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WO2018036982A1 - Chemisch-biokatalytisches verfahren zur herstellung von ursodesoxycholsäure - Google Patents

Chemisch-biokatalytisches verfahren zur herstellung von ursodesoxycholsäure Download PDF

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Publication number
WO2018036982A1
WO2018036982A1 PCT/EP2017/071070 EP2017071070W WO2018036982A1 WO 2018036982 A1 WO2018036982 A1 WO 2018036982A1 EP 2017071070 W EP2017071070 W EP 2017071070W WO 2018036982 A1 WO2018036982 A1 WO 2018036982A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nadh
hsdh
enzyme
nadph
cofactor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2017/071070
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Daniel Bakonyi
Werner Hummel
Ralf Gross
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmazell GmbH
Original Assignee
Pharmazell GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmazell GmbH filed Critical Pharmazell GmbH
Publication of WO2018036982A1 publication Critical patent/WO2018036982A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/0105—3Alpha-hydroxysteroid 3-dehydrogenase (B-specific) (1.1.1.50)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01159—7-Alpha-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.159)

Definitions

  • the invention relates to an improved chemical-biocatalytic process for the production of ursodeoxycholic acid starting from chenodeoxycholic acid
  • Bile acids are biomolecules required for the digestion and absorption of fats, fatty acids and hydrophobic vitamins.
  • a bile acid that is found in low levels in humans is ursodeoxycholic acid (referred to as UDCA or UDCS). She has now gained great therapeutic importance in the dissolution of cholesterol-containing gallstones.
  • ursodeoxycholic acid ursodeoxycholic acid
  • CDCS diastereomer chenodeoxycholic acid
  • UDCA For the production of UDCA, the prior art describes various processes which are carried out purely chemically or consist of a combination of chemical and enzymatic process steps.
  • the starting point is cholic acid (CS or CA) or cholic acid-derived CDCA.
  • 12-ketodesodeoxycholic acid (12-keto-UDCA), which can be converted into UDCA by Wolff-Kishner reduction.
  • a literature-described route for the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid starts from cholic acid (3a, 7a, 12a-trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid) catalyzed by two oxidative steps catalyzed by 7a and 12a HSDHs and a reductive step a 7ß-HSDH, can be prepared (Bovara R et al. (1996) A new enzymatic route to the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid. Biotechnol. Lett.
  • DHCA dehydrocholic acid
  • HSDHs 3 ⁇ and 7 ⁇ -HSDHs
  • the 12a-HSDH oxidizes CS selectively to 12-keto-CDCS.
  • the two contactor steps required by the classical chemical method are eliminated.
  • the CS is first extracted from 7a-HSDH from Bacteroides fragilis ATCC 25285 (Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7-hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis, Tetrahedron, 2006. 62 (18): p 4535-4539) and 12a-HSDH to 7,12-diketo-LCS. These two enzymes each depend on NADH.
  • Applicant's International Patent Application WO201 1/064404 describes a novel 7 ⁇ -HSDH from Collinsella aerofaciens ATCC 25986 which has, inter alia, a molecular weight (on SDS gel electrophoresis) of about 28-32 kDa, a molecular weight (on gel filtration, under non-denaturing Conditions, especially without SDS): from about 53 to 60 kDa and capable of stereoselective reduction of the 7-carbonyl group of 7-keto LCS to a 7 ⁇ -hydroxy group.
  • WO201 1/064404 a method for producing UDCS is provided in WO201 1/064404, which is schematically represented as follows:
  • the oxidation of CS takes place in a classical chemical way in a simple way. se.
  • the DHCS is reduced by enzyme pair 7ß-HSDH and 3a-HSDH one by one or in a pot to 12-keto-UDCS. Combined with the Wolff-Kishner reduction, UDCS can thus be synthesized from CS in just three steps. While the 7ß-HSDH is dependent on the cofactor NADPH, the 3a-HSDH requires the cofactor NADH.
  • the availability of enzyme pairs with dependency on the same cofactor or extended dependency eg, of the cofactors NADH and NADPH) would be advantageous because it could simplify cofactor regeneration.
  • WO 2012/080504 describes novel mutants of 7 .beta.-HSDH from C. aerofaciens in the sequence region of amino acid residues 36 to 42 of the C. aerofaciens sequence (SEQ ID NO: 1 1), as well as biocatalytic processes for the production of UDCS, and in particular also novel ones Whole cell method wherein 7ß-HSDH and 3a-HSDH act together on the substrate.
  • SEQ ID NO: 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 novel mutants of C. aerofaciens 7ß-HSDH are disclosed in WO2015 / 197698 and WO2016 / 016213 by the present applicant
  • WO 2016/023933 describes novel mutants of the 3a-HSDH from C. testosteronii, in particular in the mutation positions R34, L68 P185, T188 of SEQ ID NO: 8 as well as C- and N-terminal His-tag mutants
  • WO 201 1/147957 describes novel knock-out strains which are particularly suitable for the production of UDCA, since the undesired 7a-HSDH enzyme activity could be deliberately switched off.
  • the object of the invention is to provide a novel process for the production of UDCA in high yield.
  • FIG. 1 shows the SDS gel of hydroxysteroid dehydrogenases after expression in shake flask fermentation in LB medium, differentiated into the soluble fraction (1 and 4) and into purified fraction (2 and 3).
  • the soluble fraction is the cell-free crude extra kt. In each case 10 ⁇ g of protein were applied.
  • the size of the 3a-HSDH is about 26 kDa, that of the 7ß-HSDH about 29 kDa.
  • FIG. 2 shows the Michaelis-Menten kinetics of 3a-HSDH for the substrate 3,7-diketo
  • UDCA ( Figure A), for the cofactor NADH ( Figure B). and for the intermediate 3-keto-UDCA ( Figure C).
  • concentration range for 3,7-diketo-UDCA or 3-keto-UDCA is between 10 ⁇ and 10 mM.
  • concentration range was 10 to 300 ⁇ .
  • the enzyme was purified and used via an N-terminal hexahistidine residue.
  • Figure 3 shows the Michaelis-Menten kinetics of 7 ⁇ -HSDH for the substrate 3,7-diketo-UDCA (panel A), for the cofactor NADPH (panel B, with 3,7-diketo-UDCA as co-substrate); Picture D with 7-KLCA). and for the intermediate compound 7-KLCA ( Figure C).
  • the concentration range for 3,7-diketo-UDCA is between 10 ⁇ and 15 mM or 7-KLCA is between 10 ⁇ and 10 mM.
  • the concentration range was 10 to 300 ⁇ .
  • the enzyme was purified via a C-terminal hexahistidine residue and used.
  • Figure 4 shows the conversion of 3,7-diketo-UDCA to UDCA after 16 hours at different pH values.
  • Figure 5 shows the reaction with 40 mM 3,7-diketo-UDCA and the whole cell biocatalyst £. coli DB03.
  • Figure 6 shows the reaction with 40 mM 3,7-diketo-UDCA and the whole cell biocatalyst £. coli DB02.
  • FIG. 7 shows a complete reaction scheme of a preferred variant of the inventive chemical / enzymatic process for the production of UDCA from CDCA, wherein the cofactor regeneration takes place by means of a GDH containing both NAD + and NADP + in the enzymatic oxidation of glucose to glucono -1, 5-lactone with regeneration of spent NADH or NADPH used.
  • R is alkyl, H, an alkali metal ion or N (R 3 ) 4 + , in which the radicals R 3 are identical or different and are H or alkyl, or where the group -C0 2 R by an acid amide group of the formula -ONR 1 R 2 is replaced, in which R 1 and R 2 independently of one another are an alkyl radical, and R is in particular H,
  • R or the group -C0 2 R have the meanings given above, chemically oxidized; and optionally purifying the formed 3,7-deco-UDCA, b) the 3,7-diketo-UDCA of formula (3) formed in step a) in the presence of at least one 7 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (7 ⁇ -HSDH) and in the presence of at least one 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3a-HSDH) to form the UDCA compound of above formula (1) enzymatically reduced, and optionally the reaction product further purified.
  • step a) subjected to a chemical oxidation tion, wherein the oxidizing agent used for the oxidation of a secondary hydroxyl group is capable. 3.
  • the oxidation step is selected under a SWERN oxidation and a TEMPO oxidation and in particular an oxidation by means of sodium hypochlorite.
  • step b) in the presence and consumption of reduction equivalents (NADH and / or
  • step b 5. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the 3a-HSDH and 7ß-HSDH used in step b) have the same or different cofactor specificity.
  • NADPH is regenerated by coupling with an NADPH regenerating enzyme, which is especially selected from NADPH dehydrogenases, alcohol dehydrogenases (ADH), and NADPH regenerating formate dehydrogenases (FDH) and an NADPH regenerating glucose dehydrogenase (GDH) and NADPH-regenerating glucose-6-phosphate dehydrogenases (G6PDH); and / or where spent NADH is regenerated by coupling with an NADH-regenerating enzyme, in particular being selected from NADH-dehydrogenases, NADH-regenerating formate dehydrogenases (FDH), NADH-regenerating alcohol dehydrogenases (ADH), NADH-regenerating glucose-6-phosphate dehydrogenases (G6PDH), NADH-regenerating phosphite dehydrogenases (PtDH) and NADH-regenerating glucose dehydrogenases (GDH); and / or wherein spent NADH and / or spent NADPH regenerating enzyme, which
  • step b) with isolated or enriched enzymes (7ß-HSDH, the 3a-HSDH and optionally the enzyme required for cofactor regeneration) or with crude cell extract (containing the 7ß-HSDH, the 3a-HSDH and optionally the enzyme needed for cofactor regeneration) or with recombinant microorganisms which functionally express the 7ß-HSDH, the 3a-HSDH and optionally the enzyme required for cofactor regeneration, and preferably a 7ß-HSDH 3a-HSDH and the enzyme (s) required for cofactor regeneration.
  • HSDH is selected from the following enzymes and enzyme mutants, wherein the non-mutated enzyme has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 1:
  • variants that are extended C- and / or N-terminal, with a His-tag sequence; and wherein the above mutants can additionally be mutated in each of the positions K44, R53, K61, R64.
  • 3-HSDH is selected from the following enzymes and enzyme mutants, wherein the non-mu characterized enzyme has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 8.
  • mutants that are C- and / or N-terminal, extended with a His-tag sequence.
  • the reactions of step b) may be carried out in the presence of a recombinant microorganism (as further defined below), e.g. in the presence of whole cells of one or more different recombinant microorganisms, wherein the microorganism (s) carry the enzymes necessary for the reaction and cofactor regeneration in a manner described in more detail herein.
  • a recombinant microorganism as further defined below
  • the microorganism (s) carry the enzymes necessary for the reaction and cofactor regeneration in a manner described in more detail herein.
  • the method step b) can be designed differently. Either both enzymes (7ß-HSDH mutant and 3a-HSDH) may be present concurrently (eg single-pot reaction with both isolated enzymes or one or more corresponding recombinant microorganisms are present expressing both enzymes) or the partial reactions may proceed in any order (first the 7 ⁇ -HSDH mutant catalyzed reduction and then the 3a-HSDH catalyzed reduction, or first the 3a-HSDH catalyzed reduction and then the 7 ⁇ -HSDH mutant-catalyzed reduction).
  • step b) may be coupled to a cofactor regeneration system in which NADPH is regenerated by an NADPH regenerating enzyme such as, in particular, a GDH consuming glucose (particularly when employing a 7ß-HSDH and 3a-HSDH which both utilize NADPH); or coupled to a cofactor regeneration system in which spent NADH is regenerated by an enzyme regenerating NADH, such as, in particular, a GDH, ADH or FDH (particularly when using a 7ß-HSDH and 3a-HSDH both use NADH);
  • NADPH NADPH regenerating enzyme
  • a GDH consuming glucose particularly when employing a 7ß-HSDH and 3a-HSDH which both utilize NADPH
  • an enzyme regenerating NADH such as, in particular, a GDH, ADH or FDH (particularly when using a 7ß-HSDH and 3a-HSDH both use NADH)
  • step b) can be coupled to a cofactor regeneration system in which NADPH and NADH are regenerated by an enzyme which regenerates both NADPH and NADH, in particular a GDH with consumption of glucose (in particular if a 7ß-HSDH and 3a-HSDH are used will use the different cofactors.
  • the present invention is not limited to the specific embodiments described herein.
  • the person skilled in the art will be enabled by the teachings of the present invention to provide further embodiments of the invention without undue burden.
  • it can also generate additional enzyme mutants in a targeted manner and screen and optimize them for the desired property profile; or other suitable wild-type enzymes (7ß and 3a-HSDHs, FDHs, GDHs ADHs, etc.) and isolate according to the invention.
  • HSDHs used in particular 7ß-HSDH and 3a-HSDH or mutants thereof
  • suitable dehydrogenases useful for cofactor regeneration GDH, FHD, ADH etc.
  • mutants thereof and distribute the selected enzymes to one or more expression constructs or vectors and, if necessary, generate one or more recombinant microorganisms which then enable a further optimized enzymatic or, in particular, whole-cell production of UDCA.
  • 7ß-HSDH refers to a dehydrogenase enzyme which is capable of at least the stereospecific and / or regiospecific reduction of DHCS or 7,12-diketo-3a-CS (7,12-diketo).
  • the enzyme may be a native or recombinantly produced enzyme Suitable detection methods are described, for example, in the following experimental section or are known from the literature (eg characterization of NADP-dependent 7beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofoets) S. Hirano and N. Masuda, Appl Environ Microbiol., 1982). Enzymes of this activity are classified under EC number 1.1 .1.201 enzymes were e.g. isolatable from Colinseilea aerofaciens.
  • 3a-HSDH refers to a dehydrogenase enzyme which comprises at least the stereospecific and / or regiospecific reduction of 3,12-diketo-7ß-CS or DHCS to 12-keto-UDCS or 7.12-diketo-3a-CS (7,12-diketo-LCS), in particular with stoichiometric consumption of NADH and / or NADPH, and optionally catalyzes the corresponding inverse reaction
  • Suitable detection methods are described, for example, in the following experimental section or known from the literature. Suitable enzymes are available, for example, from Comanomonas testosteroni (ie Comamonas testosteroni) (eg ATCC1 1996).
  • a NADPH-dependent 3a-HSDH is known, for example, from rodents and can also be used. (Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha-hydroxysteroid / dihydrodiol dehydrogenase, JE Pawlowski, M. Huizinga and TM Penning, May 15, 1991 The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820-8825). Enzymes of this activity are classified under EC number 1.1.1.50.
  • GDH refers to a dehydrogenase enzyme which comprises at least the oxidation of ⁇ -D-glucose to D-glucono-1,5-lactone with stoichiometric consumption of NAD + and / or NADP + and optionally catalysed the corresponding reverse reaction.
  • Suitable enzymes are, for example megaterium obtainable from Bacillus subtilis or Bacillus. enzymes of this type are classified under the EC number 1 .1 .1 .47.
  • FDH refers to a dehydrogenase enzyme which comprises at least the oxidation of formic acid (or corresponding formate salts) to carbon dioxide with stoichiometric consumption of NAD + and / or NADP +
  • Suitable detection methods are described, for example, in the following experimental section or are known from the literature
  • Suitable enzymes are obtainable, for example, from Candida boidinii, Pseudomonas sp or Mycobacterium vaccae Enzymes of this activity are listed under EC number 1.2.1 .2 classified.
  • a “pure form” or a “pure” or “substantially pure” enzyme is understood according to the invention to mean an enzyme having a purity of more than 80, preferably more than 90, in particular more than 95, and in particular more than 99% by weight. , based on the total protein content, determined by means of conventional protein detection methods, such as, for example, the biuret method or the protein detection according to Lowry et al. (see description in RK Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982) ).
  • a “redox equivalent” is understood to mean a low molecular weight organic compound which can be used as an electron donor or electron acceptor, for example nicotinamide derivatives such as NAD + and NADH + or their reduced forms NADH or NADPH.
  • Redox equivalent and “cofactor” are used in the context Thus, a “cofactor” within the meaning of the invention can also be described as an "redox-capable cofactor", ie as a cofactor, which may be present in reduced and oxidized form.
  • a "spent" cofactor is understood to mean that reduced or oxidized form of the cofactor which is converted into the corresponding oxidized or reduced form in the course of a given reduction or oxidation reaction of a substrate reduced cofactor Form again transferred back into the reduced or oxidized starting form, so that it is again available for the implementation of the substrate.
  • a "modified cofactor use” is understood to mean a qualitative or quantitative change in comparison to a reference.
  • altered cofactor utilization can be observed by making amino acid sequence mutations. This change is then detectable in comparison to the non-mutated starting enzyme.
  • the activity with respect to a particular cofactor can be increased or decreased by making a mutation or be completely suppressed.
  • an altered use of cofactor also includes changes such that, instead of a specificity for a single cofactor, at least one further second cofactor different from the first cofactor can be used (ie an extended cofactor utilization is available) existing ability to use two different cofactors are modified so that specificity is only increased for one of these cofactors or reduced for one of these cofactors or completely abolished.
  • an enzyme that is dependent on the cofactor NAD (NADH) may now be dependent on NAD (NADH) or the cofactor NADP (NADPH) due to a change in cofactor use, or may have the initial dependence on NAD (NADH) completely converted into a dependence on NADP (NADPH) and vice versa.
  • NADVNADH-dependency and "NADPVNADPH-dependency” are according to the invention, unless otherwise defined, to be interpreted broadly. These terms encompass both “specific” dependencies, i.e., solely dependence on NAD7NADH and NADP7NADPH, as well as the dependence of the enzymes of the invention on both cofactors, i.e., dependence on NAD7NADH and NADP7NADPH.
  • NAD7NADH-accepting or
  • NAD7NADH-regenerating or "NADP7NADPH-regenerating” are according to the invention, unless otherwise defined, to be interpreted broadly. These terms include both “specific”, i.e., exclusive, ability to regenerate spent cofactor NAD7NADH and NADP7NADPH, as well as the ability to regenerate both cofactors, i.e., NAD7NADH and NADP7NADPH.
  • proteinogenic amino acids include (one-letter code): G, A, V, L, I, F, P, M, W, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R and H.
  • immobilization is understood as meaning the covalent or noncovalent binding of a biocatalyst used according to the invention, such as, for example, a 7 ⁇ -HSDH to a solid carrier material, ie essentially insoluble in the surrounding liquid medium the recombinant microorganisms used according to the invention may be immobilized with the aid of such carriers.
  • a "substrate inhibition reduced in comparison with the non-mutated enzyme” means that the substrate inhibition observed for the unmutated enzyme for a particular substrate is no longer observable, ie essentially no longer measurable, or only starts at a higher substrate concentration , ie the Kr value is increased.
  • N- or C-terminal extensions according to the invention comprise about 15 to 25 proteinogenic amino acid residues which, optionally reversible, e.g. via a protease interface attached to a terminal amino acid residue.
  • Preferred residues include so-called "His-tags" known in the art with, for example, 3, 6 or 9 consecutive histidine residues in the extension sequence.
  • a "cholic acid compound” is understood as meaning compounds having the basic carbon structure, in particular the steroid structure of cholic acid and the presence of keto and / or hydroxy or acyloxy groups in the ring position 7 and optionally the ring positions 3 and / or 12.
  • a “cholic acid compound” or a “ursodeoxycholic acid compound” is also understood as meaning derivatives of the parent parent compound (such as cholic acid or ursodeoxycholic acid).
  • Such derivatives include “salts” such as alkali metal salts such as lithium, sodium and potassium salts of the compounds, as well as ammonium salts wherein the ammonium salt comprises the NH 4 + salt or ammonium salts wherein at least one hydrogen atom is represented by a CrC 6 alkyl radical may be replaced.
  • Typical alkyl groups are, in particular -C 4 alkyl radicals such as methyl, ethyl, n- or i-propyl, n-, sec- or tert-butyl, and also n-pentyl and n-hexyl, and the a or multi-branched analogs thereof
  • Alkyl esters of compounds according to the invention are in particular lower alkyl esters, such as, for example, C 1 -C 6 -alkyl esters, non-limiting examples being methyl, ethyl, n- or i-propyl, n-, sec- or tert-butyl ester, or longer chain esters such as n-pentyl and n-hexyl esters and the mono- or polysubstituted analogs thereof.
  • lower alkyl esters such as, for example, C 1 -C 6 -alkyl esters, non-limiting examples being methyl, ethyl, n- or i-propyl, n-, sec- or tert-butyl ester, or longer chain esters such as n-pentyl and n-hexyl esters and the mono- or polysubstituted analogs thereof.
  • Amides are, in particular, reaction products of acids according to the invention with ammonia or primary or secondary monoamines.
  • "Such amines are, for example, mono- or di-C 1 -C 6 -alkyl-monoamines, where the alkyl radicals independently of one another may optionally be further substituted, for example by carboxy- , Hydroxy, halogen (such as F, Cl, Br, J), nitro and sulfonate groups.
  • Acyl groups are in particular nonaromatic groups having 2 to 4 carbon atoms, such as acetyl, propionyl and butyryl, and aromatic groups with optionally substituted mononuclear aromatic ring, suitable substituents being, for example, selected from hydroxy, halogen (such as F, Cl, Br , J) -, Nitro- and Ci-C 6 alkyl groups, such as benzoyl or toluoyl.
  • hydroxysteroid compounds used according to the invention such as e.g. Cholic acid, ursodeoxycholic acid, 12-keto-chenodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid and 7-keto-lithocholic acid can be used in stereoisomerically pure form or in admixture with other stereoisomers in the process of the invention or obtained therefrom.
  • the compounds used or the compounds prepared are used or isolated in essentially stereoisomerically pure form.
  • the present invention is not limited to the specifically disclosed proteins or enzymes having 7 ⁇ -HSDH, FDH, ADH-GDH or 3a-HSDH activity or their mutants, but rather also extends to functional equivalents thereof.
  • “Functional equivalents” or analogues of the specifically disclosed enzymes are, within the scope of the present invention, various polypeptides which furthermore possess the desired biological activity, such as, for example, HSH activity.
  • “functional equivalents” are understood to mean enzymes which, in the test used for 7ß-HSDH, ADH, FDH, GDH or 3a-HSDH activity, increase by at least 1%, such as at least 10% or 20%, for example. such as at least 50% or 75% or 90% higher or lower activity of a parent enzyme comprising an amino acid sequence as defined herein.
  • Functional equivalents are also preferably stable between pH 4 to 1 1 and advantageously have a pH optimum in a range of pH 6 to 10, in particular 8.5 to 9.5, and a temperature optimum in the range of 15 ° C to 80 ° C or 20 ° C to 70 ° C, such as about 45 to 60 ° C or about 50 to 55 ° C.
  • the 7 ⁇ -HSDH activity can be detected by various known tests. Without being limited to this, let a test be performed using a reference substrate, such as a reference substrate. CS or DHCS, under standardized conditions as defined in the experimental section.
  • tests to determine ADH, FDH, GDH, 7ß-HSDH or 3a-HSDH activity are also known per se.
  • “functional equivalents” are understood to mean, in particular, “mutants” which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless possess one of the abovementioned biological activities.
  • “Functional equivalents” thus include those represented by one or more, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15, amino acid additions , Mutations, deletions and / or inversions, which changes can occur in any sequence position, as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention Functional equivalence is especially given when the reactivity patterns between mutants and unchanged polypeptide, ie, for example, the same substrates are reacted at different rates, examples of suitable amino acid substitutions are summarized in the following table:
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention.
  • inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts, as well as salts with organic bases such as amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like.
  • Acid addition salts such as, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and oxalic acid, are likewise provided by the invention.
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be prepared at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups prepared by reaction with acyl groups.
  • “functional equivalents” also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, it is possible to determine regions of homologous sequence regions by sequence comparison and to determine equivalent enzymes on the basis of the specific requirements of the invention.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably single domains or sequence motifs, of the polypeptides of the invention having, for example, the desired biological function.
  • Fusion equivalents are also fusion proteins having one of the above-mentioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further functionally distinct heterologous sequence in low C-terminal functional linkage (ie, with no substantial substantial functional impairment of the fusion protein moieties)
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides, histidine anchors or enzymes.
  • Homologs to the specifically disclosed proteins encompassed by the invention include at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99%, homology (or identity) to one of the specifically disclosed amino acid sequences calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc Natl Acad, S. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448 Homology or identity of a homologous polypeptide of the invention means, in particular, percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of the amino acid sequences specifically described herein.
  • the percent identity values can also be determined using BLAST alignments, algorithm blastp (protein-protein BLAST), or by applying the Clustal settings below.
  • Homologs of the proteins or polypeptides of the invention may be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation, extension or shortening of the protein.
  • Homologs of the proteins of the invention can be prepared by screening combinatorial libraries of mutants, such as e.g. Shortening mutants, to be identified.
  • a variegated library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, e.g. by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • 2.1 7ß-HSDHs 2.1 .1
  • the invention further encompasses the use of the wild type 7ß-HSDH from Collinsella aerofaciens ATCC 25986, as described in WO2011 / 064404 of the Applicant, to which reference is hereby expressly made.
  • This 7 ⁇ -HSDH obtainable from Collinsella aerofaciens DSM 3979 is especially characterized by at least one of the following properties, e.g. 2, 3, 4, 5, 6 or 7 or all such properties, characterized:
  • this 7ß-HSDH exhibits the following properties or combinations of properties; a); b); a) and b); a) and / or b) and c); a) and / or b) and c) and d); a) and / or b) and c) and d) and e); a) and / or b) and c) and d) and e) and f).
  • Such a 7 ⁇ -HSDH or functional equivalent derived therefrom is further characterized by
  • a ketosteroid comprising a 7-position keto group and at least one additional keto group on the steroid backbone catalyzed to the corresponding 7 ⁇ -hydroxysteroid, in particular by dehydrocholic acid (DHCS) 7-position to the corresponding 3,12-diketo-7 ⁇ -cholanic acid; and eg NADPH is dependent.
  • DHCS dehydrocholic acid
  • Such a 7ß-HSDH in particular has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 1 (Accession NO: ZP_01773061) or a sequence derived therefrom with an identity of at least 60%, such as. at least 65, 70, 75, 80, 85, or 90, e.g.
  • the invention further encompasses the application of 7 ⁇ -HSDH mutants as described in WO2012 / 080504 of the Applicant, to which reference is hereby expressly made.
