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DE10051609A1 - Hemmung der Wachstumsfaktorabhängigkeit von Tumorzellen - Google Patents

Hemmung der Wachstumsfaktorabhängigkeit von Tumorzellen

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DE10051609A1
DE10051609A1 DE10051609A DE10051609A DE10051609A1 DE 10051609 A1 DE10051609 A1 DE 10051609A1 DE 10051609 A DE10051609 A DE 10051609A DE 10051609 A DE10051609 A DE 10051609A DE 10051609 A1 DE10051609 A1 DE 10051609A1
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tumor
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tumor cells
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DE10051609A
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Rosemarie Lichtner
Ulrike Fuhrmann
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Bayer Pharma AG
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Schering AG
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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Progesteronrezeptor-Inhibitoren zur Hemmung der Wachstumsfaktorabhängigkeit von Tumorzellen.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Progesteronrezeptor-Inhibitoren zur Hemmung der Wachstumsfaktorabhängigkeit von Tumorzellen.
Estradiol und Progesteron sind an der Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Zum Zeitpunkt der Diagnose zeigt jedoch nur etwa 1/3 der Tumore eine Steroidhormonabhängigkeit. Man nimmt an, dass bei der Mehrzahl steroidhormonresistenter Tumoren die Proliferationskontrolle von lokalwirkenden autokrinen oder parakrinen peptidischen Wachstumsfaktoren übernommen wird. Dabei resultieren invasive Tumoren mit äußerst schlechter Prognose, die Wachstumsfaktor-Rezeptor positiv und Steroid­ hormon resistent sind (Elledge et al, Semin. Onkol. 19 (1992), 244-253).
Wachstumsfaktoren regulieren das Zellwachstum durch Aktivierung intrazellulärer Signaltransduktionswege nach Bindung an hochaffine Tyrosinkinase-Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Neuere Erkenntnisse lassen vermuten, dass Mammakarzinomzellen durch Progestine für die mitogene Wirkung von EGF sensibilisiert werden können (Groshong et al, Mol. Endocrinol. 11 (1997), 1593-1607). So konnte beispielsweise Progesteron in der humanen Mammakarzinomzelllinie T47D den Eintritt von Zellen in die S-Phase begleitet von einem transienten Anstieg der Aktivität von Cyclin 1D und der cyclinabhängigen Kinase 4 induzieren. Die Wachstumsstimulation ist jedoch auf einen einzigen Zyklus beschränkt und von einem Wachstumsarrest am G1/S-Übergang des zweiten Zyklus gefolgt (Groshong et al. (1997), supra; Musgrove et al, Mol. Cell. Biol. 13 (1993), 3577-3587). In ihrem durch Progesteron arretierten Zustand werden die Zellen für die proliferative Wirkung von EGF sensitiv. Weiterhin wurde gezeigt, dass Progesteron die Wirkung von EGF auf T47D Zellen durch Hochregulation von EGFR, Erb2 und Erb3 verstärkt und die Tyrosinphosphorylierung von Signalmolekülen erhöht (Lange et al, J. Biol. Chem. 273 (1998), 31308-31316; Richer et al. J. Biol. Chem. 273 (1998), 31317-31326). Im Gegensatz dazu konnte eine Hemmung der Wirkung von EGF auf Tumorzellen durch Beeinflussung des Progesteronrezeptors bisher nicht gezeigt werden.
