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DE68926713T2 - Calciumkanal-zusammensetzungen und verfahren - Google Patents

Calciumkanal-zusammensetzungen und verfahren

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DE68926713T2
DE68926713T2 DE68926713T DE68926713T DE68926713T2 DE 68926713 T2 DE68926713 T2 DE 68926713T2 DE 68926713 T DE68926713 T DE 68926713T DE 68926713 T DE68926713 T DE 68926713T DE 68926713 T2 DE68926713 T2 DE 68926713T2
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Germany
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alpha
subunit
calcium channel
cell
cdna
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DE68926713T
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Robert Brenner
Steven Ellis
Michael Harpold
Jean Sartor
Arnold Schwartz
Mark Williams
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Original Assignee
Salk Institute Biotechnology Industrial Associates Inc
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Publication date
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Publication of DE68926713T2 publication Critical patent/DE68926713T2/de
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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Molekularbiologie und Pharmakologie.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung Calciumkanalzusammensetzungen und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Calciumkanäle sind membrandurchspannende Proteine mit mehreren Untereinheiten, die einen geregelten Einfluß von Ca²&spplus;-Ionen aus dem Extrazellulärfluid in Zellen erlauben. Alle Zellen im Tierreich und mindestens manche Bakterien-, Pilz- und Pflanzenzellen besitzen eine oder mehrere Typen von Calciumkanälen.
  • Der häufigste Typ eines Calciumkanals ist spannungsabhängig. In einem spannungsabhängigen Kanal fordert das "Öffnen", um den Beginn eines Einstroms von Ca²&spplus;-Ionen in die Zellen zuzulassen, eine Depolarisierung der Potentialdifferenz zwischen dem Inneren der Zelle, die den Kanal trägt, und dem extrazellulären Medium, in dem sich die Zelle befindet, auf einen bestimmten Grad, und die Einflußrate von Ca²&spplus; in die Zelle hängt von dieser Potentialdifferenz ab. Alle "erregbaren" Zellen in Tieren, wie etwa Neuronen des zentralen Nervensystems, periphere Nervenzellen und Muskelzellen einschließlich derjenigen von Skelettmuskeln, Herzmuskeln und venösen und arteriellen glatten Muskeln haben spannungsabhängige Calciumkanäle.
  • Calciumkanäle sind physiologisch bedeutend, da die Kanäle eine zentrale Rolle bei der Regulation intrazellulärer Ca²&spplus;-Spiegel ausüben und diese Spiegel für die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen von Bedeutung sind. Intrazelluläre Ca²&spplus;-Konzentrationen stehen somit im Zusammenhang mit einer Reihe lebenswichtiger Prozesse in Tieren, wie etwa Freisetzung von Neurotransmittern, Muskelkontraktion, Schrittmacheraktivität und Sezernierung von Hormonen und anderen Substanzen.
  • Von einer Reihe von Verbindungen, welche bei der Behandlung verschiedener Krankheiten in Tieren einschließlich Menschen nützlich sind, wird angenommen, daß sie ihre günstigen Wirkungen durch Modulieren von Funktionen spannungsabhängiger Calciumkanäle ausüben. Viele dieser Verbindungen binden an Calciumkanäle und blockieren den Einfluß von Ca²&spplus; in Zellen oder vermindern dessen Einflußrate in Antwort auf eine Depolarisierung des Inneren und Äußeren der Zellen.
  • Ein Verstehen der Pharmakologie der Verbindungen, die mit Calciumkanälen wechselwirken und die Fähigkeit, rationell Verbindungen zu entwerfen, die mit Calciumkanälen wechselwirken, um gewünschte therapeutische Wirkungen zu erzielen, wurden behindert durch ein fehlendes Verständnis der Struktur der Kanaluntereinheiten und der Gene, die dafür codieren. Es war somit nicht möglich, diejenigen großen Mengen von hochgereinigten Kanaluntereinheiten zu erhalten, welche erforderlich sind, um auf molekularer Ebene die Natur der Untereinheiten und deren Wechselwirkungen miteinander, mit den Zellmembranen, über die die Kanäle den Ca²&spplus;-Ionen den Durchtritt gestatten, mit Ca²&spplus; und anderen Ionen und mit Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, welche Kanalfunktion beeinflussen, zu verstehen. Beispielsweise könnten mit Verfügbarkeit großer Mengen von gereinigten Calciumkanaluntereinheiten funktionelle Kanäle hergestellt werden und verwendet werden, um die Wirkungen von Verbindungen auf die Kanalfunktion durchzusuchen, wodurch eine Grundlage bereitgestellt würde für den Entwurf therapeutischer Mittel, welche den Calciumkanal beeinflussen oder verschiedene Kombinationen von Kanaluntereinheiten könnten kristallisiert werden und deren Strukturen unter Verwendung von Röntgen- oder Neutronenbeugungstechniken mit hoher Auflösung bestimmt werden, wodurch eine nochmals weitere Grundlage für ein rationelles Entwerfen therapeutischer Mittel, welche Kanalfunktion beeinflussen, bereitgestellt würde.
  • Bestimmte Krankheiten, wie etwa das Lambert-Eaton-Syndrom, umfassen Autoimmunwechselwirkungen mit Calciumkanälen. Die leichte Verfügbarkeit von Calciumkanaluntereinheiten würde Immuntests zur Diagnose derartiger Krankheiten ermöglichen, und ein Verständnis derer auf molekularer Ebene, welches zu wirksamen Methoden zu deren Behandlung führen könnte.
  • Die fehlende Information über Gene, welche für Calciumkanaluntereinheiten codieren, hat das Verständnis der molekularen Eigenschaften der reifen Calciumkanaluntereinheiten und ihrer Vorläuferproteine (d. h. die reifen Untereinheiten mit am Aminoterminus angefügten Signalpeptiden) und der Regulierung der Expression von Calciumkanaluntereinheiten verhindert. Ein Verständnis dieser Eigenschaften und wie eine Expression von Genen der Calciumkanaluntereinheiten reguliert wird, könnte die Grundlage bereitstellen zum Entwerfen von therapeutischen Mitteln, welche durch eine Beeinflussung der Calciumkanalfunktion oder -konzentration günstige Wirkungen aufweisen. Weiterhin würde die Verfügbarkeit von Gensequenzen, welche für Calciumkanaluntereinheiten codieren, die Diagnose von Defekten in Genen, die für derartige Untereinheiten codieren ermöglichen, welche Defekte einer Reihe von Krankheiten zugrundeliegen könnten.
  • Die Verfügbarkeit einer DNA mit der Sequenz eines Abschnitts von mindestens etwa 12 und stärker bevorzugt mindestens etwa 30 Nukleotiden einer für eine Untereinheit eines Calciumkanals codierenden cDNA aus den Zellen eines Gewebes eines Tieres würde die Isolierung und Klonierung von cDNAs und möglicherweise genomischen DNAs ermöglichen, welche für die entsprechende Untereinheit verschiedener Calciumkanäle aus den gleichen oder unterschiedlichen Geweben und Tieren der gleichen oder unterschiedlichen Spezies codieren. Die Verfügbarkeit der Sequenzen zahlreicher Vollängen-cDNAs, welche für entsprechende Untereinheiten von Calciumkanälen aus einer Vielzahl von Geweben und Tierspezies codieren, würde zur Aufklärung der Struktur-Funktionsbeziehungen in den Untereinheiten beitragen und dieses Wissen wäre wiederum nützlich beim Entwurf therapeutischer Mittel, deren Aktivitäten durch die Bindung an Calciumkanäle ausgeübt werden.
  • Es wird angenommen, daß spannungsabhängige Calciumkanäle aus zwei großen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von zwischen etwa 130 und etwa 200 Kilodalton ("kD") und einer Reihe (im allgemeinen wird von einer oder drei ausgegangen) verschiedener kleinerer Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 60 kD bestehen. Mindestens eine der großen Untereinheiten und vermutlich mehrere der kleineren sind glykosyliert. Manche der Untereinheiten sind fähig, phosphoryliert zu werden. Was die Benennung der verschiedenen Untereinheiten von spannungsabhängigen Calciumkanälen anbelangt, herrscht in der Technik keine Einstimmigkeit.
  • Die zwei großen Untereinheiten spannungsabhängiger Calciumkanäle werden hierin als die "(alpha)&sub1;-Untereinheit" und die "(alpha)&sub2;-Untereinheit" bezeichnet.
  • Die Existenz und mutmaßliche Eigenschaften der (alpha)&sub1;- und (alpha)&sub2;-Untereinheiten werden von Vaghy et al. in J. Biol.
  • Chem. (1987), 262, Nr. 29, Seiten 14337 bis 14342 beschrieben. Eine im wesentlichen reine (alpha)&sub2;-Untereinheit oder ein Weg, um sie zu erhalten, wird jedoch nicht beschrieben.
  • Die (alpha)&sub1;-Untereinheit wird bei Behandlung mit Dithiothreitol ("DTT") oder mit Enzymen, welche die Entfernung N-verknüpfter Zuckergruppen von glykosylierten Proteinen katalysieren, im Molekulargewicht nicht nachweisbar verändert. Die (alpha)&sub1;-Untereinheit hat, wenn sie durch Natriumdodecylsulfat- ("SDS")-Polyacrylamidgelelektrophorese ("PAGE") nach Isolierung aus Muskelgewebe von Säugern analysiert wird, ein Molekulargewicht von etwa 150 bis etwa 170 kD und hat spezifische Bindungsstellen für verschiedene 1,4-Dihydropyridine ("DHPs") und Phenylalkylamine.
