DE10082504B4

DE10082504B4 - Verfahren, Immunoassay und Kit zur Vorhersage von cardiovasculären und /oder endothelialen Erkrankungen

Info

Publication number: DE10082504B4
Application number: DE10082504T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Prof. Dr. Woloszczuk; Gerhard Dr. Hawa
Original assignee: Biomedica GmbH
Current assignee: Biomedica GmbH
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: ATA144499A; WO2001014885A3; DE10082504D2; AU6415000A; AT407580B; WO2001014885A2

Abstract

Verfahren zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen, wobei das N-terminale Fragment pro-ONP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1) des C-Typ-natriuretischen Propeptids 1–126 (Swiss-Prot: P23582) als Indikatorpeptid in vitro in der Körperflüssigkeit eines Patienten nachgewiesen wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, einen Immunoassay sowie ein Kit zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen.
Cardiovasculäre Schäden sind häufige klinische Krankheiten, die zu verschiedenen Syndromen beitragen oder, speziell bei älteren Personen, dafür verantwortlich sind, wie z. B. für Arteriosklerose, Nierenversagen u. dgl. Es gibt einige Marker, die in der Lage sind, die Diagnose von solchen Zuständen zu erleichtern. Es ist verständlich, dass einfache Screening-Verfahren, die Risikopersonen identifizieren und eine rasche Diagnose erlauben, hilfreich für ein zeitgerechtes Einschreiten und Verhindern des Fortschreitens der Krankheiten sind. Es ist daher wünschenswert, solche Risikopersonen schon zu identifizieren, bevor sich die Krankheit ausgebildet hat, um so ein zeitgerechtes Einschreiten der Medizin zu ermöglichen.
Derzeit gibt es wenige Methoden, die die Wahrscheinlichkeit von cardiovasculären Erkrankheiten vorherzusagen vermögen. Häufig beobachtete Probleme mit derartigen Verfahren sind die ungenügende Genauigkeit und Empfindlichkeit oder das Erfordernis nach Ausarbeitung von Untersuchungen oder einer teuren Ausrüstung, für die ein speziell trainiertes Personal erforderlich ist. Es besteht daher der Bedarf für ein einfaches Verfahren einer genauen und empfindlichen Methode, die nicht nur diagnostiziert, sondern auch die Wahrscheinlichkeit einer cardiovasculären Erkrankung vorhersagen kann, u. zw. entweder als chronischer Zustand oder als akuter Zustand, wie beispielsweise septische Komplikationen. Personen mit besonderem Risiko vor dem Auftreten größerer Schäden identifizieren, erfassen und behandeln zu können, würde große klinische Bedeutung haben. Derzeit existierende Behandlungen sind teuer und auch alternative Erfindungen sind kostenaufwendig, so dass es nicht kosteneffektiv ist, jedermann ohne Indikation in der Absicht zu behandeln, das Entstehen einer Krankheit zu verhindern.
C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) ist ein Polypeptid, das ursprünglich aus Schweinehirn durch T. Sudoh und seine Mitarbeiter (Biochem-Biophys. Res. Commun., 168: 863–879, 1990) isoliert wurde. Nach Klonieren und Durchführen der Sequenzanalyse der cDNA, die für das Peptid kodiert, wurde gezeigt, dass menschliches CNP im menschlichen Vascularsystem durch Endothelialzellen erzeugt wird (S. Suga et al, J. Clin Invest 1992: 90: 1145–9). Es wird angenommen, dass menschliches C-Typ natriuretisches Peptid als ein Precurser, der aus 126 Aminosäuren besteht, produziert wird. Von den ersten 23 Resten wird angenommen, dass sie als Signalpeptid wirken, wobei diese ersten 23 Reste abgeschnitten werden, um proCNP zu erhalten (proCNP oder CNP (1–103)). ProCNP wird vor oder während der Sekretion gespalten, um die biologisch aktive Form von CNP, CNP-22 zu bilden. Eine am N-Terminus verlängerte Form, CNP 53, ist die hauptsächlich im Schweinehirn (Minamino et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 170: 973–9) vorkommende molekulare Form von CNP. CNP Immunreaktivität wurde in menschlichen Vascularendothelzellen (Singo et al Am. J. Physiol 199; 263: H1318–21) in Plasma und in Nieren (Mattingly et al. Kidney Int. 1994; 46: 744–7) gefunden. Die Plasmakonzentrationen von proCNP (1–80) und proCNP (1–50), das sind die Peptide, die aus den ersten 80 bzw. 50 Aminosäuren, gerechnet vom N-Terminus von proCNP bestehen, sind in Patienten, die an endothelialen Erkrankungen (z. B. Arteriosklerose, Naruka T. et al, Circulation 1996; 94: 3103–8) und Nierenversagen (Igaki T. et al, Kidney Int. Suppo. 1996, 55: 144–7) leiden, erhöht.
Gen und Struktur des menschlichen C-Typ-natriuretischen Peptids (CNP) sind bekannt (Tawaragi Y. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1991, 175, 2, 645–651). Auch bekannt sind Antikörperzusammensetzungen zur Bestimmung von CNP, bzw. proCNP, sowie Verfahren für deren Herstellung (Hama N et al. J. Endocrinol. 1994, 141, 3, 473–479).
