DE10109780A1 - Episomale Vektoren enthaltend Matrix-Anheftungsregionen zur zellspezifischen Genexpression - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren, die mindestens eine Matrix-Anheftungsregion umfassen und zum episomalen Einbau von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen geeignet sind, eukaryotische Zellen, enthaltend diese Vektoren, sowie die Verwendung dieser Vektoren zur Zell-/Gewebe-spezifischen Expression von Transgenen.

Description

Die Erfindung betrifft episomale Vektoren, umfassend mindestens eine Matrix- Anheftungsregion als Insulator, eukaryotische Zellen enthaltend diese Vektoren sowie die Verwendung dieser Vektoren zur Expression von Transgenen.

Zu den erfolgversprechenden Methoden der Gentechnologie zählt die Gentherapie, deren Ziel es ist, durch das Einschleußen von Erbgut in Zellen und dessen anschließender Expression Krankheiten, die auf ein defektes Gen zurückzuführen sind, zu behandeln oder zu verhindern. Zu diesem Zwecke sind mittlerweile zahlreiche Vektoren entwickelt worden, wobei man hinsichtlich des Einschleußens des Erbgutes virale von nicht-viralen Transferverfahren unterscheiden kann (Mulligan (1993), Science 260: 920). Als virale Vektoren kommen hierbei in erster Linie Retroviren und Adenoviren zum Einsatz.

Während die retrovirale Infektion zu einer stabilen Integration des genetischen Materials in das zelluläre Genom führt, liegen die Adenoviren in der Zelle episomal vor, werden also nicht stabil in das zelluläre Genom integriert.

Die Weiterentwicklung adenoviraler Vektoren für die somatische Gentherapie beinhaltet unter dem Aspekt der Sicherheit der Anwendung eine Verbesserung des Targeting, wobei man als wesentliche Targetingkonzepte den zellspezifischen Gentransfer und die zellspezifische Expression nennen kann.

Die Zellspezifität des Gentransfers kann man etwa durch Modifikation des Tropismus des Adenovirus durch Veränderung der Hüllproteine ermöglichen oder verbessern, während die Zellspezifität der Transgenexpression durch Inkorporation zell- oder gewebespezifischer Promotoren (transcriptional targeting) ermöglicht oder verbessert werden kann.

Zellspezifische Promotoren, die in adenovirale Vektoren inkorporiert werden können, sind bereits bekannt. Ein grundlegendes Problem besteht jedoch darin, dass adenovirale Enhancerelemente mit diesen regulatorischen Modulen zur Transgenexpression interferieren können. Dies wurde insbesonders bei der Inkorporation zellspezifischer Promotoren und exogen regulierbarer Genschalter beobachtet.

Adenovirale Enhancersequenzen, die mit der heterologen Transgenexpression interferieren können, befinden sich im adenoviralen ITR und der Verpackungsregion (Ad5 Sequenzen 1 bis 340). So hat der adenovirale ITR Bindungsstellen für eine Reihe von Transkriptionsfaktoren (u. a. SP1, ATF) (Hatfield et al. (1991), Virology 184: 265-76) und weist allein Enhanceraktivität auf (Miralles et al. (1989), J Biol Chem 264: 10763-72). Der EIA Enhancer überlappt mit den cis-aktiven Sequenzen für die Verpackung des viralen Genoms (Grable et al. (1992), J. Virol. 66: 723-31). Diese Verpackungssequenzen sind in allen beschriebenen adenoviralen Vektoren einschließlich der gutless Vektoren enthalten, so dass für keinen adenoviralen Vektor transkriptionelle Interferenzen ausgeschlossen werden können.

Ein Problem, dass mit der Interferenz der adenoviralen Enhancersequenzen und der heterologen Transgenexpression verbunden sein kann, ist, dass die Zellspezifität der eingebauten Promotoren verloren geht. Dies ist vor allem unter dem Aspekt der Sicherheit der Anwendung der adenoviralen Vektoren für die somatische Gentherapie unerwünscht.

Eine denkbare Vorgehensweise, diese unerwünschte Beeinflussung der Transgenexpression durch adenovirale Enhancersequenzen zu verhindern, besteht im Einsatz von Insulatoren.

