DE10019377A1 - Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien und Verwendung der mit biologisch aktiven Stoffen geträgerten Materialien für chirale Synthesen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass als Trägermaterial verschäumte Polymermaterialien eingesetzt und mit den biologisch aktiven Stoffen in Kontakt gebracht werden. DOLLAR A Gegenstände der Erfindung sind weiterhin die nach diesem Verfahren hergestellten geträgerten immobilisierten biologisch aktiven Stoffe selbst, deren Verwendung für chirale Synthesen sowie diese chiralen Synthesen selbst.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien, die Herstellung eines weitestgehend hydrophoben, unpolaren Trägermaterials hier­ für sowie die Verwendung der nach diesem Verfahren hergestellten geträgerten immobilisierten biologisch aktiven Stoffe für chirale Synthesen.

Enzyme werden aufgrund ihrer Selektivität und hohen katalytischen Aktivität in steigendem Ausmaß in der Lebensmittel-, Pharma- und chemischen Industrie eingesetzt. Technologische Nachteile bei der Verwendung von Enzymen bestehen insbesondere darin, dass diese häufig wegen ihrer Substratlöslichkeit aus dem Reaktionsmedium nicht befriedigend abgetrennt werden können. Neben dem damit einhergehenden Verlust an diesen teuren Biokatalysatoren ent­ stehen zusätzliche Aufwendungen durch entsprechend erforderliche Reinigungsprozesse.

Durch eine geeignete Immobilisierung der wasserlöslichen Enzyme können eine Reihe von vorteilhaften Effekten erreicht werden:

• - Leiche Abtrennbarkeit des Enzyms aus der Reaktionslösung;
• - Wiederverwertbarkeit des geträgerten Enzyms (Senkung der spezifischen Katalysatorkosten);
• - keine Nachbehandlung (Deaktivierung, Reinigung) der Prozess­ lösung erforderlich;
• - kontinuierliche Prozessführung möglich (bessere Prozess­ kontrolle)

In der Vergangenheit sind zahlreiche Versuche unternommen worden, um möglichst dauerhaft biologisch aktive Stoffe, insbesondere Enzyme, bei Beibehalt ihres Eigenschaftsspektrums an festen Trägermaterialien zu immobilisieren.

In EP-A-0035883 wird ein Umesterungsverfahren beschrieben. Dabei wird empfohlen, das Enzym an einem Träger zu immobilisieren. Als Trägermaterial werden dabei u. a. genannt: Diatomenerde, Kaolinit, Perlit, Silikagel, Cellulosepulver, Polyvinylalkohol und Calcium­ carbonat. Das Enzym wird als wässrige Lösung lediglich mit diesem Material verrührt. In WO-A-9936964 wird ein Enzym an Trägern, wie z. B. Siliciumdioxid, Aluminiumoxid u. a., immobilisiert, wobei diese Träger mit organischen Stoffen an der Oberfläche belegt sind, um einen hydrophoben Oberflächencharakter einzustellen. In EP-A-0140542 wird ein Anionenaustauscher als Trägermedium ein­ gesetzt. In WO-A-9426883 wird ein Enzym an porösen Materialien, wie z. B. Soda und Siliciumdioxid, adsorbiert, wobei diese Materialien mit einer Schutzschicht umhüllt sind. In DE-A-27 37 745 und US-A-0718549 wird ein Verfahren zur Erzeugung derartiger mikroporöser, nichtzellförmiger Körper beschrieben, wobei das Basismaterial ein thermoplastisches Polymer darstellt. Grund­ lage dieses Verfahrens ist die Tatsache, dass man zunächst eine homogene Lösung dieses Polymers in einem geeigneten Lösungs­ mittel herstellt. Diese Lösung wird dann so rasch abgekühlt, dass thermodynamische Nichtgleichgewichtsbedingungen eingestellt werden, wodurch eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung resultiert. Zur Bildung der mikroporösen Struktur ist dann noch zumindest ein Teil der Flüssigkeit zu entfernen. Es werden Porengrößen von 0,5 bis 100 µm erzeugt. In analoger Weise verfährt US-A-4247498. Nach beiden Schriften wird das gebildete Mikroporenvolumen teilweise noch durch funktionelle Flüssigkeiten ausgefüllt. In US-A-4250080 wird ein fester mikroporöser Träger beansprucht (z. B. Aluminium­ oxid), der mit einem prepolymerisierten Polystyrol belegt wird. Nachfolgend werden noch Aminogruppen erzeugt.