Im Rahmen der zur vorliegenden Erfindung führenden Versuche wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass Inhibitoren des Progesteronrezeptors, z. B. 17α-Fluoralkylsteroide die Bindung von Wachstumsfaktoren wie EGF an Tumorzellen zumindest teilweise verhindern können, insbesondere an Tumorzellen, die eine hohe oder/und konstitutive Expression des Progesteronrezeptors aufweisen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung eines Inhibitors des Progesteronrezeptors zur Herstellung eines Mittels für die Hemmung der Bindung von Wachstumsfaktoren an Tumorzellen und insbesondere zur Hemmung einer durch Wachstumfaktoren bewirkten Proliferation von Tumorzellen bzw. Tumoren. Ein Inhibitor des Progesteronrezeptors im Sinne der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Substanz, welche kompetitiv die Bindung von Progesteron an seinen Rezeptor hemmt. Der Inhibitor des Progesteronrezeptors wird dabei vorzugweise ausgewählt aus 17α-Fluoralkylsteroiden, wie sie z. B. in WO 98/34947 offenbart sind. Diese 17α-Fluoralkylsteroide weisen die allgemeine Formel I auf:
worin
R1 für eine Methyl- oder Ethylgruppe,
R2 für einen Rest der Formel CnFmHo, wobei n = 2, 3, 4, 5 oder 6, m < 1 und m + o = 2n + 1,
R3 für eine freie, veretherte oder veresterte Hydroxygruppe,
R4 und R5 je für ein Wasserstoffatom, gemeinsam für eine zusätzliche Bindung oder eine Methylengruppe,
St für ein steroidales ABC-Ringsystem der Teilformel A, B oder C
stehen,
worin
R6 ein Wasserstoffatom, eine geradkettige C1-C4- oder verzweigte C3-C4- Alkylgruppe oder ein Halogenatom,
R7 ein Wasserstoffatom, eine geradkettige C1-C4- oder eine verzweigte C3- C4-Alkylgruppe, oder,
wenn St für ein steroidales ABC-Ringsystem A oder B steht, außerdem R6 und R7 gemeinsam eine zusätzliche Bindung,
X ein Sauerstoffatom, eine Hydroxyminogruppierung =N~OH oder zwei Wasserstoffatome,
R8 einen Rest Y oder einen ggf. mehrfach mit einer Gruppe Y substituierten Arylrest, wobei Y ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine -OH, -NO2, -N3, -CN, -NR9aR9b, -NHSO2R9, -CO2R9, C1-C10-Alkoxy-, C1-C10-Alkanoyloxy-, Benzoyloxy-C1-C10-Alkanoyl-, C1-C10-Hydroxyalkyl- oder Benzoylgruppe ist
und R9a und R9b gleich oder verschieden sind und wie R9 ein Wasserstoffatom oder eine C1-C10-Alkylgruppe darstellen,
bedeuten,
sowie für die Reste -NR9aR9b auch deren physiologisch verträgliche Salze mit Säuren und für die Reste -CO2R9 mit R9 in der Bedeutung von Wasserstoff auch deren physiologisch verträgliche Salze mit Basen.
Ein besonders bevorzugtes Beispiel für derartige Inhibitoren des Progesteronrezeptors ist die Verbindung 11β-(4-Acetylphenyl)-17β-hydroxy- 17α-(1,1,2,2,2-pentafluorethyl)-estra-4,9-dien-3-on (im Folgenden Verbindung A). Darüber hinaus sind jedoch auch andere Antiprogestine geeignet, beispielsweise Onapriston(11β-[p-(Dimethylamino)phenyl]-17α- hydroxy-17-(3-hydroxypropyl)-13α-estra-4,9-dien-3-on).
Die Wirkung der Progesteronrezeptor-Inhibitoren wird insbesondere bei Tumorzellen gefunden, die eine hohe oder/und konstitutive Progesteronrezeptor-Expression aufweisen, beispielsweise der Progesteronrezeptor-positiven Mammakarzinomzelllinie T47D (Sartorius et al., Cancer Res. 54 (1994), 3668-3877).
Die Progesteronrezeptor-Inhibitoren hemmen die durch Progesteron induzierte Erhöhung der Expression von Wachstumsfaktoren, insbesondere von solchen Faktoren, die an Wachstumsfaktoren der EGF-Rezeptorfamilie wie etwa den EGF Rezeptor binden. Besonders bevorzugt hemmen die Inhibitoren die Bindung von EGF an humane Mammakarzinomzellen.