  • a 7ß-HSDH mutant which catalyzes at least the stereospecific enzymatic reduction of a 7-keto steroid to the corresponding 7-hydroxysteroid, wherein the mutant compared to the non-mutated enzyme, in particular an enzyme comprising SEQ ID NO: 1 1 and / or at least the sequence motif VMVGRRE according to position 36 to 42 thereof, has a reduced substrate inhibition (in particular for the 7-ketosteroid substrate); and / or an altered cofactor use (eg increased, altered specificity with respect to a cofactor (in particular NADH or NADPH) or an extended dependence, ie use of an additional, previously unused cofactor), in particular such a mutant which does not show any substrate inhibition or that it has a value for the 7-ketosteroid substrate, in particular for dehydrocholic acid (DHCS), in the range of> 10 mM, such as 1 to 200 mM, 12 to 150 mM, 15 to 100 mM.
  • DHCS dehydrocholic acid
  • a 7ß-HSDH mutant which catalyzes at least the stereospecific enzymatic reduction of a 7-keto steroid to the corresponding 7-hydroxysteroid, optionally according to one of the preceding embodiments, wherein the mutant has at least one mutation in the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 1 or an amino acid sequence derived therefrom having at least 60% sequence identity, such as at least 65, 70, 75, 80, 85, or 90, e.g. at least 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5% to this sequence.
  • a 7ß-HSDH mutant which catalyzes at least the stereospecific enzymatic reduction of a 7-ketosteroid to the corresponding 7-hydroxysteroid, optionally according to one of the preceding embodiments, wherein the mutant at least one mutation in the sequence motif VMVGRRE according to position 36 to 42 of SEQ ID NO: 1 1 or in the corresponding sequence motif of an amino acid sequence derived therefrom having at least 60% sequence identity, such as at least 65, 70, 75, 80, 85, or 90, e.g. at least 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5% to this sequence.
  • Xi, X 2 and X 3 are each independently of one another any, in particular any, the substrate inhibition-reducing and / or the Kotude let or cofactor dependence modifying, different from G or R, in particular natural amino acid;
  • suitable single mutants include: G39A, G39S, G39D, G39V, G39T, G39P, G39N, G39E, G39Q, G39H, G39R, G39K and G39W, and R40D, R40E, R40I, R40V, R40L, R40G, R40A.
  • Suitable double mutants include:
  • G39Xi and R40X 2 mutants wherein Xi is in particular D or E and / or X 2 is any amino acid, in particular proteinogenic amino acid, in particular an amino acid having an aliphatic side chain, such as (G39D, R40I), (G39D , R40L), (G39D, R40V); and the analog double mutants with G39E instead of G39D; such as
  • R40D, R41 I such as.
  • R40D, R41L such as.
  • R40D, R41V such as.
  • R40I, R41I such as.
  • R40V, R41I such as.
  • the mutants (1) to (5) additionally or alternatively, in particular additionally, at least one further substitution, such as 1, 2, 3 or 4 substitutions in the positions K44, R53, K61 and R64.
  • these radicals can be replaced independently of one another by an arbitrary amino acid, in particular a proteinogenic amino acid, in particular a substitution such that the mutant thus produced has a reduced substrate inhibition (in particular for the 7-ketosteroid substrate); and / or altered cofactor use or cofactor dependency (eg, increased, altered cofactor specificity or extended dependency, that is, use of an additional, previously unused cofactor) as defined herein.
  • cofactor use or cofactor dependency eg, increased, altered cofactor specificity or extended dependency, that is, use of an additional, previously unused cofactor
  • a 7ß-HSDH mutant which catalyzes at least the stereospecific enzymatic reduction of a 7-keto steroid to the corresponding 7-hydroxysteroid, the enzyme each having a mutation in the positions G39 and R40 of SEQ ID NO: 1 1 and, if appropriate in the positions R41 and / or optionally the position K44 of SEQ ID NO: 1 1 or in the respective corresponding sequence positions of an amino acid sequence derived therefrom having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 1 1, such as at least 85, or 90, e.g. at least 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5% to this sequence.
  • the invention further comprises the application of 7 ⁇ -HSDH mutants as described in the Applicant's WO2016 / 016213, to which reference is hereby expressly made.
  • (1) 7ß-HSDH mutant which catalyzes at least the stereospecific enzymatic reduction of a 7-keto steroid to the corresponding 7-hydroxysteroid
  • the enzyme is derived from an enzyme having the SEQ ID NO: 1 1, or an enzyme comprising this sequence, such as an enzyme comprising SEQ ID NO: 1 1 N-terminally extended by a histidine tag or histidine anchor sequence, and wherein the enzyme has a mutation in position 17 and / or 64 of SEQ ID NO: 1 1 (optionally N-terminal extended) or in the corresponding sequence positions of an amino acid sequence derived therefrom with at least 80%, such. At least e.g. 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5% sequence identity, to SEQ ID NO: 1 1.
  • amino acid sequence modified by amino acid mutation in SEQ ID NO: 1 1 (optionally extended N-terminally), wherein the amino acid sequence mutation is selected from single or multiple mutations comprising:
  • Xi is an amino acid residue other than arginine (R), in particular any amino acid which increases specific activity and / or reduces substrate inhibition and / or modifies the utilization of cofactor or cofactor, in particular natural;
  • X 2 for a proteinogenic amino acid residue other than threonine (T) is, in particular, any specific, particularly activity-enhancing, and / or substrate-inhibiting and / or cofactor-dependency-modifying, especially natural, amino acid;
  • mutated, ie altered amino acid sequence has a sequence identity to SEQ ID NO: 1 1 (optionally N-terminally extended) of 80% to less than 100%, such as 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99 or 99.5% sequence identity, preferably at least 85%, in particular at least 90%.
  • X 3 stands for a different from glycine (G), in particular proteinogenic amino acid residue, in particular any, specific activity-enhancing and / or the substrate inhibition-reducing and / or the Kotex let or cofactor dependency modifying, in particular natural amino acid stands.
  • G glycine
  • X 2 is F, A, I, or S.
  • X 3 represents S, A, V, I, L, C, K, YF or R, in particular S or A.
  • Non-limiting examples of suitable single mutants include:
  • T17F T17A, T17I, T17S.
  • Non-limiting examples of suitable double mutants include:
  • DHCA decreased substrate inhibition by DHCA, e.g. with Ki values in the range of> 1 mM, e.g. at 1 to 200 mM, 2 to 150 mM, 2.5 to 100 mM;
  • altered cofactor specificity with respect to NADH and NADPH e.g. an extended specificity, ie use of an additional, previously unused cofactor, in particular NADPH;
  • mutants of 7ß-HSDH with SEQ ID NO: 1 1 (optionally N-terminally extended) or a sequence derived therefrom with a degree of identity of at least 80% or at least 85%, in particular at least 90% to the wild-type sequence with at least one the above properties a), b), c), d) or e).
  • E, and X 3 is S, A, V, I, L, C, K, Y, F or R, preferably Z is S or A, which possess at least the above property b).
  • the double mutants R64X 1 / G39X 3 in which X- 1 is E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y , H or N, in particular E, D, T, L, S, P or V, preferably E, and X 3 is S, A, V, I, L, C, K, Y, F or R, preferably S or A, which possess at least the above property d).
  • E preferably, and X 3 is S, A, V, I, L, C, K, Y, F or R, preferably S or A, which have at least the above properties a) and b).
  • S, P or V, preferably E, and X 3 is S, A, V, I, L, C, K, Y, F or R, preferably S or A, which have at least the above properties a) and c) have.
  • / G39X 3 in which X-1 is E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H or N, in particular E, D, T, L, S, P or V, preferably E, and X 3 is S, A, V, I, L, C, K, Y, F or R, preferred S or A, which have at least the above properties b) and d).
  • E preferably, and X 3 is S, A, V, I, L, C, K, Y, F or R, preferably S or A, which have at least the above properties a) to d).
  • the exemplary embodiments (1) to (30) listed above relate in particular to mutants of the 7ß-HSDH with SEQ ID NO: 1 1 (optionally N-terminally extended) and have an identity degree of at least 80% or at least 85%, in particular at least 90% up.
  • 3a-hydroxysteroid dehydrogenase which comprises at least the stereospecific enzymatic reduction of a 3-ketosteroid to the corresponding 3-hydroxysteroid (such as 3,12-diketo-7ß-CS or DHCS to 12-keto-UDCS or 7.12-diketo-3a-CS (7,12-diketo-LCS), in particular with stoichiometric consumption of NADH and / or NADPH, in particular NADH), wherein the enzyme has a mutation in position 34 and / or 68 of SEQ ID NO: 8 or in the corresponding sequence positions of an amino acid sequence derived therefrom having at least 80% sequence identity, such as e.g. At least e.g.
  • SEQ ID NO: 8 sequence identity, to SEQ ID NO: 8; and / or C-terminal a chain extension of up to 25, especially up to 15, 14, 13, 12, 11, or 10 identical or different (proteinogenic) amino acid residues, in particular a peptide chain comprising 1 to 10, e.g. 3 to 9 basic amino acid residues, such as lysine, arginine or, in particular, histidine (such as 3xHis, 6xHis or 9xHis); wherein the histidine residues can be attached directly to the C-terminus or via a linker group comprising 1 to 10, in particular 1 to 3, arbitrary amino acid residues.
  • a linker group comprising 1 to 10, in particular 1 to 3, arbitrary amino acid residues.
  • LEHHH SEQ ID NO: 15
  • LEHHHHHH SEQ ID NO: 16
  • LEHHHHHH SEQ ID NO: 17
  • the subject matter is those 3a-HSDHs which, in addition to one or more of the above mutations or, alternatively, have an N-terminal chain extension of up to 25 identical or different amino acid residues.
  • amino acid residues are up to 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, or 10 identical or different (proteinogenic) amino acid residues, especially a peptide chain comprising 1 to 10, such as 3 to 9 basic amino acid residues, such as lysine, arginine or, in particular, histidine (such as 3xHis, 6xHis or 9xHis), extended; wherein the histidine residues may be attached directly to the N-terminus or via a 1-10 arbitrary amino acid residue-containing linker group.
  • MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH- SEQ ID NO: 18).
  • preferred 3a-HSDHs have a mutation in position 34 and / or 68 and are optionally additionally extended N-terminally or C-terminally; or they are only N-terminal or C-terminal extended; each as defined further herein.
  • the invention includes native, non-mutated enzyme according to SEQ ID NO: 8, which is modified only N- or C-terminal as described above.
  • Xi is a different, in particular proteinogenic, amino acid residue other than arginine (R), in particular any, especially natural amino acid which increases specific activity and / or reduces substrate inhibition and / or modifies cofactor dependence or cofactor dependency;
  • X 2 is a proteinogenic amino acid residue other than leucine (L), in particular any, especially natural amino acid which increases specific activity and / or reduces substrate inhibition and / or modifies the utilization of cofactor or cofactor; iii. C-terminal to a chain comprising 1 to 10 histidine (H) residues extended addition mutants; wherein, for example, the histidine residues can be attached directly to the C-terminus or via a linker group comprising 1 to 10, in particular 1 to 3, amino acid residues.
  • L leucine
  • H histidine
  • N-terminal chain extended by 1 to 10 histidine (H) residues extended addition mutants whereby e.g. the histidine residues may be attached directly to the C-terminus or to a linker group comprising 1 to 10 amino acid residues;
  • mutated, i. altered amino acid sequence has a sequence identity to SEQ ID NO: 8 of 80% to less than 100%, e.g. 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5% sequence identity.
  • Xi is N, C, S or L
  • cd N-terminally extended by a 1 to 10 histidine residues comprising peptide chain extended addition mutants; whereby e.g. the histidine residues may be attached directly to the N-terminus or via a 1-10 amino acid residue linker group, and
  • suitable mutants are
  • Double mutants comprising: [R34N / L68A]
  • DHCA decreased substrate inhibition by DHCA, e.g. with Ki values in the range of> 10mM, e.g. at 1 to 200 mM, 12 to 150 mM, 15 to 100 mM,
  • a) and b) may be present individually or in any combination, i. only a), only b), or a) and b).
  • a 3a-HSDH which comprises at least the stereospecific enzymatic reduction of a 3-ketosteroid to the corresponding 3-hydroxysteroid (such as, for example, 3,12-diketo-7 ⁇ -CS or DHCS to 12-keto-UDCS or 7,12- Diketo-3a-CS (7,12-diketo-LCS), in particular catalyzed under stoichiometric consumption of NADH and / or NADPH, especially with stoichiometric consumption of NADH, wherein the enzyme has a mutation at position 188 and / or position 185 and optionally position 68 of SEQ ID NO: 8 or in the corresponding Sequence positions of an amino acid sequence with at least 80%, such as.
  • a 3-ketosteroid such as, for example, 3,12-diketo-7 ⁇ -CS or DHCS to 12-keto-UDCS or 7,12- Diketo-3a-CS (7,12-diketo-LCS
  • the enzyme has a mutation at position 188 and / or position
  • Examples are: LEHHH, LEHHHHHH and LEHHHHHH. Furthermore, the subject matter is those 3a-HSDHs which, in addition to one or more of the above mutations or, alternatively, have an N-terminal chain extension of up to 25 identical or different amino acid residues.
  • preferred 3a-HSDHs each have a mutation at position 188 and / or 185 and optionally at position 68 and are optionally additionally extended N-terminally or C-terminally; or they are only N-terminal or C-terminal extended; each as defined further herein.
  • Ketosteroids catalyzed to the corresponding 3-hydroxysteroid
  • Xi is a proteinaceous amino acid residue other than proline (P);
  • X 2 is a (proteinogenic) amino acid residue other than leucine (L);
  • X 3 is a proteinaceous amino acid residue other than threonine (T);
  • H histidine residues
  • N-terminal extension comprising 1 to 10 histidine (H) radicals
  • mutated, i. altered amino acid sequence has a sequence identity to SEQ ID NO: 8 of 80% to less than 100%, e.g. 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5% sequence identity.
  • SEQ ID NO: 8 80% to less than 100%, e.g. 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5% sequence identity.
  • Xi is A, T, S, G or V, especially A;
  • X 2 is A, G, C, K, S or V, especially A;
  • X 3 is A, G, W, S or V, especially A or S;
  • C-terminal extension comprising 1 to 10 histidine residues, where e.g. the histidine residues may be attached directly to the C-terminus or via a 1-10 amino acid residue linker group.
  • N-terminal extension comprising 1 to 10 histidine residues; whereby e.g. the histidine residues may be attached directly to the N-terminus or via a 1-10 amino acid residue linker group.
  • Nonlimiting examples of suitable mutants are:
  • Double mutants comprising: [L68A / T188A] and [L68A / T188S]
  • DHCA decreased substrate inhibition by DHCA, such as with Ki values in the range of> 10 mM, such as 11 to 200 mM, 12 to 150 mM, 15 to 100 mM, c. an increased specific activity (v max [U / mg]) for NADH in the enzymatic reduction of DHCA with NADH as cofactor.
  • the specific activity (U / mg) in the presence of the DHCA compared to the non-mutated enzyme by at least 1, 5, 10, 50 or 100%, but in particular at least by 1-fold, in particular by 2 to 100 times or 3 to 20 times or 5 to 10 times,
  • a) to c) may be present individually or in any combination, i. only a), only b), only c), a) and b), a) and c) or b) and c).
  • the invention also nucleic acid sequences encoding an enzyme with 7ß-HSDH, ADH, FDH, GDH and / or 3a-HSDH activity and their mutants.
  • the present invention also relates to nucleic acids having a certain degree of identity to the specific sequences described herein.
  • Identity between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleotides over the entire nucleic acid length, in particular the identity which is determined by comparison with the Vector NTI Suite 7.1 software from Informax (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, Comput Appl. Biosci 1989 Apr; 5 (2): 151 -1) is calculated with the following parameters:
  • the identity may also be after Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13): 3497-500, according to Internet address: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# and determined with the following parameters:
  • nucleic acid sequences mentioned herein can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, Pages 896-897).
  • the invention also relates to nucleic acid sequences (single- and double-stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) coding for one of the above polypeptides and their functional equivalents, which are e.g. accessible using artificial nucleotide analogs.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides or proteins or biologically active portions thereof according to the invention, as well as nucleic acid fragments which are e.g. for use as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids of the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention can additionally contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a portion thereof.
  • the nucleotide sequences of the invention enable the generation of probes and primers useful for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which is under "stringent" conditions (see below) at least about 12, preferably at least about 25, such as about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence of the invention or a corresponding nucleic acid sequence Antisense strands hybridizes.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, may be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free from chemical precursors or other chemicals if it is synthesized chemically.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be analyzed by means of molecular biological
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences, or a portion thereof, as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a portion thereof, isolate by polymerase chain reaction, wherein the oligonucleotide primers that were created on the basis of this sequence can be used.
  • the thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides according to the invention can furthermore be prepared by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • Nucleic acid sequences according to the invention or derivatives thereof, homologs or parts of these sequences can be prepared, for example, by conventional hybridization methods or the PCR technique from other bacteria, e.g. isolate via genomic or cDNA libraries. These DNA sequences hybridize under standard conditions with the sequences according to the invention.
  • hybridizing is meant the ability of a poly- or oligonucleotide to bind to a nearly complementary sequence under standard conditions, while under these conditions non-specific binding between non-complementary partners is avoided.
  • the sequences may be 90-100% complementary.
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to one another for example, in the Northern or Southern Blot technique or in the primer binding in PCR or RT-PCR advantage.
  • oligonucleotides For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides of the conserved regions. However, it is also possible to use longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences for the hybridization. Depending on the nucleic acid used (oligonucleotide, longer fragment or complete sequence) or which nucleic acid type DNA or RNA is used for the hybridization, these standard conditions vary. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are about 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • the hybridization conditions for DNA are 0.1X SSC and temperatures between about 20 ° C to 45 ° C, preferably between about 30 ° C to 45 ° C.
  • the hybridization conditions are advantageously 0.1 x SSC and temperatures between about 30 ° C to 55 ° C, preferably between about 45 ° C to 55 ° C.
  • temperatures for the hybridization are exemplary calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of about 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks of genetics, such as, for example, Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, and formulas which are known to the person skilled in the art are dependent on the length of the nucleic acids, for example. calculate the type of hybrid or G + C content. Further information on hybridization can be found in the following textbooks by the person skilled in the art: Ausubel et al.
  • hybridization can in particular take place under stringent conditions
  • stringent conditions are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • stringent hybridization conditions are meant in particular: The incubation at 42 ° C overnight in a solution consisting of 50% formamide, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate ( pH7.6), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate and 20 g / ml denatured salmon sperm DNA, followed by a filter wash with 0.1 x SSC at 65 ° C.
  • the invention also relates to derivatives of the specifically disclosed or derivable nucleic acid sequences.
  • nucleic acid sequences of the invention may be used e.g. are derived from SEQ ID NO: 7, 10 or 13 and differ therefrom by addition, substitution, insertion or deletion of single or multiple nucleotides, but furthermore encode polypeptides having the desired property profile.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or which have changed in accordance with the codon usage of a specific source or host organism, in comparison with a specifically mentioned sequence, as well as naturally occurring variants, such as e.g. Splice variants or allelic variants, of which
  • Articles are also provided by conservative nucleotide substitutions (i.e., the amino acid in question is replaced by an amino acid of like charge, size, polarity, and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived by sequence polymorphisms from the specifically disclosed nucleic acids. These genetic polymorphisms can occur between individuals within a population due to the natural varia- exist. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
  • Derivatives of the nucleic acid sequence according to the invention with the sequence SEQ ID NO: 7, 10 or 13 are, for example, allelic variants which have at least 60% homology at the derived amino acid level, preferably at least 80% homology, most preferably at least 90% homology over the entire sequence range (for homology at the amino acid level, see the above comments on the polypeptides). About partial regions of the sequences, the homologies may be advantageous higher.
  • derivatives are also to be understood as meaning homologs of the nucleic acid sequences according to the invention, in particular of SEQ ID NO: 7, 10 or 13, for example fungal or bacterial homologs, truncated sequences, single stranded DNA or RNA of the coding and noncoding DNA sequence.
  • Homologues to the SEQ ID NO: 7, 10 or 13 at the DNA level a homology of at least 40%, preferably of at least 60%, more preferably of at least 70%, most preferably of at least 80% over the entire in SEQ ID NO : 7, 10 or 13 indicated DNA range.
  • the promoters which are upstream of the specified nucleotide sequences, can be modified by at least one nucleotide exchange, at least one insertions, inversions and / or deletions, without, however, impairing the functionality or effectiveness of the promoters.
  • the promoters can be increased by changing their sequence in their effectiveness or completely replaced by more effective promoters of alien organisms.
  • the person skilled in the art can introduce completely random or even more targeted mutations into genes or non-coding nucleic acid regions (which are important, for example, for the regulation of expression) and then generate gene banks.
  • the molecular biological methods required for this purpose are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.
  • error-prone PCR error-prone polymerase chain reaction
  • nucleotide sequences are mutated by defective DNA polymerases
  • DNA shuffling in which a pool of closely related genes is formed and digested, and the fragments are used as templates for a polymerase chain reaction in which repeated strand separation and recapture ultimately generate full-length mosaic genes (Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad. USA 91: 10747).
  • first gene libraries of the respective proteins are generated, using, for example, the abovementioned methods
  • the gene banks are appropriately expressed, for example by bacteria or by phage display systems.
  • the respective genes of host organisms expressing functional mutants with intrinsic properties that largely correspond to the desired properties can be subjected to another round of mutation.
  • the steps of mutation and selection or screening can be repeated iteratively until the functional mutants present have the desired properties to a sufficient extent.
  • a limited number of mutations such as 1 to 5 mutations, can be carried out step by step and evaluated and selected for their influence on the relevant enzyme property.
  • the selected mutant can then be subjected in the same way to a further mutation step. By doing so leaves significantly reduce the number of single mutants to be studied.
  • results according to the invention provide important information regarding the structure and sequence of the enzymes in question, which are required in order to selectively generate further enzymes with desired modified properties.
  • so-called "hot spots” can be defined, that is to say sequence sections which are potentially suitable for modifying an enzyme property by introducing targeted mutations.
  • the invention also relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for at least one polypeptide according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • an "expression unit” is understood as meaning a nucleic acid with expression activity which comprises a promoter as defined herein and, after functional linkage with a nucleic acid or a gene to be expressed, regulating the expression, ie the transcription and the translation, of this nucleic acid or gene
  • a promoter as defined herein and, after functional linkage with a nucleic acid or a gene to be expressed, regulating the expression, ie the transcription and the translation, of this nucleic acid or gene
  • regulatory elements e.g. Enhancers
  • an expression cassette or “expression construct” is understood according to the invention to mean an expression unit which is functionally linked to the nucleic acid to be expressed or to the gene to be expressed.
  • an expression cassette comprises not only nucleic acid sequences that regulate transcription and translation, but also the nucleic acid sequences that are to be expressed as a protein as a result of transcription and translation.
  • expression or “overexpression” in the context of the invention describe the production or increase of the intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by introducing a gene into an organism replace existing gene with another gene, increase the copy number of the gene (s), use a strong promoter or use a gene coding for a corresponding enzyme with a high activity, and optionally combine these measures.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream and optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • promoter a nucleic acid with promoter activity
  • motor sequence is understood as meaning a nucleic acid which, in functional linkage with a nucleic acid to be transcribed, regulates the transcription of this nucleic acid.
  • a “functional” or “operative” linkage in this context means, for example, the sequential arrangement of one of the nucleic acids with promoter activity and a nucleic acid sequence to be transcribed and, if appropriate, further regulatory elements, for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and, for example a terminator such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence.
  • further regulatory elements for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and, for example a terminator such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as enhancer sequences, may also exert their function on the target sequence from more distant locations or even from other DNA molecules.
  • nucleic acid sequence to be transcribed is positioned behind (i.e., at the 3 'end) of the promoter sequence such that both sequences are covalently linked together.
  • the distance between the promoter sequence and the transgenic nucleic acid sequence to be expressed may be less than 200 base pairs, or less than 100 base pairs or less than 50 base pairs.
  • regulatory elements include targeting sequences, enhancers, polyadenylation signals, selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are e.g. in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • Nucleic acid constructs according to the invention comprise in particular sequence SEQ ID NO: 7, 10 or 13 or derivatives and homologs thereof, as well as the nucleic acid sequences derivable therefrom, which are advantageously used with one or more regulatory signals for the control, e.g. Increased, the gene expression was operatively or functionally linked.
  • nucleic acid construct can also have a simpler structure, ie no additional regulatory signals were inserted before the coding sequence and the natural promoter with its regulation was not removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased.
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the already mentioned “enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids of the invention may be contained in one or more copies in the construct.
  • the construct may also contain further markers, such as antibiotic resistance or auxotrophic complementing genes, optionally for selection on the construct.
  • suitable regulatory sequences are promoters such as cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq " T7-, T5-, T3-, gal-, trc, ara, rhaP (rhaP B AD) SP6, lambda P R - or contained in the lambda P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are, for example, in the gram-positive Promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.It is also possible to use artificial promoters for regulation.
  • the nucleic acid construct, for expression in a host organism is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which allows for optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • Vectors other than plasmids and phages are also all other vectors known to those skilled in the art, e.g. Viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosides, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention.
  • Suitable plasmids are described, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-III 113 -B1, Agt1 1 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB1 10, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667, in fungi pALS1, pIL1 or pBB1 16, in yeasts 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 or pEMBLYe23 or in plants pLGV23, pGHIac + , p
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination. be grated.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or of the nucleic acid according to the invention.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously injected into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • a fusion protein comprising a GDH and a 3a -HSDH as described above and optionally a 7 ⁇ -HSDH as described above;
  • Expression cassettes comprising, under the control of at least one regulatory sequence, at least one nucleotide sequence as described above and optionally coding sequences for at least one (such as 1, 2 or 3) further enzyme selected from among hydrogen roxysteroid dehydrogenases, in particular 7 ⁇ -HSDH as described herein, and dehydrogenases suitable for cofactor regeneration, such as FDH, GDH, ADH, G-6-PDH, PDH.
  • the enzymes contained in an expression cassette can use different, but preferably identical cofactor pairs, such as, for example, the cofactor pair NAD + / NADH or NADP + / NADPH.
  • microorganism may be understood to mean the starting microorganism (wild-type) or a genetically modified, recombinant microorganism or both.
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct according to the invention.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • gram-positive or gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, more preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Comamonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium or Rhodococcus used.
  • the host organism or host organisms according to the invention preferably contain at least one of the nucleic acid sequences, nucleic acid constructs or vectors described in this invention, which code for an enzyme with 7 ⁇ -HSDH activity as defined above.