In EP-A-0044052 und EP-A-0044051 wird ein technisch anspruchs­ voller Prozess beschrieben. Dabei handelt es sich um die Herstellung eines mikroporösen Polypropylens. Ausdrücklich beschrieben wird die Tatsache, dass es nur unter extremen Schwierigkeiten möglich ist, poröse Polymermaterialien, wie z. B. Polypropylen, zu mahlen und in eine Pulverfraktion zu überführen. Es wird deshalb ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem Polypropylen in einem heißen Pentaerythritester aufgelöst und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wird. Die erstarrte Masse wird dann zerkleinert und der Ester herausgelöst. Das so hergestellte Material wird durch die Firma Akzo unter der Bezeichnung ACCUREL® vertrieben.

Nach US-A-3607793 wird ein poröses Polypropylenträgermaterial dadurch erzeugt, dass man eine Dispersion des Polypropylens in einem heißen Kohlenwasserstoff erzeugt. Aus dem beim Herunter­ kühlen entstehenden Gel wird dann das Lösungsmittel extrahiert. Es werden Partikel mit Durchmessern < 0,5 µm beansprucht.

Gemäß US-A-4539294 (EP-A-0105736) werden Proteine auf Polymer­ trägern, u. a. auch Polypropylen, immobilisiert. Dazu wird das Polymere zuvor mit einem langkettigen kationischen Tensid benetzt. In EP-A-0104542 wird ein schwacher Anionenaustauscher beansprucht, auf den eine Lipase aufgebracht wird. Zur Verbesserung der Immobilisierung dient noch eine Nachbehandlung mit Glutaraldehyd. Als Austauscherbasismaterial werden u. a. Produkte, wie Phenolformaldehydharze und Polystyrolharze, genannt. In DE-A-32 05 289 werden poröse Körper mit einstellbarer Porenwand beschrieben. Hierbei handelt es sich wiederum um thermoplastische Polymere, die über ein System aus Lösern und Nichtlösern und eine Steuerung der Phasentrennprozesse kontrolliert hergestellt werden. In DE-A-33 11 889 wird versucht, die Haftung biologisch aktiver Stoffe an unpolaren Polystyroloberflächen durch eine Oberflächenvorbehandlung mit Diazoniumverbindungen zu verbessern.

Bei der in US-A-4629742 (EP-A-0232933) beschriebenen Hydrolyse von Fetten wird u. a. Lipase, immobilisiert auf ACCUREL®, beschrieben. Die Lipase wird hier aus wässriger Lösung auf das Polymer aufgebracht, wobei gegebenenfalls noch eine Vorbehandlung mit einem polaren organischen Lösungsmittel vorgenommen wird. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn das poröse Polymere vor der Immobilisierung mit einer Metallsalzlösung vorbehandelt wird. In EP-A-322213 wird die Herstellung von Fettsäureestern beschrieben, wobei das Enzym auf einem Träger immobilisiert wird. Neben Ionenaustauschern als Träger wird Lipase, immobilisiert auf Polystyrol oder ACCUREL® beschrieben. Nach WO-A-9015868 wird Lipase auf einen porösen Träger aus wässriger Lösung direkt auf­ gebracht, wobei noch eine spezielle Vorbehandlung des Trägers (u. a. ACCUREL®) beschrieben wird. Dazu wird das Trägermaterial zuvor mit einem polaren, wassermischbaren Lösungsmittel - zumeist einem Alkohol - vorbehandelt. In WO-A-9103565 wird die Hydrolyse von Phospholipiden mittels immobilisierter Lipase beschrieben. Als bevorzugte Träger dienen dabei Acrylharze, Polystyrol, Phenolformaldehydharze und ACCUREL®. Gemäß WO-A-9428118 wird ein Enzym (Lipase) an einem hydrophoben Trägermaterial immobilisiert, wobei dieses zuvor mit einem nichtionischen Tensid vorbehandelt wird. Als Trägermaterial werden u. a. Polystyrol, Polyethylen und Polypropylen genannt. WO-A-9533047 beschreibt ein Verfahren zur Wiederaufarbeitung von an hydrophoben Trägern immobilisierten Enzymen, wie z. B. Lipase. Dabei wird erneut die Alkoholvor­ behandlung von ACCUREL® unterstrichen. Nach WO-A-9815572 wird eine Adsorption kleiner Peptide an Polystyrol durchgeführt. Da eine einfache Adsorption dieser Peptide an festen Trägern zu unbefriedigenden Ergebnissen führt, wird deshalb eine Bindungs­ knüpfung über eine Acylgruppe vorgeschlagen.

