DE10019062A1

DE10019062A1 - 2-Guanidino-4-aryl-chinazoline als NHE-3 Inhibitoren

Info

Publication number: DE10019062A1
Application number: DE10019062A
Authority: DE
Inventors: Rolf Gericke; Norbert Beier; Claudia Wilm
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2001-10-25
Also published as: HUP0300909A3; MXPA02010264A; SK13472002A3; NO20024997D0; WO2001079186A1; PL356559A1; CN1422260A; JP2004501082A; AU2001293373A1; NO20024997L; KR20030011789A; BR0109867A; AR028914A1; EP1274691A1; CA2406161A1; US20040224965A1; ZA200209274B; RU2002130246A; HUP0300909A2

Abstract

Verbindungen der Formel I DOLLAR F1 worin DOLLAR A Ar unsubstituiertes oder einfach durch R·3· substituiertes Phenyl oder Naphthyl, DOLLAR A R·1·, R·2· jeweils unabhängig voneinander H, A, OA, Hal oder CF¶3¶, DOLLAR A R·3· A, OA, Hal oder CF¶3¶, DOLLAR A A Alkyl mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atomen, DOLLAR A Hal F, Cl, Br oder I DOLLAR A bedeutet, DOLLAR A sowie deren Salze und Solvate als NHE-3-Inhibitoren.

Description

Die Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I

worin
Ar unsubstituiertes oder einfach durch R³ substituiertes Phenyl oder Naphthyl,
R¹, R² jeweils unabhängig voneinander H, A, OA, Hal oder CF₃,
R³ A, OA, Hal oder CF₃,
A Alkyl mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atomen,
Hal F, Cl, Br oder I
bedeutet,
sowie deren Salze und Solvate als NHE-3-Inhibitoren.

Die Formel I umfaßt auch die tautomeren Verbindungen der Formel I'

Andere Inhibitoren des Natrium/Protonen-Austauschers Subtyp 3 sind z. B. in der EP 0 825 178 beschrieben.

Die Verbindungen der Formel I bzw. I' sind bereits in US 3,131,187 be schreiben, sowie deren Verwendung für andere Zwecke.

Chinazolinyl-guanidinderivate sind beschrieben von V. I. Shvedov et al. in Pharm. Chem. J. (Engl. Transl.) 1980, 14, 532-538 oder in Khim. Farm. Zh. 1980, 14, 38-43, sowie von S. C. Bell et al. in J. Med. Pharm. Chem. 1962, 5, 63-69.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvol len Eigenschaften aufzufinden, insbesondere solche, die zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel I und ihre Salze bei guter Verträglichkeit den Natrium/Protonen-Aus tauscher Subtyp 3 inhibieren.

Die Verbindungen der Formel I können als Arzneimittelwirkstoffe in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden.

Es ist bekannt, daß der Na⁺/H⁺-Austauscher eine Familie mit mindestens 6 unterschiedlichen Isoformen darstellt (NHE-1 bis NHE-6), die nun alle klo niert sind. Während der Subtyp NHE-1 ubiquitär im ganzen Körper in allen Geweben verteilt ist, werden die übrigen NHE-Subtypen selektiv in spezifi schen Organen wie in der Niere oder in der Lumenwand und Kontralumi nalwand des Dünndarms exprimiert. Diese Verteilung spiegelt die spezifi schen Funktionen wider, denen die verschiedenen Isoformen dienen, nämlich einerseits die Regulation des intrazellulären pH-Werts und des Zellvolumens durch den Subtyp NHE-1 und andererseits die Na⁺-Auf nahme und -Wiederaufnahme in Darm und Niere durch die Isoformen NHE-2 bzw. NHE-3. Die Isoform NHE-4 wurde hauptsächlich im Magen gefunden. Die Expression von NHE-5 beschränkt sich auf Gehirn und Neu ronengewebe. NHE-6 stellt diejenige Isoform dar, die den Natriumproto nenaustauscher in den Mitochondrien bildet.

Die Isoform NHE-3 wird insbesondere in der Apicalmembran der proxima len Nierentubuli exprimiert; ein NHE-3-Hemmstoff übt daher u. a. eine Nie renschutzwirkung aus.