  • Die (alpha)&sub2;-Untereinheit ist etwas schlechter charakterisiert als die (alpha)&sub1;-Untereinheit. Das Molekulargewicht der (alpha)&sub2;-Untereinheit beträgt bei Bestimmung durch SDS-PAGE-Analyse in der Gegenwart von DTT nach Isolierung aus Muskelgewebe von Säugern mindestens etwa 130 bis 150 kD. In SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen (in der Gegenwart von N-Ethylmaleimid) wandert die (alpha)&sub2;-Untereinheit jedoch mit einer Bande von etwa 160 bis 190 kD. Es ist in der Technik nicht bekannt, ob das kleinere Fragment (von etwa 30 kD), welches bei Reduktion anscheinend freigesetzt wird, das Produkt eines Genes ist, welches unterschiedlich von dem Gen ist, das für das 130 bis 150 kD-Fragment codiert (und folglich die zwei Fragmente verschiedene Untereinheiten des Calciumkanals sind) oder ob beide Fragmente Produkte des gleichen Gens sind (und folglich die (alpha)&sub2;-Untereinheit etwa 160 bis 190 kD aufweist und bei Reduktion in (mindestens) zwei Fragmente aufgespalten wird). Es gibt Hinweise, daß die (alpha)&sub2;-Untereinheit, was immer ihre Größe ist, und das unter reduzierenden Bedingungen erzeugte entsprechende Fragment, ob Teil der (alpha)&sub2;-Untereinheit oder nicht, mindestens mit N-verknüpften Zuckern glykosyliert sind und keine bestimmten Bindungsstellen für 1,4-Dihydropyridine und Phenylalkylamine, die bekanntermaßen an die (alpha)&sub1;-Untereinheit binden, aufweisen.
  • Ein Verweis hierin auf den Vorläufer einer (alpha)&sub1;- Untereinheit betrifft das Protein mit der Aminosäuresequenz, welche der Sequenz der Vollängen-mRNA entspricht, die bei Translation schließlich zu einer (alpha)&sub1;-Untereinheit, welche als Teil eines Calciumkanals in einer Zellmembran vorhanden ist, führt. Das Vorläuferprotein wird durch verschiedene Prozessierungsschritte in die (alpha)&sub1;-Untereinheit überführt. Die Einzelheiten der Prozessierung zwischen dem Verläufer und der reifen (alpha)&sub1;-Untereinheit sind unklar, aber das Prozessieren umfaßt vermutlich Phosphorylierung und ebenfalls Spaltung des primären Translationsprodukts, um die reife (alpha)&sub1;-Untereinheit des Calciumkanals zu ergeben.
  • In ähnlicher Weise betrifft ein Verweis hierin auf den Vorläufer einer (alpha)&sub2;-Untereinheit das Protein mit der Aminosäuresequenz, welche der Sequenz der Vollängen-mRNA entspricht, welche bei Translation schließlich zu einer (alpha)&sub2;-Untereinheit, welche als Teil eines Calciumkanals in einer Zellmembran vorliegt, führt. Das Vorläuferprotein wird durch verschiedene Prozessierungsschritte in die (alpha)&sub2;-Untereinheit überführt. Wie bei der (alpha)&sub1;-Untereinheit sind die Einzelheiten des Prozessierens zwischen dem Vorläufer und der reifen (alpha)&sub2;-Untereinheit unklar, aber das Prozessieren umfaßt vermutlich mindestens das Entfernen einer Leadersequenz (d. h. eines Signalpeptids), Glykosylierung und möglicherweise Spaltung, um das zu ergeben, von dem derzeit angenommen wird, daß dies andere Untereinheiten des Calciumkanals sind.
  • Die cDNA und die entsprechende Aminosäuresequenz des Vorläufers der (alpha)&sub1;-Untereinheit eines Calciumkanals aus dem Rückenskelettmuskel aus Kaninchen wurde berichtet, Tanabe et al., Nature 328, 313-318 (1987).
  • Calciumkanalaktivität, elektrophysiologisch bestimmt durch Spannungs-Klemmen (voltage-clamp) -Techniken wurde in Xenopus laevis Oozyten induziert durch Injektion von Gesamt-mRNA, die aus Gehirn und Herzmuskel von Säugern isoliert worden war, in die Oozyten. Es wurde ebenfalls berichtet, daß Calciumkanalenthaltende Präparationen bei Rekonstitution in Lipiddoppelschichten den Doppelschichten spannungsabhängige Calciumkanalaktivität vermitteln.
  • Es gibt jedoch keinen Hinweis, daß die (alpha)&sub1;-Untereinheit alleine oder die (alpha)&sub2;-Untereinheit alleine in Oozyten, Lipiddoppelschichten oder beliebigen anderen Situationen einen funktionellen Calciumkanal bereitstellt. Von Hofman et al., Trends in Pharmacolog. Sci. 8, 393-398 (1987) wurde vor kurzem berichtet, daß mRNA, welche hergestellt worden war unter Verwendung der von Tanabe et al. erhaltenen cDNA der (alpha)&sub1;-Untereinheit, nicht in der Lage war, in Xenopus laevis Oozyten Calciumkanalaktivität zu induzieren.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • In kurzen Worten haben wir eine cDNA entdeckt, welche für die (alpha)&sub1;-Untereinheit eines Calciumkanals aus Tier (siehe Tabelle 1) codiert und eine cDNA, welche für die (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals aus Tier (siehe Tabellen 2 und 3 und Beispiel 4) codiert.
  • In einem ihrer Aspekte ist die Erfindung somit eine DNA, welche eine cDNA umfaßt, die für die (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals aus Säuger von Skelettmuskel, Herz oder einen neuronalen Calciumkanal oder für den Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit codiert, wobei die (alpha)&sub2;-Untereinheit die in Tabelle 2 hierin angegebene Aminosäuresequenz oder funktionelle Varianten davon oder die durch die in Tabelle 3 hierin angegebene DNA codierte Aminosäuresequenz oder funktionelle Varianten davon umfaßt.
  • Die Erfindung kann auch für eine derartige Untereinheit codierende RNA umfassen.
  • In einem anderen ihrer Aspekte ist die Erfindung eine im wesentlichen reine (alpha)&sub2;-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, umfassend eine durch die in Tabelle 3 angegebene DNA codierte Aminosäuresequenz.
  • Unter einer "im wesentlichen reinen" Untereinheit oder einem "im wesentlichen reinen" Protein wird eine Untereinheit oder ein Protein verstanden, die bzw. das im wesentlichen frei von anderen Polypeptid-Verunreinigungen ist, um bei SDS-PAGE als homogen angesehen zu werden oder um zweifelsfrei sequenziert zu werden.
  • In einem anderen ihrer Aspekte bringt die Erfindung eine Eukaryontenzelle mit einem heterologen Calciumkanal mit sich, wobei die Zelle hergestellt wird durch ein Verfahren, umfassend das Verabreichen der Zelle einer ersten Zusammensetzung, welche im wesentlichen aus einer ersten RNA besteht, die in der Zelle in den Vorläufer der (alpha)&sub1;-Untereinheit eines Calciumkanals eines Tiers einer ersten Spezies translatierbar ist, und einer zweiten Zusammensetzung, welche im wesentlichen aus einer zweiten RNA besteht, welche in der Zelle in den Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals eines Tiers einer zweiten Spezies translatierbar ist, wobei die erste und zweite Spezies gleich oder unterschiedlich sind, vorausgesetzt daß mindestens einer aus dem Vorläufer der (alpha)&sub1;-Untereinheit und dem Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit für die Zelle fremd ist und daß die (alpha)&sub2;-Untereinheit wie oben in bezug auf den ersten Aspekt dieser Erfindung definiert ist. Bevorzugte Zellen für diesen Zweck sind Xenopus laevis Oozyten.
  • In einem anderen ihrer Aspekte bringt die Erfindung ein Verfahren mit sich zum Testen einer Verbindung auf Aktivität als Calciumkanalagonist oder -antagonist, welches Verfahren umfaßt das elektrophysiologische Bestimmen der Calciumkanalaktivität einer im unmittelbar vorstehenden Absatz beschriebenen Zelle, wenn eine derartige Zelle einer Lösung der auf eine derartige Aktivität zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt wird. Für ähnliche Methoden, welche auf Xenopus laevis Oozyten und Acetylcholinrezeptoren angewendet werden, siehe z. B. Mishina et al., Nature 313, 364 (1985), und bezüglich Oozyten und Natriumkanälen, siehe Noda et al., Nature 322, 826-828 (1986).
  • In einem weiteren ihrer Aspekte ist die Erfindung eine Eukaryontenzelle, enthaltend eine DNA, welche eine cDNA umfaßt, die exprimiert werden kann, um die (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals herzustellen, wobei die (alpha)&sub2;-Untereinheit wie oben definiert ist. Eine derartige erfindungsgemäße Zelle kann auch eine DNA enthalten, welche eine cDNA umfaßt, die exprimiert werden kann, um die (alpha)&sub1;-Untereinheit eines Calciumkanals herzustellen. Bevorzugt ist die von einer solchen cDNA in einer solchen Zelle hergestellte (alpha)&sub2;-Untereinheit oder (alpha)&sub1;-Untereinheit für die Zelle fremd, d. h. sie wird eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche von der einer Calciumkanal (alpha)&sub1;-Untereinheit oder (alpha)&sub2;-Untereinheit, die in einer Zelle des gleichen Typs auftritt, welche keine DNA enthält, von der die durch eine derartige cDNA codierte (alpha)&sub1;-Untereinheit oder (alpha)&sub2;-Untereinheit exprimiert wird, abweicht. Unter derartigen Zellen sind diejenigen, die von Säugern abstammen, wie etwa COS-Zellen, NIH3T3-Zellen, Maus L-Zellen oder dgl., oder diejenigen aus Hefe, wie etwa S. cerevisiae oder P. pastoris, bevorzugt. Verfahren zum Herstellen derartiger Zellen der Erfindung durch Transformieren von Zellen mit geeigneten heterologen DNAs, um in der Zelle als Episomen oder (bevorzugt) in die chromosomale DNA der Zelle integriert gehalten zu werden, und dann Kultivieren von Transformanten oder Subkultivieren (oder Passagieren im Falle von Säugerzellen) aus einer derartigen Kultur oder einer Subkultur davon, sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt.