Neben diesen adsorptiven Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen sind noch Verfahren bekannt, bei denen eine kovalente Bindung geknüpft wird. Bei der kovalenten Bindung über reaktive Gruppen kann es neben der erwünschten Fixierung der Enzyme zu einer Beeinflussung der katalytischen Aktivität kommen.

In DE-A-41 31 546 wird Lipase an einem kommerziell erhältlichen Träger (Eupergit C - Röhm Pharma Deutschland) über vorhandene Epoxidgruppen kovalent verknüpft. Mit Hilfe des so immobili­ sierten Enzyms sollen chirale Alkohole erzeugt werden. In US-A-4342834 wird ein Enzym bei Beibehaltung oder Steigerung seiner katalytischen Aktivität an ein Polyurethan gebunden. Dabei wird vorzugsweise das Enzym aus wässriger Lösung mit dem Poly­ urethan in Kontakt gebracht, bevor das Polyurethan verschäumt wird. Beim Verschäumen wird dann darauf geachtet, dass durch die Reaktionswärme keine Denaturierung des Enzyms eintritt.

In WO-A-9746590 und WO-A-9746267 werden verschiedene Methoden zur Immobilisierung von bioaktiven Materialien genannt. Auf einem Träger wird zunächst eine Schicht eines polymeren oberflächen­ aktiven Materials aufgebracht. Dieses aufgebrachte Material wird mit Hilfe eines Vernetzers in-situ vernetzt. Als Vernetzer werden u. a. Vinylverbindungen, Imidazole, Epoxide, Isocyanate, Anhydride usw. genannt. Auf diese Schicht wird letztlich eine zweite Schicht eines hydrophilen Polymers aufgebracht und so mit der Basisschicht verbunden. Das bioaktive Molekül wird über die zweite Schicht angeknüpft.

In EP-A-0571748 wird die Tatsache diskutiert, dass Matrices aus PUR-Hydrogelen zwar gute mechanische Eigenschaften aufweisen, die vorhandenen freien Isocyanatgruppen jedoch eine hohe Toxizität gegenüber biologischen Materialien besitzen. Dadurch ist eine beträchtliche Eigenschaftsschädigung zu erwarten. Deshalb wird vorgeschlagen, zunächst eine Verkappung der Isocyanatgruppen durch ein Bisulfitaddukt zu erzeugen. Zu der wässrigen Lösung dieses Bisulfitadduktes wird die Zellmasse gegeben. Dieses Gemisch wird in eine Na-Alginatlösung eingetropft. Die sich aus­ bildende Alginathülle wirkt stabilisierend und kann nachfolgend in einem Phosphatpuffer abgelöst werden.

Die dem Stand der Technik entsprechenden Vorschläge gestatten durchaus in Einzelfällen eine Immobilisierung biologisch aktiver Spezies, die jedoch häufig mit einem Abfall der katalytischen Aktivität verbunden ist. Zur Herstellung dieser erforderlichen Träger mit hydrophober Oberfläche werden dabei technisch auf­ wendige Verfahren genutzt. Es besteht demzufolge ein hinreichen­ des Verbesserungspotential. Insbesondere ist es erforderlich, Lösungen zu entwickeln, die es gestatten, sowohl in wasserfreien Medien als auch insbesondere aus wässrigen Lösungen und/oder Suspensionen biologisch aktive Spezies insbesondere an unpolaren Matrices dauerhaft unter Beibehalt der katalytischen Aktivität zu binden. Dabei muss gewährleistet sein, dass die biologisch aktiven Spezies hinreichend fest an der Oberfläche fixiert sind und dass dabei ihre katalytische Aktivität nicht beeinträchtigt wird.