Gemäß vorliegender Erfindung können daher die Progesteronrezeptor- Inhibitoren für die Tumortherapie bei Säugern und vorzugsweise beim Menschen eingesetzt werden, und zwar insbesondere um die Progression eines Tumors, insbesondere eines Mammakarzinoms von steroidabhängigem Wachstum zu wachstumsfaktorabhängigem Wachstum zu blockieren. Auf diese Weise kann eine wirksame Behandlung des Tumors im Stadium des steroidabhängigen Wachstums, z. B. durch Antiestrogene erfolgen, ohne dass der Tumor zum Stadium des wachstumsfaktorabhängigen Wachstums, verbunden mit einer erheblichen Verschlechterung der Prognose für den Patienten, fortschreiten kann. Auch im Stadium des wachstumsfaktorabhängigen Wachstums kann das Verabreichen der Progesteronrezeptor-Inhibitoren eine Verlangsamung des Tumorwachstums bewirken.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können nicht-steroidale Antiestrogene wie z. B. Tamofixen und Nafoxidin als auch Raloxifen und EM800 verwendet werden. Die beiden letztgenannten sind Vertreter der so genannten SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators); auch andere Verbindungen mit dem Wirkprofil der SERMs sind erfindungsgemäß verwendbar, z. B. die in der PCT/EP 99/05093 genannten Verbindungen und von diesen wiederum insbesondere die Verbindung 5-(4-{5-[(RS)-4,4,5,5,5- Pentafluorpentyl)sulfinyl]pentyloxy}phenyl)-6-phenyl-8,9-dihydro-7H- benzocyclohepten-2-ol.
Beispiele für steroidale Antiestrogene umfassen jene, die in EP 0 348 341 A, insbesondere Faslodex, und jene, die in WO 98/07740 offenbart sind, insbesondere 11β-Fluor-7α-{5-[N-methyl-N-3-(4,4,5,5,5- pentafluorpentylthio-propylamino]-pentyl}-estra-1,3,5(10)trien-3,17ß-diol, oder jene, die in WO 99/33855 beschrieben sind, insbesondere 11β-Fluor- 7α-{5-[methyl-(7,7,8,8,9,9,10,10,10-nonafluor-decyl)-amino]-pentyl}-estra- 1,3,5(10)trien-3,17β-diol oder pharmazeutisch verträgliche Derivate oder Analoge davon. Aromataseinhibitoren mit einem antiestrogenen Effekt, wie beispielsweise diejenigen, die aus den Seiten 7-8 der EP 0 495 825 B1 hervorgehen, können gleichfalls als Antiestrogene verwendet werden.
Die Verabreichung der Progesteronrezeptor-Inhibitoren kann nach üblichen Methoden beispielsweise lokal, topisch, subkutan, enteral oder parenteral erfolgen. Für die enterale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Suspensionen oder Lösungen in Betracht, die in üblicher Weise mit den in der Gallenik bekannten Zusätzen und Trägersubstanzen hergestellt werden können. Für die lokale oder topische Anwendung kommen beispielsweise Vaginalzäpfchen oder transdermale Systeme wie Hautpflaster in Betracht. Die subkutane Applikation kann durch Injektion mit einer öligen Lösung erfolgen.
Eine Dosiseinheit kann beispielsweise 0,1 bis 100 mg aktiver Verbindung(en) (= Inhibitor(en) des Progesteronrezeptors) enthalten. Für die Gabe beim Menschen beträgt die tägliche Dosis der aktiven Verbindung(en) ungefähr 0,1 bis 400 mg, vorzugsweise ungefähr 10-100 mg und insbesondere ungefähr 50 mg.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 Die antiproliferative Wirksamkeit von Testsubstanzen auf die Mammakarzinomzelllinie T47D.
Fig. 2 Die Proteinmengen des Progesteronrezeptors (PR) und des Estrogenrezeptors (ER) in der Mammakarzinomzelllinie T47D.
Fig. 3 Die transkriptionelle Aktivität des Progesteronrezeptors in T47D Zellen.
Fig. 4 Eine Scatchard-Analyse der Bindung von EGF an T47D Zellen in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Testsubstanzen.
Fig. 5 Die Abhängigkeit der Bindung von EGF an T47D Zellen von der Anwesenheit von Testsubstanzen.
Beispiel 1. Materialien und Methoden Materialien
125I-EGF(100 mCi/mmol) wurde von Amersham Buchler bezogen. Verbindung A, Hydroxytamoxifen(4-OH-Tam), ZM182780 und Estradiol wurden im Institut für Arzneimittelchemie der Schering AG nach bekannten Methoden synthetisiert.
Zelllinien
Es wurde die humane Estrogenrezeptor (ER)- und Progesteronrezeptor (PR)- positive Mammakarzinomzelllinie T47D (Freake et al., BBRC 101 (1981), 1131-1138) verwendet.