  • Unter derartigen erfindungsgemäßen Zellen umfaßt die Erfindung auch eine eukaryontische Zelle mit einem heterologen Calciumkanal, wobei der Calciumkanal hergestellt wird durch ein Verfahren, umfassend die Expression einer ersten cDNA, die für den Vorläufer der (alpha)&sub1;-Untereinheit eines Calciumkanals eines Tieres einer ersten Spezies codiert, und einer zweiten cDNA, die für den Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals einer zweiten Spezies codiert, wobei die erste und zweite Spezies gleich oder unterschiedlich sind und die (alpha)&sub2;-Untereinheit wie oben mit Bezug auf den ersten Aspekt der Erfindung definiert ist. Üblicherweise ist mindestens einer aus dem Vorläufer der (alpha)&sub1;-Untereinheit und dem Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit für die Zelle fremd. Unter derartigen Zellen sind wiederum diejenigen mit Säugerursprung oder diejenigen aus Hefe, wie etwa S. cerevisiae-Zellen oder P. pastoris, bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine derartige Zelle auch ein anderes heterologes Gen enthalten, welches ein Transkriptionskontrollelement (z. B. einen Promotor oder eine Promotor/Enhancerkombination) umfaßt, das in der Zelle aktiv ist und dessen Transkriptionsaktivität auf ein Ion oder Molekül reagiert, das fähig ist, durch einen funktionellen Calciumkanal in die Zelle zu gelangen (z. B. Ca&spplus;&spplus;, Ba&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus;-Ionophore), welches zur Expression operativ mit einem Strukturgen für ein Indikatorprotein, wie etwa Chloramphenicolacetyltransferase, Luciferase oder β-Galactosidase, verbunden ist.
  • Diese Zellen der Erfindung, die funktionelle fremde Calciumkanäle aufweisen (d. h. funktionelle Calciumkanäle, bei denen mindestens eine aus (alpha)&sub1;-Untereinheit und (alpha)&sub2;-Untereinheit für die Zelle fremd ist) sind u. a. nützlich zum Untersuchen einer Verbindung auf Aktivität als Calciumkanalagonist oder -antagonist. Erstens kann eine derartige Zelle verwendet werden, um die Affinität einer derartigen Verbindung für den funktionellen Calciumkanal zu bestimmen. Zweitens kann eine derartige Zelle verwendet werden, um die Calciumkanalaktivität in der Gegenwart der zu untersuchenden Verbindung sowie eines Ions oder Moleküls, wie Ca&spplus;&spplus; oder Ba&spplus;&spplus;, welches bekanntermaßen fähig ist, durch den funktionellen Kanal in die Zelle zu gelangen, elektrophysiologisch zu bestimmen. Hinsichtlich ähnlicher Studien, die mit dem Acetylcholinrezeptor durchgeführt wurden, siehe Claudio et al., Science 238, 1688-1694 (1987). Diese Verfahren zum Untersuchen einer Verbindung auf Aktivität als Calciumkanalagonist oder -antagonist sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Derartige erfindungsgemäße Zellen in der bevorzugten Ausführungsform, wobei die Zelle auch ein heterologes Gen mit einem Transkriptionskontrollelement enthält, das in der Zelle aktiv ist und auf ein Ion oder Molekül reagiert, das fähig ist, durch einen funktionellen Calciumkanal in die Zelle zu gelangen und welches zur Expression operativ mit ein Strukturgen für ein Indikatorprotein verbunden ist, kann in einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls verwendet werden, um eine Verbindung auf Aktivität als Calciumkanalagonist oder -antagonist zu untersuchen. Dieses Verfahren umfaßt das Aussetzen einer Kultur derartiger Zellen an eine Lösung mit einer auf eine derartige Aktivität zu untersuchenden Verbindung zusammen mit einem Ion oder Molekül, das fähig ist, durch einen funktionellen Calciumkanal in die Zellen zu gelangen und die Aktivität des Transkriptionskontrollelementes, welches die Transkription des Gens des Indikatorproteins steuert, zu beeinflussen und das Vergleichen des Expressionsniveaus des Gens für das Indikatorprotein in den Zellen der Kultur mit dem Niveau einer derartigen Expression in den Zellen einer anderen Kontrollkultur derartiger Zellen.
  • Eine "Kontrollkultur", wie vom Fachmann eindeutig verstanden, ist eine Kultur, die im wesentlichen die Gleiche ist wie die Kultur, welche der zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt wird und im wesentlichen gleich behandelt wird, außer daß die Kontrollkultur nicht der zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt wird. Expressionsniveaus der Gene für die Indikatorproteine werden vom Fachmann durch bekannte Verfahren in einfacher Weise ermittelt, welche Messungen der Konzentration von Indikatorprotein mittels Untersuchung auf nachweisbare Verbindungen, welche in durch das Indikatorprotein katalysierten Reaktionen erzeugt werden, umfassen.
  • Wie oben angedeutet, sind Indikatorproteine Enzyme, die in den Zellen der Erfindung aktiv sind und die Herstellung einfach nachweisbarer Verbindungen (z. B. Chromogene, fluoreszierende Verbindungen) katalysieren.
  • Die Erfindung umfaßt auch eine markierte (z. B. ³²P oder eine biotinylierte) RNA oder einzelsträngige DNA mit einer Länge von mindestens 12 (bevorzugt mindestens 30) Basen in einer Sequenz, die eine Sequenz von mindestens 12 (bevorzugt mindestens 30) aufeinanderfolgende Basen zwischen den Basen einschließlich -238 und 3495 in Tabelle 2 nachstehend umfaßt, oder eine derartige markierte RNA oder einzelsträngige DNA mit einer aus der in Beispiel 4 beschriebenen cDNA, welche für eine humane neuronale (alpha)&sub2;-Untereinheit codiert, entnommenen Sequenz. Die Verwendung derartiger DNAs und RNAs als Sonden, um für Calciumkanal (alpha)&sub2;-Untereinheiten codierende cDNAs zu identifizieren und zu isolieren oder um Gewebe zu identifizieren, in denen (alpha)&sub2;-Untereinheit-mRNA hergestellt wird, ist dem Fachmann klar. Siehe diesbezüglich z. B. Beispiel 4.
  • Die Primärstrategie zum Klonieren von cDNAs, welche für die (alpha)&sub1;- und die (alpha)&sub2;-Polypeptiduntereinheiten der DHP-sensitiven Calciumkanäle aus Skelettmuskel von Kaninchen codieren war es, Lambda gt11 cDNA-Expressionsbanken aus Kaninchenrückenskelettmuskel mit Antikörpersonden, welche für jedes der Proteine spezifisch waren, durchzumustern. Siehe allgemein Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-interscience, New York (1987); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., New York (1986). Monoklonale Antikörper, die fähig sind, das MG 155K-170K DHP Rezeptor (alpha)&sub1; Protein aus Kaninchenskelettmuskeltriaden immunzupräzipitieren, sind früher beschrieben worden von Leung et al., J. Biol. Chem. 262, 7943-7946 (1987). Polyklonale Antiseren, welche für die (alpha)&sub2;-Polypeptiduntereinheit spezifisch waren, wurden hergestellt in Meerschweinchen unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgel-gereinigtem (alpha)&sub2;-Protein wie von Nakayama et al., J. Biol. Chem. 262, 6572-6576 (1987) beschrieben. Einer der (alpha)&sub1;-spezifischen monoklonalen Antikörper von Leung et al., vorstehend als IIF7 bezeichnet, und die (alpha)&sub2;-spezifischen polyklonalen Antiseren wurden verwendet, um eine Oligo-dT primed lambda gt11 cDNA-Bank von 1,0 · 10&sub6; rekombinanten Phagen durchzumustern. Sonden auf Grundlage der (alpha)&sub1;-Untereinheit cDNA-Sequenz von Tanabe et al. (Nature 328, 313-318 (1987)) könnten ebenfalls verwendet werden, um Klone mit Fragmenten der (alpha)&sub1;-Untereinheit cDNA zu identifizieren.
  • Sobald unter Verwendung eines Antikörperdurchmusterungsverfahrens ein positiver Klon gefunden worden war, wurde der Klon verwendet, um weiter auf überlappende Klone durchzumustern. Somit wurde eine aufeinanderfolgende Reihe überlappender Klone erzeugt. Diese Klone wurden sequenziert und Fragente wurden entweder in pIBI 24/25 (IBI, New Haven, CT) oder M13 mp18/19 subkloniert. Bei Klonieren der (alpha)&sub1;-Untereinheit wurde dies DNA-Sequenz zu der Primärsequenz der von Tanabe et al. berichteten DHP Rezeptor (alpha)&sub1;-Untereinheit verglichen. Nukleotidunterschiede, welche Aminosäureunterschiede zur Folge hatten, wurden durch Sequenzieren in beiden Richtungen bestätigt.
  • Was die (alpha)&sub1;-Untereinheit anbelangt, wurden anfänglich zwei cDNA-Klone, die mit dem monoklonalen IIF7 Antikörper positiv reagierten, isoliert und es wurde festgestellt, daß sie aufgrund von Kreuzhybridisierung verwandt waren.
  • Die DNA-Sequenzierung eines dieser Klone ergab die Gegenwart eines cNDA-Inserts von 453 Basenpaaren (bp). Bemerkenswerterweise codierte dieses Insert für einen offenen Leserahmen von 151 Aminosäuren mit einer 28% Homologie zu einem Bereich der Natriumkanalsequenz aus Electrophorus electroplax. Das aus diesem Klon stammende cDNA-Insert wurde verwendet, um erneut die lambda gt11 cDNA-Bank und eine Kaninchenrückenmuskel Okayama-Berg-cDNA-Bank (MacLennan et al., Nature 316, 696-700 (1985)) durchzumustern, um überlappende cDNA-Klone zu isolieren. Die cDNA-Klone wurden unter Verwendung des Dideoxykettenabbruchverfahrens von Sanger analysiert, um die gesamte codierende Sequenz der (alpha)&sub1;-Untereinheit des Calciumkanals zu bestimmen und eine Restriktionskarte wurde zum Vergleich und zur Orientierung von DNA-Sequenzen erstellt.
