resultate:
  Die 1 zeigt die SLPI-Konzentrationen im Stuhl der Patienten (SLPI in Picogramm pro Gramm Stuhl), aufgetragen für die Patientengruppe ohne chronische Pankreatitis, die Patientengruppe mit Pankreaskarzinom und die Patientengruppe mit chronischer Pankreatitis. Es zeigt sich deutlich, dass die Mitglieder der Kontrollgruppe kein beziehungsweise nur sehr wenig SLPI im Stuhl haben, während die beiden Patientengruppen mit chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom erheblich erhöhte SLPI-Konzentrationen im Stuhl aufweisen.
• Die 2 zeigt die an den gleichen Patientengruppen durchgeführten Konzentrationsmessungen von Elastase-1. Die gesunde Kontrollgruppe weist einen deutlich über 200 μg/g Stuhl liegenden Elastasegehalt auf, während die beiden Patientengruppen mit chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom signifikant reduzierte Elastase-l-Konzentrationen im Stuhl aufweisen.

Claims (10)

1. Verfahren zum Nachweis von Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis beim menschlichen oder tierischen Körper, wobei Stuhl des Körpers gewonnen und in diesem vorhandenes SLPI, ein Fragment oder ein Komplex davon durch Inkontaktbringen mit immunologischen Mitteln nachgewiesen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Stuhl vor Inkontaktbringen mit den immunologischen Mitteln homogenisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die immunologischen Mittel Antikörper, insbesondere markierte Antikörper, gegen SLPI, Fragmente oder Komplexe davon sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die SLPI-Antikörperreaktion mittels eines ELISA-Tests nachgewiesen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei im Stuhl des Körpers neben der SLPI-Antikörperreaktion auch die Elastase 1-Konzentration nachgewiesen wird.
6. Verfahren nach Ansprüche 3 oder 4, wobei die Antikorper monoklonale Antikörper sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Komplex ein SLPI-Elastase-l-Komplex ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fragment von SLPI der N-terminale Bereich von SLPI mit den Aminosäureresten 1 bis 54 ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Fragment von SLPI der C-terminate Teil von SLPI mit den Aminosäureresten 55 bis 107 ist.
10. Verwendung von gegen SLPI-Fragmente oder Komplexe davon gerichteten Antikörpern zum Nachweis von Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis beim menschlichen oder tierischen Körper im Stuhl des menschlichen oder tierischen Körpers.