Unter Insulatoren versteht man im allgemeinen DNA-Elemente, die integrierte Reportergene vor chromosomalen Positionseffekten schützen, so dass die Transgene eine verringerte Positionsabhängigkeit der Genexpression zeigen, und/oder DNA-Elemente, die die Wirkung eines Enhancers auf einen stromabwärts liegenden Promotor reduzieren oder ganz verhindern.

Bei Verwendung von Vektoren zum stabilen Einbau von Nukleinsäuren in das Genom des Wirtes konnte die wirkungsvolle Verwendung von Matrix- Anheftungsregionen als Insulatoren nachgewiesen werden. So wurde für die MAR des Lysozymegens gezeigt, dass sie die Positionsabhängigkeit der Transgenexpression von stabilen Transfektanten in Zellen verschiedener Spezies (Ratte, Huhn) und unterschiedlicher Differenzierung (Makrophagen, Fibroblasten) und bei Kontrolle durch unterschiedliche Promotoren reduziert (Stief et al. (1989), Nature 341: 343-5; Phi-Van et al. (1990), Mol Cell Biol 10: 2302-7).

Die Insulation eines Promotors von der Aktivität eines Enhancers durch eine Matrix- Anheftungs-Region könnte hierbei an die Integration eines Konstruktes und den Aufbau einer vollständigen Domäne (mit Zusammenbau von Nucleosomen unter Einschluß von Histonen) geknüpft sein.

Bezüglich adenoviraler Vektoren sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt lediglich zwei adenovirale E1-/E3-Vektoren beschrieben, die zur Verbesserung der Transgenexpression mit Insulatoren ausgestattet wurden. So beschreiben Vassaux et al. (1999) (Gene Ther. 6: 1192-7) die Tumorzell-spezifische Expression des ERBB2-Promotors durch Inkorporation des transkriptionellen Stop-Signals aus dem bovinen Wachstumshormon-Gen (bPA), wobei bPA eigentlich nicht zu den klassischen Insulatoren zu zählen ist.

Neuere Untersuchungen haben ferner für den HS-4 β-Globin-Insulator aus G. gallus gezeigt, dass dieser episomal und insbesondere in Adenoviren Insulatorfunktion aufweist. Recillas-Targa et al. konnten so zeigen, dass für die Aktivität des HS-4 β-Globin Insulators eine Integration in das Genom - und damit vollständiger Aufbau der Chromatinstruktur - nicht notwendig ist (Recillas-Targa et al. (1999), Proc. Natl Acad Sci USA 96: 14354-9).

Steinwaerder und Lieber zeigten, dass durch seine Inkorporation hinter die adenovirale ITR die Induzierbarkeit des Metall-responsiven Promotors MRE in vitro und in vivo verbessert wird (Steinwaerder und Lieber (2000), Gene Ther. 7, 556-67). Burcin et al. (1999) konnten mit dem HS-4 Insulator eine verbesserte Induzierbarkeit eines Mifepriston-abhängigen Genschalters in einem adenoviralen gutless Vektor in vitro beobachten, während in vivo, in einem Mausmodell, die absoluten Expressionshöhen der adenoviralen Vektoren mit HS-4 Insulator reduziert waren (Burcin et al. (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96: 355-60).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, alternative Möglichkeiten zur Insulation von episomal in Zellen vorliegendes genetisches Material bereitzustellen, wofür angesichts der Anwendungsmöglichkeiten von episomalen Nukleinsäuren in der Gentherapie ein dringender Bedarf besteht.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, zu verhindern, dass es beim Einbau von Nukleinsäuren, die Zell-spezifische Promotoren umfassen und episomal in eukaryotische Zellen eingebaut werden, zum Verlust der Zell-Spezifität des Promotors kommt, wofür unter dem Aspekt der Sicherheit der Anwendung in der Gentherapie ein dringender Bedarf besteht.