  • the organisms used in the method according to the invention are grown or grown according to the host organism in a manner known to those skilled in the art.
  • Microorganisms are usually in a liquid medium containing a carbon source usually in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C attracted under oxygen fumigation.
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is regulated during the cultivation or not.
  • the cultivation can take place batchwise, semi-batchwise or continuously. Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • Recombinant microorganisms carrying at least one nucleotide sequence or at least one expression cassette or at least one expression vector, each as described above.
  • Recombinant microorganisms carrying in addition to the coding sequence for 3a and 7ß-HSDH the coding sequence for a dehydrogenase suitable for cofactor regeneration wherein the dehydrogenase is selected from NADPH regenerating enzymes, such as NADPH dehydrogenases, alcohol dehydrogenases (ADH), and NADPH re Generating formate dehydrogenases (FDH), as well as glucose dehydrogenase (GDH), glucose co-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH), or phosphite dehydrogenases (PtDH), or NADH-regenerating enzymes, such as NADH dehydrogenases, NADH regenerating formate dehydrogenases (FDH), NADH regenerating alcohol dehydrogenases (ADH), NADH regenerating glucose-6-phosphate dehydrogenases (G6PDH), NADH regenerating phosphite dehydrogenases (PtDH) and NADH regenerating
  • Recombinant microorganisms which carry the coding sequences for a 3a-HSDH, a GDH and a 7ß-HSDH (or their mutants) on one or more (different) expression constructs.
  • the invention thus relates to recombinant microorganisms which are modified with a single-plasmid system (such as transformed, for example), which contain the coding sequences for 3a -HSD, GDH and 7ß-HSDH (or their mutants) in one or more copies, such as in 2, 3, 4, 5, or 6 to 10 copies, wear.
  • the invention thus also relates to recombinant microorganisms which are modified (such as transformed) with a single-plasmid system which contains the coding sequences for 7ß-HSDH, GDH and 3a-HSDH (or their mutants) in one or more copies, such as in 2, 3, 4, 5 or 6 to 10 copies.
  • a single-plasmid system which contains the coding sequences for 7ß-HSDH, GDH and 3a-HSDH (or their mutants) in one or more copies, such as in 2, 3, 4, 5 or 6 to 10 copies.
  • the enzymes (7 ⁇ -HSDH, GDH and 3a-HSDH or their mutants) can also be present on 2 or 3 separate, mutually compatible plasmids in one or more copies.
  • Suitable base vectors for the production of single-plasmid systems and multicopy plasmids are known to the person skilled in the art.
  • Examples which may be mentioned are for a single-plasmid system, for example pET21 a and for multicopy plasmids, for example the Duet vectors marketed by Novagen, such as pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1, pRSFDuet-1 and pCOLADuet-1.
  • pACYCDuet-1 pETDuet-1
  • pCDFDuet-1 pRSFDuet-1
  • pCOLADuet-1 pCOLADuet-1
  • Such vectors, their compatibility with other vectors and microbial host strains can be found, for example, in the "User Protocol TB340 Rev. E0305 from Novagen.
  • the optimum combination of enzymes for the generation of plasmid systems can be carried out by the person skilled in the art without taking reasonable account of the teaching of the present invention.
  • the person skilled in the art can select the enzyme most suitable for cofactor regeneration, selected from the abovementioned dehydrogenases, in particular GDH and the respective mutants thereof.
  • plasmids Furthermore, it is possible to distribute the enzymes chosen for the reaction to two or more plasmids and to produce two or more different recombinant microorganisms with the plasmids thus prepared, which are then used together for the biocatalytic reaction according to the invention.
  • the particular enzyme combination used for the preparation of the plasmid can be carried out in particular under the specification of a comparable cofactor use.
  • a first microorganism may be modified with a plasmid carrying the coding sequence for a 7 ⁇ -HSDH or mutant thereof and a GDH.
  • a second microorganism may be modified with a plasmid carrying the coding sequence for a 3 ⁇ -HSDH or mutant thereof and the coding sequence for a GDH. Both enzyme pairs can be chosen so that they can regenerate the same cofactor pairs. Both microorganisms can then be used simultaneously for the biocatalytic reaction according to the invention.
  • biocatalysts can be genetically modified and optimized separately from each other. In particular, it is possible to use various cofactor regeneration enzymes optimized for either NADH or NADPH regeneration.
  • the biocatalysts can be used in different proportions. This allows intervention in the individual reaction velocities of the multi-enzyme process during biocatalysis, even after all biocatalysts have already been prepared.
  • HSDH knock-out strain prepared as e.g. described in WO201 1/147957 of the applicant.
  • the reaction is carried out using methods known per se for the chemical oxidation of secondary alcohols.
  • the reaction by means of potassium dichromate in dilute sulfuric acid, by means of pyridinium dichromate, by means of Jones reagent, or Collins reagent (cf., for example, Brückner, Reaction mechanisms, 3rd edition, 2004, Spektrum Akademischer Verlag
  • oxalyl chloride is dissolved in CH 2 Cl 2 and cooled with an acetone / T rockeneis bath to -78 ° C. To this is added dropwise a solution of dimethyl sulfoxide CH 2 Cl 2 added dropwise. A solution of chenodeoxycholic acid (CDCA) in a mixture of CH 2 Cl 2 / DMSO is added. The reaction mixture is stirred, then triethylamine is added, stirring is continued and the cooling bath is removed. To the heated to RT reaction mixture is added H 2 0 and stirred. Subsequently, aqueous and organic phases are separated and the aqueous phase CH 2 Cl 2 is extracted. The combined organic phases are washed successively with 0.5 M HCl and dist. H 2 0, dried over NaS0 4 and freed from the solvent in vacuo.
  • the chenodeoxycholic acid is dissolved in acetic acid at 18 ° C.
  • the hypochlorite is added to the resulting brown solution.
  • the temperature is kept at 7 -15 ° C.
  • the milky suspension was then stirred with cooling.
  • sodium bisulfite is added thereto.
  • the temperature is kept constant at 15 ° C and stirred.
  • H 2 0 a milky suspension is obtained, which is heated to 70 ° C and then cooled.
  • the product is filtered off and washed with water. The product is then dried.
  • 2nd step biocatalytic, i. enzymatic or microbial conversion of 3, 7-diketo-UDCA to UDCA
  • 3,7-diketo-UDCA is specifically reduced by 3a-HSDH and 7 ⁇ -HSDH or mutants thereof to UDCS in the presence of NADPH and / or NADH.
  • the cofactor NADPH or NADH can be replaced by an ADH or FDH or GDH or mutants thereof with consumption of e.g. Isopropanol (ADH) or Natiumformiat (FDH) or Gluco- se (GDH) are regenerated.
  • ADH Isopropanol
  • FDH Natiumformiat
  • GDH Gluco- se
  • recombinant microorganisms expressing the required enzyme activity (s) in the presence of the substrate to be reacted may be cultured anaerobically or aerobically in suitable liquid media.
  • suitable cultivation conditions are known per se to the person skilled in the art. They include reactions in the pH range of for example 5 to 10 or 6 to 9, at temperatures in the range of 10 to 60 or 15 to 45 or 25 to 40 or 37 ° C.
  • Suitable media include z, B, LB and TB or the media described below. The reaction can be carried out z, B, batchwise or continuously or in other conventional process variants (as described above).
  • the reaction time can be, for example, in the range of minutes to several hours or days, and for example be 1 h to 48 h.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of polypeptides according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, wherein a polypeptide-producing microorganism is cultivated, if appropriate, the expression of the polypeptides is induced and these are isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or batchwise in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process).
  • batch cultivation or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process).
  • Storhas bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) Find.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • These media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • sugars such as mono-, di- or polysaccharides.
  • very good carbon sources are glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds, such as molasses, or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible sources of carbon are oils and fats such.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soy protein, yeast. extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds which may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • sulfur source inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides but also organic sulfur compounds, such as mercaptans and thiols can be used.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used according to the invention usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • growth factors and salts are often derived from complex media components, such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the exact composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis. Information about the media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol Physiology, A Practical Approach" (ed. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media may also be obtained from commercial suppliers such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1, 5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately. All media components may be present at the beginning of the culture or added randomly or batchwise, as desired.
  • the temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be controlled during cultivation by addition of basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid. To control the development of foam anti-foaming agents, such as. Fatty acid polyglycols ter, are used.
  • the medium can be selected selectively acting substances such. As antibiotics, are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such. B. ambient air, registered in the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C and.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broth is then further processed.
  • the biomass can be wholly or partly by separation methods, such. As centrifugation, filtration, decantation or a combination of these methods are removed from the fermentation broth or completely left in it.
  • the cells may be digested and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells may optionally be treated by high frequency ultrasound, high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods.
  • Purification of the polypeptides may be accomplished by known chromatographic techniques such as molecular sieve chromatography (gel filtration) such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as other conventional techniques such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • anchors such as anchors.
  • anchors may be used to attach the proteins to a solid support, e.g. a polymer matrix, which may for example be filled in a chromatography column, or used on a microtiter plate or on another carrier.
  • these anchors can also be used to detect the proteins.
  • conventional markers such as fluorescence colorants, can be used to detect the proteins.
  • the enzymes according to the invention can be used freely or immobilized in the enzymatic methods described herein.
  • An immobilized enzyme is an enzyme which is fixed to an inert carrier. Suitable support materials and the enzymes immobilized thereon are known from EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 and DE-OS 100193773 and from the references cited therein. The disclosure of these documents is hereby incorporated by reference in its entirety.
  • Suitable support materials include, for example, clays, clay minerals such as kaolinite, diatomaceous earth, perlite, silica, alumina, sodium carbonate, calcium carbonate, cellulose powders, anion exchange materials, synthetic polymers such as polystyrene, acrylic resins, phenolformaldehyde resins, polyurethanes and polyolefins such as polyethylene and polypropylene.
  • the support materials are usually used to prepare the supported enzymes in a finely divided, particulate form, with porous forms being preferred.
  • the particle size of the carrier material is usually not more than 5 mm, in particular not more than 2 mm (grading curve).
  • Carrier materials are, for example, calcium alginate, and carrageenan.
  • Enzymes as well as cells can also be cross-linked directly with glutaraldehyde (cross-linking to CLEAs). Corresponding and further immobilization processes are described, for example, in J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim ,
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of microorganisms, growth of microorganisms, propagation of phage and sequence analysis of recombinant DNA using standard protocols, e.g. as in Sambrook et al. (1989) supra. described be performed.
  • KPi buffer 50 mM, pH 8) containing 8.3 g K 2 HP0 4 and 0.3 g KH 2 P0 4 per liter buffer.
  • TEA buffer 100 mM, pH 7.5
  • 14.9 g of triethanolamine per liter of buffer adjusted to pH 7.5 with 1 M HCl.
  • Tris-HCl buffer (100 mM, pH 8.0, 8.5, 9.0) containing 12.1 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane per liter of buffer, adjusted to the desired pH with 1 M NaOH.
  • Citric acid buffer (100 mM pH 6) containing 2.4 g of citric acid monohydrate and 26.0 g of trisodium citrate dihydrate per liter of buffer.
  • Digestion buffer containing 10 mM imidazole, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 8.
  • wash buffer containing 20 mM imidazole, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 8.
  • Elution buffer containing 250 mM imidazole, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 8.
  • Escherichia coli strain DH5a (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) was propagated at 37 ° C in LB medium containing appropriate antibiotics.
  • the Escherichia coli strain BL21 (DE3) A7a-HSDH was obtained from PharmaZell GmbH (see also WO201 1/147957).
  • PET28a (+) - 7ß-HSDH (C) pET28a (+) - vector in which the gene of 7ß-HSDH from C. aero-faciens was cloned in the usual way via the Nco ⁇ and Xho ⁇ . This construct has a C-terminal 6xHis tag.
  • pDB02 pETDuet vector in which the gene of the 7ß-HSDH from C. aerofaciens via the interfaces Nco ⁇ and Not ⁇ in the 1.
  • Multi-cloning site (MCS) and the 3a-HSDH from C. testosteroni via the interfaces Nde ⁇ and Xho ⁇ were cloned into the MCS2 in the usual way. This construct does not have a 6xHis tag.
  • PDB04 pETDuet vector in which the gene of glucose dehydrogenase from B.subtilis 168 via the Nco ⁇ and Xho ⁇ in the MCS1 and the 3a-HSDH from C. tes- tosteroni were intercepted in the usual way via the interfaces Nde ⁇ and Xho ⁇ in the MCS2. This construct does not have a 6xHis tag.
  • pDB04b pETDuet vector in which the B. subtilis 168 glucose dehydrogenase gene is linked to the MCS1 via the Nco ⁇ and Xho ⁇ interstices and the C.-tes- tosteroni 3a-HSDH via the Nde ⁇ and Xho ⁇ cleavage sites MCS2 were eingkllo- in the usual way.
  • QuikChange® PCR was used to introduce the mutation T188A into the gene of 3 ⁇ -HSDH. This construct does not have a 6xHis tag.
  • PA_7 ⁇ -HSDH pACYCDuet vector in which the gene of the 7ß-HSDH from C. aerofaciens was cloned in via the interfaces ⁇ / col and Xho in the usual way. This construct does not have a 6xHis tag.
  • PA_7ß-HSDH [G39S / R64E]: pACYCDuet vector in which the gene of 7ß-HSDH from C. aerofaciens was cloned in the usual way via the interfaces ⁇ / col and Xho.
  • QuikChange® PCR the mutations G39S and R64E were introduced into the gene of 7ß-HSDH This construct has no 6xHis tag.
  • PA_GDH2 pACYCDuet vector in which the gene of B. subtilis 168 glucose dehydrogenase was cloned in the customary manner via the Bsa / NcoI and XhoI cleavage sites. This construct does not have a 6xHis tag.
  • Table 2 Recombinant strains used.
  • the plasmids used are listed in the chapter "Expression vectors and vector constructs"
  • the attracted cells were sonicated (25% cell suspension) and the recovered crude extract was separated from the cell debris by centrifugation (20,000 g, 30 min, 4 ° C).
  • E. coli ⁇ Z-27 (DE3) A7a-HSDH was transformed with the expression construct.
  • the E. coli BL21 (DE3) A7a-HSDH strain containing the expression construct was incubated in LB medium with the corresponding antibiotic (50 ⁇ g ml kanamycin for pET28a, 36 ⁇ g ml chloramphenicol for pACYCDuet or 40 ⁇ g ml kanamycin + 29 ⁇ g ml Chloramphenicol for the whole cell biocatalyst). The cells were harvested by centrifugation (10,000xg, 30 min, 4 ° C). The pellet was resuspended in digestion buffer (25% cell suspension).
  • the cells were disrupted under constant cooling by sonication for 2 minutes (30 W power, 10 - 25% working interval and 1 min break) using a Sonopuls HD2070 ultrasound machine (Bandelin, Germany). The digest was repeated three times.
  • the cell extract was centrifuged (20,000xg, 30 min, 4 ° C).
  • the supernatant was loaded onto a chromatography column (Thermo scientific, USA) previously equilibrated with 25 ml digestion buffer. Weak binding protein was removed by washing with 40 to 50 ml wash buffer.
  • the fusion protein was eluted with elution buffer (10 ml). The procedure was carried out at RT.
  • the eluate was concentrated by Centricon (ultrafiltration modules) and rebuffered to buffer 50 mM KPi (pH 8.0) by means of a PD10 column to remove the containing imidazole.
  • the protein concentration was determined by Bradford (see Method 2.5) (crude extract) or purified protein using Nanodrop ⁇ (ThermoScientific). In addition, the sample was analyzed by 15% SDS-PAGE and Coomassie Brilliant Blue staining.
  • the reaction mixture contains a total volume of 1 ml: 880 ⁇ 50 mM potassium phosphate (KPi) buffer, pH 8.0
  • the decrease in absorbance is measured at 340 nm over a period of 30 seconds and the activity is calculated as the enzyme unit (U, ie ⁇ " ⁇ / ⁇ " ⁇ ) using the molar extinction coefficient of 6.22 mM "1 xcm " 1 .
  • the reaction mixture contains a total volume of 1 ml: 940 ⁇ 50 mM potassium phosphate (KPi) buffer, pH 8.0
  • the increase in absorbance is measured at 340 nm over a period of 30 seconds and the activity is expressed as the enzyme unit (U, ie ⁇ " ⁇ / ⁇ " ⁇
  • the samples (100 ⁇ each) were mixed with 900 ⁇ Bradford reagent and incubated for at least 15 min in the dark.
  • the protein content was determined at 595 nm against a calibration curve (BSA) in the concentration range of the assay used.
  • the HPLC system Jasco was used, consisting of the interface LC-Net II / ADC, 3-way degasser DG2080-53, autosampler AS2059SFPIus, two pumps PU-2080Plus, column oven CO-2060Plus, RI detector RI-2031 Plus and multi-wavelength detector MD-2010Plus.
  • the substances were separated using a Purospher STAR® RP-18e (5 ⁇ ) reversed-phase chromatography column from Merck (Darmstadt, Germany).
  • a gradient elution was selected in which the mobile phase used was a mixture of acetonitrile and phosphoric acid water (pH 2.6). The latter served to obtain a uniform degree of protonation.
  • the gradient used was: 0-15 min linear increase from 20% acetonitrile to 35%, 15-53 min linear increase to 70% acetonitrile, 53-75 min constant 70% acetonitrile, 75-78 min linear decrease to 20% acetonitrile, 78 - 88 min constant 20% acetonitrile.
  • oxalyl chloride 70 mmol, 6.02 ml
  • acetone / T rock ice bath 50 ml CH 2 Cl 2
  • a solution of dimethyl sulphoxide (130 mmol, 9.24 ml) in 15 ml CH 2 Cl 2 is added dropwise via a dropping funnel for 5 min.
  • aqueous and organic phases are separated and the aqueous phase is extracted with 200 ml of CH 2 Cl 2 .
  • the combined organic phases are successively with 250 ml of 0.5 M HCl and dist. H 2 0, dried over NaS0 4 and freed from the solvent in vacuo.
  • Scheme 1 Reaction scheme of the chemical oxidation of CDCA using the SWERN protocol.
  • the product was obtained with a yield of 46% and a purity of about 90%.
  • Scheme 2 Reaction scheme of chemical oxidation of CDCA by TEMPO.
  • the product was obtained with a yield of 78% and a purity of about 95%.
  • the chenodeoxycholic acid (10 g, 24.5 mmol) was dissolved in a 500 ml three-necked flask in acetic acid (1 x 10 ml) at 18 ° C.
  • Hypochlorite 35 ml, 2.66 eq, 65.15 mmol
  • the temperature was kept at 7 -15 ° C.
  • the milky suspension was then stirred for a further three hours with cooling.
  • sodium bisulfite solution (20.4 mmol, 35 ml) was added dropwise thereto. The temperature was kept constant at 15 ° C again.
  • QuikChange® PCR was used to target the exchange of individual amino acids.
  • the primers used are shown in Table 3, which effected the desired exchange at positions 39 and 64 for the 7ß-HSDH and position 188 for the 3a-HSDH, respectively.
  • the reaction was first followed by a 2 min initial denaturation step at 95 ° C. Thereafter, 23 cycles of denaturation (30 sec. At 95 ° C), primer hybridization and elongation (2.5 min. At 72 ° C) were performed. The final step was a final elongation of 72 ° C for 10 minutes before the polymerase chain reaction was terminated by cooling to 15 ° C. Table 4 indicates the corresponding composition of the reaction mixture.
  • the template used was a pET28a vector with the corresponding wild-type gene.
  • the DNA sequence of the corresponding gene is mutated positionally.
  • the template is N6-adeninmethylêt, double-stranded plasmid DNA carrying the gene to be mutated.
  • N6-adenine methylated plasmid DNA is obtained from the dam + £. co // strain isolated, such as E. coli DH5a.
  • the polymerase chain reaction is carried out as described above.
  • the primers are extended complementarily to the template, resulting in plasmids with the desired mutation, which have a strand break.
  • the DNA yield only increases linearly, since newly formed DNA molecules can not serve as templates for the PCR reaction.
  • the PCR product was purified by means of the PCR purification kit (Analytik Jena) and the parent N6-adenine-methylated DNA was digested using the restriction enzyme dpn ⁇ .
  • This enzyme has the peculiarity that it nonspecifically restricts N6 adenine methylated DNA, but not the newly formed, unmethylated DNA.
  • the restriction was carried out by adding 1 ⁇ dpn ⁇ to the purified PCR reaction mixture and incubating for at least 2 h or overnight at 37 ° C.
  • Example 3 Biochemical Characterization of 3 ⁇ and 7 ⁇ -HSDH
  • C plasmid pET28a_7 ⁇ HSDH
  • pET28a_3 ⁇ plasmid pET28a_7 ⁇ HSDH
  • pET28a_3 ⁇ plasmid pET28a_7 ⁇ HSDH
  • pET28a_3 ⁇ plasmid pET28a_7 ⁇ HSDH
  • pET28a_3 ⁇ plasmid pET28a_7 ⁇ HSDH (C) and pET28a_3 ⁇ , respectively.
  • HSDH (N) expressed in E. coli BL21 (DE3) A7a-HSDH.
  • These variants have a C-terminal (7ß HSDH) and N-terminal (3a-HSDH) 6xHis tag, respectively.
  • the crude extract of the disrupted cells was purified by means of Ni-NTA (see Section 2.3) and to have an SDS page for the control of the expression as well as
  • Table 5 Kinetic constants of 3a- and 7ß-HSDH for the substrate 3,7-diketo-UDCA as well as 3-keto-UDCA or 7-KLCA as well as the associated cofactor.
  • UDCA UDCA from 3,7-diketo-UDCA
  • preparations were made with both crude extract (see Section A below) and whole cell biocatalysts (see Section B, below)).
  • concentration of 3,7-diketo-UDCA was 10 mM (with crude extract) or 40 mM (whole cell biocatalysts).
  • FIG. 5 shows that after 20.5 hours, a conversion of about 90% could be detected with the whole-cell biocatalyst E. coli DB03. Furthermore, 10% intermediate 7-KLCA could be detected.
  • the intermediate 3-keto-UDCA accumulated after 5 hours with a share of about 30%, but it was subsequently fully implemented by the 3a-HSDH.
  • NAD NAD H-dependent glucose dehydrogenase from B. subtilis strain 168 (28.07 kDa); underlined twice are the amino acids that were exchanged.
  • NS nucleic acid sequence

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein weiteres chemisch-biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von Ursodesoxycholsaure ausgehend von Chenodesoxycholsäure nach chemischer Oxidation zu 3,7-Diketo- Ursodesoxycholsäure und anschließender Umsetzung mit 7-beta- Hydroxysteroid-Dehydrogenase aus C. aerofaciens und 3-alpha- Hydroxysteroid-Dehydrogenase aus C. testosteroni.

Description

Chemisch-biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von Ursodesoxycholsäure
Die Erfindung betrifft ein verbessertes chemisch-biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von Ursodesoxycholsäure ausgehend von Chenodesoxycholsäure
Hintergrund der Erfindung:
Gallensäuren sind Biomoleküle, die für die Verdauung und Absorption von Fetten, Fettsäuren und hydrophoben Vitaminen erforderlich sind. Eine Gallensäure, die beim Menschen nur in geringen Anteilen vorkommt, ist Ursodesoxycholsäure (als UDCA oder UDCS bezeichnet). Sie hat mittlerweile große therapeutische Bedeutung bei der Auflösung von Cholesterin-haltigen Gallensteinen erlangt.
Zur medikamentösen Behandlung von Gallensteinleiden werden seit vielen Jahren u. a. die Wirkstoffe Ursodesoxycholsäure (UDCS oder UDCA) und das zugehörige Diastereo- mer Chenodesoxycholsäure (CDCS oder CDCA) eingesetzt. Beide Verbindungen unter- scheiden sich lediglich durch die Konfiguration der Hydroxylgruppe am C-Atom 7 (UDCS: ß - Konfiguration, CDCS: a-Konfiguration).
Zur Herstellung von UDCA sind im Stand der Technik verschieden Verfahren beschreiben, welche rein chemisch durchgeführt werden oder aus einer Kombination chemischer und enzymatischer Verfahrensschritte bestehen. Ausgangspunkt ist jeweils Cholsäure (CS oder CA) oder die aus Cholsäure hergestellte CDCA.
Eine wichtige Vorstufe für die Synthese von UDCA ist 12-Ketoursodesoxycholsäure (12-Keto-UDCA), die durch eine Wolff-Kishner-Reduktion in UDCA umgewandelt werden kann. Eine literaturbeschriebene Route zur Synthese von 12-Ketoursodesoxycholsäure startet von Cholsäure (3a,7a,12a-Trihydroxy-5ß-cholansäure), die durch zwei oxidative Schritte, die durch 7a- und 12a-HSDHs katalysiert werden, und einen reduktiven Schritt, katalysiert durch eine 7ß-HSDH, hergestellt werden kann (Bovara R et al. (1996) A new enzymatic route to the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid. Biotechnol. Lett. 18:305-308; Monti D et al. (2009) One-pot multienzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid: Subtle cofac- tor specificities rule the reaction equilibria of five biocatalysts working in a row. Adv. Synth. Catal. 351 :1303-131 1 ).
Eine weitere Route startet von 7-Ketolithocholsäure (7-Keto-LCA), die durch stereoselektive Reduktion der 7-Keto-Gruppe zu UDCA umgesetzt werden kann, auch dieser Schritt wird vorteilhafterweise enzymatisch katalysiert durchgeführt, katalysiert durch eine 7ß-HSDH (Higashi S et al. (1979) Conversion of 7-ketolithocholic acid to ursodeoxycholic acid by human intestinal anaerobic microorganisms: Interchangeability of chenodeoxycholic acid and ursodeoxycholic acid. Gastroenterologia Japonica 14:417-424; Liu L et al. (201 1 ) Identification, cloning, heterologous expression, and characterization of a NADPH- dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Collinsella aerofaciens. Appl. Micro- biol. Biotechnol. 90:127-135.).
Eine weitere günstige Syntheseroute geht von Dehydrocholsäure (DHCA) aus, die durch zwei reduktive Schritte zu 12-Keto-UDCA umgesetzt werden kann, diese beiden Schritte können durch zwei stereoselektive HSDHs (3a- und 7ß-HSDHs) katalysiert werden (Carrea G et al. (1992) Enzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydro- cholic acid in a membrane reactor. Biotechnol. Lett. 14:1 131 -1 135; Liu L et al. (2013) One- step synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid using a multienzy- matic System. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97:633-639).