Es gibt im Stand der Technik keine Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der Konzentration von proCNP (1–80) in Körperflüssigkeiten und cardiovasculären oder endothelialen Erkrankungen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Überlegung, dass die N-terminalen Fragmente von menschlichem proCNP (1–103) (SEQ ID NO: 1), ähnlich wie proCNP (1–80) und proCNP (1–50), aufgrund ihrer gegenüber CNP-Hormonen (CNP-22 bzw. CNP 53) langen Halbwertszeit als gute diagnostische Indikatoren oder Prognosemittel für alle Fälle von endothelialen Schäden oder renalen Krankheiten, z. B. Risiko für Arteriosklerose, septischen Schock oder chronischer Nierendisfunktion dienen können.
Menschliches proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) und proCNP (1–50) kann daher als Basis entweder für ein Diagnose- oder für einen Prognosetest für die vorgenannten Zustände, und auch in erster Linie für die Biosynthese von Antikörpern, zum Gebrauch in solchen Tests dienen, weiters aber auch als Antigen für einen kompetitiven Bindungsimmunoassay. PrOCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) oder ein immunogenes Fragment daraus kann vorteilhafterweise an ein immunogenes Protein oder Peptid, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, konjugiert werden.
Dieser Stand der Technik stellt sich als Problem dar. Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und Mittel zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren nach Anspruch 1, sowie den Immunoassay nach Anspruch 8 und den Kit nach Anspruch 12.
Weiter bereitgestellt ist eine Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an humanes proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) bindet, in einer Antikörperzusammensetzung zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen nach Anspruch 2.
Somit kann ein Indikatorpolypeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen Erkrankungen dienen, wobei das Polypeptid das N-terminale Fragment proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) des C-Typ natriuretischen Prekursers Aminosäure (1–126) (Swiss Prot. P23582) ist.
Derartige Polypeptide können zur Erzielung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper eingesetzt werden, die spezifisch auf CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) sind.
Ein Aspekt der Erfindung ist es, ein Immunoassay-Verfahren für menschliches CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) zur Verfügung zu stellen, wobei der primäre Bindungspartner ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist. Immunoassays sind natürlich im Stand der Technik bekannt, wie z. B. RIA, EIA, Fluoreszenzimmunoassay (FIA) oder Trockenchemieteststreifen-Immunoassays. So ein Immunoassay verwendet grundsätzlich einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in immobilisierter Form, z. B. an einer Mikrotiterplatte, an Membranen oder Partikel, um die Ziel-Verbindung proCNP (1–80) zu isolieren. In einem Sandwichassay kann das gebundene Antigen mittels eines zusätzlichen löslichen Antikörpers, der ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein kann, nachgewiesen werden. Dieser Antikörper kann entweder eine Markierung tragen oder, noch einfacher, selbst später durch Reaktion mit einem zweiten Antikörper, der eine Markierung trägt, markiert werden. Wenn dabei also der erste Antikörper in einem Schaf gezüchtet wurde, kann der zweite Antikörper ein Antischafantikörper sein.
Geeignete Markierungen umfassen Radionuklide, fluoreszierende Substanzen, z. B. Europium basierte Hybridverfahren, Farbstoffe oder farbige Partikel, wie z. B. kolloidales Gold. Alternativ kann ein Bindungsassay verwendet werden, bei welchem eine bekannte Menge von markiertem menschlichem proCNP (1–80) (SEQ. ID NO: 1) oder ein antigenes Fragment davon einer Analytlösung zugesetzt und mit einer begrenzten Menge von immobilisiertem Antikörper in Kontakt gebracht wird, wodurch die Menge des markierten Antigens, welches immobilisiert wird, umgekehrt proportional der Menge des im Analyt vorhandenen Zielantigens ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Immunoassay-Kit, welcher folgendes enthält:

(a) einen Antikörper, der spezifisch an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) bindet, in immobilisierter Form; und
(b) mindestens eine weitere Zusammensetzung aus der Gruppe:
(b1) markierte Probe von humanem pro-CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) oder einem markierten antigenen Fragment davon;
(b2) Antikörper, der spezifisch an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) bindet; und
(b3) markierter zweiter Antikörper, der an einen Antikörper, spezifisch bindend an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1), bindet.