  • Eine Oligo-dT-primed Expressions-cDNA-Bank wurde konstruiert in lambda gt11 unter Verwendung von Rückenskelettmuskel Poly(A+) RNA aus jungen erwachsenen Kaninchen (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von J. Robbins, University of Cincinnati), isoliert in Guanidinisothiocyanat (siehe Gubler et al., Gene 25, 263-269 (1983); Lapeyre et al., Gene 37, 215-220 (1985); Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I 49-78 (IRL, Oxford, 1985)). Doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert und EcoRI-Adaptoren wurden angefügt. Nach dem Hinzufügen der Adaptoren wurde die doppelsträngige cDNA auf einer Sepharose CL-4B oder Bio-Gel A-50 m-Säule größenselektioniert. Fragmente > 1500 bp wurden in EcoRI verdauten dephosphorylierten lambda gt11 legiert. Die Bank wurde in vitro mit Gigapack-plus (Stratagene, San Diego, CA) verpackt und durch Platieren in der Gegenwart von X-gal und IPTG wurde eine Effizienz von > 95% Rekombinanten bestimmt. Zwei Klone aus insgesamt 1 · 10&sub6; Rekombinanten wurden durch Durchmustern der Expressionsbank mit dem monoklonalen Ak IIF7 identifiziert, der mit der MG 170.000 (alpha)&sub1;-untereinheit des Calciumkanals von Kaninchenskelettmuskel reaktiv ist. Positive Plaques wurden sichtbar gemacht durch Bindung von HRP-Ziege anti-Maus IgG gefolgt von Farbentwicklung mit 4-Chlor-1-naphthol. Jeder Klon enthielt ein Insert von 500 bp und sie waren aufgrund von Kreuzhybridisierung verwandt. Die DNA eines Klones wurde sequenziert, wobei ein offener Leserahmen (Nukleotide 2847-3300) identifiziert wurde und wurde verwendet, um durch Northern-Analyse ein 6,5 kb Transkript zu identifizieren. Das oben erwähnte 453 bp Insert wurde verwendet, um die lambda gt11-Bank erneut durchzumustern und 8 von 1 · 10&sub6; Klonen waren positiv. Ein Klon (1700 bp) extendierte am weitesten 5' bis Nukleotid 2237; sein 522 bp PstI-Fragment, Nukleotide 2294-2816 wurde verwendet, um 1 · 10&sub6; Transformanten einer Kaninchenrückenskelettmuskel-cDNA-Bank durchzumustern, die gemäß dem Verfahren von Okayama und Berg (siehe MacLennan et al., Nature 316, 696-700 (1985)) konstruiert worden war. Drei positive Klone wurden isoliert, von denen der längste (5,0 kb) nach 5' bis Nukleotid 750 extendierte. Die Okayama-Berg-cDNA-Bank wurde erneut mit einem 5' 250 bp (PstI)-EcoRI-Fragment (die PstI-Stelle stammt vom Okayama-Berg-Vektor) (Nukleotide 750-1006) durchgemustert. Der längste isolierte Klon von 5 Positiven war 5,3 Kb und extendierte 5' bis Nukleotid 450. Um das 5'-Ende von (alpha)&sub1; zu klonieren, wurde eine Randomprimed lambda gt11-cDNA-Bank aus Kaninchenrückenskelettmuskel wie oben beschrieben synthetisiert mit den folgenden Modifizierungen: (1) pd(N)&sub6; Hexamere (Pharmacia, Inc. Piscathaway, NJ) wurden verwendet, um die Erststrang-cDNA Reaktion zu primen, (2) Adaptoren enthaltend NcoI, KpnI und EcoRI-Stellen:
  • 5'-CCATGGTACCTTCGTTGACG-3'
  • 3'-GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA-5'
  • wurden an die doppelsträngige cDNA wie oben beschrieben legiert und (3) die doppelsträngige cDNA wurde über eine 1 ml Bio-Gel A50 m Säule größenselektioniert. Fragmente > 600 bp wurden in lambda gt11 legiert. 1 · 10&sub6; Rekombinante dieser Bank wurden zweifach durchgemustert mit dem 1648 bp EcoRI/XhoI-Fragment entsprechend den Nukleotiden 1006-2653 und einer Oligonukleotidsonde, welche den Methionin-Startkodon überspannt: 5'-GGGAAGCCATGGAGCCATCCTCACCCCAGG-3'. 40 Klone waren mit beiden Sonden positiv, von denen einer (1,55 Kb) 78 Nukleotide 5' vom Startkodon und 450 bp 3' der EcoRI-Stelle extendierte.
  • Tabelle 1 (nachstehend) zeigt die 5975 lange Nukleotidsequenz der für die (alpha)&sub1;-Untereinheit codierenden cDNA. Es existiert ein Leserahmen einer 5619 Nukleotide langen Sequenz, der für eine Sequenz von 1873 Aminosäuren codiert (Tabelle 1). Der Sequenzkontext des bezeichneten Startkodons ist mit der vorgeschlagenen Konsensussequenz von Kozak, Nucleic Acids Res. 15, 8125-8132 (1987) konsistent. Die 3'-nichtcodierende Sequenz der cDNA hat, nicht gerechnet den Poly (dA) Strang, eine Länge von 234 Nukleotiden und enthält 17 Nukleotide stromaufwärts vom Poly (dA) Strang ein Konsensus-Polyadenylierungssignal ATTAAA (Nukleotide 5832-5837). Diese cDNA-Sequenz ist konsistent mit einer DHP-Rezeptor (alpha)&sub1; mRNA von 6500 Nukleotiden. Weiterhin ist die DNA-Sequenz zu 99,4% identisch zu der von Tanabe et al., oben, berichteten für den DHP-Rezeptor codierenden cDNA-Sequenz. Nukleotidunterschiede wurden in 33 Positionen identifiziert, von denen drei, die Nukleotide 5423, 5444 und 5504, ebenfalls Aminosäureaustausche zur Folge haben. Tabelle I Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle I (Fortsetzung)
  • Was die (alpha)&sub2;-Untereinheit anbelangt, wurden bei einem anfänglichen Durchmustern mit den (alpha) &sub2;-spezifischen polyklonalen Antiseren aus Meerschweinchen drei cDNA-Klone isoliert und es wurde gezeigt, daß sie aufgrund von Kreuzhybridisierung miteinander verwandet waren, aber nicht mit einer der (alpha)&sub1;-cDNA-Sequenzen. Zwei dieser cDNA-Klone wurden verwendet, um die lambda gt11-cDNA-Bank erneut durchzumustern, um überlappende cDNA-Klone zu isolieren. Die cDNA-Klone wurden analysiert, um die codierende cDNA-Sequenz der (alpha)&sub2;-Untereinheit des Calciumkanals festzustellen, und eine Restriktionskarte wurde erstellt. Annähernd 7850 Nukleotide der (alpha)&sub2;-cDNA wurden kloniert, was mit einer (alpha)&sub2;-mRNA von 8000 Nukleotiden konsistent ist.
  • Eine Oligo-dT-primed Expressions-cDNA-Bank wurde in lambda-gt11 konstruiert unter Verwendung der Rückenskelettmuskel-Poly (A+) RNA aus jungen erwachsenen Kaninchen, wie für die (alpha)&sub1;-Untereinheit beschrieben. Doppelsträngige cDNA-Fragmente > 1500 bp wurden in lambda gt11 legiert und eine Primärplattierung von 1 · 10&sub5; Rekombinanten wurde mit anti-160 Kd (alpha)&sub2;-polyklonalen Antiseren aus Meerschweinchen durchgemustert. Drei positive Plaques wurden durch Binden von HRP-Protein A sichtbar gemacht, gefolgt von Farbentwicklung mit 4-Chlor-1-Naphthol. Zwei Klone (2,5 Kb und 3,6 Kb) überlappten, wobei sie für 4,75 Kb eines 8 Kb Transkripts, identifiziert durch Northern Analyse, codierten. In 5'- und 3'-Richtung extendierende (alpha)&sub2;-cDNA-Klone (orientiert durch DNA-Sequenzieren und Identifizieren eines langen offenen Leserahmens) wurden -isoliert durch erneutes Screenen der gleichen lambda gt11-cDNA-Bank mit dem (EcoRI)-HindIII-Fragment eines Klons (Nukleotide 43-272, 5' proximal; EcoRI-Stelle aus dem Adapter) oder dem EcoRI- (EcoRI)-Fragment eines zweiten Klons ( 1,0 Kb im 3'-nichttranslatierten Bereich). Insgesamt wurden 14 Klone isoliert, 7 von jedem Ende, von denen ein überlappendes Klonpaar (einer 2750 Nukleotide 3' extendierend und der andere 350 Nukleotide 5' extendierend) für 7850 Nukleotide des (alpha)&sub2;-Transkripts codierten, 308 Nukleotide 5'-nichttranslatierte Sequenz, 3318 Nukleotide codierende Sequenz und etwa 4424 Nukleotide 3' nichttranslatierte Sequenz. Lediglich 176 Nucleotide 3' nichttranslatierte Sequenz wurden in beiden Richtungen bestimmt und werden angegeben.
  • Tabelle 2 stellt die 3802 Nukleotide der für die (alpha)&sub2;-Untereinheit und ihren Vorläufer codierenden cDNA-Sequenz dar, einschließlich 308 Nukleotiden 5' nichttranslatierter Sequenz, einen 3318 Nukleotide langen offenen Leserahmen und 176 Nukleotiden 3' nichttranslatierter Sequenz. Tabelle II Tabelle II (Fortsetzung) Tabelle II (Fortsetzung) Tabelle II (Fortsetzung) Tabelle II (Fortsetzung) Tabelle II (Fortsetzung) Tabelle II (Fortsetzung)
  • Tabelle 2 zeigt auch das Signalpeptid der (alpha)&sub2;-Untereinheit, gezeigt als die ersten 26 mit negativen Zahlen bezeichneten Aminosäuren. Ein Pfeil identifiziert die Spaltstelle zwischen dem Signalpeptid und der reifen (alpha)&sub2;- Untereinheit. Die früher bestimmte N-terminale Aminosäuresequenz ist in Fettdruck gezeigt (Thr(+8), Trp(+12) und Asp(+14) waren zuvor nicht bestimmt). Die gezeigte Nukleotidsequenz wurde aus zwei Klonen bestimmt, welche überlappten, wobei sie die codierende Sequenz der (alpha)&sub2;-Untereinheit überspannten. Unter individuellen Klonen wurden fünf Nukleotidunterschiede beobachtet, welche vier Aminosäureaustausche zur Folge hatten. Unterschiede traten in der Sequenz an den Positionen 169, 347, 348, 984 und in einer Deletion der Nukleotide 1858 bis 1860 auf. Die Aminosäuren wurden schließlich bestimmt wie folgt: Asn in Position 31, Lys in Position 90 und eine Deletion von Ser in Position 594. Ein stromaufwärts liegender Stoppkodon im Leseraster ist unterstrichen sowie die Start- und Stoppkodons eines kurzen stromaufwärts liegenden offenen Leserahmens. Drei mutmaßliche Transmembranregionen sind in Rahmen eingeschlossen. Potentielle N-Glykosylierungs- und Phosphorylierungsstellen sind angegeben wie für Tabelle 1 beschrieben.