Es zeigte sich nun überraschenderweise, dass Matrix-Anheftungsregionen nicht nur in stabil in das Genom integrierten, sondern auch in episomal in eukaryotische Zellen eingebauten Nukleinsäuren Insulatorfunktion ausüben. Man kann also darauf schließen, daß Matrix-Anheftungsregionen cis-aktiv auf episomale DNA wirken, ohne dass der Aufbau einer vollständiger Chromatinorganisation - wie sie im Falle einer Integration der Nukleinsäure ins Genom vorläge - für die Insulatorfunktion unbedingt notwendig ist. Die Quasi-Chromatin- bzw. Histone einschließende Nukleosomen-Struktur, die für episomale Nukleinsäuren nachgewiesen wurde (Daniell et al. (1981), Mol Cell Biol 1: 1094-105; Dery et al. (1985), J Gen Virol 66: 2671-84), könnte hierbei wichtig für die Ausübung der Insulatorfunktion der Matrix- Anheftungsregion sein.

Ferner zeigte sich überraschenderweise, dass bei Vorlage von Zell-spezifischen Promotoren unter Verwendung von Matrix-Anheftungsregionen sichergestellt werden kann, dass die Zell-Spezifität des Promotors erhalten bleibt.

Weiterhin zeigte sich überraschenderweise, dass durch den Einbau der Matrix- Anheftungsregionen die Expressionsdauer des eingebauten Vektors in einem replizierenden Zellsystem deutlich höher ist als ohne Einbau des Insulators, der so erhaltene Vektor also eine verbesserte Expressionspersistenz besitzt.

Der Gedanke, Matrix-Anheftungsregionen in episomale Vektoren einzubauen, wurde bereits von Sandig et al. (1997) ausgesprochen, wobei dieser allerdings nicht angibt, aus welchen Gründen die Matrix-Anheftungsregion in den episomalen Vektor eingebaut werden soll, und weiterhin offensichtlich von diesem auch keine Experimente in dieser Hinsicht durchgeführt worden sind (WO 97/04117).

Weiterhin wurde von Zaehres et al. (2000) beschrieben, dass durch Einbau einer Matrix-Anheftungsregion in episomale Vektoren die Expression eines Transgens in Zellkultur verlängert werden kann, allerdings werden hier weder die verwendeten Zellen noch der Einbauort der Matrix-Anheftungsregion in den episomalen Vektor angegeben. Insbesondere ist eine Insulator-Wirkung der Matrix-Anheftungsregion bei Zaehres et al. nicht beschrieben (Zaehres et al. (2000), J Gene Med 2 (5 Suppl): 57).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Vektoren, die zum episomalen Einbau von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen verwendet werden können und die sich dadurch auszeichnen, dass sie mindestens eine Matrix-Anheftungsregion umfassen, wobei die Matrix-Anheftungsregion vorzugsweise Insulatorfunktion in Bezug auf in diesen Vektoren enthaltenen und/oder in diese Vektoren einbaubare Promotoren besitzt.

Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden kann man in die erfindungsgemäßen Vektoren eine Nukleinsäure einbauen, die einen Promotor und eine Transgensequenz umfasst. Die so erhältlichen Vektoren sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren sind durch Infektion und/oder Transfektion eukaryotische Zellen erhältlich, die eine Nukleinsäure episomal enthalten, die eine Matrix-Anheftungsregion und einen Promotor umfasst.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb eukaryotische Zellen, enthaltend eine episomale Nukleinsäure, die eine Matrix-Anheftungsregion und einen Promotor umfasst, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser eukaryotischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors die erfindungsgemäßen eukaryotischen Zellen hergestellt werden, wobei der Einbau der episomalen Nukleinsäure erfindungsgemäß bevorzugt durch Infektion oder Transfektion der eukaryotischen Zellen mit dem erfindungsgemäßen Vektor erfolgt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren zur Herstellung von eukaryotischen Expressionssystemen, insbesondere zur Herstellung von Expressionssystemen mit einer verbesserten Expressionspersistenz.

Die erfindungsgemäßen Vektoren und/oder eukaryotischen Zellen werden erfindungsgemäß bevorzugt als Therapeutikum und/oder Diagnostikum eingesetzt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit weiterhin eine Zusammensetzung, enthaltend einen der erfindungsgemäßen Vektoren und/oder erfindungsgemäße eukaryotische Zellen und gegebenenfalls weitere Hilfs- und Zusatzstoffe, sowie die Verwendung dieser Vektoren und/oder eukaryotischen Zellen zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei es sich bei der Zusammensetzung bevorzugt um ein Therapeutikum oder ein Diagnostikum handelt.