Die klassisch chemische Methode zur UDCS Herstellung wie folgt schematisch dargestellt werden:
CS CS-Methylester 3 , 7-Diacetyl-C S -methy lester
12-Keto-3 ,7-Diacetyl- CS -methy lester
Figure imgf000003_0003
Figure imgf000003_0001
Ein gravierender Nachteil ist unter anderem folgender: da die chemische Oxidation nicht selektiv ist, müssen die Carboxy-Gruppe und die 3a und 7a-Hydroxy-Gruppe durch Veresterung geschützt werden.
Ein alternatives chemisch/enzymatische Verfahren basierend auf der Verwendung des Enzyms 12a-Hydroxysteroid Dehydrogenase (12a-HSDH) kann wie folgt dargestellt werden und ist z.B. beschrieben in der WO 2009/1 18176der vorliegenden Anmelderin.
12-Keto-CDCS 7-Keto-LCS UDCS
Figure imgf000003_0004
Figure imgf000003_0005
Die 12a-HSDH oxidiert dabei CS selektiv zu 12-Keto-CDCS. Die zwei nach der klassisch chemischen Methode erforderlichen Schützschritte entfallen dabei.
Weiterhin wird von Monti, D., et al., (One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12- Ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009) ein alternatives en- zymatisch-chemisches Verfahren beschrieben, das wie folgt schematisch darstellbar ist:
CS » Γ 7,12-Diketo-LCS
Figure imgf000003_0002
Die CS wird zuerst von 7a-HSDH aus Bacteroides fragilis ATCC 25285 (Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7 -hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis. Tetrahedron, 2006. 62(18): p. 4535-4539) und 12a-HSDH zu 7,12-Diketo-LCS oxidiert. Diese beiden Enzyme sind jeweils NADH abhängig. Nach der Reduktion durch 7ß-HSDH (NADPH abhängig) aus Clostridium absonum ATCC 27555 (DSM 599) (MacDonald, I.A. and P.D. Roach, Bile induction of 7 alpha- and 7 beta- hydroxysteroid dehydrogenases in Clostridium absonum. Biochim Biophys Acta, 1981. 665(2): p. 262-9) entsteht 12-Keto-UDCS. Durch Wolff-Kishner-Reduktion wird das Endprodukt erhalten.
Als 7ß-HSDH hat sich das Enzym aus C. aerofaciens als gut geeignet erwiesen. Mittlerweile ist die Gensequenz dieses Enzyms aus C. aerofaciens bekannt, so dass zum einen das Enzym nach Klonierung rekombinant verfügbar gemacht werden kann, zum anderen besteht die Möglichkeit, mit Methoden des Proteinengineering Mutanten dieses Enzyms zu erzeugen und damit ggf. vorteilhaftere Enzymvarianten aufzufinden. Eine 7ß-HSDH aus Stamm Collinsella aerofaciens ATCC 25986 (DSM 3979; ehemalige Eubacterium aerofaciens) ^^ im Jahr 1982 von Hirano und Masuda beschrieben (Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Pep- tostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Environ Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63). Sequenzinformationen wurden zu diesem Enzym nicht offenbart. Das durch Gelfiltration bestimmte Molekulargewicht betrug 45,000 Da (vgl. Hirano, Seite 1059, linke Spalte). Weiterhin konnte für das dortige Enzym die Reduktion der 7-Oxo-Gruppe zur 7ß-Hydroxygruppe nicht beobachtet werden (vgl. Hirano, Seite 1061 , Diskussion 1 . Absatz), der Fachmann erkennt somit, dass das von Hirano et al beschriebene Enzym nicht zur Katalyse der Reduktion von Dehydrocholsäure (hierin als DHCS oder DHCA bezeichnet) in 7- Position zu 3,12-Diketo-7ß-CS geeignet ist.
In der internationalen Patentanmeldung WO201 1/064404 der Anmelderin wird eine neuartige 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens ATCC 25986 beschrieben, welche unter anderem ein Molekulargewicht (bei SDS-Gelelektrophorese) von etwa 28-32 kDa, ein Molekulargewicht (bei Gelfiltration, unter nicht denaturierenden Bedingungen, wie insbesondere ohne SDS): von etwa 53 bis 60 kDa, und die Befähigung zur stereoselektiven Reduktion der 7-Carbonyl-Gruppe von 7-Keto-LCS in eine 7ß-Hydroxy-Gruppe aufweist.
Außerdem wird in der WO201 1/064404 ein Verfahren zur UDCS Herstellung bereitgestellt, welches schematisch wie folgt darstellbar ist:
DHCS 12-Keto-UDCS
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0002
Dabei erfolgt die Oxidation von CS auf klassisch chemischem Weg in einfacher Wei- se. Die DHCS wird von Enzympaar 7ß-HSDH und 3a-HSDH einzeln nacheinander oder in einem Topf zu 12-Keto-UDCS reduziert. Kombiniert mit der Wolff-Kishner-Reduktion kann UDCS somit in nur drei Schritte aus CS synthetisiert werden. Während die 7ß-HSDH vom Kofaktor NADPH abhängig ist, benötigt die 3a-HSDH den Kofaktor NADH. Die Verfügbarkeit von Enzympaaren mit Abhängigkeit vom gleichen Kofaktor oder erweiterter Anhängigkeit, (z.B. von den Kofaktoren NADH und NADPH) wäre von Vorteil, weil damit die Kofaktor- Regenerierung vereinfacht werden könnte.
Die WO 2012/080504 beschreibt neuartige Mutanten der 7 ß-HSDH aus C. aerofaciens im Sequenzbereich der Aminosäurereste 36 bis 42 der C. aerofaciens Sequenz (SEQ ID NO: 1 1 ), sowie biokatalytische Verfahren zur Herstellung von UDCS, und insbesondere auch neuartige Ganzzell-Verfahren, wobei 7ß-HSDH und 3a-HSDH zusammen auf das Substrat einwirken. Weitere neuartige Mutanten der 7ß-HSDH aus C. aerofaciens sind in der WO2015/197698 und der WO2016/016213 der vorliegenden Anmelderin offenbart
Als 3a-HSDH hat sich das Enzym aus C. testosteroni als gut geeignet erwiesen. Mitt- lerweile ist die Gensequenz dieses Enzyms bekannt, so dass zum einen das Enzym nach Klonierung rekombinant verfügbar gemacht werden kann, zum anderen besteht die Möglichkeit, mit Methoden des Proteinengineering Mutanten dieses Enzyms zu erzeugen und damit ggf. vorteilhaftere Enzymvarianten aufzufinden.
Die WO 2016/023933 beschreibt neuartige Mutanten der 3a-HSDH aus C. testoste- ronii insbesondere in den Mutationspositionen R34, L68 P185, T188 von SEQ ID NO:8 sowie C- und N-terminale His-Tag-Mutanten
Die WO 201 1/147957 beschreibt neuartige knock-out Stämme, die zur Herstellung von UDCA besonders geeignet sind, da die unerwünschte 7a-HSDH Enzymaktivität gezielt ausgeschalten werden konnte.
Hwang et al. erwähnen in PLOS ONE (2013) 8, 5, e63594 speziellen Einfachmutanten (P185A, G oder W; T188A, S oder W) und Doppelmutanten (W173F/P185W und W173F/T188W) der 3a-HSDH aus C. testosteronii. Diese Mutanten, welche N-His-Tags besitzen, werden zur NAD-abhängigen Oxidation des Substrats Androsteron vorgeschlagen. Andere Substrate werden nicht diskutiert.
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zur Herstellung von UDCA in hoher Ausbeute.
Kurzfassung der Erfindung:
Obige Aufgaben konnten überraschenderweise gelöst werden durch die Bereitstel- lung eines zweistufigen Verfahrens zur Herstellung von UDCA aus CDCA gemäß der Definition in den beiliegenden Patentansprüche, wobei CDCA zunächst chemisch zu 3,7-Diketo- UDCA umgesetzt wird und dieses dann biokatalytisch durch in Gegenwart von 7ß-HSDH und 3a-HSDH stereospezifisch in hoher Ausbeute zu UDCA reduziert wird.
Figurenbeschreibung:
Figur 1 zeigt das SDS-Gel der Hydroxysteroid Dehydrogenasen nach Expression in Schüttelkolben-Fermentation in LB-Medium, differenziert in den löslichen Anteil (1 und 4) und in aufgereinigte Fraktion (2 und 3). Als lösliche Fraktion ist der zellfreie Roh extra kt aufgetragen. Es wurden jeweils 10 μg Protein aufgetragen. Die Größe der 3a-HSDH beträgt ca. 26 kDa, die der 7ß-HSDH ca. 29 kDa. 1/2 = 7ß HSDH(C); 3/4 = 3a-HSDH(N); M = Marker (Thermo scientific prestained Ladder).
Figur 2 zeigt die Michaelis-Menten-Kinetik der 3a-HSDH für das Substrat 3,7-Diketo-
UDCA (Bild A), für den Kofaktor NADH (Bild B). sowie für die Zwischenverbindung 3-Keto- UDCA (Bild C). Der Konzentrationsbereich für 3,7-Diketo-UDCA bzw. 3-Keto-UDCA ist zwischen 10 μΜ und 10 mM dargestellt. Für das Coenzym NADH betrug der Konzentrationsbereich 10 bis 300 μΜ. Das Enzym wurde über einen N-terminalen Hexahistidin-Rest aufgerei- nigt und eingesetzt.
Figur 3 zeigt die Michaelis-Menten-Kinetik der 7ß-HSDH für das Substrat 3,7-Diketo- UDCA (Bild A), für den Kofaktor NADPH (Bild B, mit 3,7-Diketo-UDCA als Co-Substrat); Bild D mit 7-KLCA). sowie für die Zwischenverbindung 7-KLCA (Bild C). Der Konzentrationsbereich für 3,7-Diketo-UDCA ist zwischen 10 μηη und 15 mM bzw. 7-KLCA ist zwischen 10 μΜ und 10 mM dargestellt. Für das Coenzym NADPH betrug der Konzentrationsbereich 10 bis 300 μΜ. Das Enzym wurde über einen C-terminalen Hexahistidin-Rest aufgereinigt und eingesetzt.
Figur 4 zeigt die Umsetzung von 3,7-Diketo-UDCA zu UDCA nach 16 Stunden bei verschiedenen pH-Werten.
Figur 5 zeigt die Umsetzung mit 40 mM 3,7-Diketo-UDCA und dem Ganzzellbiokatalysator £. coli DB03.
Figur 6 zeigt die Umsetzung mit 40 mM 3,7-Diketo-UDCA und dem Ganzzellbiokatalysator £. coli DB02.
Figur 7 zeigt ein vollständiges Reaktionsschema einer bevorzugten Variante des er- findungsmäßen chemisch/enzymatischen Verfahrens zur Herstellung von UDCA aus CDCA, wobei der Kofaktor-Regeneration mittels einer GDH erfolgt, die sowohl NAD+ als auch NADP+ bei der enzymatischen Oxidation von Glucose zu Glucono-1 ,5-lacton unter Regenerierung von verbrauchtem NADH bzw. NADPH utilisiert.
Spezielle Ausführungsformen der Erfindung Die Erfindung betrifft insbesondere folgende spezielle Ausführungsformen:
1 . Verfahren zur Herstellung einer Ursodesoxycholsaure (UDCA) der Formel (1 )
Figure imgf000007_0001
R für Alkyl, H, ein Alkalimetallion oder N(R3)4 + , steht, worin die Reste R3 gleich oder verschieden sind und für H oder Alkyl stehen, oder wobei die Gruppe -C02R durch eine Säu- reamid-Gruppe der Formel -ONR1R2 ersetzt ist, worin R1 und R2 unabhängig voneinander für einen Alkylrest stehen, und R insbesondere für H steht,
wobei man
a) eine Chenodesoxycholsäure (CDCA) der Formel (2)
Figure imgf000007_0002
worin R oder die Gruppe -C02R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
zu einer 3,7-Diketo-Ursodeoxycholsäure (3,7-Diketo -UDCA) der Formel (3)
Figure imgf000007_0003
worin R oder die Gruppe -C02R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, chemisch oxidiert; und das gebildete 3,7-Deketo-UDCA gegebenenfalls aufreinigt, b) die in Stufe a) gebildete 3,7-Diketo-UDCA der Formel (3) in Gegenwart wenigstens einer 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (7ß-HSDH) und in Gegenwart wenigstens einer 3a- Hydroxysteroiddehydrogenase (3a-HSDH) zur UDCA-Verbindung der obigen Formel (1 ) enzymatisch reduziert, und das Reaktionsprodukt gegebenenfalls weiter aufreinigt.
2. Verfahren nach Ausführungsform 1 , wobei man in Stufe a) eine chemische Oxi- dation unterzieht, wobei das eingesetzte Oxidationsmittel zur Oxidation einer sekundären Hydroxylgruppe befähigt ist. 3. Verfahren nach Ausführungsform 2, wobei der Oxidationsschritt ausgewählt ist unter einer SWERN-Oxidation und einer TEMPO-Oxidation und insbesondere einer Oxidation mittels Natriumhypochlorit.
4. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man Stufe b) in Gegenwart und unter Verbrauch von Reduktionsäquivalenten (NADH und/oder
NADPH) durchführt.
5. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die in Stufe b) verwendeten 3a-HSDH und 7ß-HSDH gleiche oder verschiedene Kofaktor-Spezifität be- sitzen.
6. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man Stufe b) zur Kofaktor-Regeneration mit wenigstens einem weiteren, die verbrauchten Regenerationsäquivalente regenerierenden Enzym koppelt.
7. Verfahren nach Ausführungsform 6, wobei verbrauchtes NADPH durch Kopplung mit einem NADPH-regenerierenden Enzym regeneriert wird, wobei dieses insbesondere ausgewählt ist unter NADPH Dehydrogenasen, Alkoholdehydrogenasen (ADH), und NADPH regenerierenden Formiatdehydrogenasen (FDH) und einer NADPH-regenerierenden Glu- cosedehydrogenase (GDH) sowie NADPH-regenerierenden Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenasen (G6PDH); und/oder wobei verbrauchtes NADH durch Kopplung mit einem NADH-regenerierenden Enzym regeneriert wird, wobei dieses insbesondere ausgewählt ist unter NADH-Dehydrogenasen, NADH-regenerierenden Formiatdehydrogenasen (FDH), NADH-regenerierenden Alkohol- dehydrogenasen (ADH), NADH-regenerierenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), NADH-regenerierenden Phosphitdehydrogenasen (PtDH) sowie NADH- regenerierenden Glucosedehydrogenasen (GDH); und/oder wobei verbrauchtes NADH und/oder verbrauchtes NADPH durch Kopplung mit einem beide Kofaktoren regenerierenden Enzym, ausgewählt unter einer NAD(P)H regenerierenden GDH regeneriert wird.
8. Verfahren nach Ausführungsform 7, wobei verbrauchtes NADH und/oder verbrauchtes NADPH durch Kopplung mit einem beide Kofaktoren regenerierenden thermostabilen Mutante einer GDH aus Bacillus subtilis regeneriert wird, insbesondere der E170K,Q262L-Doppelmutante (vgl. Väzquez-Figueroa, Eduardo; Chaparro-Riggers, Javier; Bommarius, Andreas S., Chembiochem, 2007, 8, 2295-2301 ) gemäß SEQ ID NO: 14
9. Verfahren nach Ausführungsform 7 oder 8, wobei man dem Reaktionsmedium Glucose als Substrat für die GDH zusetzt. 10. Verfahren nach Ausführungsform 9, wobei man dem Reaktionsmedium zusätzlich NAD+ und/oder NADP+ zusetzt, um (zusätzliche) Reduktionsäquivalente für die enzyma- tische Umsetzung zur 3,7-Deketo-UDCA-Verbindung der Formel (3) gemäß Stufe b) zu generieren. 1 1 . Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Stufe b) mit isolierten, oder angereicherten Enzymen (7ß-HSDH, die 3a-HSDH und gegebenenfalls das zu Kofaktor-Regenerierung benötigte Enzym) oder mit Zell-Rohextrakt (enthaltend die 7ß-HSDH, die 3a-HSDH und gegebenenfalls das zu Kofaktor-Regenerierung benötigte Enzym) oder mit rekombinanten Mikroorganismen durchgeführt wird, welche die 7ß-HSDH, die 3a-HSDH und gegebenenfalls das zu Kofaktor-Regenerierung benötigte Enzym funktional exprimieren, und vorzugsweise eine 7ß-HSDH, eine 3a-HSDH und das (die) zu Kofaktor-Regenerierung benötigte Enzym (benötigten Enzyme) funktional exprimiert .
12. Verfahren nach Ausführungsform 1 1 , wobei das man einen rekombinanten Mik- roorganismus verwendet, in welcher unerwünschte Nebenaktivität einer 7a-HSDH inhibiert ist. 13. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die 7ß-
HSDH ausgewählt ist unter folgenden Enzymen und Enzymmutanten, wobei das nichtmu- tierte Enzym eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 1 aufweist:
Figure imgf000010_0001
WT = Wildtyp; S = Einfachmutation; D = Doppelmutation; T = Dreifachmutation; Q = Vierfachmutation
'Angabe des ausschließlich bzw. bevorzugt utilisierten Kofaktors (wobei auch die oxidierte Form des entsprechenden Kofaktors mitumfasst ist)
mitumfasst sind dabei Varianten, die C- und/oder N-terminal, mit einer His-Tag-Sequenz verlängert sind; und wobei die obigen Mutanten zusätzlich in jeder der Positionen K44, R53, K61 , R64 zusätzlich mutiert sein können.
14. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die 3a- HSDH ausgewählt ist unter folgenden Enzymen und Enzymmutanten, wobei das nichtmu- tierte Enzym eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 aufweist.
Figure imgf000011_0001
''Angabe des ausschließlich bzw. bevorzugt utilisierten Kofaktors (wobei auch die oxidierte Form des entsprechenden Kofaktors mitumfasst ist)
WT = Wildtyp; S = Einfachmutation; D = Doppelmutation
mitumfasst sind dabei Mutanten, die C- und/oder N-terminal, mit einer His-Tag-Sequenz verlängert sind.
15. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei folgende Enzymkombinationen verwendet werden
3a-HSDH 7ß-HSDH GDH
C. testosteroni C. aerofaciens B. subtilis
1 WT ggf. mit N-His-Tag WT ggf. mit C-His-Tag SEQ ID NO: 12 Mutante
2 T188A, S, V, G oder W WT ggf. mit C-His-Tag SEQ ID NO: 12 Mutante 3a-HSDH 7ß-HSDH GDH
C. testosteroni C. aerofaciens B. subtilis
3 T188A, S, V, G oder W G39S/R64E ggf. mit C-His-Tag SEQ I D NO: 12 Mutante
4 WT ggf. mit N-His-Tag G39S/R64E ggf. mit C-His-Tag SEQ I D NO: 12 Mutante
WT = Wildtyp
In obigem Verfahren kann die Umsetzungen des Schritts b) in Gegenwart eines re- kombinanten Mikroorganismus (wie unter weiter definiert) erfolgen, wie z.B. in Gegenwart ganzer Zellen eines oder mehrerer verschiedener rekombinanter Mikroorganismen erfolgen, wobei der/die Mikroorganismen die zur Umsetzung und Kofaktorregenerierung erforderlichen Enzyme in einer hierin näher beschriebenen Weise tragen.
Der Verfahrensschritt b) kann dabei unterschiedlich ausgestaltet sein. Entweder können beide Enzyme (7ß-HSDH-Mutante und 3a-HSDH) gleichzeitig zugegen sein (z.B. Ein- Topf-Reaktion mit beiden isolierten Enzymen oder ein oder mehrere entsprechende rekom- binante Mikroorganismen sind zugegen, der beide Enzyme exprimiert), oder die Teilreaktionen können in beliebiger Reihenfolge (erst die 7ß-HSDH-Mutante-katalysierte Reduktion und dann die 3a-HSDH-katalysierte Reduktion; oder erst die 3a-HSDH -katalysierte Reduktion und dann die 7ß-HSDH-Mutante -katalysierte Reduktion) ablaufen.
Weiterhin kann Schritt b) mit einem Kofaktorregenerierungssystem gekoppelt sein, bei welchem NADPH durch ein NADPH regenerierendes Enzym, wie insbesondere einer GDH unter Verbrauch von Glucose regeneriert wird (insbesondere wenn eine 7ß-HSDH und 3a-HSDH eingesetzt werden die beide NADPH utilisieren); oder mit einem Kofaktorregenerierungssystem gekoppelt ist, bei welchem verbrauchtes NADH durch ein NADH regenerie- rendes Enzym, wie insbesondere einer GDH, ADH oder FDH regeneriert wird (insbesondere wenn eine 7ß-HSDH und 3a-HSDH eingesetzt werden die beide NADH utilisieren);.
Weiterhin kann Schritt b) mit einem Kofaktorregenerierungssystem gekoppelt sein, bei welchem NADPH und NADH durch ein sowohl NADPH als auch NADH regenerierendes Enzym, wie insbesondere einer GDH unter Verbrauch von Glucose regeneriert werden (ins- besondere wenn eine 7ß-HSDH und 3a-HSDH eingesetzt werden die verschiedene Kofakto- ren utilisieren.
16. Rekombinanter Mikroorganismus gemäß, der Definition in einer der Ausführungsformen 1 1 und 12.
17. Bioreaktor zur Durchführung eines Verfahrens nach einer der Ausführungsformen
1 bis 15, insbesondere enthaltend wenigstens eines der in Stufe b) verwendeten Enzyme. Vorliegende Erfindung ist nicht auf die hierin beschriebenen konkreten Ausführungsformen beschränkt. Der Fachmann wird durch die Lehre der vorliegenden Erfindung vielmehr in die Lage versetzt, ohne unzumutbaren Aufwand weitere Ausgestaltungen der Erfin- dung bereitzustellen. So kann er beispielsweise auch weitere Enzymmutanten gezielt generieren und diese auf das gewünschte Eigenschaftsprofil screenen und optimieren; oder weitere geeignete Wildtypenzyme (7ß- und 3a-HSDHs, FDHs, GDHs ADHs usw.) isolieren und erfindungsgemäß verwenden. Weiterhin kann er beispielsweise je nach Eigenschaftsprofil (insbesondere Kofaktor-Abhängigkeit) der verwendeten HSDHs, wie insbesondere 7ß- HSDH und 3a-HSDH oder Mutanten davon, geeignete zur Kofaktorregenerierung brauchbare Dehydrogenasen (GDH, FHD, ADH usw.) und Mutanten davon auswählen, und die ausgewählten Enzyme auf einen oder mehrere Expressionskonstrukte oder Vektoren verteilen und damit erforderlichenfalls einen oder mehrere rekombinante Mikroorganismen erzeugen, die dann ein weiter optimiertes enzymatisches oder insbesondere ganzzellbasiertes Herstel- lungsverfahren von UDCA ermöglichen.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung
1 . Allgemeine Definitionen und verwendete Abkürzungen
Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „7ß-HSDH" ein Dehydrogenase-Enzym, welches wenigstens die stereospezifische und/oder regiospezifi- sche Reduktion von DHCS oder 7,12-Diketo-3a-CS (7,12-Diketo-LCS) zu 3,12-Diketo-7ß- CS oder 12-Keto-UDCS insbesondere unter stöchiometrischem Verbrauch von NADPH, und gegebenenfalls die entsprechende Umkehrreaktion katalysiert. Das Enzym kann dabei ein natives bzw. rekombinant hergestelltes Enzym sein. Das Enzym kann grundsätzlich im Ge- misch mit zellulären, wie z.B. Proteinverunreinigungen, vorzugsweise aber in Reinform vorliegen. Geeignete Nachweisverfahren sind z.B. im folgenden experimentellen Teil beschrieben oder aus der Literatur bekannt (z.B. Characterization of NADP-dependent 7 beta- hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aero- faciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982). Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Nummer 1.1 .1.201 klassifiziert. Geeignete Enzyme sind z.B. aus Colinseilea aerofaciens isolierbar.
Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „3a-HSDH" ein Dehydrogenase-Enzym, welches wenigstens die stereospezifische und/oder regiospezifi- sche Reduktion von 3,12-Diketo-7ß-CS oder DHCS zu 12-Keto-UDCS oder 7,12-Diketo-3a- CS (7,12-Diketo-LCS), insbesondere unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH und/oder NADPH, und gegebenenfalls die entsprechende Umkehrreaktion katalysiert. Geeignete Nachweisverfahren sind z.B. im folgenden experimentellen Teil beschrieben oder aus der Literatur bekannt. Geeignete Enzyme sind z.B. aus Comanomonas testosteroni (i.e. Comamonas testosteroni) (z.B. ATCC1 1996) erhältlich. Eine NADPH abhängige 3a-HSDH ist z.B. aus der Nagern bekannt und ebenfalls einsetzbar. (Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha-hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase, J E Pawlowski, M Huizinga and T M Penning, May 15, 1991 The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820- 8825). Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Nummer 1.1.1.50 klassifiziert.
Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „GDH" ein De- hydrogenase-Enzym, welches wenigstens die Oxidation von ß-D-Glucose zu D-Glucono-1 ,5- Lacton unter stöchiometrischem Verbrauch von NAD+ und/oder NADP+ sowie ggf. die ent- sprechende Umkehrreaktion katalysiert. Geeignete Enzyme sind z.B. aus Bacillus subtilis oder Bacillus megaterium erhältlich. Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Nummer 1 .1 .1 .47 klassifiziert.
Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „FDH" ein De- hydrogenase-Enzym, welches wenigstens die Oxidation von Ameisensäure (oder korres- pondierenden Formiat-Salzen) zu Kohlendioxid unter stöchiometrischem Verbrauch von NAD+ und/oder NADP+, und gegebenenfalls die entsprechende Umkehrreaktion katalysiert. Geeignete Nachweisverfahren sind z.B. im folgenden experimentellen Teil beschrieben oder aus der Literatur bekannt. Geeignete Enzyme sind z.B. aus Candida boidinii, Pseudomonas sp, oder Mycobacterium vaccae erhältlich. Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Num- mer 1.2.1 .2 klassifiziert.
Unter einer„Reinform" oder einem „reinen" oder„im wesentlichen reinen" Enzym versteht man erfindungsgemäß ein Enzym mit einem Reinheitsgrad von mehr als 80, vorzugsweise mehr als 90, insbesondere mehr als 95, und vor allem mehr als 99 Gew.-%, bezogen auf den Gesamtproteingehalt, bestimmt mit Hilfe üblicher Proteinnachweismethoden, wie .z.B. der Biuret- Methode oder dem Proteinnachweis nach Lowry.et al.(vgl Beschreibung in R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)).