Aufgabe der Erfindung war es demzufolge, ein Verfahren zu ent­ wickeln, das eine dauerhafte Fixierung von biologisch aktiven Stoffen, insbesondere Enzymen, an unpolaren Matrices, ins­ besondere an Schäumen, ermöglicht, wobei eine ausreichende mechanische Festigkeit des Trägermaterials gewährleistet sein sollte. Der so hergestellte Biokatalysator-Träger-Verbund sollte bei hoher Selektivität bei chiralen Synthesen, insbesondere bei Umesterungsverfahren, eingesetzt werden können.

Diese Aufgabe konnte überraschenderweise dadurch gelöst werden, dass unpolare Matrices mit möglichst großer Oberfläche, ins­ besondere Polymerschäume, die keine oder nur sehr geringe Anteile an reaktiven Gruppierungen aufweisen, vorzugsweise zerkleinert, als Trägermaterialien verwendet werden und diese mit wässrigen Lösungen und/oder Suspensionen oder mit Enzymsysuspensionen in geeigneten Lösungsmitteln in Kontakt gebracht werden. Dieses so entstehende inhomogene Gemisch wird bei Einhaltung einer Temperatur, bei der das Enzym nicht zerstört wird, schonend abgedampft und ist danach im Syntheseprozess einsetzbar.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Träger­ materialien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass als Träger­ material verschäumte Polymermaterialien eingesetzt und mit den biologisch aktiven Stoffen in Kontakt gebracht werden.

Gegenstände der Erfindung sind weiterhin die nach diesem Verfahren hergestellten geträgerten immobilisierten biologisch aktiven Stoffe selbst, deren Verwendung für chirale Synthesen sowie diese chiralen Synthesen selbst.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass es durchaus mög­ lich ist, verschäumte Polymere, wie Polypropylen oder Polystyrol, mit vergleichsweise geringem Aufwand zu zerkleinern. Wir fanden bei unseren Untersuchungen weiterhin überraschenderweise, dass bei Einsatz von weitestgehend hydrophoben, unpolaren Träger­ materialien, vorzugsweise in zerkleinertem Zustand, biologisch aktive Materialien dauerhaft auf der Schaumstoffoberfläche ver­ ankert und damit immobilisiert werden können, ohne dass diese ihre Aktivität verlieren. Das erfindungsgemäße Ergebnis wurde dabei erreicht, ohne dass weitere spezielle Maßnahmen notwendig waren, um eine zusätzliche Oberflächenvergrößerung der Polymer­ partikel zu erzeugen. Es stand lediglich die durch die Her­ stellungsprozess vorhandene Oberfläche, zugänglich gemacht vor­ zugsweise durch den Zerkleinerungsprozess, zur Verfügung. Es war überraschend, dass bereits damit eine gute adsorptive Fixierung erreicht werden konnte.

Die spezielle Zerkleinerungstechnologie besteht darin, dass während und/oder vor der Zerkleinerung, beispielsweise durch Mahlen oder Raspeln, die Schaumstoffpartikel gekühlt werden. Vorzugsweise erfolgt dies in Anwesenheit von Trockeneis.

Weiterhin kann man mit geringem technischen Aufwand aus ver­ schäumten Polymerteilchen, insbesondere verschäumten Polystyrol­ typen, ein poröses Pulver dadurch herstellen, dass man Formkörper aus diesem Material oder expandierte Schaumstoffkugeln herstellt und diese mittels einer Raspelvorrichtung verreibt. Hierbei kann dann eine Kühlung in der Regel entfallen. Die Teilchengröße der hierdurch erhaltenen Polymerpartikelchen beträgt vorteilhafter­ weise 0,5 bis 5 mm, vorzugsweise 0,5 bis 3,0 mm.

Gegebenenfalls, aber nicht unbedingt erforderlich, kann ein nach­ folgender Siebvorgang zur Klassierung des Schaumstoffpulvers her­ angezogen werden. Bei dieser Zerkleinerungstechnologie erhält man poröse Polymerteilchen mit teilweise angerauhter Oberfläche, wobei die Schaumhäute, die selbst eine große Oberfläche dar­ stellen, zumindest teilweise erhalten bleiben (siehe Abb. 1).

Das so erhaltene Polymerpulver eignet sich insbesondere zur Immobilisierung von biologisch aktiven Materialien, die direkt aus wässrigen Lösungen, wobei durchaus Anteile an Lösungsmittel enthalten sein können, aufgetragen werden.