  • Der offene Leserahmen codierte für eine Sequenz von 1106 Aminosäuren (Tabelle 2). Die früher bestimmte NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz des (alpha)&sub2;-Proteins wird durch die Nukleotide 79-129 im gleichen offenen Leserahmen (Aminosäurereste 1 bis 17, Tabelle 2) codiert. Die an den bezeichneten Startkoden angrenzende Nukleotidsequenz ist in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Konsensussequenz. Ein Stoppkodon im Leseraster ist stromaufwärts, beginnend am Nukleotid -27, vorhanden. Zusätzlich ist ein potentieller Startkodon außerhalb des Leserasters vorhanden, beginnend mit dem Nukleotid -229 und später folgt ein Stoppkodon an den Nukleotiden -179 bis -181. Die 5' nichttranslatierte Sequenz der (alpha)&sub2;-cDNA, 308 klonierte und so weit sequenzierte Nukleotide, ist ungewöhnlich lang. Dieser Bereich ist extrem G+C-reich, annähernd 80% G+C, was ähnlich ist zu anderen relativ langen 5' nichtcodierenden Sequenzen, von denen berichtet wurde.
  • Tabelle 1 zeigt die 1873 lange Aminosäuresequenz, welche von der cDNA der (alpha)&sub1;-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel abgeleitet ist. Basierend auf der Identifizierung eines Klons unter Verwendung des (alpha)&sub1;-spezifischen monoklonalen Antikörpers IIF7 haben wir ermittelt, daß die von dem 453 bp cDNA Insert codierte Proteinsequenz (Aminosäurereste 950 bis 1100), das durch diesen monoklonalen Antikörper erkannte Epitop enthält. Die vollständige Sequenz ergibt ein berechnetes Molekulargewicht von 212,143 für das (alpha)&sub1;-Protein im Gegensatz zum beobachteten MG von 155K bis 170K, welches früher von anderen unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese angegeben worden war. Die hier bestimmte und angegebene Aminosäuresequenz ist zu 99,8% identisch zu der kürzlich von Tanabe et al. oben beschriebenen, wobei sie 3 Aminosäureunterschiede an den Resten 1808 (Thr nach Met), 1815 (Ala nach Val) und 1835 (Ala nach Glu) zeigt. Das Protein der Calciumkanal (alpha)&sub1;-Untereinheit enthält 5 potentielle N-Glykosylierungsstellen an den Asn-Resten 79, 257, 797, 1464 und 1674 und 7 potentielle cAMP-abhängige
  • Phosphorylierungsstellen an den Ser-Resten 687, 1502, 1575, 1757, 1772 und 1854 und dem Thr-Rest 1552. Analog zur (alpha)-Untereinheit des Natriumkanals enthält die (alpha)&sub1;-Untereinheit des Calciumkanals aus Skelettmuskel vier intern wiederholte Sequenzbereiche. Eine Analyse des Hydropathieprofils der (alpha)&sub1;-Proteinsequenz ergibt, daß jede Wiederholungseinheit fünf hydrophobe Abschnitte und einen Abschnitt mit stark positiver Ladung enthält. Da der (alpha)&sub1;-Proteinsequenz eine für ein Signalpeptid charakteristische hydrophobe aminoterminale Sequenz fehlt, wurde vorgeschlagen, daß die Abschnitte der vier intern wiederholten Bereiche 24 Transmembranabschnitte darstellen und daß sich die Amino- und Carboxytermini in den Intrazellulärraum erstrecken. Dieses Modell ist damit konsistent, daß zwei der potentiellen Glykosylierungsstellen (Asn-Reste 79 und 257) extrazellulär lokalisiert sind und alle die potentiellen Phosphorylierungsstellen intrazellulär lokalisiert sind. Dies stimmt im allgemeinen mit früheren biochemischen Untersuchungen überein, welche nahelegen, daß die (alpha)&sub1;-Untereinheit (die als der mutmaßliche 1,4-Dihydropyridinrezeptor identifiziert wurde) nicht glykosyliert, aber phosphoryliert ist.
  • Tabelle 2 zeigt die von der cDNA der (alpha)&sub2;-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel abgeleitete 1106 Aminosäuren lange Sequenz. Die Sequenz ergibt ein berechnetes MG von 125.018 für dieses Protein im Gegensatz zum beobachteten MG von 165K bis 175K (unter nichtreduzierenden Bedingungen; MG 135K bis 150K unter reduzierenden Bedingungen), welches früher durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wurde. Die hier von der cDNA abgeleitete (alpha)&sub2;-Aminosäuresequenz bestätigt die Sequenz von 17 Aminosäuren, von der früher berichtet wurde, daß sie vermutlich die Sequenz der 17 aminoterminalen Aminosäuren der (alpha)&sub2;-Untereinheit darstellt. Der Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit hat ein 26 Aminosäuren langes Signalpeptid (Reste -1 bis -26). Obwohl dieses vorgeschlagene Signalpeptid hydrophob ist und eine angemessene, für eine Signalsequenz charakteristische Länge aufweist, ist es in gewisser Beziehung ungewöhnlich, indem das Peptid Glu an Position -1 aufweist und Gln an Position -12 einen ziemlich kurzen, zentralen, hydrophoben Bereich definiert. Das (alpha)&sub2;-Protein enthält 18 potentielle N-Glykosylierungsstellen (Asn-Reste 68, 112, 160, 300, 324, 444, 451, 580, 589, 652, 671, 758, 801, 865, 872, 962, 975 und 1005) und zwei potentielle cAMP-abhängige Phosphorylierungsstellen an Thr 477 und Ser 822 (Tabelle 2).
  • Eine Analyse der (alpha)&sub2;-Proteinsequenz auf regionale Hydropathie ergibt, daß im ausgesprochenen Unterschied zur ähnlichen Analyse des (alpha)&sub1;-Proteins dieses Protein im wesentlichen hydrophil ist, obwohl es eine Reihe hydrophober Bereiche enthält. Eine weitere Charakterisierung der hydrophoben Bereiche aufgrund Analysen des Polaritätsindex und hydrophoben Moments weist daraufhin, daß drei Abschnitte Transmembran-Domänen des (alpha)&sub2;-Proteins darstellen könnten. Die Topographie des (alpha)&sub2;-Proteins kann jedoch nicht einfach aufgrund der abgeleiteten primären Aminosäuresequenz vorhergesagt werden. Dieses Problem wird weiter erschwert durch die Bestimmung, daß dem (alpha)&sub2;-Protein eine signifikante Homologie mit irgendeinem Protein in der Dayhoff-Proteinsequenz-Datenbank oder mit anderen bekannten Ionenkanal- und Rezeptorproteinen fehlt. Falls die vorgeschlagene (alpha)&sub2;-Signalsequenz tatsächlich zwischen dem Glu-Rest an Position -1 und dem Glu-Rest an Position gespalten wird, dann wäre der Aminoterminus des reifen Proteins extrazellulär. Weiterhin wäre unter der Annahme, daß die drei hydrophoben Abschnitte als Transmembrandomänen wirken und daß es lediglich drei derartige Domänen gibt, der Carboxyterminus des (alpha)&sub2;-Proteins intrazellulär. Eine derartige Transmembrantopographie wäre damit konsistent, daß 8 der 18 potentiellen N-Glykosylierungsstellen extrazellulär lokalisiert wären und die einzige potentielle Phosphorylierungsstelle intrazellulär lokalisiert wäre. Frühere biochemische Untersuchungen deuten daraufhin, daß die (alpha)&sub2;-Untereinheit des Calciumkanals aus Skelettmuskel nicht phosphoryliert, aber extensiv glykosyliert ist.
  • Genomische DNAs vom Kaninchen und Mensch wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und Southern Blots dieser DNAs wurden mit radioaktiv markierten, für die (alpha)&sub1;-Untereinheit oder die (alpha)&sub2;-Untereinheit spezifischen cDNA-Klonen hybridisiert. Unter hochstringenten Bedingungen wurden sowohl mit den (alpha)&sub1;- als auch den (alpha)&sub2;-spezifischen Sonden in genomischer DNA aus Kaninchen sehr wenige hybridisierende Banden beobachtet. Dieses Ergebnis ist konsistent mit einer niedrigen Anzahl von Kopien, unter Umständen einer Einzelkopie von jedem der Gene für die (alpha)&sub1;- und die (alpha)&sub2;-Untereinheit im Genom von Kaninchen. Southern Blots der gleichen DNA-Präparationen wurden ebenfalls unter niedrigstringenten Bedingungen mit den gleichen (alpha)&sub1;- und (alpha)&sub2;-spezifischen Sonden getestet. Während unter niedrigstringenten Bedingungen in genomischer DNA aus Kaninchen sowohl mit den (alpha)&sub1;- als auch den (alpha)&sub2;-spezifischen Sonden zusätzliche hybridisierende Banden beobachtet wurden, wurde eine wesentlich stärkere Hybridisierung mit den (alpha)&sub1;-spezifischen cDNA-Sonden beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die (alpha)&sub1;- und (alpha)&sub2;-Untereinheiten des DHP-sensitiven Calciumkanals aus Skelettmuskel eine signifikante Homologie mit Genen teilen könnten, welche für andere spannungsabhängige DHP-sensitive Calciumkanäle, spannungsabhängige Calciumkanäle, welche nicht DHP-sensitiv sind (z. B. T- und N-Typen) und möglicherweise für ligandengesteuerte (ligand-gated) Calciumkanäle (z. B. Glutamatrezeptor) codieren. Interessanterweise wurden sowohl unter hoch- als auch niederstringenten Bedingungen in genomischer DNA aus Mensch hybridisierende Banden mit den (alpha)&sub1;-spezifischen cDNA-Sonden beobachtet, während signifikante Hybridisierung der (alpha)&sub2;-spezifischen cDNA-Sonden lediglich unter niedrigstringenten Bedingungen beobachtet wurde. Somit könnte, obwohl es Humangene gibt, die zu den Genen der (alpha)&sub1;- und (alpha)&sub2;-Untereinheit aus Kaninchen homolog sind, im (alpha)&sub2;-Gen relativ zum (alpha)&sub1;-Gen eine stärkere evolutionäre Sequenzdivergenz stattgefunden haben.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht einen Diagnosetest auf das Lambert Eaton Syndrom (LES) vor. LES ist eine Autoimmunkrankheit, welche durch eine unzureichende Freisetzung von Acetylcholin aus Endigungen motorischer Nerven, die normalerweise auf Nervenimpulse reagieren, gekennzeichnet ist. Eine neuere Veröffentlichung (Kim und Neher, Science 239, 405-408 (1988)) zeigt, daß IgG aus LES-Patienten individuelle spannungsabhängige Calciumkanäle blockiert und somit deren Funktion behindert. Ein Diagnosetest auf LES auf Basis der immunologischen Reaktivität von LES IgG mit der Calciumkanal (alpha)&sub2;-Untereinheit alleine oder in Kombination mit der (alpha)&sub1;-Untereinheit wird somit bereitgestellt. Beispielsweise kann ein derartiger Test auf eine Immunpräzipitation von LES IgG durch die Calciumkanaluntereinheiten der Erfindung beruhen.