Besonders bevorzugt handelt es sich erfindungsgemäß um ein Therapeutikum und/oder Diagnostikum zum Einsatz in der Gen- und Zelltherapie und zur Behandlung von chronischen Krankheiten und Erbkrankheiten wie Diabetes, Hämophilie, ADA, Muskeldystrohpie, familiäre Hypercholesterinämie oder Rheuma, oder akuten Krankheiten wie vaskuläre Erkrankungen - Arteriosklerose oder deren Folgekrankheiten (Stenose, Restenose, Herzinfarkt) - oder Tumorerkrankungen.

Das sich im Vektor befindliche Transgen, das unter der Kontrolle des insulierten Promotors steht, umfasst erfindungsgemäß beispielsweise eine Nukleinsäure kodierend für Insulin, Blutgerinnungsfaktor VIII oder X, eine Isoform der Stickstoffmonoxid-Synthase (z. B. iNOS: induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase; eNOS: endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase; nNOS: neuronale Stickstoffmonoxid- Synthase), hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie GM-CSF, M-CSF oder MCP-1 oder Transkriptionsfaktoren wie die Gruppen der Nkx oder Pax oder myogene Faktoren, die Zellen in ihrem Differenzierungs- und Reifungsprozeß beeinflussen könnten.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren für die Zell- oder Gewebe-spezifische Expression eines Transgens.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei insbesondere ein Verfahren zur Zell-spezifischen Expression einer episomalen Nukleinsäure, das sich dadurch auszeichnet, dass nach Infektion oder Transfektion mit einem erfindungsgemäßen Vektor die episomale Nukleinsäure in den infizierten oder transfizierten Zellen exprimiert wird.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind transgene Säugetiere außer dem Menschen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Differenzierung und/oder Selektion von Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemäßer Vektor, der mindestens ein Transgen umfasst, das den Differenzierungsstatus der Stammzellen beeinflusst, durch Transfektion und/oder Infektion in die Stammzellen eingebracht wird und die transfizierten und/oder infizierten Zellen gegebenenfalls von den anderen Zellen getrennt werden.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Differenzierung und/oder Selektion von Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass Stammzellen, die einen erfindungsgemäßen Vektor umfassen, mit den dem Fachmann bekannten Methoden aus transgenen Tieren oder deren Embryonen isoliert werden.

Die aus diesen Stammzellen differenzierten Zellen können zur zellvermittelten Transplantation und für den somatischen Gentransfer in vivo eingesetzt werden.

Bei den erfindungsgemäßen Vektoren, die eine Matrix-Anheftungsregion umfassen, handelt es sich bevorzugt um adenovirale Vektoren, besonders bevorzugt um E1-/E3- Vektoren oder Gutless-Vektoren, insbesondere handelt es sich um den adenoviralen Vektor pAd-SAR1-X/pASX gemäß SEQ ID 1, der als Basisvektor zur Konstruktion unterschiedlicher adenoviraler Vektoren verwendet werden kann.

Matrix-Anheftungsregionen sind dem Fachmann bekannt. Unter Matrix- Anheftungsregionen wird erfindungsgemäß insbesondere auch verstanden, was im englischen Sprachgebrauch unter "scaffold attachment regions" bekannt ist.

Die Matrix-Anheftungsregion wird erfindungsgemäß mit den dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Methoden in den episomalen Vektor eingebaut. Bei Verwendung von adenoviralen Vektoren erfolgt der Einbau hierbei bevorzugt stromabwärts (in 3'-Richtung) von den adenoviralen Verpackungs- und Enhancersequenzen, die beispielsweise bei dem adenoviralen Vektor pd1E1Sp1A von Position 1 bis 360 lokalisiert sind, sowie stromaufwärts (in 5'-Richtung) von der Position, an der sich der zu insulierende Promotor befindet oder an der der zu insulierende Promotor mit molekularbiologischen Standardmethoden eingebaut werden kann.

Die Matrix-Anheftungsregion wird hierbei bevorzugt so eingebaut, dass sich der Promotor bzw. der einzubauende Promotor unmittelbar an das 3'-Ende der Matrix- Anheftungsregion anschließt oder maximal 1000 Baseneinheiten vom 3'-Ende der Matrix-Anheftungsregion entfernt ist, und/oder dass sich die Verpackungsregion des adenoviralen Vektors unmittelbar an das 5'-Ende der Matrixanheftungsregion anschließt oder maximal 1000 Baseneinheiten vom 5'-Ende der Matrixanheftungsregion entfernt ist.