Eine Zerkleinerung von Neopolen®-Schaumstoffperlen mit einer analogen Technologie gelingt selbst bei einer entsprechenden Kühlung nur mit großen Schwierigkeiten. Hier bietet sich jedoch ein modifizierter Mahlprozess an. Zunächst werden die Neopolen®- Schaumstoffperlen mit Trockeneis vorgekühlt und in einem gegebenenfalls mehrstufigen, vorzugsweise zweistufigen, Mahl­ prozess mittels einer Mühle, vorzugsweise einer Schneidmühle, zerkleinert. Von besonderem Vorteil ist es, wenn man während des Mahlprozesses etwas zerkleinertes Trockeneis hinzusetzt. Das so erhaltenen poröse Schaumstoffpulver auf Basis von Neopolen® kann gegebenenfalls durch Sieben klassiert werden, ist jedoch auch direkt für die Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen geeignet. Nach diesem Verfahren wird ein poröses Polypropylenpulver erhalten. Der Korngrößenbereich ist dabei von der gewählten Mahltechnologie abhängig.

Es gelingt jedoch ohne weitere Kühlung, einen Formkörper, bestehend aus geschäumten Polypropylen, über eine Raspel­ vorrichtung zu zerkleinern. Solche Formkörper können durch Befüllen einer Form mit beispielsweise Neopolen®-Schaumstoff­ perlen und Verschweißen derselben unter Einwirkung von Dampf hergestellt werden.

Gut geeignet als Träger für biologisch aktive Stoffe sind grob­ körnige Partikel. Diese Materialien können beispielsweise in ein Reaktorrohr eingebracht werden. Durch eine entsprechende Variation der Teilchengröße kann der erforderliche Pumpendruck bei Anwendung dieser Materialien optimiert werden.

Die erfindungsgemäßen Schaumstoffe sollen eine möglichst große Oberfläche für den Kontakt zwischen der Schaumstoffoberfläche und den biologisch aktiven Materialien, die aus dem flüssigen Medium auf die Schaumstoffoberfläche zu fixieren sind, besitzen.

Darüberhinaus kann es vorteilhaft sein, die Schaumstoffe hydrophil einzustellen, damit eine optimale Benetzung des Schaumstoffs mit dem Reaktionsmedium gewährleistet wird. Die Hydrophilie der Schaumstoffe kann beispielsweise durch die Verwendung oberflächenaktiver Stoffe, die während des Schäum­ prozesses eingebracht oder nachträglich dem Schaum einverleibt werden, erhöht werden. Gegebenenfalls können Lösungsmittel mit­ verwendet werden, um die Partikelbenetzbarkeit zu verbessern.

In der Regel sind die erfindungsgemäßen Schaumstoffe hydrophob. Die Schaumstoffe haben eine gute Gerüststabilität.

Die Herstellung des erfindungsgemäß eingesetzten Polymer­ materials kann auf übliche Art und Weise erfolgen. Die Verfahrensbedingungen und die notwendigen Einsatzprodukte sowie Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sind in der Fachliteratur umfangreich beschrieben (vergleiche z. B. A. Echte, Handbuch der Technischen Polymerchemie, Verlag Chemie, 1993).

Als Treibmittel zur Herstellung der Schaumstoffe werden bevorzugt Wasser und/oder Kohlenwasserstoffe verwendet. Auch physikalisch wirkende Treibmittel, beispielsweise Kohlenwasserstoffe, wie n-, iso- oder Cyclopentan, oder halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Tetrafluorethan, Pentafluorpropan, Heptafluorpropan, Pentafluor­ butan, Hexafluorbutan oder Dichlormonofluorethan, können ein­ gesetzt werden. Über die eingesetzte Menge des physikalischen Treibmittels kann die Rohdichte des Schaumstoffes und gegebenen­ falls die Porosität beeinflußt werden.

Als Hilfsmittel und/oder Zusatzstoffe werden beispielsweise oberflächenaktive Substanzen, Schaumstabilisatoren, Zellregler, äußere und innere Trennmittel, Füllstoffe, Pigmente, Hydrolyse­ schutzmittel sowie fungistatisch und bakteristatisch wirkende Substanzen eingesetzt.