Die therapeutische Verwendung eines selektiven Hemmstoffs für NHE-3- Isoformen ist vielseitig. NHE-3-Hemmstoffe hemmen oder verringern Ge webeschäden und Zellnekrosen nach pathophysiologischen hypoxischen und ischemischen Ereignissen, die zu einer Aktivierung der NHE-Aktivität führen, wie dies während Nierenischämie oder während der Entfernung, des Transports und der Reperfusion einer Niere bei der Nierenverpflan zung der Fall ist.

Die Verbindungen der Formel I wirken zytoprotektiv, indem sie die über schiessende Aufnahme von Natrium und Wasser in die Zellen von mit Sauerstoff unterversorgten Organen verhindern.

Die Verbindungen der Formel I wirken blutdrucksenkend und eignen sich als Arzneimittelwirkstoffe zur Behandlung der Hypertonie. Weiterhin eig nen sie sich als Diuretika.

Die Verbindungen der Formel I wirken alleine oder in Verbindung mit NHE- Inhibitoren anderer Subtypspezifität antiischämisch und können verwendet werden bei Thrombosen, Atherosklerose, Gefäßspasmen, zum Schutz von Organen, z. B. Niere und Leber, vor und während Operationen, sowie bei chronischem oder akutem Nierenversagen.

Weiterhin können sie verwendet werden zur Behandlung von Schlaganfall, des Hirnödems, Ischämien des Nervensystems, verschiedenen Formen des Schocks, z. B. des allergischen, kardiologischen, hypovolaäischen oder bakteroellen Schocks, sowie zur Verbesserung des Atemantriebs bei beispielsweise folgenden Zuständen: zentrale Schlafapnoen, plötzlicher Kindstod, postoperative Hypoxie und anderen Atemstörungen.

Durch die Kombination mit einem Carboanhydrase-Hemmer kann die At mungstätigkeit weiter verbessert werden.

Die Verbindungen der Formel I wirken inhibierend auf die Proliferationen von Zellen, beispielsweise der Fibroblasten-Zellproliferation und der Pro liferation der glatten Gefäßmuskelzellen und können daher zur Behand lung von Krankheiten verwendet werden, bei denen die Zellproliferation ei ne primäre oder sekundäre Ursache darstellt.

Die Verbindungen der Formel I können verwendet werden gegen diabeti sche Spätkomplikationen, Krebserkrankungen, fibrotische Erkrankungen, endotheliale Disfunktion, Organhypertrophien und -hyperplasien, insbe sondere bei Prostatahyperplasie bzw. Prostatahypertrophie.

Ferner eignen sie sich als Diagnostika zur Bestimmung und Unterschei dung bestimmter Formen der Hypertonie, der Atherosklerose, des Diabe tes und proliferativer Erkrankungen.

Da die Verbindungen der Formel I auch den Spiegel der Serumlipoprotei ne vorteilhaft beeinflussen, können sie zur Behandlung eines erhöhten Blutfettspiegels alleine oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln ein gesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Thrombosen, ischämischen Zuständen des Herzens, des peripheren und zentralen Nervensystems und des Schlaganfalls, ischämischen Zuständen peripherer Organe und Gliedmaßen und zur Behandlung von Schockzu ständen.

Gegenstand der Erfindung ist weiter die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Sal ze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zum Einsatz bei chirurgischen Operationen und Organtransplantationen und zur Konservie rung und Lagerung von Transplantaten für chirurgische Maßnahmen.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, bei denen die Zellproliferation eine primäre oder sekundäre Ursache darstellt, zur Behandlung oder Prophylaxe von Störungen des Fettstoffwechsels oder gestörtem Atemantrieb.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Sal ze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischer Niere, ischämischen Darmerkrankungen oder zur Pro phylaxe von akutem oder chronischen Nierenerkrankungen.

Methoden zur Identifizierung von Substanzen, die den Natrium/Protonen- Austauscher Substyp 3 inhibieren, sind z. B. in US 5,871,919 beschrieben.

Für alle Reste in den Verbindungen der Formel I, die mehrfach auftreten, wie z. B. A, gilt, daß deren Bedeutungen unabhängig voneinander sind.