Unter einem„Redoxäquivalent" versteht man eine als Elektronendonor bzw. Elektronenakzeptor brauchbare, niedermolekulare organische Verbindung, wie beispielsweise Niko- tinamidderivate wie NAD+ und NADH+ bzw. deren reduzierte Formen NADH bzw. NADPH. „Redoxäquivalent" und„Kofaktor" werden im Kontext der vorliegenden Erfindung als Synonym verwendet. So kann ein „Kofaktor" im Sinne der Erfindung auch als „redoxfähiger Kofaktor", d.h. als Kofaktor, der in reduzierter und einer oxidierter Form vorliegen kann, umschrieben werden.
Unter einem„verbrauchten" Kofaktor versteht man diejenige reduzierte bzw. oxidierte Form des Kofaktors, die im Verlauf einer vorgegebene Reduktions- bzw. Oxidationsreaktion eines Substrats in die korrespondierende oxidierte bzw. reduzierte Form überführt wird. Durch Regenerierung wird die bei der Reaktion gebildete oxidierte bzw. reduzierte Kofaktor- Form wieder in die reduzierte bzw. oxidierte Ausgangsform zurück überführt, so dass diese für die Umsetzung des Substrats wieder zur Verfügung steht.
Unter einer„veränderten Kofaktor-Nutzung versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine qualitative oder quantitative Veränderung im Vergleich zu einer Refe- renz. Insbesondere ist eine veränderte Kofaktor-Nutzung durch Vornahme von Aminosäuresequenzmutationen zu beobachten. Diese Veränderung ist dann im Vergleich zum nicht- mutierten Ausgangsenzym feststellbar. Dabei kann die Aktivität in Bezug auf einen bestimmten Kofaktor durch Vornahme einer Mutation erhöht oder erniedrigt werden oder vollständig unterbunden werden. Eine veränderte Kofaktor-Nutzung umfasst aber auch Änderungen dergestalt, dass anstelle einer Spezifität für einen einzelnen Kofaktor nunmehr wenigstens ein weiterer, vom ersten Kofaktor verschiedener, zweiter Kofaktor nutzbar ist (d.h. es liegt eine erweiterte Kofaktor-Nutzung vor) Umgekehrt kann aber auch eine ursprünglich vorhandene Befähigung zur Nutzung zweier verschiedener Kofaktoren so abgeändert werden, dass Spezifität nur für einen dieser Kofaktoren erhöht bzw. für einen dieser Kofaktoren verringert oder vollständig aufgehoben wird. So kann beispielsweise ein Enzym, das vom Kofaktor NAD (NADH) abhängig ist, aufgrund einer Veränderung der Kofaktor-Nutzung nunmehr sowohl von NAD (NADH) als auch vom Kofaktor NADP (NADPH) abhängig sein oder die ursprüngliche Abhängigkeit von NAD (NADH) kann vollständig in eine Abhängigkeit von NADP (NADPH) überführt werden und umgekehrt.
Die Begriffe „NADVNADH-Abhängigkeit" bzw. „NADPVNADPH-Abhängigkeit" sind erfindungsgemäß, wenn nicht anders definiert, weit auszulegen. Diese Begriffe umfassen sowohl „spezifische" Abhängigkeiten, d.h. ausschließlich Abhängigkeit von NAD7NADH bzw. NADP7NADPH, als auch die Abhängigkeit der erfindungsgemäß verwendeten Enzyme von beiden Kofaktoren, d.h. Abhängigkeit von NAD7NADH und NADP7NADPH.
Entsprechendes gilt für die verwendeten Begriffe„NAD7NADH-akzeptierend" bzw.
„NADPVNADPH-akzeptierend".
Die Begriffe„NAD7NADH-regenerierend" bzw.„NADP7NADPH-regenerierend" sind erfindungsgemäß, wenn nicht anders definiert, weit auszulegen. Diese Begriffe umfassen sowohl „spezifische" d.h. ausschließliche Befähigung verbrauchten Kofaktor NAD7NADH bzw. NADP7NADPH zu regenerieren, als auch die Befähigung beide Kofaktoren, d.h. NAD7NADH und NADP7NADPH, zu regenerieren.
„Proteinogene" Aminosäuren umfassen insbesondere (Einbuchstaben-Code): G, A, V, L, I, F, P, M, W, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R und H.
Unter einer „Immobilisierung" versteht man erfindungsgemäß die kovalente oder nicht-kovalente Bindung eines erfindungsgemäß verwendeten Biokatalysators, wie z.B. einer 7ß-HSDH an einem festen, d.h. in dem umgebenden flüssigen Medium im Wesentlichen unlöslichen, Trägermaterial. Erfindungsgemäß können entsprechend auch ganze Zellen, wie die erfindungsgemäß verwendeten, rekombinanten Mikroorganismen, mit Hilfe derartiger Träger immobilisiert sein.
Eine„im Vergleich zum nicht-mutierten Enzym verringerte Substratinhibition" bedeutet, dass das die beim nicht-mutierten Enzym für ein bestimmtes Substrat beobachtete Sub- stratinhibition nicht mehr zu beobachten ist, d.h. im Wesentlichen nicht mehr messbar ist, oder erst bei höherer Substratkonzentration einsetzt, d.h. der KrWert erhöht ist.
Erfindungsgemäße N- oder C-terminale Verlängerungen umfassen etwa 15 bis 25 proteinogene Aminosäurereste, welche, gegebenenfalls reversibel, z.B. über eine Protease -Schnittstelle, an einen terminalen Aminosäurerest angehängt sind. Bevorzugte Reste um- fassen sogenannte an sich bekannte„His-Tags" mit z.B. 3, 6 oder 9 konsekutiven Histidin- resten in der Verlängerungssequenz.
Unter einer„Cholsäure-Verbindung" versteht man erfindungsgemäß Verbindungen mit dem Kohenstoffgrundgerüst, insbesondere der Steroidstruktur der Cholsäure und dem Vorhandensein von Keto- und/oder Hydroxy- oder Acyloxy-Gruppen in der Ringposition 7 und gegebenenfalls den Ringpositionen 3 und/oder 12.
Unter einer Verbindung eines speziellen Typs, wie z.B. einer„Cholsäure-Verbindung" oder einer„Ursodesoxycholsäure-Verbindung" versteht man insbesondere auch Derivate der zugrunde liegenden Ausgangsverbindung (wie z.B. Cholsäure oder Ursodesoxycholsäure).
Derartige Derivate umfassen„Salze", wie z.B. Alkalimetallsalze wie Lithium-, Natri- um- und Kaliumsalze der Verbindungen; sowie Ammoniumsalze, wobei man unter einem Ammoniumsalz das NH4 +-Salz bzw. solche Ammoniumsalze umfasst, worin wenigstens ein Wasserstoffatom durch einen CrC6-Alkylrest ersetzt sein kann. Typische Alkylreste sind insbesondere CrC4-Alkylreste, wie Methyl, Ethyl, n- oder i-Propyl-, n-, sec- oder tert-Butyl, sowie n-Pentyl und n-Hexyl und die ein- oder mehrfach verzweigten Analoga davon
„Alkylester" erfindungsgemäßer Verbindungen sind insbesondere Niedrigalkyl-Ester, wie z.B. CrC6-Alkylester. Als nicht limitierende Beispiele sind zu nennen Methyl-, Ethyl-, n- oder i-Propyl-, n-, sec- oder tert-Butylester, oder längerkettige Ester, wie z.B. n-Pentyl- und n-Hexylester sowie die ein- oder mehrfach verzweigten Analoga davon.
„Amide" sind insbesondere Umsetzungsprodukte erfindungsgemäßer Säuren mit Ammoniak oder primären oder sekundären Monoaminen. Derartige Amine sind beispielsweise Mono- oder Di-Ci-C6-Alkyl-monoamine, wobei die Alkylreste unabhängig voneinander gegebenenfalls weiter substituiert sein können, wie z.B. durch Carboxy-, Hydroxy-, Halogen (wie F, Cl, Br, J)-, Nitro- und Sulfonatgruppen.
Erfindungsgemäße„Acylgruppen" sind insbesondere nichtaromatische Gruppen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Acetyl, Propionyl und Butyryl, sowie aromatische Gruppen mit gegebenenfalls substituiertem einkernigen aromatischem Ring, wobei geeignete Substituenten z.B. ausgewählt sind unter Hydroxy-, Halogen (wie F, Cl, Br, J)-, Nitro- und Ci-C6-Alkylgruppen, wie z.B. Benzoyl oder Toluoyl.
Die erfindungsgemäß eingesetzten bzw. hergestellten Hydroxysteroidverbindungen, wie z.B. Cholsäure, Ursodesoxycholsäure, 12-Keto-Chenodesoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure und 7-Keto-Lithocholsäure können in stereoisomerenreiner Reinform oder im Gemisch mit anderen Stereoisomeren im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt oder daraus erhalten werden. Vorzugsweise werden jedoch die eingesetzten bzw. die hergestellten Verbindungen in im Wesentlichen stereoisomerenreiner Form eingesetzt bzw. isoliert.
In folgender Tabelle sind die Strukturformeln, deren chemischen Namen und die verwendeten Abkürzungen wesentlicher chemischer Verbindungen tabellarisch zusammen- gefasst:
Figure imgf000018_0001
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2. Proteine
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die konkret offenbarten Proteine bzw. Enzyme mit 7ß-HSDH-, FDH-, ADH- GDH- oder 3a-HSDH Aktivität bzw. deren Mutanten beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf funktionale Äquivalente davon.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. 7ß HSDH-Aktivität, besitzen.
So versteht man beispielsweise unter„funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die im verwendeten Test auf 7ß-HSDH-, ADH-, FDH-, GDH- oder 3a-HSDH -Aktivität eine um mindestens 1 % , wie z.B. mindestens 10% oder 20 %, wie z.B. mindestens 50 % oder 75% oder 90 % höhere oder niedrigere Aktivität eines Ausgangs-Enzyms, umfassend eine hierin definierte Aminosäuresequenz aufweisen.
Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 1 1 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum in einem Bereich von pH 6 bis 10, wie insbesondere 8,5 bis 9,5, sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 15°C bis 80°C oder 20°C bis 70°C, wie z.B. etwa 45 bis 60°C oder etwa 50 bis 55°C.
Die 7ß-HSDH-Aktivität kann mit Hilfe verschiedener bekannter Tests nachgewiesen werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, sei ein Test unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. CS oder DHCS, unter standardisierten Bedingungen wie im experimentellen Teil definiert, zu nennen.
Tests zur Bestimmung der ADH-, FDH-, GDH-, 7ß-HSDH- oder 3a-HSDH -Aktivität sind ebenfalls an sich bekannt. Unter„funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch „Mutanten", welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" um- fassen somit die durch eine oder mehrere, wie z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 oder 15, Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitäts- muster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zusammenge- fasst:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin; His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn ; Gin
lle Leu; Val
Leu lle; Val
Lys Arg ; Gin ; Glu
Met Leu ; lle
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
Val lle; Leu
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch„Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie„funktionale Derivate" und„Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität.
Unter dem Ausdruck„Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfas- sen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanola- min, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umset- zung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxylgruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise las- sen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller Nieder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige hete- rologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Histidin-Anker oder Enzyme.
Erfindungsgemäß mit umfasste„funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, Homologie (bzw. Identität) zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie bzw. Identität eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
Die prozentualen Identitätswerte können auch anhand von BLAST Alignments, Algo- rithmus blastp (protein-protein BLAST), oder durch Anwendung der unten angegebenen Clustal Einstellungen ermittelt werden.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße„funkti- onale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosy- lierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Muta- genese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, un- ter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1 -7815; Delgrave et al. (1993) Protein Enginee- ring 6(3):327-331 ).
2.1 7ß-HSDHs: 2.1 .1 Die Erfindung umfasst weiterhin die Anwendung des 7ß-HSDH-Wildtyps aus Collin- sella aerofaciens ATCC 25986, wie er in der WO2011/064404 der Anmelderin beschrieben ist, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Dieser aus Collinsella aerofaciens DSM 3979 erhältliche 7ß-HSDH ist insbesondere durch wenigstens eine weitere der folgenden Eigenschaften, wie z.B. 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 oder aller solcher Eigenschaften, gekennzeichnet:
a) Molekulargewicht (SDS-Gelelektrophorese): etwa 28-32 kDa, insbesondere etwa 29 bis 31 kDa oder etwa 30 kDa;
b) Molekulargewicht (Gelfiltration, unter nicht denaturierenden Bedingungen, wie ins- besondere ohne SDS): etwa 53 bis 60 kDa, insbesondere etwa 55 bis 57 kDa , wie 56.1 kDa. Dies belegt die dimere Beschaffenheit der 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens DSM 3979;
c) Stereoselektiven Reduktion der 7-Carbonyl-Gruppe von 7-Keto-LCS in eine 7ß- Hydroxy-Gruppe;
d) pH Optimum für die Oxidation von UDCS im Bereich von pH 8,5 bis 10,5, insbesondere 9 bis 10;
e) pH Optimum für die Reduktion von DHCS und 7-Keto-LCS im Bereich von pH 3,5 bis 6,5, insbesondere bei pH 4 bis 6;
f) wenigstens einen kinetischen Parameter aus folgender Tabelle für wenigstens ei- nes der dort genannten Substrate/Kofaktoren; im Bereich von ±20%, insbesondere ±10%,
±5%, ±3% ±2% oder ±1 % um den in der folgenden Tabelle jeweils konkret genannten Wert.
Figure imgf000024_0001
konnten aufgrund der sehr geringen Aktivität nicht bestimmt werden
1 U = 1 μη"ΐοΙ/η"ΐίη g) Phylogenetische Sequenzverwandtschaft der prokaryotischen 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens DSM 3979 mit der tierischen 1 1 ß-HSDH-Untergruppe, umfassend Cavia porcellus, Homo sapiens und Mus musulus, verwandt.
Beispielsweise zeigt diese 7ß-HSDH folgende Eigenschaften oder Kombinationen von Eigenschaften; a); b); a) und b); a) und/oder b) und c); a) und/oder b) und c) und d); a) und/oder b) und c) und d) und e); a) und/oder b) und c) und d) und e) und f).
Eine derartige 7ß-HSDH oder davon abgeleitetes funktionales Äquivalent ist zudem gekennzeichnet durch
a. die stereospezifische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7ß- Hydroxysteroid, und/oder
b. die regiospezifische Hydroxylierung eines Ketosteroids umfassend eine Ketogruppe in 7-Position und wenigstens eine weitere Ketogruppe am Steroidgerüst zum korrespondierenden 7ß-Hydroxysteroid, wie insbesondere von Dehydrocholsäure (DHCS) in 7-Position zur korrespondierenden 3,12-Diketo-7ß-Cholansäure, katalysiert, und z.B. NADPH abhängig ist.
Eine derartige 7ß-HSDH hat insbesondere eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 1 (Accession NO: ZP_01773061 ) oder eine davon abgeleiteten Sequenz mit einem Identitätsgrad von wenigstens 60%, wie z.B. wenigstens 65, 70, 75, 80, 85, oder 90, wie z.B. wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% zu dieser Sequenz; gegebenenfalls zusätzlich gekennzeichnet durch eine der folgende Eigenschaften oder Kombinationen von Eigenschaften; a); b); a) und b); a) und/oder b) und c); a) und/oder b) und c) und d); a) und/oder b) und c) und d) und e); a) und/oder b) und c) und d) und e) und f) gemäß obiger Definition.
2.1 .2 Die Erfindung umfasst weiterhin die Anwendung 7ß-HSDH-Mutanten wie er in der WO2012/080504 der Anmelderin beschrieben ist, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Insbesondere sei auf folgende spezielle Ausführungsformen Bezug genommen::
(1 ) Eine 7ß-HSDH-Mutante, welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7-Hydroxysteroid katalysiert, wobei die Mutante im Vergleich zum nicht-mutierten Enzym, wie insbesondere ein Enzym umfassend SEQ ID NO:1 1 und/oder wenigstens das Sequenzmotiv VMVGRRE gemäß Position 36 bis 42 davon, eine verringerte Substratinhibition (insbesondere für das 7-Ketosteroid- Substrat) aufweist; und/oder eine veränderte Kofaktor-Nutzung (z.B. erhöhte, veränderte Spezifität bezüglich eines Kofaktors (insbesondere NADH bzw. NADPH) oder eine erweiter- te Abhängigkeit, das heißt Nutzung eines zusätzlichen, bisher nicht genutzten Kofaktors) aufweist, insbesondere eine solche Mutante, die keine Substratinhibition zeigt oder die einen KrWert für das 7-Ketosteroid-Substrat, insbesondere für Dehydrocholsäure (DHCS), im Be- reich von >10 mM, wie z.B. bei 1 1 bis 200 mM, 12 bis 150 mM, 15 bis 100 mM, aufweist.
(2) Eine Mutante nach (1 ), wobei die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des Kofaktors NADPH im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5 oder 10 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 -fache, insbesondere um das 2- bis 10-fache erhöht oder erniedrigt ist; oder im Wesentlichen fehlt und durch die Nutzung von NADH ersetzt ist, oder eine erweiterte Nutzung von NADPH und HADH aufweist).
(3) Eine 7ß-HSDH-Mutante, welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Re- duktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7-Hydroxysteroid katalysiert, gegebenenfalls nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Mutante wenigstens eine Mutation in der Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 1 oder einer davon abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 60% Sequenzidentität, wie z.B. wenigstens 65, 70, 75, 80, 85, oder 90, wie z.B. wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% zu dieser Sequenz.
(4) Eine 7ß-HSDH-Mutante, welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7-Hydroxysteroid katalysiert, gegebenenfalls nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Mutante wenigstens eine Mutation im Sequenzmotiv VMVGRRE gemäß Position 36 bis 42 von SEQ ID NO:1 1 oder in dem korrespondierenden Sequenzmotiv einer davon abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 60% Sequenzidentität aufweist, wie z.B. wenigstens 65, 70, 75, 80, 85, oder 90, wie z.B. wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% zu dieser Sequenz.
(5) Mutante nach (3) oder (4), ausgewählt unter
a) den Einfachmutanten G39Xi und R40X2.,
b) den Zweifach-Mutanten (G39Xi, R40X2), (R40X2, R41X3) und (G39Xi, R41X3) o- der
c) der Dreifach-Mutante (G39Xi, R40X2, R41X3),
(jeweils bezogen auf SEQ ID NO:1 1 )
wobei X-i, X2 und X3 jeweils unabhängig voneinander für eine beliebige, insbesondere eine beliebige, die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor-Abhängigkeit modifizierende, von G bzw. R verschiedene, insbesondere natürliche Aminosäure stehen;
oder
d) den korrespondierenden Einfach-, Zweifach- oder Dreifach-Mutanten einer von SEQ ID NO:1 1 abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 60% Sequenzidentität, wie z.B. wenigstens 65, 70, 75, 80, 85, oder 90, wie z.B. wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% zu dieser Sequenz. Beispiele geeigneter Einfachmutanten umfassen: G39A, G39S, G39D, G39V, G39T, G39P, G39N, G39E, G39Q, G39H, G39R, G39K und G39W, und R40D, R40E, R40I, R40V, R40L, R40G, R40A.
Beispiele geeigneter Doppelmutanten umfassen:
Zweierkombinationen obiger G39Xi und R40X2-Mutanten, wobei Xi insbesondere für D oder E steht und/oder X2 eine beliebige Aminosäure, insbesondere proteinogene Aminosäure, wie insbesondere eine Aminosäure mit aliphatischer Seitenkette sein kann, wie z.B. (G39D,R40I), (G39D,R40L), (G39D,R40V); sowie die analogen Doppelmutanten mit G39E anstelle von G39D; sowie
Zweierkombinationen obiger G39XrMutanten oder R40X2-Mutanten mit R41X3-Mutanten, worin X3 eine beliebige, insbesondere eine die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktorabhängigkeit modifizierende, von R verschiedene insbesondere natürliche Aminosäure ist, wie z.B. des Typs (G39Xi,R41 X3) oder (R40X2,R41X3), z.B. mit Xi=D oder E; X2=l, L oder V; X3= N, I, L oder V)
wie z.B. (R40D,R41 I); (R40D,R41 L); (R40D,R41V); (R40I,R41 I); (R40V,R41 I), (R40L,R41 I).
Beispiele geeigneter Dreifachmutanten umfassen beliebige Dreier-Kombinationen obiger Einfachmutanten G39Xi, R40X2 und R41X3; wobei Xi, X2 und X3 wie oben definiert sind; insbesondere aber wobei Xi für D, oder E steht und/oder X2 und X3 unabhängig voneinander für eine beliebige Aminosäure, insbesondere eine proteinogene Aminosäure stehen, wie insbesondere Dreichfachmutanten des Typs
Figure imgf000027_0001
oder E; R40X2=I, L oder V; R41X3= N, I, L oder V), wie z.B. (G39D,R40I,R41 N).
Gegebenenfalls können die Mutanten (1 ) bis (5) zusätzlich oder alternativ, insbesondere zusätzlich, wenigstens eine weitere Substitution, wie z.B. 1 , 2, 3 oder 4 Substitutionen in den Positionen K44, R53, K61 und R64. Hierbei können diese Reste unabhängig voneinander durch eine beliebige Aminosäure, insbesondere eine proteinogene Aminosäure ersetzt sein, insbesondere eine Substitution derart, dass die so erzeugte Mutente eine verringerte Substratinhibition (insbesondere für das 7-Ketosteroid-Substrat) aufweist; und/oder eine verän- derte Kofaktornutzung oder Kofaktorabhängigkeit (z.B. erhöhte, veränderte Spezifität bezüglich eines Kofaktors oder eine erweiterte Abhängigkeit, das heißt Nutzung eines zusätzlichen, bisher nicht genutzten Kofaktors) wie hierin definiert aufweist. 2.1 .3 Die Erfindung umfasst weiterhin die Anwendung 7ß-HSDH-Mutanten wie er in der WO2015/197698 der Anmelderin beschrieben ist, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Insbesondere sei auf folgende spezielle Ausführungsformen Bezug genommen::
(1 ) Eine 7ß-HSDH-Mutante, welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7-Hydroxysteroid katalysiert, wobei das Enzym je eine Mutation in den Positionen G39 und R40 von SEQ ID NO:1 1 sowie ge- gebenenfalls in der Positionen R41 und/ gegebenenfalls der Position K44 von SEQ ID NO:1 1 oder in den jeweils korrespondierenden Sequenzpositionen einer davon abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 1 , wie z.B. wenigstens 85, oder 90, wie z.B. wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% zu dieser Sequenz, umfasst.
(2) 7ß-HSDH-Mutante nach (1 ), umfassend die Doppelmutation G39D/R40F.
(3) 7ß-HSDH-Mutante nach (1 ) oder (2), umfassend die Dreifachmutation G39D/R40F/R41X-I , wobei Xi für einen beliebigen andere Aminosäurerest, insbesondere proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine die NADH-Spezifität erhöhenden Rest, insbesondere für K, Q, S oder R und vor allem für K steht.
(4) 7ß-HSDH-Mutante nach (1 ) oder (2)), umfassend die Vierfachmutation G39D/R40F/R41 X-i,/K44X2, wobei Xi für einen beliebigen andere Aminosäurerest, insbe- sondere proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine die NADH-Spezifität erhöhenden Rest insbesondere für K, Q, S oder R und vor allem K steht, und X2 für einen beliebigen andere Aminosäurerest, insbesondere proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine die NADH-Spezifität erhöhenden Rest, insbesondere für G, N oder Q, und vor allem G steht.
(5) 7ß-HSDH-Mutante nach (1 ) bis (4) , die im Vergleich zur 7ß-HSDH mit SEQ ID NO:1 1 folgendes Eigenschaftsprofil zeigt:
a. eine erhöhte spezifische Aktivität (Vmax [U/mg]) für NADH bei der enzymati- schen Reduktion von DHCA mit NADH als Kofaktor; und / oder b. eine erhöhte spezifische Aktivität (Vmax [U/mg]) für NADH bei der enzymati- schen Reduktion von 7-Ketosteroiden (insbesondere Gallensalzen mit einer Ketogruppe in Position C7 des Steroidrings), mit NADH als Kofaktor. 2.1.4 Die Erfindung umfasst weiterhin die Anwendung 7ß-HSDH-Mutanten wie er in der WO2016/016213 der Anmelderin beschrieben ist, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Insbesondere sei auf folgende spezielle Ausführungsformen Bezug genommen::
(1 ) 7ß-HSDH-Mutante, welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7-Hydroxysteroid katalysiert, wobei das Enzym abgeleitet ist von einem Enzym mit der SEQ ID NO:1 1 , oder einem diese Sequenz umfassenden Enzyms, wie z.B. einem Enzym umfassend SEQ ID NO:1 1 N-terminal verlängert um einen Histidin-Tag oder Histidin-Anker-Sequenz, und wobei das Enzym eine Mutation in Position 17 und/oder 64 von SEQ ID NO:1 1 (ggf N-terminal verlängert) oder in den korrespondierenden Sequenzpositionen einer davon abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 80%, wie z. B. wenigstens wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, zu SEQ ID NO:1 1 umfasst.
(2) 7ß-HSDH-Mutante die wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7-Hydroxysteroid katalysiert, und
eine durch Aminosäuremutation in SEQ ID NO:1 1 (ggf N-terminal verlängert) veränderte Aminosäure-Sequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz-Mutation ausgewählt ist unter Ein- oder Mehrfachmutationen umfassend:
Figure imgf000029_0001
b) T17X2
wobei Xi für einen von Arginin (R) verschiedenen, insbesondere proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor-Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht;
steht; und
und X2 für einen von Threonin (T) verschiedenen, proteinogenen Aminosäurerest insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor-Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht;
wobei die mutierte, d.h. veränderte Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 1 (ggf. N-terminal verlängert) von 80% bis weniger als 100%, wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, vorzugsweise von wenigstens 85% insbesondere von wenigstens 90 % aufweist. (3) 7ß-HSDH nach (1 ) oder (2), die zusätzlich wenigstens eine Mutation im Sequenzmotiv VMVGRRE gemäß Position 36 bis 42, insbesondere Position 39 von SEQ ID NO:1 1 (ggf N-terminal verlängert) oder in dem korrespondierenden Sequenzmotiv einer davon abgelei- teten Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Sequenzidentität, wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, zu SEQ ID NO:1 1 (ggf N-terminal verlängert)) aufweist.