Die Schaumstoffe können in offenen oder geschlossenen metallischen Formwerkzeugen oder durch das kontinuierliche Auftragen des Reaktionsgemisches auf Bandstraßen zur Erzeugung von Schaumblöcken hergestellt werden oder stehen nach dem Schäumprozess als expandierte Polymerpartikel zur Verfügung.

Die erfindungsgemäße Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf den beschriebenen Trägermaterialien erfolgt durch Inkontaktbringen der Trägermaterialien mit den biologisch aktiven Verbindungen.

Unter biologisch aktiven Verbindungen werden Produkte verstanden, die aus der Proteingruppe der Antikörper, Antigene, Protein- Konjugate, Lectine und vorzugsweise der Enzyme herrühren. Ein­ gesetzt werden insbesondere Zellkulturen, Zellsuspensionen, Mikroorganismen und insbesondere Enzyme. Diese Materialien ver­ mögen biologische Prozesse zu aktivieren. Sie können für den Anwendungsfall der Erfindung sowohl als festes Material oder vorzugsweise als Lösung oder gegebenenfalls als Suspension in einem wässrigen und/oder organischem Medium vorliegen.

Als besonders vorteilhaft haben sich als biologisch aktive Stoffe neben Zellsuspensionen auch eine überstehende Fermenterlösung aus der Fermentation von Zellverbänden sowie Enzyme in reiner Form erwiesen. Im Besonderen hat sich Lipase für eine Umesterung als Enzym bewährt. Häufig wird dabei eine Lipase angewandt, die durch Fermentation von Pseudomonas Plantarii gewonnen wird. Nach einer entsprechenden Gefriertrocknung steht diese Lipase als festes Pulver zur Verfügung, wobei dieser Aufbereitungsschritt kosten­ intensiv ist. Von besonderem Interesse ist es daher, eine Fermenterlösung, die nach dem Abzentrifugieren des Zellmaterials verbleibt und die das zu fixierende Enzym in einer wässrigen Suspension enthält, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Träger­ materials aufzuarbeiten.

Das Inkontaktbringen von Trägermaterial und biologisch aktivem Stoff sowie das gegebenenfalls nachfolgende Abdampfen des Wassers oder Lösungsmittels muss unter Bedingungen erfolgen, bei denen das biologisch aktive Material nicht geschädigt wird. Dies ist bei Temperaturen unter 45°C gewährleistet. Des weiteren sollte während der Immobilisierung ein pH-Bereich von 4 bis 7 ein­ gehalten werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorteil­ haft, die biologisch aktiven Stoffe in Lösung oder Suspension mit den porösen Polymerpartikelchen in direkten Kontakt zu bringen. Beispielsweise können eine Fermenterlösung oder eine Zellsuspen­ sion, die Lipase enthält, direkt mit einer entsprechenden Menge des porösen Polymeren verrührt werden. Nach einer Kontaktzeit, die vom jeweiligen biologisch aktiven Stoff abhängig ist, kann unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eine Abtrennung des überschüssigen Wassers und gegebenenfalls von Lösungsmittel­ anteilen erfolgen. Dieser Prozess ist mit dem Erreichen eines rieselfähigen Polymermaterials abgeschlossen. In diesem Fall wird Lipase über adsorptive Bindungen an der Oberfläche fixiert und kann dann für die Erzeugung chiraler Reagenzien eingesetzt werden.

Es ist weiterhin möglich und üblich, die erfindungsgemäßen porösen Schaumstoffpartikelchen in eine Reaktionssäule ein­ zufüllen. Zum Beladen kann dann die Fermenterlösung über diese Säule gegeben werden. Ein nachfolgender Trocknungsschritt ist möglich.

Vorteilhafterweise ist eine Enzymbeladung von 1 bis 20%, vor­ zugsweise 1 bis 10%, einzustellen. Die Steuerung erfolgt bei bekannter Enzymaktivität über eine entsprechende Einwaage. Es ist weiterhin möglich, die erreichte Enzymbeladung zu messen. Dazu wird die Aktivität in einer geeigneten Testreaktion ermittelt (siehe auch Testreaktion Beispiel 1).