    • BEISPIEL 1 Isolierung von RNA für eine cDNA-Bank
  • Am Tag, bevor RNA isoliert wird, wird das Nachstehende vorbereitet. Als Vorsichtsmaßnahme sollten alle Glaswaren ausgeheizt werden und alle Vorratslösungen in der unmittelbar nachstehenden Liste sollten durch Autoklavieren sterilisiert werden.
  • 200 ml 0,1 NaOAc, pH 5,2, 1 mM EDTA
  • 50 ml 0,2 M Na&sub2; EDTA, pH 8,0
  • 50 ml 1 M Tris, pH 7,5
  • 50 ml 3,2 M Tris, pH 7,2
  • 50 ml 0,01 M Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA
  • 50 ml PK-Puffer (0,1 M Tris, pH 7,2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA)
  • 50 ml 10% SDS
  • 4 l ultrareines H&sub2;O
  • Am Morgen der RNA-Isolierung wird zusammengegeben:
  • 100 ml H&sub2;O
  • 100 g Guanidinisothiocyanat (IBI)
  • 10,6 ml 1 M Tris, pH 7,5
  • 10,6 ml 0,2 M EDTA
  • Rühren, doch nicht über 65ºC erhitzen, um das Guanidinisothiocyanat aufzulösen.
  • Rückenskelettmuskel von jungen erwachsenen Kaninchen werden auf einer sauberen Glasplatte präpariert und etwa 10 g Muskelgewebe (in 4 mm Stücke geschnitten) werden zu etwa 50 ml der Guanidinisothiocyanatlösung in z. B. einer 100 ml Wheatonflasche zugegeben.
  • Homogenisieren erfolgt unter Verwendung eines "tissuemizer" von Tekman (große Klinge) für 10 bis 20 s oder bis kleine Stücke nicht länger sichtbar sind.
  • Stellen in ein Wasserbad mit 60ºC, Zugabe von 30 ml frischdestilliertem Phenol, welches auf 0,1% in 8.OH Quinolin, 0,2% β-ME eingestellt wurde. Nach dieser Zugabe sollte die Lösung klar und homogen sein.
  • Zugabe von 30 ml einer 1 : 1 Lösung Chloroform:Acetatpuffer.
  • Heftiges Schütteln bei 60ºC während 10 min; die Lösungen sollten opak erscheinen, falls nicht, Zugabe von ausreichend Chloroform:Acetat, bis sie milchig wird.
  • Abkühlen auf Eis, Abzentrifugieren zur Phasentrennung (7000 · g, 10 - 20 Minuten)
  • Abnehmen und heftiges Durchdrücken durch eine 22er Nadel.
  • Behandlung mit Phenol:Chloroform (1 : 1), gesättigt mit Acetatpuffer. Wäßrige Extraktion mit dem dreifachen Volumen Chloroform. Zugabe von 2 Volumina EtOH -20ºC und Präzipitation für 1 bis 2 Stunden, aber nicht länger.
  • Abnehmen des Präzipitats, kurzes Trocknen (< 5 Minuten) unter Vakuum. Resuspension in 7 ml PK-Puffer, der in bezug auf SDS auf 0,2% eingestellt wurde. Falls sich ein Präzipitat bildet, Erwärmen bei 65ºC, bis die Lösung klar erscheint. Zugabe von 1,5 mg Proteinase K.
  • 20 minütige Inkubation bei 37ºC (falls zu lange getrocknet wurde, wird die DNA sehr schwierig in Lösung zu bringen sein und heftiges Pipettieren wird während der Inkubation erforderlich sein).
  • Extraktion des Ansatzes mit 1 : 1 Phenol:Chloroform (eingestellt auf 0,1% in 8-OH Quinolin, 0,2% &beta;-ME, gesättigt mit 100 mM Tris, pH 8,5 oder PK-Puffer pH 7,7), 2 · mit Chloroform, Präzipitation durch Zugabe von 1/10 Volumen bei 3,2 M Tris, pH 7,5 und 2 Vol. EtOH. Poly A&spplus; RNA kann dann aus dem RNA-Gemisch durch gutbekannte Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Matrix-immobilisiertem Oligo (dT) isoliert werden.
    • BEISPIEL 2 cDNA-Klonierungsverfahren 1. Erststrangsynthese
  • a. Die folgenden Reagenzien und Zusammensetzungen werden miteinander vereint und 5 Minuten auf Eis inkubiert: Reagenz Volumen Endkonzentration 5 µg Poly A&spplus; RNA plus Wasser 5 · Reverse Transkriptase-Puffer
  • b. Danach werden die folgenden drei Reagenzien zu (a) zugegeben und das Gemisch wird 60 Minuten bei 37ºC inkubiert: MMLV-Reverse Transkriptase
  • c. Die folgenden Reagenzien werden zu (b) zugeben und das Gemisch wird 30 Minuten bei 37ºC inkubiert:
  • RNAsin (24 U/µl) 1 µl
  • MMLV-Reverse Transkriptase (BRL-200 U/µl) 3 µl
  • d. Entnahme von Aliquots zur Analyse:
  • 1 µl zum Zeitpunkt 0 für TCA
  • 1 µl nach 90 Minuten für TCA
  • 0,5 µl nach 90 Minuten für Gel
  • e. Die Reaktion wird nach 30 Minuten gestoppt durch Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA und Durchführung einer Phenolchloroformextraktion, gefolgt von einer Chloroformextraktion. Danach werden 10 µl 10 M NH&sub4;OAc plus zwei Volumina Ethanol zugegeben, um den Erststrang zu präzipitieren.
  • f. Um die Synthese zu analysieren, werden 0,5 µl der Reaktion auf einem 1,5% Agaroseminigel laufen gelassen, das Gel photographiert, getrocknet und unter einen Film eingelegt (im allgemeinen ist eine Exposition mit einem Verstärkerschirm über Nacht angemessen).
  • g. Berechnen der Masse an cDNA aus dem Prozenteinbau von Markierung über dem Hintergrund. 1 µg einzelsträngige cDNA = 1,4% Einbau.
    • 2. Zweitstrangsynthese
  • a. Die cDNA-RNA wird durch Zentrifugation in einer Laborbankmikrozentrifuge 15 Minuten abzentrifugiert. Das Pellet wird in 95% Ethanol gewaschen und getrocknet.
  • b. Das folgende Gemisch wird vorbereitet und 60 Minuten bei 12ºC inkubiert. Endkonzentration Volumen cDNA RNA plus Wasser 5· Zweitstrangpuffer
  • c. Zu diesem Gemisch wird das folgende zugegeben und die Inkubation 60 Minuten bei 22ºC fortgesetzt:
  • DNA-Polymerase 1 (10 U/µl) 1,5 µl
  • E.coli DNA-Ligase (2 U/µl) 1,5 µl
  • d. Die Reaktion wird nach 60 Minuten durch Zugabe von 4 µl 0,5 M EDTA und Durchführung einer Phenol/Chloroformextraktion und einer Chloroformextraktion gestoppt.
  • e. Die wäßrige Phase wird über eine G-50 Säule in einer kurzen Pasteurpipette geleitet und 100 µl Fraktionen werden gesammelt. Die 500 µl, welche die cDNA enthalten, werden gesammelt und gepoolt und durch Butanolextraktion auf ein Volumen von 50 µl eingeengt. Die cDNA wird durch Zugabe von 10 µl 10 M NH&sub4;OAc plus 2 Volumina Ethanol präzipitiert.
    • 3. T4 Polymerasereaktion
  • a. Die cDNA wird 15 Minuten in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert. Ein Waschschritt mit 95% Ethanol wird durchgeführt und das cDNA-Pellet getrocknet. Das trockene Pellet wird in einem Szintillationszähler gezählt. Unter Annahme einer Effizienz der Zweitstrangsynthese von 100% wird die Masse der doppelsträngigen cDNA aus der Erststrangberechnung berechnet.
  • b. Zu der cDNA wird dann das folgende zugegeben und das Gemisch wird 20 Minuten bei 37ºC inkubiert.
  • cDNA +
  • 10 · T4 Puffer 5 µl
  • H&sub2;O 40,75 µl
  • 4 mM dNTPs 1,25 µl
  • 0,1 mM DTT 2,5 µl
  • T4 Polymerase (10 U/µl) 0,5 µl
  • 50 µl
  • c. Entnahme von Aliquots:
  • 0,5 µl für Gel zum Zeitpunkt 0
  • 0,5 µl für Gel nach 20 Minuten
  • d. Die Reaktion wird nach 20 Minuten durch Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA gestoppt, gefolgt von einer Phenol/Chloroformextraktion und einer Chloroformextraktion.
  • e. Die wäßrige Phase wird über eine G-50 Säule in einer kurzen Pasteurpipette geleitet und 100 µl Fraktionen werden gesammelt. Die die cDNA enthaltenden 500 µl werden gesammelt und gepoolt und durch Butanolextraktion auf ein Volumen von 50 µl eingeengt. Die cDNA wird durch Zugabe von 10 µl 10 M NH&sub4;OAc plus 2 Volumina Ethanol präzipitiert.
  • f. Die zum Zeitpunkt 0 und nach 20 Minuten entnommenen 0,5 µl Proben werden auf einem 1,5% Agaroseminigel laufen gelassen, welches anschließend photographiert, getrocknet und unter Film eingelegt wird.