Ein solcher Immunoassay und Testsatz kann dazu verwendet werden, verwandte biologische Systeme zu untersuchen, sowie auch Diagnosen oder Prognosen von Zuständen zu stellen, in welchen der Titer von menschlichem proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) in Körperflüssigkeiten ein diagnostischer oder präventiver Indikator ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen, wobei das N-terminale Fragment pro-CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) des C-Typ-natriuretischen Propeptids 1–126 (Swiss-Prot: P23582) als Indikatorpeptid in vitro in der Körperflüssigkeit eines Patienten nachgewiesen wird.
Resultate von unter Dialysebehandlung stehenden Patienten zeigen eindeutig, dass das proCNP-Niveau deutlich bei Patienten erhöht ist, welche an chronischer Nierenfehlfunktion leiden. Dies wird auch noch dadurch gestützt, dass proCNP in sogenannten Hemofiltraten von Dialysepatienten aufgefunden wird (siehe auch Schulz-Knappe et al J. Chromatogr. A776 (1997) 125–132), wie dies in 3 illustriert ist.
Folgende Konzentrationen wurden gefunden:
CNP3: 1,7 pmol/l
CNP1: 12,4 pmol/l Hemofiltrat.
Hemofiltrate wurden deshalb verwendet, weil sie nahezu unbeschränkt vorliegen und überdies die Peptidhormonkonzentrationen jener von menschlichem Plasma sehr ähnlich sind (Schulz-Knappe et al Eur. J. Med. Res. (1995/96) 1: 223–236).
Demgemäß können die Immunoassays zur Beobachtung von chronischer Nierenfehlfunktion eingesetzt werden.
Obwohl derzeit wenig dokumentiert, kann humanes proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) auch als diagnostisches Werkzeug zur Risikoabwägung für die Entwicklung von Arteriosklerose eingesetzt werden (Naruka T. et al, Circulation 1996, 94: 3103–8).
Die Körperflüssigkeit, an welcher der Immunoassay ausgeführt wird, kann jegliche Körperflüssigkeit sein, in welcher menschliches proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) vorhanden ist; es wird aber üblicherweise Plasma-Serum oder Harn verwendet werden. In einigen Fällen kann es angezeigt sein, die Peptide zu extrahieren oder die Probe vor der Durchführung des Assays anderweitig zu behandeln.
Das menschliche proCNP (1–80) (SEQ ID. NO: 1) Peptid oder ein Antigen oder immunogenes Fragment davon kann mit in der Wissenschaft gut bekannten Techniken durch Synthese aus den sie bildenden Aminosäuren zusammengestellt oder durch das Zusammensetzen von vorsynthetisierten Aminosäureblöcken gebildet werden. Rekombinante Expression von Peptiden ist natürlich eine andere, sehr passende Methode zur Erzeugung des Antigens für die Immunisierung. Wo markiertes Material notwendig ist, kann die Markierung durch Standardtechniken eingebracht werden.
Zum Zweck der Herstellung von Antikörpern kann das menschliche proCNP (1–80) (SEQ. ID NO: 1) oder ein antigenes Fragment davon an ein immunogenes Protein oder Peptide, wie es Stand der Technik ist, konjugiert werden.
Die Antikörper können durch Injizierung von proCNP-Antigen gemäß der Erfindung in ein Wirtstier hergestellt werden, u. zw. vorteilhafterweise durch ein Konjugat mit einem immunogenen Protein wie vorstehend beschrieben. Geeignete Wirtstiere sind z. B. ein Schaf, um entweder ein Serum, welches polyklonale Antikörper enthält, oder z. B. eine Maus oder ein Kaninchen, um Milzzellen für die Umwandlung zu Hybridomas oder immortalisierten Zelllinien zu gewinnen und damit monoklonale Antikörper herzustellen.
Beispiel 1: Produktion von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen CNP (1–80)
Konjugation:
3 synthetisierte Fragmente aus proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1), proCNP (1–19), proCNP (29–50) und proCNP (51–79) wurden durch die Fa. Pichem GmbH, in Graz (Österreich) synthetisiert und an ein passendes Trägerprotein konjugiert (z. B. Thyroglobulin).
Immunisierung:
18 Schafe wurden verwendet. Die Schafe erhielten 2 mg des entsprechenden Antigens, das mit nicht ulcerativem Freund'schem Adjuvans (Guildhay, GB) und BOG (bacillus Calmette Guerlin) gemischt ist.
Screening:
Mikrotiterplatten wurden mit synthetischen proCNP Peptidsequenzen (1 μg/ml) beschichtet. Probeblut wurde in Phosphatpuffer mit 3%igem BSA 1: 1000/10000/100000 verdünnt, und die Bindung eines Antikörpers wurde durch Zusatz von Antischaf IgG-Peroxidase-Konjugat, gefolgt von Substratzugabe (TMB) nachgewiesen.
Monoklonale Antikörper können analog hergestellt werden, wobei Mäuse oder Kaninchen als Wirtstiere verwendet werden und Hybridomas nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 2: Immunoassay für proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) oder immunreaktive Fragmente davon.
Die Antikörper können in verschiedenen Arten von Immunoassay für proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) oder immunreaktiven Fragmenten davon verwendet werden. Diese sind u. a.