Die nach den beschriebenen Verfahren hergestellten geträgerten immobilisierten biologisch aktiven Stoffe sind für den Einsatz bei chiralen Synthesen geeignet. Ganz besonders sind Enzyme zu chiralen Synthesen befähigt. Eine häufige angewandte Synthese ist dabei die Umesterung geeigneter Rohstoffe bei möglichst selektiver Ausbeute an den gewünschten chiralen Estern.

Die chiralen Synthesen werden vorzugsweise in einem Temperatur­ bereich von 5 bis 80°C durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung soll anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert werden.

Testreaktion

Als Testreaktion zur Überprüfung der Wirksamkeit der Lipase diente die enzymkatalysierte Veresterung von 1-Phenylethanol mit Vinylpropionat.

Dabei wird wie folgt verfahren:

Die immobilisierte Lipase wird mit einer Substratlösung (siehe nachstehende Modellreaktion) versetzt und bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Umsatz wird mittels Gaschromatographie verfolgt. Der Maximalumsatz beträgt 50%. Nach 24 Stunden wird filtriert, die zurückgewonnene Lipase mit neuem Substrat versetzt und erneut geschüttelt.

Als Enzym diente eine Lipase, die aus Pseudomonas Plantarii gewonnen wurde.

Beispiel 1 Vergleich

Polypropylengranulat (nicht expandiert) wurde mittels eines Mahl­ werkes unter Kühlung zerkleinert. Analoge Bemühungen erfolgten mittels einer Raspel. Nach beiden Technologien ließ sich das Material nur unter extremen Schwierigkeiten zerkleinern. Es kam zu einem Verkleben der bewegten Teile.

Beispiel 2

Verschäumte Polypropylenperlen (Neopolen®) wurden zunächst mit Trockeneis für 30 Minuten gekühlt. Anschließend wurden diese so gekühlten Schaumperlen mittels einer Hochleistungsschneidmühle zerkleinert. Dabei wurde dem Neopolen® während des Zerkleinerns noch etwas Trockeneis zugesetzt.

Die so erhaltenen Partikel hatten eine Korngröße von < 3 mm.

Beispiel 3

Neopolen®-Formkörper (Hergestellt durch Befüllen einer Form mit Neopolen®-Schaumstoffperlen und Verschweißen derselben unter Ein­ wirkung von Dampf) wurden so zurechtgeschnitten, dass die Form­ körper in die Einzugsöffnung einer Haushaltsraspel (Quelle AG) hineinpassten. Durch Verwendung eines geeigneten Raspeleinsatzes ließen sich ohne Kühlung problemlos Schaumpartikel herstellen.

Beispiel 4

Mit der unter Beispiel 3 angewandten Raspeltechnologie wurden in analoger Weise verschäumte Polystyroltypen zerkleinert. Eine Kühlung des Material war bei dieser Zerkleinerungstechnologie nicht erforderlich.

Sowohl bei Styrodur® als auch Styropor® wurde eine pulverförmige Fraktion erhalten. Die Korngröße betrug 0,8 bis 3 mm.

Beispiel 5 Vergleich

10 g Polypropylengranulat (unzerkleinert) wurden in einen Reaktionskolben gegeben und mit einer Fermenterlösung (Enzym­ aktivität 25000 U/ml) aus Pseudomonas plantarii (Enzymaktivität 10000 U/ml) in Kontakt gebracht. Diese Mischung wurde für 15 Minuten langsam gerührt. Danach wurde das überschüssige Wasser im Rotationsverdampfer bei Temperaturen < 45°C vorsichtig im Vakuum abgedampft.

Der so hergestellte Enzym-Träger-Verbund wurde hinsichtlich seiner Aktivität bei der chiralen Umesterung (siehe Testreaktion) eingesetzt.

Nach 2 Durchläufen kam es zu einem signifikanten Aktivitäts­ abfall.

Beispiel 6

Analog zu Beispiel 5 wurden 10 g der im Beispiel 2 erhaltenen porösen Schaumstoffpartikel mit einer wässrigen Fermenterlösung (Enzymaktivität 25000 U/ml) behandelt und in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 angegeben, aufgearbeitet.

Der so hergestellte Enzym-Träger-Verbund wurde hinsichtlich seiner Aktivität bei der chiralen Umesterung (siehe Testreaktion) eingesetzt.