Wachstumsstudien
Die Tumorzellen wurden bei 5000 Zellen/Well in 96-Well-Platten für 6 Tage in RPMI Medium plus 10% Rinderserum, 200 nM Insulin und 0,1 nM Estradiol in Anwesenheit der jeweils angegebenen Verbindungen kultiviert und das Wachstum durch Anfärbung mit Kristallviolett bestimmt.
PR und ER Proteinmenge
Die Bestimmung der PR und ER Mengen erfolgt in Zelllysaten unter Verwendung von Steroid-Bindeassays mit radioaktiv markiertem Progesteron bzw. Estradiol nach der bei Führmann et al. (Contraception 54 (1996), 243-251) beschriebenen Methode.
Bindung von 125I-EGF an Tumorzellen
R5020-vorbehandelte T47D Zellen wurden für 2 h mit 125I-EGF bei 4°C inkubiert. Die unspezifische Bindung war immer weniger als 10% der Gesamtbindung.
Transaktivierungsassay
T47D Zellen wurden transient mit MTV-LUC (Cato et al., EMBO J., 9: 2237-40) transfiziert und in Abwesenheit bzw. Gegenwart von 1 nM R5020 kultiviert. Zum Test auf einen PR-vermittelten Antagonismus wurden die transient transfizierten T47D Zellen mit R5020 und zusätzlich mit zunehmenden Konzentrationen an Verbindung A oder RU486 behandelt. Nach 24 h wurde ein Luziferasetest durchgeführt.
2. Ergebnisse
Fig. 1 zeigt die antiproliferative Wirksamkeit verschiedener Testsubstanzen. T47D Zellen wurden in Gegenwart (obere Schraffierung) oder Abwesenheit (untere Schraffierung) von 0,1 nM E2 plus zunehmende Konzentrationen von Verbindung A (▲), Onapriston (∎), ZK191703 (⚫) oder 4-OH-Tam (⬩) kultiviert. Bei T47D Zellen zeigt Verbindung A selbst in extrem geringen Konzentrationen eine signifikante antiproliferative Wirkung.
Fig. 2 zeigt die PR- und ER-Proteinmengen in T47D Zellen.
Fig. 3 zeigt die transkriptionelle Aktivität von PR in T47D Zellen, wobei die jeweiligen Zellen transient mit MTV-LUC transfiziert und in Abwesenheit (Co) oder Gegenwart von 1 nM R5020 kultiviert wurden (a). Zum Test auf einem PR-vermittelten Antagonismus wurden die transient transfizierten T47D Zellen mit 0,1 nM R5020 und zunehmenden Konzentrationen an Verbindung A oder RU468 behandelt (b).
In Fig. 4 ist eine Scatchard-Analyse der 125I-EGF Bindung an T47D Zellen gezeigt. Die Zellen wurden für 48 h in Gegenwart von 20 nM R5020 mit oder ohne 20 nM Verbindung A kultiviert und dann gewaschen. Anschließend wurde die EGF-Bindung über einen Konzentrationsbereich von 0,25 bis 150 ng/ml EGF durch Inkubation für 2 h bei 4°C bestimmt. Die Insertionen zeigen die Menge an gebundenem Liganden gegenüber dem Logarithmus der freien Ligandenkonzentration. Es ist zu erkennten, dass die durch R5020 verursachte Erhöhung der EGF-Bindung (mittleres Bild) gegenüber der Kontrolle (oberes Bild) bei Zugabe von Verbindung A (unteres Bild) blockiert werden konnte.
In Fig. 5 ist die Bindung von 125I-EGF an intakte T47D Zellen gezeigt. Die Zellen wurden hierzu für 48 h mit 2 bzw. 20 nM R5020 plus Verbindung A oder Onapriston oder Verbindung A alleine behandelt. Auch hier ist zu erkennen, dass Verbindung A die durch R5020 hervorgerufene Erhöhung der EGF-Bindung an T47D Zellen blockiert. Ein ähnlicher - wenn auch erheblich schwächerer - Effekt wird auch für Onapriston gefunden.
3. Diskussion
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass das Estradiol-stimulierte Wachstum von T47D Zellen mit hohem und konstitutivem PR-Gehalt wirksam durch Verbindung A blockiert wurde.
Durch Transaktivierungsassays konnte gezeigt werden, dass der PR in den T47D Zellen transkriptionell aktiv war und durch Verbindung A blockiert werden konnte.