    • 4. Addition von EcoRI Adaptoren (zur Einfügung in lambda gt11)
  • a. Oligos mit den folgenden Sequenzen werden synthetisiert:
  • 20 mer: 5'-CCATGGTACCTTCGTTGACG-3'
  • 24 mer: 3'-GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA-5'
  • b. Das 20 mer wird phosphoryliert durch Vereinen der folgenden Reagenzien und 15 minütiger Inkubation bei 37ºC:
  • 225 pmol 20 mer +
  • Wasser 6,8 µl
  • 10 · Kinasepuffer 1,2 µl
  • ³²P-gammaATP (7000 Ci/mMol) 1,0 µl
  • Kinase (2 U/µl) 1,0 µl
  • 10 µl (gesamt b+c)
  • c. Die folgenden zwei Reagenzien werden dem obigen Gemisch zugegeben und es wird 30 Minuten bei 37ºC inkubiert:
  • 10 mM ATP 1 µl
  • Kinase (2 U/ml) 1 µl
  • 12 µl
  • d. Das Enzym wird dann durch 10 minütiges Erhitzen inaktiviert.
  • e. Das 24mer wird auf das phosphorylierte 20mer durch Zugabe von 225 pmol des 24mer (plus Wasser, um das Volumen auf 15 µl einzustellen) und Inkubation während 5 Minuten bei 65ºC hybridisiert. Die Reaktion wird dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
  • Die Adaptoren sind nunmehr in einer Konzentration von 15 pmol/µl vorhanden und zur cDNA Vektorlegierung bereit.
  • f. Vereinen des folgenden:
  • cDNA +
  • Hybridisierte Adaptoren (15 pmol/µl) 50-facher molarer Überschuß bezogen auf cDNA
  • Wasser 16 µl
  • 10 · Ligasepuffer 2 µl
  • Ligase (10 U/µl) 2 µl
  • 20 µl
    • 5. Phosphorylierung der cDNA
  • a. Die Ligase wird durch Erhitzen des Gemisches während 15 Minuten auf 72ºC inaktiviert.
  • b. Die folgenden Reagenzien werden zu der cDNA
  • Legierungsreaktion zugegeben und es wird 30 Minuten auf 37ºC erwärmt:
  • cDNA Legierungsreaktion 20 µl
  • Wasser 24 µl
  • 10 · Kinasepuffer 3 µl
  • 10 mM ATP 1 µl
  • Kinase (2 U/µl) 2 µl
  • 50 µl
  • c. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA gestoppt, gefolgt von einer Phenol/Chloroformextraktion und einer Chloroformextraktion.
    • 6. Reinigung und Größenselektionierung der cDNA
  • a. Die cDNA wird über eine BIO-GEL A-50 Säule, die mit &ge; 5 ml TE-Puffer gewaschen worden war, geleitet. Die Säule hat ein Harzbett von 0,8 ml in einer silikonisierten Glasröhre von 0,2 cm (Innendurchmesser) · 30 cm mit einem Glaswollepfropfen in einer gelben Pipettenspitze an der Unterseite.
  • b. Die cDNA wird in einem Schnellvakuum auf 20 µl eingeengt. 2,5 µl Gel-Ladefarbstoff wird zugegeben und die cDNA wird über die Säule geleitet. Die Radioaktivität beginnt herauszulaufen, nachdem 200 bis 250 µl TE-Puffer durch die Säule geleitet wurden. 5 Minuten Fraktionen ( 30 µl) werden gesammelt und in einem Szintillationszähler gezählt. Freie Adaptoren können 350 bis 400 µl, nachdem die cDNA zu eluieren beginnt, zu eluieren beginnen.
  • c. 0,5 µl verschiedener der gesammelten Fraktionen werden auf einem 1,5% Agaroseminigel laufen gelassen. Das Gel wird photographiert, getrocknet und unter Film eingelegt.
    • 7. Legierung von cDNA in den Vektor lambda gt11
  • a. Die cDNA enthaltenden Fraktionen werden gepoolt durch Butanolextraktion auf 20 bis 30 µl eingeengt und 5 µl 10 M NH&sub4;OAc plus 2 Volumina Ethanol werden zugegeben, um die cDNA zu präzipitieren. Sie wird 15 Minuten in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert und dann einem Waschschritt mit 95% Ethanol unterzogen und getrocknet.
  • b. Das Pellet wird gezählt und die Masse von cDNA relativ zur Masse nach der Zweitstrangsynthese wird berechnet.
  • c. Die cDNA wird in TE (-0,10 pmol/µl) resuspendiert.
  • d. Die Legierungsreaktion enthält das folgende, was bei 14 bis 16ºC über Nacht inkubiert wird:
  • (Die Verwendung von 1 µg lambda gt11 Vektor = 0,035 pmol Vektor)
  • lambda gt11 (1 µg/µl) 1 µl
  • cDNA Insert (2-4 facher molarer Überschuß von cDNA gegenüber Vektor) Wasser auf 3 µl
  • 5 · Ligasepuffer 1 µl
  • Ligase (10 U/µl) 1 µl
  • 5 µl
    • 8. Verpackung
  • Der Vektor wird unter Verwendung des Gigapack in vitro packaging kits, bezogen von Stratagene, und befolgen der darin enthaltenen Anweisungen verpackt.
    • REAGENZIEN
  • 5 · RT-Puffer
  • 250 mM Tris, pH 7,4 250 µl 1 M Lösung
  • 375 mM KCl 375 µl 1 M Lösung
  • 15 mM MgCl&sub2; 75 M¹ 0,2 M Lösung
  • H&sub2;O 300 µl
  • 1000 µl
  • 5 · dNTPs
  • 5 mM dATP 14,1 µl
  • 3 mM dCTP 9,1 µl
  • 5 mM dGTP 13,6 µl
  • 5 mM dTTP 13,3 µl
  • 50 µl
  • 5 · Zweitstrangpuffer
  • 100 mM Tris, pH 7,5 100 µl 1 M Lösung
  • 500 mM KCl 500 µl 1 M Lösung
  • 50 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 50 µl 1 M Lösung
  • 25 mM MgCl&sub2; 125 µl 0,2 M Lösung
  • 250 µg/ml BSA 5 µl 50 mg/ml
  • Wasser 220 µl
  • 1000 µl
  • 10 · T4 Puffer
  • 670 mM Tris, pH 8,0 670 µl 1 M Lösung
  • 167 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 167 µl 1 M Lösung
  • 67 mM MgCl&sub2; 67 µl 1 M Lösung
  • H&sub2;O 96 µl
  • 1000 µl
    • BEISPIEL 3
  • Durchmusterung der cDNA-Bank mit Antikörper
  • Platieren der lambda gt11-Bank auf Y1090 in LB Agar und 50 µg/ml Ampicillin. Wachsenlassen über Nacht in 15 ml LB, 0,2% Maltose und 50 µg/ml Ampicillin. Pelletieren der Zellen und Resuspendieren in 3 ml 10 mM MgSO&sub4;. Ausplattieren von vier Platten mit einer Dichte von 250000 Plaque/Platte unter Verwendung von 25 µl Phage (10000/µl) und 300 µl der 3 ml Lösung von Zellen in 50 µg/ml Ampicillin enthaltendem 10 ml Softagar.
  • Wachsenlassen während 2,5 Stunden bei 42ºC und Auflegen von IPTG-behandelten Filtern, welche mit 10 mM IPTG (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) getränkt waren.
  • Trocknen der Filter, gerade bis sie feucht sind, Auflegen von ihnen auf die Platten und Inkubation über Nacht bei 37ºC.
  • Orientieren der Platten und Auftropfen von 0,5 µl gereinigtem DHP-Rezeptor auf eine Platte als Positivkontrolle. Waschen der Filter während 10 Minuten bei Raumtemperatur in TBS (50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 8,0). Waschen der Filter in TBS, 20% FCS (filtriert) während 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  • Inkubieren der Filter während 2 Stunden in TBS, 20% FCS, Anti-DHS-Rezeptor-Antikörper (monoklonal oder polyklonal). 10 minütiges Waschen in TBS. Transfer der Filter auf neue Platten und einminütiges Waschen in TBS, 0,1% NP40. 10 minütiges Waschen in TBS und Transfer auf neue Platten.
  • Inkubation während mindestens einer Stunde mit TBS, 20% FCS, welches einen geeigneten zweiten Antikörper (z. B. HRP-Protein A, oder HRP-Ziege anti-Maus-IgG) enthält.
  • Waschen der Filter, wie oben für den ersten Antikörper beschrieben.
  • Entwickeln der positiven Klone unter Verwendung von etwa 40 ml/Platte von 4-Chlor-1-naphthol-Reagenz, das hergestellt wird durch Auflösen von 60 mg des Entwicklers in 20 ml eiskaltem MeOH und Mischen von 4-Chlor-1-naphthol (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) in 100 ml TBS, welches 60 µl 30% H&sub2;O&sub2; enthält.
    • BEISPIEL 4
  • Eine cDNA, welche für die (alpha)&sub2;-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals codiert.
  • Aufgrund der oben erwähnten Hinweise, daß die Gene für die (alpha)&sub2;-Untereinheit des humanen Calciumkanals in gewissem Umfang von den Genen der (alpha)&sub2;-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchen divergiert waren, wurden Fragmente isoliert, die für die humane (alpha)&sub2;-Untereinheit codierten, zur Verwendung als Sonden, um cDNA-Banken aus Humanhirn unter hochstringenten Bedingungen abzusuchen.