Nach 15 Durchläufen kam es zu einem signifikanten Aktivitäts­ abfall.

Beispiel 7

10 g der gemäß Beispiel 3 hergestellten porösen Schaumstoff­ partikelchen wurden mit einer wäßrigen Fermenterlösung (Enzym­ aktivität 50000 U/ml) aus Pseudomonas plantarii (Enzymaktivität 10000 U/ml) in Kontakt gebracht. Diese Mischung wurde für 15 Minuten langsam gerührt. Danach wurde das überschüssige Wasser im Rotationsverdampfer bei Temperaturen < 45°C vorsichtig im Vakuum abgedampft bis ein rieselfähiges Pulver entstand.

Der so hergestellte Enzym-Träger-Verbund wurde hinsichtlich seiner Aktivität bei der chiralen Umesterung (siehe Testreaktion) eingesetzt.

Nach 18 Durchläufen kam es zu einem signifikanten Aktivitäts­ abfall.

Beispiel 8

10 g eines porösen Polypropylenpulvers gemäß Beispiel 2 wurden vor dem Immobilisierungsprozess mittels Sieben klassiert. Zur Immobilisierung analog Beispiel 5 wurden Schaumstoffpartikelchen der Größe 0,5 bis 1,8 mm verwendet. Der Fermenterlösung sind anteilig 10% Methyltertiärbutylether zugesetzt worden.

Der so hergestellte Enzym-Träger-Verbund wurde hinsichtlich seiner Aktivität bei der chiralen Umesterung (siehe Testreaktion) eingesetzt.

Nach 16 Durchläufen kam es zu einem signifikanten Aktivitäts­ abfall.

Claims (19)

1. Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägermaterial verschäumte Polymermaterialien eingesetzt und mit den biologisch aktiven Stoffen in Kontakt gebracht werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verschäumten Polymermaterialien mechanisch zerkleinert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägermaterial ein weitestgehend hydrophobes, unpolares Polymeres verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, dass als Polymermaterialien Polypropylen, Poly­ ethylen und Polystyrol, die unter Verwendung von Treibmitteln verschäumt wurden, verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die so erhaltenen Schaumstoffpartikel durch Mahlen oder Raspeln zerkleinert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, dass während und/oder vor der Zerkleinerung die Schaumstoffpartikel gekühlt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, dass der Mahl- oder Zerkleinerungsprozess in Anwesenheit von Trockeneis durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, dass aus verschäumten Polymerteilchen hergestellte kompakte Formstoffe durch einen Zerkleinerungsprozess in eine Teilchenform überführt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Teilchengröße der Polymerpartikelchen 0,5 bis 5 mm beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Immobilisierung der biologisch aktiven Stoffe in wässriger Lösung oder in Anwesenheit von Lösungs­ mittelbestandteilen durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, dass während der Immobilisierung ein pH-Bereich von 4 bis 7 eingehalten wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn­ zeichnet, dass das Inkontaktbringen von Trägermaterial und biologisch aktivem Stoff sowie das gegebenenfalls nach­ folgende Abdampfen des Wassers oder Lösungsmittels bei Temperaturen unter 45°C erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekenn­ zeichnet, dass der Prozess der Immobilisierung der biologisch aktiven Stoffe direkt im Reaktionsgefäß stattfindet, wobei gegebenenfalls ein Trocknungsschritt nachgeschaltet werden kann.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die biologisch aktiven Stoffe aus der Protein­ gruppe der Antikörper, Antigene, Protein-Konjugate, Lectine und vorzugsweise der Enzyme herrühren.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn­ zeichnet, dass als Enzym Lipase verwendet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, dass eine Enzymbeladung von 1 bis 20%, vorzugs­ weise 1 bis 10% eingestellt wird.

17. Mit biologisch aktiven Stoffen geträgerte Polymermaterialien, herstellbar nach einem der Ansprüche 1 bis 16.

18. Verwendung der mit biologisch aktiven Stoffen geträgerten Polymermaterialien gemäß Anspruch 17 für chirale Synthesen.

19. Chirale Synthesen, dadurch gekennzeichnet, dass geträgerte immobilisierte biologisch aktive Stoffe, herstellbar nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, ein­ gesetzt werden und die Synthesen in einem Temperaturbereich von 5 bis 80°C ablaufen.