Eine Stimulierung der T47D Zellen mit R5020 führte zu einer 2- bis 3-fach erhöhten EGF-Rezeptorexpression, die durch Verbindung A blockiert wurde. Gleichzeitig war die Bindung von EGF an die Zellen 2- bis 3-fach erhöht und konnte durch Verbindung A und weniger effizient durch Onapriston verhindert werden. Die erhöhte EGF-Bindung an R5020 behandelte Zellen könnte durch eine erhöhte EGF-Rezeptor-Expression oder erhöhte Heterodimerbildung zwischen EGF-Rezeptor und erbB2 hervorgerufen sein.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen die Wechselwirkungen zwischen PR- und Wachstumsfaktor-Signalsystemen in humanen Mammakarzinomzellen. Durch Einsatz von Antiprogestinen kann die Progression von Tumorzellen vom steroidabhängigen Wachstum zum wachstumsfaktorabhängigen Wachstum gehemmt bzw. verhindert werden.

Claims (10)

1. Verwendung eines Inhibitors des Progesteronrezeptors zur Herstellung eines Mittels für die Hemmung der Bindung von Wachstumsfaktoren an Tumorzellen oder/und an einen Tumor.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine durch Wachstumsfaktoren bewirkte Proliferation der Tumorzellen oder/und des Tumors gehemmt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor des Progesteronrezeptors ausgewählt wird aus 17α- Fluoralkylsteroiden der allgemeinen Formel I
worin
R1 für eine Methyl- oder Ethylgruppe,
R2 für einen Rest der Formel CnFmHo, wobei n 2, 3, 4, 5 oder 6, m < 1 und m + o = 2n + 1 ist,
R3 für eine freie, veretherte oder veresterte Hydroxygruppe,
R4 und R5 je für ein Wasserstoffatom, gemeinsam für eine zusätzliche Bindung oder eine Methylengruppe,
St für ein steroidales ABC-Ringsystem der Teilformel A, B oder C stehen,
worin
R6 ein Wasserstoffatom, eine geradkettige C1-C4- oder verzweigte C3- C4-Alkylgruppe oder ein Halogenatom,
R7 ein Wasserstoffatom, eine geradkettige C1-C4- oder eine verzweigte C3-C4-Alkylgruppe, oder,
wenn St für ein steroidales ABC-Ringsystem A oder B steht, außerdem R6 und R7 gemeinsam eine zusätzliche Bindung,
X ein Sauerstoffatom, eine Hydroxyminogruppierung =N~OH oder zwei Wasserstoffatome,
R8 einen Rest Y oder einen ggf. mehrfach mit einer Gruppe Y substituierten Arylrest, wobei Y ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine -OH, -NO2, -N3, -CN, -NR9aR9b, -NHSO2R9, -CO2R9, C1-C10-Alkoxy-, C1-C10-Alkanoyloxy-, Benzoyloxy-C1-C10-Alkanoyl-, C1- C10-Hydroxyalkyl- oder Benzoylgruppe ist
und R9a und R9b gleich oder verschieden sind und wie R9 ein Wasserstoffatom oder eine C1-C10-Alkylgruppe darstellen,
bedeuten,
sowie für die Reste-NR9aR9b auch deren physiologisch verträgliche Salze mit Säuren und für die Reste -CO2R9 mit R9 in der Bedeutung von Wasserstoff auch deren physiologisch verträgliche Salze mit Basen.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor des Progesteronrezeptors die Verbindung 11β-(4- Acetylphenyl)-17β-hydroxy-17α-(1,1,2,2,2-pentafluorethyl)estra-4,9- dien-3-on ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen eine hohe oder/und konstitutive Progesteronrezeptor-Expression aufweisen.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen Mammakarzinomzellen sind.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung von EGF oder/und anderen Faktoren, die an den EGF-Rezeptor binden, an Tumorzellen gehemmt wird.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung von Heterodimeren zwischen dem EGF-Rezeptor und erbB2 gehemmt wird.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Tumortherapie.
10. Verwendung nach Anspruch 9, um die Progression eines Tumors von steroidabhängigem Wachstum zu wachstumsfaktorabhängigem Wachstum zu hemmen.
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