  • So wurde ein EcoRI-verdauter genomischer Southern Blot aus Mensch sowohl unter niedrigen als auch hochstringenten Bedingungen mit einem Fragment der für die (alpha)&sub2;-Untereinheit codierenden cDNA aus Kaninchen (das in Tabelle 2 angegebene Fragment von Nukleotid 43 bis Nukleotid 272) getestet. Unter niedrigstringenten Bedingungen wurden zwei genomische Fragmente mit einer Größe von 3,0 kbp und 3,5 kbp identifiziert. Unter hochstringenten Bedingungen ergab nur das 3,5 kbp Fragment ein stabiles Hybrid. Diese zwei Fragmente wurden in lambda gt11 kloniert. Das 3,5 kbp Fragment enthält ein kleines PstI-XbaI Fragment von etwa 300 bp, welches ein 82 bp Exon mit einer Homologie von 96,4% zu den Nukleotiden 102 bis 183 der Sequenz in Tabelle 2 enthält. Diesem Exon geht das Dinukleotid AG (splice donor) voraus und nachstehend folgt das Dinukleotid GT (splice acceptor), wie in der Technik wohl verstanden. Das 3,0 kbp Fragment enthält ein XbaI-BgIII Fragment von etwa 585 bp, welches 104 bp eines Exons (welches die BglII-Stelle an seinem stromabwärts liegenden Ende umfaßt) enthält, das innerhalb der 104 bp eine Homologie von 93,3% zu den Nukleotiden 184 bis 287 der Sequenz in Tabelle 2 aufweist. Sowohl das 300 bp Pst-XbaI Fragment als auch das 585 bp XbaI-BglII Fragment wurden verwendet, um duplizierte Abklatsche einer Basalganglien cDNA-Bank aus Mensch in lambda gt11 abzusuchen (die Bank wurde erhalten von der American Type Culture Collection, Pockville, Maryland, USA und enthielt etwa 106 unabhängige Rekombinante mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 800 bis 1000 bp). Es wurden drei positive Klone identifiziert, die mit beiden Sonden unter hochstringenten Bedingungen hybridisierten, einer mit einer Insertgröße von etwa 1150 bp, ein anderer mit einer Insertgröße von etwa 790 bp und der dritte mit einer Insertgröße von etwa 670 bp. Das 1150 bp Insert in dem einen Klon extendierte in den codierenden Bereich etwa vom Nukleotid 200 im codierenden Bereich und es wurde festgestellt, daß es eine Sequenz aufwies, die zu mehr als 90% zum entsprechenden Abschnitt der cDNA, deren Sequenz in Tabelle 2 dargestellt ist, homolog ist. Unter Verwendung des lambda Genoms mit dem 1150 bp Insert als Sonde wurde unter hochstringenten Bedingungen eine humane Hirnstamm-cDNA-Bank abgesucht (ebenfalls von der American Type Culture Collection bezogen und mit etwa 4 · 106 unabhängigen Rekombinanten mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 800 - 1000 bp). Bei diesem Absuchen wurden vier positive Klone identifiziert mit Inserts von etwa 950 bp, 1120 bp, 3000 bp und 2500 bp. Der Großteil des 1120 bp Inserts überlappte mit dem 1150 bp Insert der als Sonde verwendeten DNA, aber extendierte etwas stromaufwärts vom stromaufwärts gelegenen Ende des 1150 bp Inserts. Das 2500 bp Insert extendierte von etwa 650 bp vom 5'-Ende des 1120 bp Inserts stromabwärts. Die DNA mit dem 2500 bp Insert wurde verwendet, um die Hirnstammbank erneut abzusuchen, und ein Klon mit einem Insert von 2750 bp wurde gefunden. Durch Restriktionsanalyse und Sequenzieren wurde festgestellt, daß das 2750 bp Insert in 3'-Richtung über das Translations-Stopsignal eines Leserahmens extendierte, von dem festgestellt wurde, daß er im oben beschriebenen 1120 bp Insert begann. Das 2750 bp Insert und das 1120 bp Insert haben eine gemeinsame PvuII-Stelle und wurden unter Verwendung der PvuII-Stelle legiert, um eine cDNA bereitzustellen, die für eine neuronale humane Calciumkanal (alpha)&sub2;-Untereinheit codiert. Die 5'-gelegenen 1560 bp dieser cDNA wurden sequenziert und wie in Tabelle 3 dargestellt wurde festgestellt, daß sie zu 91,2% homolog mit dem in Tabelle 2 angegebenen entsprechenden 1575 bp Abschnitt sind.
  • Die für die humane (alpha)&sub2;-Untereinheit codierende cDNA wird zur Expression in Gewebskulturzellen aus Säuger in den Säugerexpressionsvektor pSV2DHFR, der in der Technik verfügbar ist, subkloniert werden.
  • Wir erhielten die Human-Neuroblastomzellinie IMR32 von der American Type Culture Collection (Accession Nr. CCL127). Unter Verwendung der für die humane (alpha)&sub2;-Untereinheit codierenden Vollängen-cDNA wurde eine Northern Blot Analyse mit der Poly A+ RNA dieser Zellinie durchgeführt. Unter niedrigstringenten Waschbedingungen wurde ein einzelnes 8,2 kb Fragment gefunden. Die für (alpha)&sub2; aus Kaninchenskelettmuskel codierende Messenger RNA hatte ebenfalls eine zu 8,2 kb ähnliche Größe. Tabelle 3 Neuronal &alpha;2 Human Kaninchenskelettmuskel &alpha;2 Tabelle 3 (Fortsetzung) Tabelle 3 (Fortsetzung) Tabelle 3 (Fortsetzung)
  • Obwohl die Erfindung hierin mit einiger Spezifität beschrieben wurde, wird der Durchschnittsfachmann zahlreiche Abwandlungen und Modifizierungen an dem, was beschrieben ist, erkennen.

Claims (10)

1. DNA, umfassend eine cDNA mit einer Sequenz, welche für die (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals aus Säuger von Skelettmuskel, Herz oder einen neuronalen Calciumkanal oder für den Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit codiert, wobei die (alpha)&sub2;-Untereinheit die in Tabelle 2 angegebene Aminosäuresequenz oder funktionell äquivalente Varianten davon umfaßt oder die (alpha)&sub2;-Untereinheit die Aminosäuresequenz umfaßt, die durch die in Tabelle 3 angegebene DNA codiert wird oder funktionell äquivalente Varianten davon.
2. DNA nach Anspruch 1, worin die Sequenz der cDNA eine cDNA-Sequenz ist, die für eine (alpha)&sub2;-Untereinheit codiert mit der in Tabelle 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder der durch die in Tabelle 3 angegebene DNA codierten Aminosäuresequenz.
3. Im wesentlichen reine (alpha)&sub2;-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, umfassend eine durch die in Tabelle 3 angegebene DNA codierte Aminosäuresequenz oder funktionell äquivalente Varianten davon.
4. Eukaryontenzelle, umfassend eine amphibische Oozyte mit einem heterologen Calciumkanal, wobei die Zelle hergestellt ist durch ein Verfahren, umfassend das Verabreichen der Zelle einer ersten Zusammensetzung, welche im wesentlichen aus einer ersten RNA besteht, die in der Zelle in den Vorläufer der (alpha)&sub1;-Untereinheit eines Calciumkanals eines Säugers einer ersten Spezies translatierbar ist, und einer zweiten Zusammensetzung, die im wesentlichen aus einer zweiten RNA besteht, die in der Zelle in den Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals eines Säugers einer zweiten Spezies translatierbar ist, wobei die erste und zweite Spezies gleich oder unterschiedlich sind, vorausgesetzt, daß mindestens einer aus dem Vorläufer der (alpha)&sub1;-Untereinheit und dem Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit für die Zelle fremd ist, wobei die (alpha)&sub2;-Untereinheit die in Tabelle 2 angegebene Aminosäuresequenz oder funktionell äquivalente Varianten davon umfaßt, oder die (alpha)&sub2;-Untereinheit eine durch die in Tabelle 3 angegebene DNA codierte Aminosäuresequenz oder funktionell äquivalente Varianten davon umfaßt.
5. Eukaryontenzelle mit einem heterologen Calciumkanal, wobei der Calciumkanal hergestellt ist durch ein Verfahren, umfassend Expression einer ersten cDNA, welche für den Vorläufer der (alpha)&sub1;-Untereinheit eines Calciumkanals eines Säugers einer ersten Spezies codiert und einer zweiten cDNA, welche für den Vorläufer der (alpha)&sub2;-Untereinheit eines Calciumkanals eines Säugers einer zweiten Spezies codiert, wobei die erste und zweite Spezies gleich oder unterschiedlich sind, wobei die (alpha)&sub2;-Untereinheit die in Tabelle 2 angegebene Aminosäuresequenz oder funktionell äquivalente Varianten davon umfaßt, oder die (alpha)&sub2;-Untereinheit die durch die in Tabelle 3 angegebene DNA codierte Aminosäuresequenz oder funktionell äquivalente Varianten davon umfaßt.
6. Eukaryontenzelle nach Anspruch 4 oder 5, worin die (alpha)&sub2;-Untereinheit entweder die in Tabelle 2 angegebene Aminosäuresequenz oder die durch die in Tabelle 3 angegebene DNA codierte Aminosäuresequenz umfaßt.
7. Zelle nach Anspruch 5 oder 6, die mit einem heterologen Gen transformiert ist, das ein Transkriptionskontrollelement umfaßt, das in der Zelle aktiv ist und dessen Transkriptionsaktivität auf ein Ion oder Molekül reagiert, welches fähig ist, durch einen funktionellen Calciumkanal in die Zelle einzudringen, und das zur Expression operativ mit einem Strukturgen für ein Indikatorprotein verbunden ist.
8. Verfahren zum Untersuchen einer Verbindung auf Aktivität als Calciumkanalagonist oder Calciumkanalantagonist, welches umfaßt das Suspendieren einer Zelle nach Anspruch 7 in einer Lösung der zu untersuchenden Verbindung und eines Ions oder Moleküls, das fähig ist, durch einen funktionellen Calciumkanal in die Zelle einzudringen und fähig ist, den Transkriptionsgrad des Transkriptionskontrollelements des heterologen Gens in der Zelle zu beeinflussen und das Messen der Konzentrationsänderung des Indikatorproteins in der Zelle.
9. Markierte RNA oder einzelsträngige DNA mit einer Sequenzlänge von mindestens 12 Basen, welche eine Sequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Basen umfaßt, ausgewählt aus der in Tabelle 2 oder Tabelle 3 angegebenen codierenden Sequenz oder dem Komplement einer Sequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Basen, ausgewählt aus der in Tabelle 2 oder Tabelle 3 angegebenen codierenden Sequenz.
10. Markierte RNA oder einzelsträngige DNA mit einer Sequenzlänge von mindestens 30 Basen, welche eine Sequenz von mindestens 30 aufeinanderfolgenden Basen umfaßt, ausgewählt aus der in Tabelle 2 oder Tabelle 3 angegebenen codierenden Sequenz oder dem Komplement einer Sequenz von mindestens 30 aufeinanderfolgenden Basen, ausgewählt aus der in Tabelle 2 oder 3 angegebenen codierenden Sequenz.
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