Optional kann zusätzlich eine zweite Matrix-Anheftungsregion stromabwärts (3') vom internen, Zell-spezifischen Promotor eingebaut werden.

Als Promotor wird erfindungsgemäß bevorzugt ein Zell- oder Gewebe-spezifischer Promotor verwendet, besonders bevorzugt ein Endothelzell-spezifischer Promotor, insbesondere ein Promotor des VE-Cadherin 1 oder 2 oder des VEGF-Rezeptors (FLT-1, KDR/FLK-1), ein Cardiomyocyten-spezifischer Promotor, insbesondere der cardiac myosin light chain (MLC) 2 gene-Promotor oder der cardiac myosin heavy chain (MHC) gene-Promotor, ein für glatte Muskelzellen spezifischer Promotor, insbesondere der smooth muscle alpha-actin-Promotor, oder ein für Pankreas/β- Zellen spezifischer Promotor, insbesondere der Insulin-, PDX-, NKx- oder Beta2- Promotor. Der Promotor ist erfindungsgemäß bevorzugt durch eine Matrix- Anheftungsregion insuliert.

Die Matrix-Anheftungsregion hat erfindungsgemäß bevorzugt eine Basenlänge zwischen 500 und 5000, besonders bevorzugt zwischen 1000 und 3000, ganz besonders bevorzugt zwischen 1500 und 2500, insbesondere eine Basenlänge von etwa 2000.

Bei der Matrix-Anheftungsregion handelt es sich beispielsweise um eine Matrix- Anheftungsregion aus Wirbeltieren, insbesondere aus Säugern, besonders bevorzugt handelt es sich um eine humane Matrix-Anheftungsregion, insbesondere um diejenige des humanen Interferon β-Locus. Die Matrix-Anheftungsregion fungiert erfindungsgemäß bevorzugt als Insulator.

Die Matrix-Anheftungsregion kann erfindungsgemäß sowohl 5'-3'- als auch in 3'-5'- Richtung in den episomalen Vektor eingebaut werden.

Bei den eukaryotischen Zellen handelt es sich erfindungsgemäß bevorzugt um Zellen von Wirbeltieren, insbesondere um Säuger-Zellen, besonders bevorzugt um menschliche Zellen, insbesondere um Endothel-Zellen, Cardiomyocyten, glatte Muskelzellen oder um Pankreas/β-Zellen.

In den folgenden Ausführungsbeispielen wird die Erfindung beispielhaft veranschaulicht.

Beispiele 1. Deletionskonstrukte des humanen VE-Cadherin1 Promotors mit Luciferase als Reportergen zeigen in vitro Endothelzell-spezifische Expression (Abb. 1)

In Vorexperimenten wurde eine Deletionsanalyse des humanen VE-Cadherin1 Promotors durchgeführt: Verschiedene Promotorfragmente von -14Sbp bis -1355 bp stromaufwärts vom hVE1-Transkriptionsstartpunkt wurden mit einem Reportergen (Luciferase) gekoppelt. Diese Reportergenkonstrukte wurden in a.) Endothelzelllinien (BAEC) und in b.) Zellen nicht endothelialen Ursprungs (NIH3T3) transfiziert. In diesen Experimenten zeigten alle untersuchten Promotorfragmente eine endothelspezifische Expression: In den Endothelzellinien lag die Luciferaseaktivität der Reportergenkonstrukte 70-110-fach über dem Hintergrund, in den NIH3T3 wurden lediglich Aktivitäten bis zu 10-fach über dem Hintergrund gemessen.

2) Adenovirale E1-/E3-Vektoren mit einem humanen VE-Cadherin1 Promotor- Fragment (Abb. 2) zeigen keine Endothelzell-spezifische Expression (Abb. 3)

Zur Konstruktion des adenoviralen Vektors Ad-VE1-IacZ wurde das -3500 bp hVE-Cadherin1 Promotor Fragment, das in den Transfektionsexperimenten Endothelzell-spezifische Expression zeigte, vor dem IacZ Gen in die EcoRV Schnittstelle von pΔE1asp1A inseriert. Dieses shuttle Plasmid wurde mit pBHG10 in 293 kotransfiziert. Es wurden rekombinante Adenoviren mit Virustitern um 10e8 generiert.