7ß-HSDH nach (3), die zusätzlich die Aminosäuresequenz-Mutation c) G39X3 aufweist,
wobei X3 für einen von Glycin (G) verschiedenen, insbesondere proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor- Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht steht.
7ß-HSDH nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, ausgewählt unter a) den Einfachmutanten
Figure imgf000030_0001
T17X2 und den
b) den Doppelmutanten
R64X1/G39X3
worin
Xi für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V steht;
X2 für F, A, I, oder S steht
X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y F oder R, insbesondere S oder A, steht
Nichtlimitierende Beispiele geeigneter Einfachmutanten umfassen:
R64A, R64S, R64D, R64V, R64T, R64P, R64N, R64E, R64Q, R64H, R64RL, R64K, R64C, R64G, R64I, R64Y, R64F und R64W, und
T17F, T17A, T17I, T17S.
Nichtlimitierende Beispiele geeigneter Doppelmutanten umfassen:
(G39S/R64E); (G39S/R64D); (G39S/R64T); (G39S/R64L); (G39S/R64S); (G39S/R64P); (G39S/R64V); (G39A/R64E); (G39A/R64D); (G39A/R64T); (G39A/R64S); (G39A/R64L); (G39A/R64P); (G39A/R64V); Obige Ausführungen zu Einfach- und Doppelmutanten gelten insbesondere für SEQ ID NO:1 1 und die N-terminal verlängerte Form davon
(6) 7ß-HSDH nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, die im Vergleich zur nicht-mutierten 7ß-HSDH mit SEQ ID NO:1 1 (ggf. N-terminal verlängert) wenigstens eine der folgenden Eigenschaften oder folgendes Eigenschaftsprofil zeigt:
a) eine erhöhte spezifische Aktivität (Vmax [U/mg]) für Dehydrocholsäure (DHCA) bei der enzymatischen Reduktion von DHCA mit NAD(P)H, insbesondere NADPH, als Kofaktor; wobei z.B. die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des Kofaktors NAD(P)H, insbesondere NADPH, im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5, 10, 50 oder 100 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 -fache, insbesondere um das 2- bis 100-fache oder 3- bis 20-fache oder 5- bis 10-fache erhöht ist.
b) eine erhöhte spezifische Aktivität (Vmax [U/mg]) für NAD(P)H, insbesondere NADPH, bei der enzymatischen Reduktion von DHCA mit NAD(P)H, insbesondere NADPH, als Kofaktor; wobei z.B. die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des Kofaktors NAD(P)H, insbesondere NADPH, im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5 oder 10 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 - fache, insbesondere um das 2- bis 10-fache erhöht ist
c) eine verringerte Substratinhibition durch DHCA, wie z.B. mit Ki-Werten im Bereich von >1 mM, wie z.B. bei 1 bis 200 mM, 2 bis 150 mM, 2,5 bis 100 mM; d) eine veränderte Kofaktorspezifität bezüglich NADH und NADPH wie z.B. eine erweitere Spezifität, das heißt Nutzung eines zusätzlichen, bisher nicht genutzten Kofaktors, insbesondere NADPH;
e) wobei diese Eigenschaften a) bis d) einzeln oder in beliebiger Kombination vorliegen können.
Weitere spezielle Ausführungsformen betreffen Mutanten der 7ß-HSDH mit SEQ ID NO:1 1 (ggf. N-terminal verlängert) oder einer davon abgeleiteten Sequenz mit einem Identitätsgrad von wenigsten 80% oder wenigstens 85%, insbesondere wenigstens 90% zur Wildtypsequenz mit wenigstens einer der obigen Eigenschaften a), b), c), d) oder e).
Als weitere Beispiele sind zu nennen:
Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft a) besitzen.
(2) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft b) besitzen.
(3) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft c) besitzen.
(4) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T,
L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft d) besitzen
(5) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und b) besitzen.
(6) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und c) besitzen.
(7) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und d) besitzen.
(8) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und c) besitzen.
(9) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T,
L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und d) besitzen.
(10) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) bis d) besitzen. (1 1 ) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft a) besitzen.
(12) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft b) besitzen.
(13) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft c) besitzen.
(14) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft d) besitzen.
(15) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und b) besitzen.
(16) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und c) besitzen.
(17) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und d) besitzen.
(18) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und c) besitzen.
(19) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und d) besitzen.
(20) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X2 worin X2 für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) bis d) besitzen.
(21 ) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft a) besitzen.
(22) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für
E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevor- zugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft b) besitzen.
(23) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I , Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevor- zugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft c) besitzen.
(24) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X1/G39X3 worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft d) besitzen. (25) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für
E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und b) besitzen.
(26) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L,
S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und c) besitzen.
(27) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I , Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und d) besitzen.
(28) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevor- zugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und c) besitzen.
(29) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und d) besitzen. (30) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X3 worin X-ι für
E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X3 für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) bis d) besitzen.
Die oben aufgelisteten beispielhaften Ausführungsformen (1 ) bis (30) betreffen insbesondere Mutanten der 7ß-HSDH mit SEQ ID NO:1 1 (ggf. N-terminal verlängert) und weisen dazu einen Identitätsgrad von wenigsten 80 % oder wenigstens 85%, insbesondere wenigstens 90% auf.
2.2 3a-HSDHs: Besonders zu nennen sind die in der WO2016/023933 beschriebenen Enzyme:
2.2.1 Eine 3a-Hydroxysteroiddehydrogenase (3a-HSDH), welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 3-Ketosteroids zum korrespondierenden 3- Hydroxysteroid (wie z.B. von 3,12-Diketo-7ß-CS oder DHCS zu 12-Keto-UDCS oder 7,12- Diketo-3a-CS (7,12-Diketo-LCS), insbesondere unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH und/oder NADPH, insbesondere NADH) katalysiert, wobei das Enzym eine Mutation in Position 34 und/oder 68 von SEQ ID NO:8 oder in den korrespondierenden Sequenzpositionen einer davon abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Sequenzidentität, wie z. B. wenigstens wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, zu SEQ ID NO:8 umfasst; und / oder C-terminal eine Kettenverlängerung um bis zu 25, insbesondere um bis zu 15, 14. 13, 12, 1 1 oder 10 gleiche oder verschiedene (proteinogene) Aminosäurereste, insbesondere um eine Peptidkette, umfassend 1 bis 10, wie z.B. 3 bis 9 basische Aminosäurereste, wie Lysin, Arginin oder insbesondere Histidin (wie 3xHis, 6xHis oder 9xHis), aufweist; wobei die Histidinreste direkt an den C-Terminus oder über eine 1 bis 10, insbesondere 1 bis 3 beliebigen Aminosäurereste umfassende Lin- kergruppe angebunden sein können. Beispielhaft sind zu nennen: LEHHH (SEQ ID NO:15), LEHHHHHH (SEQ ID NO:16) und LEHHHHHHHHH (SEQ ID NO:17). Weiterhin sind Gegenstand solche 3a-HSDHs, die zusätzlich zu einer oder mehreren der obigen Mutationen oder alternativ dazu, N-terminal eine Kettenverlängerung um bis zu 25 gleiche oder verschiedene Aminosäurereste aufweisen. Diese sind um bis zu 25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14. ,13, 12, 1 1 oder 10 gleiche oder verschiedene (proteinogene) Aminosäurereste, insbesondere um eine Peptidkette, umfassend 1 bis 10, wie z.B. 3 bis 9 basische Aminosäurereste, wie Lysin, Arginin oder insbesondere Histidin (wie 3xHis, 6xHis oder 9xHis), verlängert; wobei die Histidinreste direkt an den N-Terminus oder über eine 1 bis 10 beliebigen Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können. Beispiel- haft ist zu nennen: MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH- (SEQ ID NO:18).
Beispielsweise weisen bevorzugte 3a-HSDHs eine Mutation in Position 34 und/oder 68 auf und sind ggf. N-terminal oder C-terminal zusätzlich verlängert; oder sie sind nur N- terminal oder C-terminal verlängert; jeweils wie hierin näher definiert.
Weiterhin umfasst die Erfindung natives, nichtmutiertes Enzym gemäß SEQ ID NO:8, das lediglich N- oder C- Terminal wie oben beschrieben modifiziert ist.
2.2.2 Eine 3a-HSDH die wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 3-Ketosteroids zum korrespondierenden 3-Hydroxysteroid katalysiert, und
eine durch Aminosäuremutation in SEQ ID NO:8 veränderte Aminosäure-Sequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz-Mutation ausgewählt ist unter Ein- oder Mehrfachmutationen umfassend:
Figure imgf000036_0001
ii. L68X2
wobei Xi für einen von Arginin (R) verschiedenen, insbesondere proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornut- zung oder Kofaktor-Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht;
steht; und
X2 für einen von Leucin (L) verschiedenen, proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor- Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht; iii. C-terminal um eine 1 bis 10 Histidin (H) Reste umfassende Kette verlängerte Additionsmutanten; wobei z.B. die Histidinreste direkt an den C-Terminus oder über eine 1 bis 10, insbesondere 1 bis 3 Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können.
iv. N-terminal um eine 1 bis 10 Histidin (H) Reste umfassende Kette verlängerte Additionsmutanten; wobei z.B. die Histidinreste direkt an den C-Terminus o- der über eine 1 bis 10 Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können;
wobei die mutierte, d.h. veränderte Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität zu SEQ ID NO:8 von 80% bis weniger als 100%, wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, aufweist.
2.2.3 3a-HSDHs ausgewählt unter
ca) den Einfachmutanten
Figure imgf000036_0002
cb) den Doppelmutanten
R34X1/L68X2
worin
Xi für N, C, S oder L steht;
X2 für A, G, C, K, S oder V steht; wobei besonders bevorzugte Kombinationen von X1 , X2; umfassen = N und /oder X2 = A cc) C-terminal um eine 1 bis 10 Histidin Reste umfassend Peptidkette verlängerte Additionsmutanten; wobei z.B. die Histidinreste direkt an den C-Terminus oder über eine 1 bis 10, insbesonderel bis 3 Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können;
cd) N-terminal um eine 1 bis 10 Histidin Reste umfassend Peptidkette verlängerte Additionsmutanten; wobei z.B. die Histidinreste direkt an den N-Terminus oder über eine 1 bis 10 Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können, und
ce) Mutanten gemäß ca) und cb), jeweils zusätzlich enthaltend die Additionsmutation gemäß cc) und /oder cd), insbesondere gemäß cc) oder cd). Nichtlimitierende Beispiele geeigneter Mutanten sind
Einfachmutanten umfassend: [R34N], [R34C], [R34S], [R34L], [L68A], [I68C], [L68K], [L68S], [L68V] und [L68G]
Doppelmutanten umfassend: [R34N/L68A]
jeweils sowohl ohne His-Tag als auch mit C-terminalen bzw. N-Terminalen His-Tag.
2.2.4 3a -HSDH wie oben unter 2.2.1 bis 2.2.3 beschrieben, die im Vergleich zur nativen, nicht-mutierten 3a -HSDH mit SEQ ID NO:8 folgendes Eigenschaftsprofil zeigt:
a) eine erhöhte spezifische Aktivität (Vmax [U/mg]) für Dehydrocholsäure (DHCA) bei der enzymatischen Reduktion von DHCA mit NADH als Kofaktor; wobei z.B. die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des Kofaktors NAD(P)H im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5, 10, 50 oder 100 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 -fache, insbesondere um das 2- bis 100-fache oder 3- bis 20-fache oder 5- bis 10-fache erhöht ist,
b) eine verringerte Substratinhibition durch DHCA, wie z.B. mit Ki-Werten im Bereich von >10 mM, wie z.B. bei 1 1 bis 200 mM, 12 bis 150 mM, 15 bis 100 mM,
wobei diese Eigenschaften a) und b) einzeln oder in beliebiger Kombination vorliegen können, d.h. nur a), nur b), oder a) und b).
2.2.5 Eine 3a-HSDH, welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 3-Ketosteroids zum korrespondierenden 3-Hydroxysteroid, (wie z.B. von 3,12-Diketo- 7ß-CS oder DHCS zu 12-Keto-UDCS oder 7,12-Diketo-3a-CS (7,12-Diketo-LCS), insbeson- dere unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH und/oder NADPH, vor allem unter stö- chiometrischem Verbrauch von NADH, katalysiert, wobei das Enzym eine Mutation in Position 188 und/oder Position 185 und gegebenenfalls Position 68 von SEQ ID NO:8 oder in den korrespondierenden Sequenzpositionen einer Aminosäuresequenz mit wenigstens 80%, wie z. B. wenigstens wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99, 5%, Sequenzidentität zu SEQ ID NO:8 umfasst; und / oder C-terminal eine Kettenverlängerung um bis zu 15, 14, 13, 12, 1 1 oder 10 gleiche oder verschiedene (proteinogene) Aminosäurereste, insbesondere um eine Peptidkette, umfassend 1 bis 10, wie z.B. 3 bis 9 basische Aminosäurereste, wie Lysin, Arginin oder insbesondere Histidin (wie 3xHis, 6xHis oder 9xHis), aufweist; wobei die Histidinreste direkt an den C-Terminus oder über eine 1 bis 3 beliebigen Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können. Beispielhaft sind zu nennen: LEHHH, LEHHHHHH und LEHHHHHHHHH. Weiterhin sind Gegenstand solche 3a-HSDHs, die zusätzlich zu einer oder mehreren der obigen Mutationen oder alternativ dazu, N-terminal eine Kettenverlängerung um bis zu 25 gleiche oder verschiedene Aminosäurereste aufweisen. Diese sind um bis zu 25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14. ,13, 12, 1 1 oder 10 gleiche oder verschiedene (proteinogene) Aminosäurereste, insbesondere um eine Peptidkette, umfassend 1 bis 10, wie z.B. 3 bis 9 basische Aminosäurereste, wie Lysin, Arginin oder insbesondere Histidin (wie 3xHis, 6xHis oder 9xHis), verlängert; wobei die Histidinreste direkt an den N-Terminus oder über eine 1 bis 10 beliebigen Amino- säurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können. Beispielhaft ist zu nennen: MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-.
Beispielsweise weisen bevorzugte 3a-HSDHs je eine Mutation in Position 188 und/oder 185 und ggf. in Position 68 auf und sind ggf. N-terminal oder C-terminal zusätzlich verlängert; oder sie sind nur N-terminal oder C-terminal verlängert; jeweils wie hierin näher definiert.
2.2.6 3a-HSDH die wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 3-
Ketosteroids zum korrespondierenden 3-Hydroxysteroid katalysiert, und
eine durch Aminosäuremutation in SEQ ID NO:8 veränderte Aminosäure-Sequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz-Mutation ausgewählt ist unter Ein- oder Mehrfachmutationen umfassend:
Figure imgf000038_0001
b) T188X3
und gegebenenfalls zusätzlich
Figure imgf000038_0002
wobei Xi für einen von Prolin (P) verschiedenen (proteinogenen) Aminosäurerest steht; X2 für einen von Leucin (L) verschiedenen (proteinogenen) Aminosäurerest steht; X3 für einen von Threonin (T) verschiedenen (proteinogenen) Aminosäurerest steht; d) gegebenenfalls zusätzlich mit C-terminaler Verlängerung umfassend 1 bis
10 Histidin (H) Reste; und/oder gegebenenfalls zusätzlich mit N-terminaler Verlängerung umfassend 1 bis 10 Histidin (H) Reste.
wobei die mutierte, d.h. veränderte Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität zu SEQ ID NO:8 von 80% bis weniger als 100%, wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, aufweist. 2.2.7 3a-HSDH wie oben unter 2.2.5 und 2.2.6 beschrieben, ausgewählt unter
a) den Einfachmutanten
T188X3
b) den Doppelmutanten
Figure imgf000039_0001
worin
Xi für A, T, S, G oder V, insbesondere A steht;
X2 für A, G, C, K, S oder V, insbesondere A, steht; und
X3 für A, G, W, S oder V, insbesondere A oder S steht;
c) gegebenenfalls zusätzlich mit C-terminaler Verlängerung umfassend 1 bis 10 His- tidin-Reste, wobei z.B. die Histidinreste direkt an den C-Terminus oder über eine 1 bis 10 Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können.
und; und/oder
d) gegebenenfalls zusätzlich mit N-terminaler Verlängerung umfassend 1 bis 10 His- tidin-Reste; wobei z.B. die Histidinreste direkt an den N-Terminus oder über eine 1 bis 10 Aminosäurereste umfassende Linkergruppe angebunden sein können.
und
e) Mutanten gemäß a) und b), jeweils zusätzlich enthaltend die Additionsmutation gemäß c) und /oder d), insbesondere gemäß c) oder d).
Insbesondere sind zu nennen die Doppelmutanten P185Xi/T188X3; L68X2/T188X3; L68X2/T185Xi; ohne bzw. mit N- oder C-terminaler Verlängerung wie oben definiert.
Nichtlimitierende Beispiele geeigneter Mutanten sind:
Einfachmutanten umfassend: [T188A], [T188S], [T188G], [T188V], [T188W], [P185A], [P185T], [P185S], [P185G], [P185V], [P185A],
Doppelmutanten umfassend: [L68A/T188A] and [L68A/T188S]
jeweils sowohl ohne His-Tag als auch mit C-terminalen bzw. N-Terminalen His-Tag.
2.2.8 3a -HSDH wie oben unter 2.2.5 bis 2..2.7 beschrieben, die im Vergleich zur nativen, nicht-mutierten 3a -HSDH mit SEQ ID NO:8 folgendes Eigenschaftsprofil zeigt:
a) eine erhöhte spezifische Aktivität (vmax [U/mg]) für Dehydrocholsäure (DHCA) bei der enzymatischen Reduktion von DHCA mit NADH als Kofaktor; wobei z.B. die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des Kofaktors NADH im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5, 10, 50 oder 100 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 -fache, insbesondere um das 2- bis 100-fache oder 3- bis 20-fache oder 5- bis 10-fache erhöht ist,
b. eine verringerte Substratinhibition durch DHCA, wie z.B. mit Ki-Werten im Bereich von >10 mM, wie z.B. bei 1 1 bis 200 mM, 12 bis 150 mM, 15 bis 100 mM, c. eine erhöhte spezifische Aktivität (vmax [U/mg]) für NADH bei der enzymatischen Reduktion von DHCA mit NADH als Kofaktor. wobei z.B. die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des von DHCA im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5 , 10 , 50 oder 100 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 -fache, insbesondere um das 2- bis 100-fache oder 3- bis 20-fache o- der 5- bis 10-fache erhöht ist,
wobei diese Eigenschaften a) bis c) einzeln oder in beliebiger Kombination vorliegen können, d.h. nur a), nur b), nur c), a) und b), a) und c) oder b) und c).
3. Nukleinsäuren und Konstrukte
3. 1 Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für ein Enzym mit 7ß-HSDH-, ADH-, FDH-, GDH- und/oder 3a-HSDH Aktivität und deren Mutanten kodieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren mit einem bestimmten Identitätsgrad zu den hierin beschriebenen konkreten Sequenzen.
Unter„Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2): 151 -1 ) unter Einstel- lung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameters: Gap opening penalty 10
Gap extension penalty 10
Gap Separation penalty ränge 8
Gap Separation penalty off
% identity for alignment delay 40
Residue specific gaps off
Hydrophilic residue gap off
Transition weighing 0 Pairwise alignment parameter:
FAST algorithm on
K-tuplesize 1
Gap penalty 3
Window size 5
Number of best diagonals 5
Alternativ dazu kann die Identität auch nach Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, gemäß Internetadresse: http://www.ebi.ac.Uk/Tools/clustalw/index.html# und mit den folgenden Parametern bestimmt werden:
DNA Gap Open Penalty 15.0
DNA Gap Extension Penalty 6.66
DNA Matrix Identity
Protein Gap Open Penalty 10.0
Protein Gap Extension Penalty 0.2
Protein matrix Gönnet
Protein/DNA ENDGAP -1
Protein/DNA GAPDIST 4
Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Clon- ing: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppel- strängige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalente, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungs- gemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Se- quenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer
Standard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridi- sierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonuk- leotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen oder Derivate davon, Homologe oder Teile dieser Sequenzen, lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Bakterien, z.B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen.
Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids an eine nahezu komplementäre Sequenz unter Standardbedingungen zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu können die Sequenzen zu 90-100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.
Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Berei- che verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10 °C niedriger als die von DNA:RNA- Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentel- len Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Es- sential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Ox- ford.
Die „Hybridisierung" kann insbesondere unter stringenten Bedingungen erfolgen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31 -9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6 beschrieben.
Unter„stringenten" Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die Inkubation bei 42°C über Nacht in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium-citrat), 50 mM Natrium Phosphat (pH7,6), 5x Den- hardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschschritt der Filter mit 0,1 x SSC bei 65°C.
Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.
So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen z.B. von SEQ ID NO:7, 10 oder 13 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verän- dert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allel- varianten, davon.
Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstitutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Varia- tion existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.
Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO:7, 10 oder 13sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.
Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere der SEQ ID NO:7, 10 oder 13beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen. So besitzen z.B. Homologe zur der SEQ ID NO:7, 10 oder 13 auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 40 %, bevorzugt von mindestens 60 %, besonders bevorzugt von mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80 % über den gesamten in SEQ ID NO:7, 10 oder 13 angegebenen DNA- Bereich.
Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, kön- nen durch wenigstens einen Nukleotidaustausch, wenigstens eine Insertionen, Inversionen und/oder Deletionen verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler Mutanten bekannt.
Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere Mutationen in Gene oder auch nicht codierende Nukleinsäurebereiche (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning. 3. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.
Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der durch diese codierten Protein sind dem Fachmann seit langem geläufig, wie beispielsweise
- die ortsspezifische Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), - die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Val- cärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1 ),
- die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleotidsequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);
- das Passagieren von Genen in Mutator-Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defek- ter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von Nukleotidsequenzen auftritt
(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique u- sing an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder
- das DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747).
Unter Anwendung der sogenannten gerichteten Evolution („directed evolution"; be- schrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwendung kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, beispielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display- Systeme.
Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigen- schatten exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaften weitgehend entsprechen, können einer weiteren Mutationsrunde unterworfen werden. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screening können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen. Durch diese iterative Arbeitsweise können stufenweise eine begrenzte Anzahl von Mutationen , wie z.B. 1 bis 5 Mutationen, vorgenommen und auf deren Einfluss auf die betreffende Enzymeigenschaft bewertet und selektiert werden. Die selektierte Mutante kann dann in gleicher Weise einem weiteren Mutationsschritt unterworfen werden. Dadurch lässt sich die Anzahl der zu untersuchenden Einzelmutanten signifikant verringern.
Die erfindungsgemäßen Ergebnisse liefern wichtige Informationen in Bezug auf Struktur und Sequenz der betreffenden Enzyme, die erforderlich sind, um gezielt weitere Enzyme mit gewünschten modifizierten Eigenschaften zu generieren. Insbesondere kön- nen sogenannte„hot spots" definiert werden, d.h. Sequenzabschnitte, die sich potentiell eignen, um über die Einführung gezielter Mutationen eine Enzymeigenschaft zu modifizieren.
3.2 Konstrukte
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für wenigstens ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Unter einer„Expressionseinheit" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, die einen Promotor, wie hierein definiert umfasst, und nach funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder einem Gen, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert. Man spricht deshalb auch in diesem Zusammenhang von einer„regulativen Nukleinsäuresequenz". Zusätzlich zum Promotor können weitere, regulative Elemente, wie z.B. Enhancer, enthalten sein.
Unter einer„Expressionskassette" oder„Expressionskonstrukt" wird erfindungsgemäß eine Expressionseinheit verstanden, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäure oder dem zu exprimierenden Gen funktionell verknüpft ist. Im Gegensatz zu einer Expressionseinheit umfasst eine Expressionskassette somit nicht nur Nukleinsäuresequenzen, welche Transkription und Translation regulieren, sondern auch die Nukleinsäuresequenzen, welche als Folge der Transkription und Translation als Protein exprimiert werden sollen.
Die Begriffe "Expression" oder„Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.
Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Termina- torsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einem„Promotor", einer„Nukleinsäure mit Promotoraktivität" oder einer„Pro- motorsequenz" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu transkribierenden Nukleinsäure die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.
Unter einer„funktionellen" oder„operativen" Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente, wie zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beispiel einen Terminator, derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäurese- quenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA- Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der Promotorsequenz positi- oniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Dabei kann der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, oder kleiner als 100 Basenpaare oder kleiner als 50 Basenpaare sein.
Neben Promotoren und Terminator sind als Beispiele weiterer regulativer Elemente zu nennen Targeting-Sequenzen, Enhancer, Polyadenylierungssignale, selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte umfassen insbesondere Sequenz SEQ ID NO:7, 10 oder 13 oder Derivate und Homologe davon, sowie die davon ableitbaren Nukleinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht ent- fernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weite- re regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Beispiele geeigneter Regulationssequenzen sind in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq" T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD)SP6-, lambda-PR- oder im lambda-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cos- mide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar.
Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll113-B1 , Agt1 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB1 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB1 16, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die ge- nannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus inte- griert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "Co- donnutzung" zu verändern. Der "Codonnutzung" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie ei- nem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombina- tions- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor inse- rtiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fach- mann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.
Insbesondere sind zu nennen:
Nukleotidsequenzen kodierend für eine 3a-HSDH oder eine 7ß-HSDH nach einem der oben beschriebenen Ausführungsformen.
Beispielhaft zu nennen sind Nukleotidsequenzen, ausgewählt unter Sequenzen
a) gleichzeitig kodierend für eine GDH und eine 3a-HSDH wie oben beschrieben und gegebenenfalls eine 7ß-HSDH wie oben beschrieben;
b) kodierend für ein Fusionsprotein umfassend eine GDH und eine 3a -HSDH wie oben beschrieben und gegebenenfalls eine 7ß-HSDH wie oben beschrieben;
wobei die kodierenden Sequenzen unabhängig voneinander ein- oder mehrfach in dem Konstrukt, wie z.B. in 2, 3, 4, 5, oder 6 bis 10 Kopien, enthalten sein können. Durch Wahl der geeigneten Kopienzahl können so eventuell gegebene Aktivitätsunterschiede in den einzelnen Expressionsprodukten kompensiert werden. - Expressionskassetten, umfassend unter der Kontrolle wenigstens einer regulativer Sequenz wenigstens eine Nukleotidsequenz wie oben beschrieben, sowie ggf. kodierende Sequenzen für wenigstens ein (wie z.B. 1 , 2 oder 3) weiteres Enzym, ausgewählt unter Hyd- roxysteroiddehydrogenasen, insbesondere 7ß-HSDH wie hierin beschrieben, und zur Kofak- torregenerierung geeignete Dehydrogenasen, wie z.B. FDH, GDH, ADH, G-6-PDH, PDH. Insbesondere können die in einer Expressions-Kassette enthaltenen Enzyme verschiedene, bevorzugt aber gleiche Kofaktorenpaare nutzen, wie z.B. das Kofaktorenpaar NAD+/NADH oder NADP+/NADPH.