(a) Radioimniunoassay (RIA);
(b) Enzymimmunoassay (EIA);
(c) Enzym-gebundenes Immunosorbentassay (ELISA) einschließlich "Sandwich"-Typ Methoden, die auf Mikrotiterplatten oder Membranen ausgeführt werden;
(d) verschiedene trockenchemische Teststreifenimmunoassays.

Nachfolgend ist ein Beispiel basierend auf einem kompetitiven Enzymimmunoassay wiedergegeben. Mikrotiterplatten werden mit Schafantikörpern vorbeschichtet. Dann wird der spezifische proCNP Antikörper zugesetzt und für drei bis fünf Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ dazu können Platten, die mit proCNP vorbeschichtet sind und mit Karion F (Merk, Nr. 2993) stabilisiert sind, verwendet werden.
200 μl der Probe oder des Standards zusammen mit 50 μl eines Tracers (Biotin-markiertes proCNP (1–80) oder ein Fragment davon) wird in die Vertiefungen eingegeben und 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden gewaschen und mit 200 μl von Streptavidin-Peroxidase von Southern Biotechnology (SB-7100-05) inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt und Zusatz von Substrat (Tetramethylenbenzidin, TMB) bildet sich eine Farbe aus, die umgekehrt proportional zu der proCNP-Konzentration der Probe ist und in einem Mikrotiterplattenphotometer gemessen wird. Ein Beispiel einer Standardkurve für proCNP (1–19) und proCNP (51–79), die mit dieser Art von Assay erhalten wurden, ist in 2 wiedergegeben.

Claims

Verfahren zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen, wobei das N-terminale Fragment pro-ONP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1) des C-Typ-natriuretischen Propeptids 1–126 (Swiss-Prot: P23582) als Indikatorpeptid in vitro in der Körperflüssigkeit eines Patienten nachgewiesen wird.
Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1) bindet, in einer Antikörperzusammensetzung zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der Antikörper mit einer Markierung versehen ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Markierung ausgewählt ist aus Radionuklide, Biotin, fluoreszierende Substanzen, Enzyme, Farbstoffe und farbige Partikel.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der Antikörper an einem festen Träger immobilisiert ist.
Immunassay-Verfahren zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen, umfassend die Schritte: a) Kontaktieren einer Patientenkörperflüssigkeit in vitro mit einem ersten Antikörper, der spezifisch an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1) bindet, um einen Komplex aus Antikörper und pro-CNP (1–80) zu bilden; und b) Messen der Bildung dieses Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei ein Antikörper eingesetzt wird, der an einer Mikrotiterplatte, Membran oder an Partikeln (Beads) immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei zur Bestimmung der Bildung des Komplexes aus Antikörper und pro-CNP (1–80) der Komplex mit einem zweiten, pro- CNP (1–80) bindenden Antikörper zusammengebracht wird, so dass ein Sekundärkomplex aus beiden Antikörpern und pro-CNP resultiert, der in Form eines Sandwichassays bestimmt werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der erste Antikörper an einem festen Träger immobilisiert ist und wobei eine bekannte Menge von markiertem humanem pro-CNP (1–80) oder markiertem antigenem Fragment davon der Körperflüssigkeit zugesetzt wird, um einen kompetitiven Bindungsassay zu erzielen.
Kit für einen Immunassay zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen, umfassend a) einen Antikörper, der spezifisch an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1) bindet, in immobilisierter Form und b) mindestens eine weitere Zusammesetzung aus der Gruppe: b1) markierte Probe von humanem pro-CNP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1) oder einem markierten antigenen Fragment davon; b2) Antikörper, der spezifisch an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1) bindet und b3) markierter zweiter Antikörper, der an einen Antikörper, spezifisch bindend an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID Nr.: 1), bindet.