Zur Analyse der zellspezifischen Expression von Ad-VE1-IacZ wurden Endothelzellen (HUVEC) und Glatte Muskelzellen (SMC) mit dem Vektor sowie als weiterer Kontrolle dem Vektor Ad-CMV-GFP in einer MOl von 50 für zwei Stunden in I2-Medium infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden Zellextrakte aufbereitet und die β-Galaktosidaseaktivität sowie der Proteingehalt der Zellextrakte bestimmt. In Vorexperimenten konnte mit Ad-CMV-IacZ und Ad-CMV-GFP Adenoviren vergleichbare Gentransfereffizienzen in HUVEC und SMC nachgewiesen werden. Der Vektor Ad-VE1-IacZ exprimierte sowohl in den Endothelzellen als auch in den Glatten Muskelzellen gleichermaßen stark. (Abb. 3) Die Expression vom hVE- Cadherin1 Promotor Fragment ist in diesem Kontext also nicht Endothelzell­ spezifisch.

Auch Adenovirale gutless Vektoren mit einem humanen VE-Cadherin 1 Promotor- Fragment zeigten keine Endothelzell-spezifische Expression.
3) Wiederherstellung der Zell-Spezifität durch Herstellung des adenoviralen Vektors Ad-SAR1-VE1-IacZ durch Inkorporation der Matrix-Anheftungsregion.

Zur Konstruktion des adenoviralen Vektors Ad-SAR1-VE1-IacZ (Abb. 2) wurde das -700 bp hVE-Cadherin1 Promotor - Fragment vor dem IacZ Gen in die EcoRV Schnittstelle von pAd-SAR1-x inseriert. Dieses shuttle Plasmid wurde mit dem Plasmid pJM17 in 293 kotransfiziert. Es wurden rekombinante Adenoviren mit Virustitern um 10e8 generiert.

Zur Analyse der zellspezifischen Expression von Ad-SAR1-VE1-IacZ wurden Endothelzellen (HUVEC) und Glatte Muskelzellen (SMC) mit dem Vektor sowie als weiterer Kontrolle dem Vektor Ad-CMV-GFP in einer MOl von 50 für zwei Stunden in I2-Medium infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden Zellextrakte aufbereitet und die β-Galaktosidaseaktivität sowie der Proteingehalt der Zellextrakte bestimmt. In Vorexperimenten konnte mit Ad-CMV-IacZ und Ad-CMV-GFP Adenoviren vergleichbare Gentransfereffizienzen in HUVEC und SMC nachgewiesen werden. Der Vektor Ad-SAR1-VE1-IacZ exprimierte in Endothelzellen, die Expression in den Glatten Muskelzellen war deutlich reduziert (Abb. 3). Dieses Resultat konnte in mehreren Experimenten und auch durch morphologische Betrachtung transduzierter und β-Gal gefärbter Zellen verifiziert werden. In Kombination mit dem S/MAR-Modul war vom hVE-Cadherin1 Promotor eine Endothelzell-spezifische Expression im adenoviralen Vektor möglich.

Tabelle 1

Expression der adenoviralen Vektoren Ad-SAR1-VE1-IacZ und Ad-VE1- IacZ nach Transduktion (MOl 50) von Endothelzellen (HUVEC) und glatten Muskelzellen (SMC)

In Abb. 1 ist die Expression der Deletionskonstrukte des humanen VE- Cadherin1 Promotors mit Luciferase als Reportergen in vitro dargestellt. Während in Endothelzellen (BAEC) Expression nachweisbar ist (a), ist in Fibroblasten keine Expression nachweisbar (b).