4. Mikroorganismen
Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff „Mikroorganismus" der Ausgangsmikroorganismus (Wildtyp) oder ein genetisch veränderter, rekombinanter Mikroorganismus oder beides verstanden werden.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Trans- fektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Cur- rent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben. Einen Überblick über bakterielle Expressionssysteme für die heterologe Expression von Proteinen liefertz.B. auch Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 21 1 - 222.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram- negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonad- aceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Comamonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit 7ß-HSDH-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"- weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden.
Beispielsweise sind zu nennen:
Rekombinante Mikroorganismen, die wenigstens eine Nukleotidsequenz oder wenigstens eine Expressionskassette oder wenigstens einen Expressionsvektor, jeweils wie oben beschrieben tragen.
Rekombinante Mikroorganismen, die zusätzlich zur kodierenden Sequenz für 3a- und 7ß-HSDH die kodierende Sequenz für eine zur Kofaktorregenerierung geeignete Dehydrogenasen, tragen, wobei die Dehydrogenase ausgewählt ist unter NADPH-regenerierenden Enzymen, wie NADPH Dehydrogenasen, Alkoholdehydrogenasen (ADH), und NADPH re- generierenden Formiatdehydrogenasen (FDH), sowie Glucosedehydrogenase (GDH)-, Glu- cose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH), oder Phosphit-Dehydrogenasen (PtDH), oder NADH-regenerierenden Enzymen, wie NADH Dehydrogenasen, NADH regenerierenden Formiatdehydrogenasen (FDH), NADH regenerierenden Alkoholdehydrogenasen (ADH), NADH regenerierenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), NADH regenerie- renden Phosphitdehydrogenasen (PtDH) sowie NADH regenerierenden Glucosedehydro- genasen (GDH).
Rekombinante Mikroorganismen, welche die kodierenden Sequenzen für eine 3a - HSDH, eine GDH und eine 7ß-HSDH(bzw. deren Mutanten) auf einem oder mehreren (verschiedenen) Expressionskonstrukten tragen. Gegenstand der Erfindung sind somit re- kombinante Mikroorganismen, welche mit einem Einplasmidsystem modifiziert (wie z.B. transformiert) sind, das die kodierenden Sequenzen für 3a -HSD, GDH und 7ß-HSDH (bzw. deren Mutanten) in einer oder mehreren Kopien, wie z.B. in 2, 3, 4, 5, oder 6 bis 10 Kopien, tragen. Gegenstand der Erfindung sind somit auch rekombinante Mikroorganismen, welche mit einem Einplasmidsystem modifiziert (wie z.B. transformiert) sind, das die kodierenden Sequenzen für 7ß-HSDH, GDH und 3a-HSDH (bzw. deren Mutanten) in einer oder mehreren Kopien, wie z.B. in 2, 3, 4, 5 oder 6 bis 10 Kopien tragen. Die Enzyme (7ß-HSDH, GDH und 3a-HSDH bzw. deren Mutanten) können aber auch auf 2 oder 3 getrennten, miteinander kompatiblen Plasmiden in einer oder mehreren Kopien enthalten sein. Geeignete Basisvektoren zur Herstellung von Einplasmidsystemen und Multicopy-Plasmiden sind dem Fachmann bekannt. Als Beispiele können genannt werden für Einplasmidsystem, z.B. pET21 aund für Multicopyplasmide z.B. die von der Firma Novagen vertriebenen Duet- Vektoren, wie pACYCDuet-1 , pETDuet-1 , pCDFDuet-1 , pRSFDuet-1 und pCOLADuet-1. Derartige Vektoren, deren Kompatibilität mit anderen Vektoren und mikrobiellen Wirtsstämmen sind z.B. dem„User Protocol TB340 Rev. E0305 der Firma Novagen zu entnehmen.
Die optimale Kombination von Enzymen für die Generierung von Plasmidsystemen kann der Fachmann unter Berücksichtigung der Lehre der vorliegenden Erfindung ohne un- zumutbaren Aufwand vornehmen. So kann der Fachmann beispielsweise in Abhängigkeit von der Kofaktorspezifität des jeweils verwendeten HSDH-Enzyms das zur Kofaktorregene- rierung am besten geeignete Enzym, ausgewählt unter den oben genannten Dehydrogenasen, insbesondere GDH und den jeweiligen Mutanten davon, auswählen.
Weiterhin besteht die Möglichkeit, die zur Umsetzung gewählten Enzyme auf zwei oder mehrere Plasmide zu verteilen und mit den so hergestellten Plasmiden zwei oder mehrere verschiedene rekombinante Mikroorganismen herzustellen, die dann gemeinsam für die erfindungsgemäße biokatalytische Umsetzung eingesetzt werden. Die jeweilige zur Herstellung des Plasmids verwendete Enzymkombination kann dabei insbesondere auch unter der Vorgabe einer vergleichbaren Kofaktor-Nutzung erfolgen. So kann beispielsweise ein erster Mikroorganismus mit einem Plasmid modifiziert werden, welches die kodierende Sequenz für eine 7ß-HSDH oder Mutante davon und eine GDH tragen. Ein zweiter Mikroorganismus kann dagegen mit einem Plasmid modifiziert sein, das die kodierende Sequenz für eine 3a- HSDH oder Mutante davon und die kodierende Sequenz für eine GDH trägt. Beide Enzympaare können so gewählt sein dass sie gleiche Kofaktoren-Paare regenerieren können. Beide Mikroorganismen können dann gleichzeitig zur erfindungsgemäßen biokatalytischen Umsetzung eingesetzt werden.
Die Verwendung von zwei getrennten Biokatalysatoren (rekombinanter Mikroorganismen) kann gegenüber der Verwendung nur eines Biokatalysators, in dem alle Syntheseenzyme exprimiert werden, zwei wesentliche Vorteile bieten:
a) Beide Biokatalysatoren können separat voneinander gentechnisch modifiziert und optimiert werden. Insbesondere ist der Einsatz von verschiedenen Kofaktorregenerierungs- enzymen möglich, die entweder auf NADH- oder auf NADPH-Regenerierung optimiert sind. b) Für die Biokatalyse können die Biokatalysatoren in unterschiedlichen Anteilen eingesetzt werden. Dies ermöglicht ein Eingreifen in die einzelnen Reaktionsgeschwindigkeiten des Multienzymprozesses während der Biokatalyse, selbst nachdem sämtliche Biokatalysatoren bereits hergestellt sind.
Die hierin beschriebenen rekombinanter Mikroorganismus können zudem ein 7a-
HSDH knock-out-Stamm sein, hergestellt wie z.B. beschrieben in der WO201 1/147957 der Anmelderin.
5. Herstellung der UDCS
1. Schritt: Chemische Oxidation von CDCA zu 3, 7-Diketo-UDCA
Die Umsetzung erfolgt unter Verwendung an sich bekannter Verfahren zur chemischen Oxidation sekundärer Alkohole. Beispielsweise sind zu nennen, die Umsetzung mittels Kaliumdichromat in verdünnter Schwefelsäure, mittels Pyridiniumdichromat, mittels Jones-Reagenz, oder Collins-Reagens (vgl. z.B. Brückner , Reaktionsmechanismen, 3. Aufl, 2004, Spektrum Akademischer Verlag. Insbesondere ssind zu nenne die folgenden Verfahren
5.1 SWERN-Oxidation
Hierzu wird Oxalylchlorid in CH2CI2 gelöst und mit einem Aceton/T rockeneis-Bad auf -78 °C gekühlt. Dazu tropft man eine Lösung von Dimethylsulfoxid CH2CI2 zugetropft. Eine Lösung von Chenodesoxycholsäure (CDCA) in einem Gemisch aus CH2CI2/DMSO wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird gerührt, anschließend wird mit Triethylamin versetzt, weiter gerührt und das Kältebad entfernt. Zu der auf RT erwärmten Reaktionsmischung wird H20 gegeben und gerührt. Anschließend werden wässrige und organische Phase getrennt und die wässrige Phase CH2CI2 extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden sukzessive mit 0,5 M HCl und dest. H20 gewaschen, über NaS04 getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit.
5.2 Tempo-Oxidation Hierzu wird CDCA in Acetonitril gelöst. Nach Kühlen der Reaktionslösung auf 4 °C wird Natriumbromid und TEMPO hinzugegeben. Anschließend wird eine vorgekühlte NaOCI-Lösung in Aliquots unter stetigem Rühren zur Reaktionslösung gegeben, wobei die Innentemperatur unter 5 °C gehalten wurde. Nach beendeter Reaktion wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gebracht, mit HCl versetzt, wodurch sich gebildeter Feststoff auflöste und anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit HCl gewaschen, über MgS04 getrocknet und vom Lösungsmittel befreit. 3,7-Diketo-UDCA wurde als farbloser Feststoff erhalten.
5.3 Oxidation mittels Natriumhypochlorit/Natriumbisulfit
Die Chenodesoxycholsäure wird in Essigsäure bei 18°C gelöst. Zur daraus resultie- renden braunen Lösung wird das Hypochlorit zugesetzt. Dabei wird die Temperatur bei 7 -15 °C gehalten. Die milchige Suspension wurde anschließend unter Kühlung gerührt. Zur Neutralisation des überschüssigen Hypochlorits wird Natriumbisulfit dazugegebent. Die Temperatur wird konstant bei 15°C gehalten und gerührt. Nach Zugabe von H20 wird eine milchige Suspension erhalten, die man auf 70°C erhitzt und anschließend abgekühlt. Das Produkt wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wird anschließend getrocknet.
2. Schritt: Biokatalytische, d.h. enzymatische oder mikrobielle Umsetzung von 3, 7-Diketo- UDCA zu UDCA
In wässriger Lösung wird 3,7-Diketo-UDCA durch 3a-HSDH und 7ß-HSDH bzw. Mu- tanten davon spezifisch zu UDCS in Anwesenheit von NADPH und/oder NADH reduziert. Der Kofaktor NADPH bzw. NADH kann durch eine ADH bzw. FDH bzw. GDH bzw. Mutanten davon unter Verbrauch von z.B. Isopropanol (ADH) bzw. Natiumformiat (FDH) bzw. Gluco- se(GDH) regeneriert werden. Die Reaktion läuft unter milder Bedingung. Beispielsweise kann die Reaktion bei pH = 6 bis 9, insbesondere etwa pH = 8 und bei etwa 10 bis 30, 15 bis 25 oder etwa 23°C durchgeführt werden.
Im Falle eines mikrobiellen Umsetzungsschrittes können rekombinante Mikroorganismen, welche die erforderliche(n) Enzymaktivität(en) exprimieren in Gegenwart des umzusetzenden Substrates (3,7-Diketo-UDCA) anaerob oder aerob in geeigneten Flüssigmedien kultiviert werden. Geeignete Kultivierungsbedingungen sind dem Fachmann an sich be- kannt. Sie umfassen Umsetzungen im pH Bereich von beispielsweise 5 bis 10 oder 6 bis 9, bei Temperaturen im Bereich von 10 bis 60 oder 15 bis 45 oder 25 bis 40 oder 37 °C. Geeignete Medien umfassen z,B, LB und TB oder die unten beschriebenen Medien. Die Umsetzung kann dabei z,B, batchweise oder kontinuierlich oder in sonstigen üblichen Verfahrensvarianten erfolgen (wie oben beschrieben). Die Umsetzungsdauer kann dabei z.B. im Bereich von Minuten bis mehreren Stunden oder Tagen liegen, und z.B. 1 h bis 48 h betragen. Gegebenenfalls kann, wenn Enzymaktivität nicht kontinuierlich exprimiert wird, diese durch Zugabe eines geeigneten Induktors, nach Erreichen einer Zielzelldichte , z.B. von etwa OD6oo = 0,5 bis 1 ,0, eingeleitet werden.
Weitere mögliche geeignete Abwandlungen des mikrobiellen Herstellungsverfahrens hinsichtlich Fahrweise der Fermentation, Zusätze zum Medium, Enzymimmobilisierung und Isolierung der Wertstoffe sind auch dem folgenden Abschnitt betreffend„Rekombinante Herstellung der Enzyme bzw. Mutanten" zu entnehmen
6. Rekombinante Herstellung der Enzyme und Mutanten
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäßer Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.
Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen um- fassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefe- extrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykoles- ter, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugati- on, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.
Die Zellen können auch, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modi- fikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarb- Stoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Deri- vatisierung der Proteine verwendet werden. 7. Enzymimmobilisierung
Die erfindungsgemäßen Enzyme können in den hierin beschriebenen enzymatischen Verfahren frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Einsatz der Dehydro- genäse als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobiliserte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-Iinking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin „Immobilization of Enzymes" " in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991 -1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben.
Experimenteller Teil:
Werden keine anderen Angaben gemacht, so können die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte, wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Mikroorganismen, Anzucht von Mikroorganismen, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA mit Hilfe üblicher Arbeitsvorschriften, wie z.B. wie bei Sambrook et al. (1989) a.a.O. beschrieben, durchgeführt werden.
1. Materialien:
1.1 Allgemein
Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich, Carl Roth und Biomol (Deutschland) sowie von Gerbu (Niederlande) bezogen. Sämtliche Restriktionsendonukleasen und die T4 DNA Ligase wurden von ThermoScientific (Deutschland) bezogen.
1.2 Medien & Puffer:
LB-Medium, enthaltend Trypton 10 g, Hefeextrakt 5 g, NaCI 10 g pro Liter Medium.
KPi-Puffer (50 mM, pH 8), enthaltend 8,3 g K2HP04 und 0,3 g KH2P04 pro Liter Puffer.
TEA-Puffer (100 mM, pH 7,5), enthaltend 14,9 g Triethanolamin pro Liter Puffer, mit 1 M HCl auf pH 7,5 eingestellt.
Tris-HCI-Puffer (100 mM, pH 8,0; 8,5; 9,0) enthaltend 12,1 g Tris(hydroxymethyl)- aminomethan pro Liter Puffer, mit 1 M NaOH auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Zitronensäure-Puffer (100 mM pH 6), enthaltend 2,4 g Zitronensäure-monohydrate und 26,0 g Trinatriumcitrat dihydrat pro Liter Puffer.
Aufschlusspuffer, enthaltend 10 mM Imidazol, 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCI, pH 8.
Waschpuffer, enthaltend 20 mM Imidazol, 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCI, pH 8. Eluationspuffer, enthaltend 250 mM Imidazol, 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCI, pH 8.
Für die Verwendung von Puffern mit geringerer Molarität wurde dieser aus der Liste (siehe oben) mit dest. Wasser so verdünnt, dass die gewünschte Molarität erhalten wurde.
1.3 Mikroorganismen: Tabelle 1 : Verwendete Escherichia coli Stämme
Stamm Genotyp
Escherichia coli DH5a F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG O80dlacZAM15 A(lacZYA- argF)U169, hsdR17(rK - mK+),A-
Escherichia coli BL21 (DE3) A7a-HSDH F- ompT gal dem Ion hsdSB(rB-mB-) A(DE3
[lad lacUV5-T7 gene 1 ind 1 sam7 nin5])
(7a-HSDH Knock-out Stamm)
hshA- KanR+
Der Escherichia coli Stamm DH5a (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) wurde bei 37°C in LB-Medium, enthaltend geeignete Antibiotika vermehrt.
Der Escherichia coli Stamm BL21 (DE3) A7a-HSDH wurde von PharmaZell GmbH erhalten (siehe auch WO201 1/147957).
1.4 Expressionsvektoren und Vektorkonstrukte: Zur Expression der rekombinanten Dehydrogenasen wurden die bekannten Expressionsvektoren pET28a(+) (für die Einzelexpression der Gene) sowie pETDuet und pACYCDuet verwendet (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) und folgende Vektorkonstrukte erzeugt:
• pET28a(+)_3a-HSDH(N): pET28a(+)-Vektor in der das Gen der 3a-HSDH aus C. tes- tosteroni über die Schnittstellen Nde\ und Xho\ in üblicher Weise einkloniert wurde. Dieses Konstrukt besitzt einen N-terminalen 6xHis-Tag.
• pET28a(+)_7ß-HSDH(C): pET28a(+)-Vektor in der das Gen der 7ß-HSDH aus C. aero- faciens über die Schnittstellen Nco\ und Xho\ in üblicher Weise einkloniert wurde. Dieses Konstrukt besitzt einen C-terminalen 6xHis-Tag.
• pDB02: pETDuet-Vektor in der das Gen der 7ß-HSDH aus C. aerofaciens über die Schnittstellen Nco\ und Not\ in die 1 . Multi-cloning-site (MCS) und die 3a-HSDH aus C. testosteroni über die Schnittstellen Nde\ und Xho\ in die MCS2 in üblicher Weise einkloniert wurden. Dieses Konstrukt besitzt keinen 6xHis-Tag.
• pDB04: pETDuet-Vektor in der das Gen der Glucose Dehydrogenase aus B. subtilis 168 über die Schnittstellen Nco\ und Xho\ in die MCS1 und die 3a-HSDH aus C. tes- tosteroni über die Schnittstellen Nde\ und Xho\ in die MCS2 in üblicher Weise einklo- niert wurden. Dieses Konstrukt besitzt keinen 6xHis-Tag.
• pDB04b: pETDuet-Vektor in der das Gen der Glucose Dehydrogenase aus B. subtilis 168 über die Schnittstellen Nco\ und Xho\ in die MCS1 und die 3a-HSDH aus C. tes- tosteroni über die Schnittstellen Nde\ und Xho\ in die MCS2 in üblicher Weise einklo- niert wurden. Durch QuikChange®-PCR wurde die Mutation T188A in das Gen der 3a- HSDH eingebracht. Dieses Konstrukt besitzt keinen 6xHis-Tag.
• pA_7ß-HSDH: pACYCDuet-Vektor in der das Gen der 7ß-HSDH aus C. aerofaciens über die Schnittstellen Λ/col und Xho\ in üblicher weise einkloniert wurde. Dieses Konstrukt besitzt keinen 6xHis-Tag.
• pA_7ß-HSDH [G39S/R64E]: pACYCDuet-Vektor in der das Gen der 7ß-HSDH aus C. aerofaciens über die Schnittstellen Λ/col und Xho\ in üblicher Weise einkloniert wurde. Durch QuikChange®-PCR wurden die Mutationen G39S sowie R64E in das Gen der 7ß-HSDH eingebracht Dieses Konstrukt besitzt keinen 6xHis-Tag.
• pA_GDH2: pACYCDuet-Vektor in der das Gen der Glucose Dehydrogenase aus B. subtilis 168 über die Schnittstellen Bsa\/Nco\ und Xho\ in üblicher Weise einkloniert wurde. Dieses Konstrukt besitzt keinen 6xHis-Tag.
Die erzeugten rekombinanten Stämme („designer bugs"), die für die Reduktion von 3,7- Diketo-UDCA zu UDCA eingesetzt wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Verwendete rekombinante Stämme. Der Stamm Escherichia coli BL21 (DE3)A7a-HSDH wurde als Expressionsstamm von PharmaZell zur Verfügung gestellt. Die verwendeten Plasmide sind im Kapitel„Expressionsvektoren und Vektorkonstrukte" aufgeführt
Name Plasmide
E. coli DB02 pDB04 (GDH2 + 3a-HSDH) & pA_7ß-HSDH
E. coli DB03 pDB02 (7ß-HSDH + 3a-HSDH) & pA_GDH2
£. coli DB08 pDB04b (GDH2 + 3a-HSDH [T188A]) & pA_7ß-HSDH [G39S/R64E]
2. Methoden:
2.1 Anzucht
Die Anzucht erfolgte im Schüttelkolben in LB-Medium bei 37°C. Bei einer OD600= 0,6 - 0,8 wurde die Genexpression durch Zusatz von 0,5 mM IPTG induziert. Danach wuchsen die Zellen bis zur Ernte bei 25°C für weitere 20 Stunden. 2.2 Gewinnung von Rohextrakt
Die angezogenen Zellen wurden mittels Ultraschall aufgeschlossen (25%ige Zellsuspension) und der gewonnene Rohextrakt wurde durch Zentrifugation (20.000 g, 30 min, 4 °C) von den Zelltrümmern getrennt.
2.3 Expression und Aufreinigung
E. coli ßZ-27(DE3)A7a-HSDH wurde mit dem Expressionskonstrukt transformiert. Dazu wurde der das Expressionskonstrukt enthaltende E. coli BL21 (DE3)A7a-HSDH-Stamm in LB- Medium mit dem entsprechend Antibiotikum (50 μg ml Kanamycin für pET28a, 36 μg ml Chloramphenicol für pACYCDuet bzw. 40 μg ml Kanamycin + 29 μg ml Chloramphenicol für den Ganzzellbiokatalysator) vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10.000xg, 30 min, 4°C) geerntet. Das Pellet wurde im Aufschlusspuffer resuspendiert (25%ige Zellsuspension). Die Zellen wurden unter konstanter Kühlung durch 2-minütige Ultraschallbehand- lung (30 W Leistung, 10 - 25% Arbeitsintervall und 1 min Pause) unter Verwendung eines Ultraschallgeräts Sonopuls HD2070 (Bandelin, Deutschland) aufgeschlossen. Der Auf- schluss wurde dreimal wiederholt. Das Zellextrakt wurde zentrifugiert (20.000xg, 30 min, 4°C). Der Überstand wurde auf eine Chromatographiesäule (Thermo scientific, USA) geladen, die vorher mit 25 ml Aufschlusspuffer äquilibriert wurde. Schwach bindendes Protein wurde durch Waschen mit 40 bis 50 ml Waschpuffer entfernt. Das Fusionsprotein wurde mit Elutionspuffer (10 ml) eluiert. Das Verfahren wurde bei RT durchgeführt. Das Eluat wurde mittels Centricon (Ultrafiltrationsmodule) eingeengt und die Umpufferung auf Puffer 50 mM KPi (pH 8,0) geschah mittels einer PD10-Säule, um das enthaltende Imidazol zu entfernen.
Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford (s. Methode 2.5) (Rohextrakt) oder aufgerei- nigtes Protein mittels Nanodrop© (ThermoScientific)bestimmt. Außerdem wurden die Probe durch 15%ige SDS-PAGE und Färben mit Coomassie Brilliant Blue analysiert.
2.4. Standardbedingungen
2.4.1 Standardbedingungen für HSDH-Aktivitätsbestimmung Die Reaktionsmischung enthält ein Gesamtvolumen von 1 ml: 880 μΙ 50 mM Kaliumphosphat (KPi) Puffer, pH 8.0
100 μΙ 100 mM 3,7-Diketo-UDCA (gelöst in 50 mM KPi, pH 8) 10 μΙ Enzymlösung (in Puffer verdünnt, im Bereich von 1 zu 5 U/ml)
10 μΙ 50 mM NAD+ bzw NADP+(gelöst in ddH20)
Die Abnahme der Extinktion wird bei 340 nm über einen Zeitraum von 30 Sekunden gemessen und die Aktivität wird als Enzym-Unit (U, i.e. μη"ΐοΙ/η"ΐίη) unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten von 6.22 mM"1xcm"1 berechnet.
2.4.2. Standardbedingungen für die Aktivitätsbestimmung der Glucose Dehydrogenase
Die Reaktionsmischung enthält ein Gesamtvolumen von 1 ml: 940 μΙ 50 mM Kaliumphosphat (KPi) Puffer, pH 8.0
40 μΙ 2,5 M Glucose (gelöst in dest. Wasser)
10 μΙ Enzymlösung (in Puffer verdünnt, im Bereich von 1 zu 5 U/ml)
10 μΙ 50 mM NAD+ bzw NADP+(gelöst in ddH20)
Die Zunahme der Extinktion wird bei 340 nm über einen Zeitraum von 30 Sekunden gemessen und die Aktivität wird als Enzym-Unit (U, i.e. μη"ΐοΙ/η"ΐίη
2.5 Proteinbestimmung mittels Bradford
Die Proben (jeweils 100 μΙ) wurden mit 900 μΙ Bradford Reagenz gemischt und für mind. 15 min im Dunkeln inkubiert. Der Proteingehalt wurde bei 595 nm gegen einen Kalibrierkurve (BSA) im Konzentrationsbereich des verwendeten Assay bestimmt.
2.6 Molekularbiologische Arbeitsmethoden
Molekularbiologische Arbeiten erfolgen, soweit keine anderen Angaben gemacht werden, in Anlehnung an etablierte Methoden, z.B. beschrieben in: Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). 2.7 Hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Zur qualitativen und quantitativen Analytik aller für die betrachteten Reaktionen beteiligten Gallensäuren wurde das HPLC-System Jasco verwendet, bestehend aus der Schnittstelle LC-Net ll/ADC, 3-Wege-Entgaser DG2080-53, Autosampier AS2059SFPIus, zwei Pumpen PU-2080Plus, Säulenofen CO-2060Plus, Rl-Detektor RI-2031 Plus und Multiwellenlängen- Detektor MD-2010Plus. Die Trennung der Substanzen erfolgte mit Hilfe einer Umkehrphasen-Chromatographiesäule vom Typ Purospher STAR® RP-18e (5 μηη) der Firma Merck (Darmstadt, Deutschland). Es wurde eine Gradientenelution gewählt, in der als mobile Pha- se ein Gemisch aus Acetonitril und phosphorsaurem Wasser (pH 2,6) eingesetzt wurde. Letzteres diente dazu, einen einheitlichen Protonierungsgrad zu erhalten. Die Analyse der Substanzen erfolgte bei 25 °C Ofentemperatur und die Detektion erfolgte mit einem UV- Sensor bei λ = 200 nm.
Als Gradient wurde eingesetzt: 0 - 15 min lineare Zunahme von 20% Acetonitril auf 35%, 15 - 53 min lineare Zunahme auf 70% Acetonitril, 53 - 75 min konstant 70% Acetonitril, 75 - 78 min lineare Abnahme auf 20% Acetonitril, 78 - 88 min konstant 20% Acetonitril.
3. Beispiele
Beispiel 1 : Chemische Oxidation von CDCA 1.1 SWERN-Oxidation
In einem 1 L Dreihalskolben wird Oxalylchlorid (70 mmol; 6,02 ml) in ca. 50 ml CH2CI2 gelöst und mit einem Aceton/T rockeneis-Bad auf -78 °C gekühlt. Über einen Tropftrichter wird bin- nen 5 min eine Lösung von Dimethylsulfoxid (130 mmol; 9,24 ml) in 15 ml CH2CI2 zugetropft. Eine Lösung von Chenodesoxycholsäure (CDCA) (30 mmol; 1 1 ,78 g) in einem Gemisch aus CH2CI2/DMSO (insg. 30 ml [ca. 15 ml DMSO, Rest CH2CI2]) wird über einen weiteren Tropftrichter binnen 5 min zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 15 min. gerührt, anschließend wird mit Triethylamin (150 mmol; 21 ml 42 ml) versetzt, weitere 5 min gerührt und das Kälte- bad entfernt. Zu der auf RT erwärmten Reaktionsmischung werden 180 ml dest. H20 gegeben und min 5 gerührt. Anschließend werden wässrige und organische Phase getrennt und die wässrige Phase mit 200 ml CH2CI2 extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wer- den sukzessive mit je 250 ml 0,5 M HCl und dest. H20 gewaschen, über NaS04 getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit.
Reaktionsgleichung:
Figure imgf000066_0001
Chenodesoxycholsäure 3,7-Diketo-UDCA
Schema 1 : Reaktionsschema der chemischen Oxidation von CDCA mittels SWERN-Vorschrift.
Das Produkt wurde mit einer Ausbeute von 46 % und einer Reinheit von ca. 90 % erhalten.
1 .2 Tempo-Oxidation
In einem 100 ml Zweihalskolben mit Innenthermometer wurde CDCA (300 mg, 764 μηηοΙ) in 20 ml Acetonitril gelöst. Nach Kühlen der Reaktionslösung auf 4 °C wurden Natriumbromid (15.7 mg, 153 mol) und TEMPO (2,2,6,6-Tetramethylpiperidinyloxy) (4.8 mg, 30.6 mol) hinzugegeben. Anschließend wurde eine vorgekühlte NaOCI-Lösung (10.0 ml, 0.76 M, pH = 8.8) in Aliquots ä 1 .0 ml unter stetigem Rühren innerhalb von 5 Minuten zur Reaktionslösung gegeben, wobei die Innentemperatur unter 5 °C gehalten wurde. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten wurde eine Umsatzkontrolle per DC (Cyclohexan/Ethylacetat/Essigsäure 1 :1 :0.005, v/v) durchgeführt und die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gebracht. Es wurde mit 20 ml 1 M HCl versetzt, wodurch sich jeglicher Feststoff auflöste und anschließend zweimal mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 30 ml 0.5 M HCl gewaschen, über MgS04 getrocknet und vom Lösungsmittel befreit. 3,7-Diketo-UDCA wurde als farbloser Feststoff erhalten.
Reaktionsgleichung:
Figure imgf000067_0001
Chenodesoxycholsäure 3.7-Diketo-UDCA
Schema 2: Reaktionsschema der chemischen Oxidation von CDCA mittels TEMPO.
Das Produkt wurde mit einer Ausbeute von 78 % und einer Reinheit von ca. 95 % erhalten.
1 .3 Natriumhypochlorit/Natriumbisulfit
Die Chenodesoxycholsäure (10g, 24.5 mmol) wurde in einem 500 ml Dreihalskolben in Essigsäure (1 10 ml) bei 18°C gelöst. Zur daraus resultierenden braunen Lösung wurde innerhalb von 40 min Hypochlorit (35 ml, 2.66 Eq, 65.15 mmol) über einen Tropftrichter zugesetzt. Dabei wurde die Temperatur bei 7 -15 °C gehalten. Die milchige Suspension wurde an- schließend weitere drei Stunden unter Kühlung gerührt. Zur Neutralisation des überschüssigen Hypochlorits wurde Natriumbisulfit-Lösung (20.4 mmol, 35 ml) dazu getropft. Die Temperatur wurde dabei wieder konstant bei 15°C gehalten. Es wurde weitere 45 min gerührt, dabei wurde die zunächst klare Lösung wieder leicht milchig. Nach Zugabe von H20 (160 ml) wurde eine milchige Suspension erhalten. Diese milchige Suspension wurde für 45 min. auf 70°C erhitzt, anschließend wurde innerhalb einer Stunde auf 20°C runtergekühlt. Das Produkt wurde mittels einer Saugfasche filtriert und mit 600 ml Wasser gewaschen, bis kein Essigsäure-Geruch mehr zu vernehmen war. Das Produkt wurde über mehrere Tage im Exsikkator und zuletzt an der Schlenkline getrocknet. Das Produkt wurde mit einer Ausbeute von 7,97 g (79,7%) und einer Reinheit von 98,6 % erhalten. Die Reinheit wurde mittels 1H- NMR und HPLC ermittelt.
Reaktionsgleichung:
Figure imgf000067_0002
Chenodesoxycholsäure 3,7-Diketo-UDCA
Schema 3: Reaktionsschema der chemischen Oxidation von CDCA mit stöchiometrischen Mengen an NaOCI. 1.4 Analytik:
Nach jeder chemischen Oxidation erfolgte die Analyse mit NMR (C13 & H-ι ) und HPLC.
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ [ppm] = 1 1.96 (s, 1 H), 2.90 (dd, 1 H, J = 12.7 Hz, 5.5 Hz), 2.54 (t, 1 H, J = 1 1.4 Hz), 2.35 (dt, J = 14.7 Hz, 5.2 Hz), 2.26-2.04 (m, 5H), 2.00-1 .92 (m, 5H), 1 .86-1 .64 (m, 3H), 1 .56-1.34 (m, 5H), 1 .28-1 .15 (m, 6H), 1 .07 (q, 1 H, J = 9.5 Hz), 0.99-0.91 (m, 1 H), 0.88 (d, 3H, J = 6.5 Hz), 0.64 (s, 3H).
MS (ESI): m/z = 41 1 .0 ([M+Na]+), 445.0 ([M+K]+), 799.5 ([2M+Na]+).
RP-HPLC = CDCA = 31 ,1 min.; 3,7-Diketo-UDCA = 29,7 min.
Beispiel 2: QuikChange-PCR
Mithilfe der QuikChange®-PCR (QC-PCR) wurde der gezielte Austausch einzelner Aminosäuren vorgenommen. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 3 dargestellt, die an den Positionen 39 und 64 für die 7ß-HSDH bzw. Position 188 für die 3a-HSDH den gewünschten Austausch bewirkten.
Tabelle 3: Verwendete Primer für QuikChange®-PCR.
Figure imgf000069_0001
Bei der Reaktion erfolgte zuerst ein 2 min langer initialer Denaturierungsschritt bei 95°C. Danach wurden 23 Zyklen von Denaturierung (30 s bei 95°C), Primerhybridisierung und Elongation (2,5 min bei 72°C) durchgeführt. Als letzter Schritt erfolgte eine finale Elongation von 10 min bei 72°C, bevor die Polymerasekettenreaktion durch Kühlen auf 15°C beendet wurde. Tabelle 4 gibt die entsprechende Zusammensetzung des Reaktionsgemisches an.
Tabelle 4: PCR-Ansatz für die Erzeugung der verschiedenen 3a- und 7ß-HSDH Varianten
Figure imgf000069_0002
Als Template wurde ein pET28a-Vektor mit dem entsprechenden Wildtyp-Gen verwendet. Um Aminosäuren in Proteinsequenzen gezielt austauschen zu können, wird die DNA- Sequenz des entsprechenden Gens positionsgerichtet mutiert. Hierzu werden zueinander komplementäre Primer genutzt, die die gewünschte Mutation in ihrer Sequenz tragen. Als Template dient N6-adeninmethylierte, doppelstrangige Plasmid-DNA, die das zu mutierende Gen tragen. N6-adeninmethylierte Plasmid-DNA werden aus dem dam+ £. co//-Stamm wie zum Beispiel E. coli DH5a isoliert. Die Polymerasekettenreaktion wird wie oben beschrieben durchgeführt. Dabei werden die Primer komplementär zum Template verlängert, wodurch Plasmide mit der gewünschten Mutation entstehen, die einen Strangbruch aufweisen. Anders als bei anderen PCR- Reaktionen steigt die DNA-Ausbeute hierbei nur linear, da neu gebildete DNA-Moleküle nicht als Template für die PCR-Reaktion dienen können. Nach Abschluss der PCR-Reaktion wurde das PCR-Produkt mittels PCR-Purification-Kit (Analytik Jena) aufgereinigt und die parentale, N6-adeninmethylierte DNA mit Hilfe des Restriktionsenzyms dpn\ verdaut. Dieses Enzym hat die Besonderheit, dass es unspezifisch N6- adeninmethylierte DNA restringiert, jedoch nicht die neu gebildete, nichtmethylierte DNA. Die Restriktion erfolgte, indem 1 μΙ dpn\ zum aufgereinigten PCR-Reaktionsansatz hinzu gegeben und für mind. 2 h bzw. über Nacht bei 37°C inkubiert wurde.
8 μΙ dieses Ansatzes wurden zur Transformation von 100 μΙ chemisch-kompetenten DH5o Zellen verwendet.
Beispiel 3: Biochemische Charakterisierung der 3a- und der 7ß-HSDH Um die enzymkinetischen Parameter der 7ß- als auch der 3a-HSDH zu bestimmen, wurde die Gene der 7ß-HSDH Mutanten unter Verwendung des Plasmids pET28a_7ß HSDH(C) bzw. pET28a_3a-HSDH(N) in E. coli BL21 (DE3)A7a-HSDH exprimiert. Diese Varianten besitzen einen C-terminalen (7ß HSDH) bzw. N-terminalen (3a-HSDH) 6xHis-Tag. Der Rohextrakt der aufgeschlossenen Zellen wurde mittels Ni-NTA aufgereinigt (siehe Kapitel 2.3) und eine SDS-Page zur Kontrolle der Expression als auch der Aufreinigung zu haben (siehe Figur 1 ).
Aus Figur 1 geht hervor, dass die Expression erfolgreich war, man erkennt in beiden Fällen deutliche Überexpressionsbanden. Weiterhin konnte durch die Ni-NTA Aufreinigung nahezu vollständig Fremdprotein entfernt werden. In den Messungen zur Bestimmung der kinetischen Konstanten für die 3a-HSDH wurden unterschiedliche Substratkonzentrationen zwischen 10 μΜ und 10 mM für 3,7-Diketo-UDCA sowie für das Intermediat 3-Keto-UDCA bei konstant 0,2 mM NADH verwendet. Für die Bestimmung der Konstanten für den Kofaktor wurde die Konzentration an 3,7-Diketo-UDCA konstant bei 1 mM gehalten und die NAD(P)H-Konzentration zwischen 10 μΜ und 0,30 mM untersucht. In Figur 2 sind die Verlaufsdiagramme sowie in Tabelle 5 die Werte dargestellt.
Für die Bestimmung der kinetischen Konstanten für die 7ß-HSDH wurden unterschiedliche Substratkonzentrationen zwischen 10 μΜ und 15 mM für 3,7-Diketo-UDCA sowie für das Intermediat 7-KLCA zwischen 10 μΜ und 12,5 mM bei konstant 0,2 mM NADPH verwendet. Für die Bestimmung der Konstanten für den Kofaktor wurde die Konzentration an 3,7-Diketo- UDCA konstant bei 1 mM, für das Cosubstrat 7-KLCA bei konstant 5 mM gehalten und die NADPH-Konzentration wurde zwischen 10 μΜ und 0,3 mM untersucht. In Figur 3 sind die Verlaufsdiagramme sowie in Tabelle 5 die entsprechenden Werte dargestellt.
Tabelle 5: Kinetische Konstanten der 3a- und 7ß-HSDH für das Substrat 3,7-Diketo-UDCA sowie 3-Keto-UDCA bzw 7-KLCA als auch dem zugehörigen Kofaktor. Variiert wurde jeweils die Verbindung, die in der Spalte„Substrat" aufgeführt ist. In der Spalte Cosubstrat betrug die Konzentration an NAD(P)H 0,2 mM und an 3,7-Diketo- UDCA 0,1 mM (3a-HSDH) bzw. 10 mM (7ß-HSDH). X = keine Inhibierung.
Figure imgf000071_0001
Aus Tabelle 5 geht hervor, dass von den beiden Enzymen 3a-HSDH und 7ß-HSDH nur die 3a-HSDH mit dem Diketon 3,7-Diketo-UDCA und auch mit dem Monoketon 3-Keto-UDCA eine Substratinhibierung aufweist. Für das Monoketon ist die Inhibierung allerdings weniger ausgeprägt. Weiterhin ist auffällig, dass die 7ß-HSDH keine Inhibierung aufweist. Der Vergleich beider Enzyme zeigt, dass die 3a-HSDH trotz der Substratinhibierung eine höhere Aktivität als die 7 ß-HSDH aufweist. Beispiel 4: Biotransformationen von 3,7-Diketo-UDCA zu UDCA
Für die Synthese von UDCA ausgehend von 3,7-Diketo-UDCA wurden Ansätze sowohl mit Rohextrakt (siehe unten Abschnitt A)) als auch mit Ganzzellbiokatalysatoren (siehe unten Abschnitt B)) durchgeführt. Die Konzentration an 3,7-Diketo-UDCA betrug 10 mM (mit Rohextrakt) bzw. 40 mM (Ganzzellbiokatalysatoren).
A) Biotransformation mit Rohextrakt
Bedingungen: 0,5 mg 3a-HSDH(N); 0,5 mg 7-ßHSDH(C); 5 mg GDH; 10 mM 3,7-Diketo- UDCA; 0,5 mM NAD+ als auch 0,5 mM NADP+; 50 mM Glucose in 100 mM Puffer (TEA, pH 7,5; Tris-HCI, pH 8,0; Tris-HCI, pH 8,5; Tris-HCI, pH 9,0). Nach 16 Stunden wurde eine Probe genommen und mittels HPLC analysiert.
Aus Figur 4 ist ersichtlich, dass die Reaktion stark pH-abhängig ist: Nach 16 Stunden sind in allen Ansätzen weder Edukt noch die Zwischenverbindung 3-Keto-UDCA nachweisbar. Weiterhin kann man erkennen, das bei einem pH-Wert von 7,5 noch ca. 49 % vom Zwischen- produkt 7-KLCA nachweisbar ist und bei einem pH-Wert von 8 nur noch ca. 14 %. Bei den Umsetzungen mit einem pH-Wert von 8,5 bzw. 9,0 konnte eine vollständige Umsetzung gemessen werden.
B) Biotransformation mit Ganzzell biokatalysatoren
B1 ) Ganzzellbiokatalysator £. coli DB03: Bedingungen:
5 mg(BFM)/ml E. coli DB03; 40 mM 3,7-Diketo-UDCA; 0,2 mM NAD+ als auch 0,2 mM NADP+; 200 mM Glucose in 5 mM Puffer (Zitronensäure, pH 6,0). Die Reaktion lief am pH- Stat/Titrino, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 10%iger NaOH konstant bei 6,0 gehalten wurde. Nach 0, 5 und 20,5 Stunden wurde eine Probe genommen und mittels HPLC analysiert.
Aus Figur 5 geht hervor, dass nach 20,5 Stunden ein Umsatz von ca. 90 % mit dem Ganz- zellbiokatalysator E. coli DB03 detektiert werden konnte. Des Weiteren konnte 10 % Zwischenprodukt 7-KLCA detektiert werden. Das Zwischenprodukt 3-Keto-UDCA akkumulierte nach 5 Stunden mit einem Anteil von ca. 30 %, allerdings wurde es in der Folge vollständig von der 3a-HSDH umgesetzt.
B2) Ganzzellbiokatalysator £. coli DB02:
Bedingungen:
5 mg(BFM)/ml E. coli DB02; 40 mM 3,7-Diketo-UDCA; 0,2 mM NAD+ als auch 0,2 mM NADP+; 200 mM Glucose in 5 mM Puffer (Zitronensäure, pH 6,0). Die Reaktion lief am pH- Stat/Titrino, der pH-Wert wurde durch Zugabe von 10%iger NaOH konstant bei 6,0 gehalten. Nach 0, 5 und 20,5 Stunden wurde eine Probe genommen und mittels HPLC analysiert.
Aus Figur 6 geht hervor, dass nach 27 Stunden ein Umsatz von ca. 93 % mit dem Ganzzellbiokatalysator E. coli DB03 detektiert werden konnte. Die restlichen 7 % sind dem Zwischenprodukt 7-KLCA zuzuordnen. Das Intermediat 3-Keto-UDCA konnte zu den genommenen Zeiten nicht detektiert werden.
Anhang
Aminosäuresequenz der NADH-abhängigen 3a-HSDH aus C. testosteroni (28,56 kDa; mit N-terminalen His-Tag [unterstrichen]); MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSIIVISGCATGIGAATRKVLEAAGHQIVGIDIRDAEVI- ADLSTAEGRKQAIADVLAKCSKGMDGLVLCAGLGPQTKVLGNVVSVNYFGATELMDAFL- PALKKGHQPAAVVISSVASAHLAFDKNPLALALEAGEEAKARAIVEHAGEQGGNLAYAGS- KNALTVAVRKRAAAWGEAGVRLNTIAPGATETPLLQAGLQDPRYGESIAKFVPPM- GRRAEPSEMASVIAFLMSPAASYVHGAQIVIDGGIDAVMRPTQF
Aminosäuresequenz der NADPH-abhängigen 7ß-HSDH aus C. aerofaciens (29,82 kDa; mit C-terminalen 6xHis-Tag [unterstrichen])
MNLREKYGEWGLILGATEGVGKAFCEKIAAGGMNWMVGRREEKLNVLAGEIRETYG- VETKWRADFSQPGAAETVFAATEGLDMGFMSYVACLHSFGKIQDTPWEKHEAMIN- VNWTFLKCFHHYMRIFAAQDRGAVINVSSMTGISSSPWNGQYGAGKAFILKMTEAVACE- CEGTGVDVEVITLGTTLTPSLLSNLPGGPQGEAVMKIALTPEECVDEAFEKLGKELSVIAG- QRNKDSVHDWKANHTEDEYIRYMGSFYRDLEHHHHHH
Aminosäuresequenz der NAD(P)H-abhängigen Glucose Dehydrogenase aus B. subtilis strain 168 (28,07 kDa); doppelt unterstrichen sind die Aminosäuren, die ausgetauscht wurden.
MYPDLKGKWAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAG- GEAWVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMP- LKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKG- GIKLMT TLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGE- PEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG Hierin verwendete Sequenzen
Figure imgf000075_0001
AS = Aminosäuresequenz
NS = Nukleinsäuresequenz
Auf die Offenbarung der hierin erwähnten Druckschriften wird ausdrücklich Bezug genommen.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Herstellung einer Ursodesoxycholsäure (UDCA) der Formel (1 )
Figure imgf000076_0001
worin
R für Alkyl, H, ein Alkalimetallion oder N(R3)4 +steht, worin die Reste R3 gleich oder verschieden sind und für H oder Alkyl stehen, oder wobei die Gruppe -C02R durch eine Säureamid-Gruppe der Formel -ONR1R2 ersetzt ist, worin R1 und R2 unabhängig voneinander für einen Alkylrest stehen,
wobei man a) eine Chenodeoxycholsäure (CDCA) der Formel (2)
Figure imgf000076_0002
worin R oder die Gruppe -C02R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
zu einer 3,7-Diketo-Ursodeoxyccholsäure (3,7-Diketo -UDCA) der Formel (3)
Figure imgf000076_0003
worin R oder die Gruppe -C02R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, chemisch oxi- diert; und das gebildete 3, 7-Deketo-UDCA gegebenenfalls aufreinigt, b) die in Stufe a) gebildete 3,7-Diketo-UDCA der Formel (3) in Gegenwart wenigstens einer 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase (7ß-HSDH) und in Gegenwart wenigstens einer 3a- Hydroxysteroiddehydrogenase (3a-HSDH) zur UDCA-Verbindung der obigen Formel (1 ) enzyma- tisch reduziert, und das Reaktionsprodukt gegebenenfalls weiter aufreinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei man in Stufe a) eine chemische Oxidation unterzieht, wobei das eingesetzte Oxidationsmittel zur Oxidation einer sekundären Hydroxylgruppe befähigt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Oxidationsschritt ausgewählt ist unter einer SWERN-Oxidation und einer TEMPO-Oxidation und einer Oxidation mittels Natriumhypochlorit.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Stufe b) in Gegenwart und unter Verbrauch von Reduktionsäquivalenten (NADH und/oder NADPH) durchführt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Stufe b) verwendeten 3a-HSDH und 7ß-HSDH gleiche oder verschiedene Cofaktor-Spezifität besitzen.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Stufe b) zur Cofaktor- Regeneration mit wenigstens einem weiteren, die verbrauchten Regenerationsäquivalente regenerierenden Enzym koppelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei verbrauchtes NADPH durch Kopplung mit einem NADPH-regenerierenden Enzym regeneriert wird, wobei dieses insbesondere ausgewählt ist unter NADPH Dehydrogenasen, Alkoholdehydrogenasen (ADH), und NADPH regenerierenden For- miatdehydrogenasen (FDH) und einer NADPH-regenerierenden Glucosedehydrogenase (GDH) sowie NADPH-regenerierenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH); und/oder wobei verbrauchtes NADH durch Kopplung mit einem NADH-regenerierenden Enzym regeneriert wird, wobei dieses insbesondere ausgewählt ist unter NADH-Dehydrogenasen, NADH- regenerierenden Formiatdehydrogenasen (FDH), NADH-regenerierenden Alkoholdehydrogenasen (ADH), NADH-regenerierenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), NADH- regenerierenden Phosphitdehydrogenasen (PtDH) sowie NADH-regenerierenden Glucosedehyd- rogenasen (GDH); und/oder wobei verbrauchtes NADH und/oder verbrauchtes NADPH durch Kopplung mit einem beide Cofaktoren regenerierenden Enzym, ausgewählt unter einer GDH regeneriert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei verbrauchtes NADH und/oder verbrauchtes NADPH durch Kopplung mit einem beide Cofaktoren regenerierenden thermostabilen Mutante einer GDH aus Bacillus subtilis regeneriert wird, insbesondere der E170K,Q262L-Doppelmutante gemäß SEQ ID NO: 14J
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei man dem Reaktionsmedium Glucose als Substrat für die GDH zusetzt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei man dem Reaktionsmedium zusätzlich NAD+ und/oder NADP+ zusetzt, um (zusätzliche) Reduktionsäquivalente für die enzymatische Umsetzung zur 3,7-Deketo-UDCA-Verbindung der Formel (3) gemäß Stufe b) zu generieren.
1 1. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Stufe b) mit isolierten, oder angereicherten Enzymen (7ß-HSDH, die 3a-HSDH und gegebenenfalls das zu Cofaktor- Regenerierung benötigte Enzym) oder mit Zell-Rohextrakt (enthaltend die 7ß-HSDH, die 3a- HSDH und gegebenenfalls das zu Cofaktor-Regenerierung benötigte Enzym) oder mit rekombi- nanten Mikroorganismen durchgeführt wird, welche die 7ß-HSDH, die 3a-HSDH und gegebenen- falls das zu Cofaktor-Regenerierung benötigte Enzym funktional exprimieren.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , wobei das man einen rekombinanten Mikroorganismus verwendet, in welcher unerwünschte Nebenaktivität einer 7a-HSDH inhibiert ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die 7ß-HSDH ausgewählt ist unter folgenden Enzymen und Enzymmutanten, wobei das nichtmutierte Enzym eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 1 aufweist: Position der Typ Bevorzugte Mutation Cofaktor Mutation Nutzung
WT (Colinsella WT Keine NADPH aerofaciens)
C-His-Tag WT 6xHis-Tag NADPH N-His-Tag
T17 s T17 F, A, I, oder S NADPH/
NADH
G39 s G39 S, A, D, V, I, L, C, K, Y, F, R, T, P, N, E, Q, H, oder NADPH/
W NADH
R64 s R64 E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N NADPH
G39/R64 D G39S/R64E oder G39S/R64D NADPH
G39/R40 D G39D/R40F, G39D/R40I, G39D/R40L, oder G39D/R40W, NADH
G39/R40/R41 T G39D/R40F/R41 (K, Q, S oder R) NADH
G39D/R40I/R41 N
G39/R40/R41/K44 Q G39D/R40F/R41 K/K44(G, N oder Q) NADH
R40 S R40D, E, I, V, L, G oder A. NADH
R41 S R41 N.I.L oder V NADH
G39/R40 R40/R41 D G39D/R40I, G39D/R40V, G39D/R40L oder R40D/R41 I NADH G39/R41
WT = Wildtyp; S = Einfachmutation; D = Doppelmutation; T = Dreifachmutation; Q = Vierfachmutation
mitumfasst sind dabei Varianten, die C- und/oder N-terminal , insbesondere mit einer His-Tag- Sequenz verlängert sind ; und wobei die obigen Mutanten zusätzlich in jeder der Positionen K44, R53, K61 , R64 zusätzlich mutiert sein können.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die 3a-HSDH ausgewählt ist unter folgenden Enzymen und Enzymmutanten, wobei das nichtmutierte Enzym eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 aufweist. Position der Typ Bevorzugte Mutation Cofaktor
Mutation Nutzung
WT (Coma- WT NADH
monas testos- teroni)
C-His-Tag WT 6xHis-Tag NADH
N-His-Tag?
R34 s R34N, L, S oder C NADH
L68* s L68A,C,K,S oder V NADH
R34/L68 D R34N/L68A NADH
P185* S P185A, G, T, V oder S NADH
T188* S T188A, S, V, oder G NADH
T188/P185 D P185A/T188A; NADH
P185A/T188S;
L68/P185 D L68A/P185A und L68C/P185A NADH
L68/T188 D L68A/T188A und L68A/T188S; NADH
L68C/T188A und L68C/T188S
WT = Wildtyp; S = Einfachmutation; D = Doppelmutation
mitumfasst sind dabei Mutanten, die C- und/oder N-terminal, insbesondere mit einer His-Tag- Sequenz verlängert sind.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei folgende Enzymkombinationen verwendet werden
Figure imgf000080_0001
WT = Wildtyp
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