In Abb. 2 ist beispielhaft der erfindungsgemäße adenovirale shuttle Vektor pAd-SAR1-x/pASX (8401 bp) schematisch dargestellt. Er setzt sich zusammen aus

• - der Sequenz des adenoviralen shuttle Vektors pd1E1Sp1A (6409 bp)
  (Bett et al. PNAS 91: 8802-8806, 1994)
  Sequenz 1-364
• - der Sequenz der humanen Interferonß - Scaffold-Attachment-Region
  (NCBI-Nukleotid-Datenbank Nr.: M83137)
  Sequenz 218-2201 + Sequenz AATT
• - der Sequenz des adenoviralen shuttle Vektors pd1E1Sp1A
  Sequenz 361-6409

Dem adenoviralen Inverted Terminal Repeat (ITR) folgt die adenovirale Verpackungsregion, an diese schließt sich die Matrix-Anheftungsregion an, der eine multiple Klonierungsstelle folgt, in die erfindungsgemäß eine Nukleinsäure eingebaut werden kann, die einen Promotor und ein Transgen umfasst.

Die vollständige Sequenz des Vektors pAd-SAR1-x/pASX ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 1 angegeben.

In Abb. 3 ist die Expression der adenoviralen Vektoren Ad-SAR1-VE1-IacZ und Ad-VE1-IacZ nach Transduktion (MOl 50) von Endothelzellen (HUVEC) und glatten Muskelzellen (SMC) dargestellt (s. auch Tabelle 1).

SEQENZPROTOKOLL

Claims (28)

1. Vektor zum episomalen Einbau von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Matrix-Anheftungsregion umfasst.

2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen adenoviralen Vektor handelt.

3. Vektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Matrix-Anheftungsregion um eine humane Matrix- Anheftungsregion handelt.

4. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Vektor pAD-SAR1-X/pASX gemäß SEQ ID No. 1 handelt.

5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die einen Promotor und ein Transgen enthält.

6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Matrix-Anheftungsregion in 5'-Richtung vom Promotor und in 3'-Richtung von der viralen Verpackungsregion befindet.

7. Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstände zwischen 3'-Ende der Verpackungsregion und 5'-Ende der Matrix- Anheftungsregion sowie 3'-Ende der Matrix-Anheftungsregion und 5'-Ende des Promotors jeweils nicht mehr als 1000 Baseneinheiten betragen.

8. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix-Anheftungsregion den Promotor insuliert.

9. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix-Anheftungsregion eine Basenlänge zwischen 500 und 5000 Baseneinheiten besitzt.

10. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Gewebe- oder Zell-spezifischen Promotor umfasst.

11. Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Promotor um einen Endothelzell-spezifischen Promotor handelt.

12. Eukaryotische Zelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Eukaryotische Zelle, enthaltend eine episomal vorliegende Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Matrix-Anheftungsregion umfasst.

14. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eukaryotische Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 als Therapeutikum.

15. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eukaryotische Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 als Diagnostikum.

16. Zusammensetzung, enthaltend mindestens einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 sowie gegebenenfalls weitere Hilfs- und Zusatzstoffe.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zusammensetzung um ein Therapeutikum handelt.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zusammensetzung um ein Diagnostikum handelt.

19. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18 zur Behandlung oder Diagnose einer der folgenden Krankheiten: Diabetes, Hämophilie, ADA, Muskeldystrohpie, familiäre Hypercholesterinämie, Rheuma, Arteriosklerose oder deren Folgekrankheiten, Tumorerkrankungen.

20. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Herstellung eines Therapeutikums.

21. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Herstellung eines Diagnostikums.

22. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines eukaryotischen Expressionssystems.

23. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Gewebe- oder Zell-spezifischen Expression eines Transgens.

24. Verfahren zur Gewebe- oder Zell-spezifischen Expression einer episomalen Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 infiziert und/oder transfiziert werden und die episomale Nukleinsäure anschließend exprimiert wird.

25. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 in der Gen- und/oder Zelltherapie.

26. Transgene Säugetiere außer dem Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthalten.

27. Verfahren zur Differenzierung und/oder Selektion von Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der mindestens ein Transgen umfasst, das den Differenzierungsstatus der Stammzellen beeinflusst, durch Transfektion und/oder Infektion in die Stammzellen eingebracht wird und die transfizierten und/oder infizierten Zellen gegebenenfalls von den anderen Zellen getrennt werden.

28. Verfahren zur Differenzierung und/oder Selektion von Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass Stammzellen, die einen erfindungsgemäßen Vektor umfassen, aus transgenen Tieren oder deren Embryonen isoliert werden.