Unter Hydraten und Solvaten versteht man z. B. die Hemi-, Mono- oder Dihydrate, unter Solvaten z. B. Alkoholadditionsverbindungen wie z. B. mit Methanol oder Ethanol.

In den vorstehenden Formeln bedeutet A Alkyl, ist linear oder verzweigt, und hat 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atome. A bedeutet vorzugsweise Methyl, weiterhin Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.- Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3-Methylbutyl, 1,1-, 1,2- oder 2,2- Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-, 2-, 3- oder 4-Methylpentyl, 1,1-, 1,2-, 1,3-, 2,2-, 2,3- oder 3,3-Dimethylbutyl, 1- oder 2-Ethylbutyl, 1-Ethyl- 1-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, 1,1,2- oder 1,2,2-Trimethylpropyl.

OA bedeutet vorzugsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy oder Butoxy.

Hal bedeutet vorzugsweise F, Cl oder Br, aber auch I.

Ar bedeutet vorzugsweise unsubstituiertes Phenyl oder Naphthyl, weiterhin vorzugsweise z. B. durch A, Fluor, Chlor, Brom, Iod, Methoxy, Ethoxy, Pro poxy, Butoxy oder CF₃ monosubstituiertes Phenyl oder Naphthyl.

Dementsprechend ist Gegenstand der Erfindung insbesondere die Ver wendung derjenigen Verbindungen der Formel I, in denen mindestens ei ner der genannten Reste eine der vorstehend angegebenen bevorzugten Bedeutungen hat. Einige bevorzugte Gruppen von Verbindungen können durch die folgenden Teilformeln Ia bis Ik ausgedrückt werden, die der Formel I entsprechen und worin die nicht näher bezeichneten Reste die bei der Formel I angegebene Bedeutung haben, worin jedoch
in Ia
R¹ H oder Hal
bedeutet;
in Ib
R¹ H oder Hal,
R² H
bedeuten;
in Ic
R¹ H oder Hal,
R² H
Ar Phenyl
bedeuten;
in Id
R¹ H oder Hal,
R² H
R³ A, OA oder Hal
bedeuten;
in Ie
Ar Phenyl bedeutet;
in If
Ar Phenyl,
R¹, R² jeweils unabhängig voneinander H, A, OA, Hal oder CF₃
bedeuten;
in Ig
Ar unsubstituiertes oder einfach durch R³ substituiertes Phenyl,
R¹ H oder Hal,
R² H
R³ A, OA oder Hal
bedeuten;
in Ih
Ar einfach durch R³ substituiertes Phenyl,
R¹ H oder Hal,
R² H,
R³ A, OA oder Hal
bedeuten;
in Ii
Ar einfach durch R³ substituiertes Phenyl,
R¹ H, Hal, OA oder A,
R² H,
R³ Hal
bedeuten;
in Ij
Ar einfach durch R³ substituiertes Phenyl,
R¹ H, Hal, OA oder A,
R² H oder OA,
R³ Hal
bedeuten;
in Ik
Ar unsubstituiertes oder einfach durch R³ substituiertes Phenyl,
R¹ H, Hal, OA oder A,
R² H oder OA,
R³ Hal
bedeuten.

Die Verbindungen der Formel I und auch die Ausgangsstoffe zu ihrer Her stellung werden im übrigen nach an sich bekannten Methoden hergestellt, wie sie in der Literatur (z. B. in den Standardwerken wie Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart) be schrieben sind, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die für die genan nten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann man auch von an sich bekannten, hier nicht näher erwähnten Varianten Gebrauch ma chen.

Die Ausgangsstoffe können, falls erwünscht, auch in situ gebildet werden, so daß man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort weiter zu den Verbindungen der Formel I umsetzt.

Die 2-Guanidino-4-aryl-chinazoline der Formel I werden vorzugsweise her gestellt, indem man o-Aminophenylketone der Formel II

worin R¹, R² und Ar die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit 1-Cyanguanidin umsetzt.

Die Umsetzung erfolgt in einem inerten Lösungsmittel.

Als inerte Lösungsmittel eignen sich z. B. Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Petrolether, Benzol, Toluol oder Xylol; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Trichlorethylen, 1,2-Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform oder Dichlormethan; Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol; Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Te trahydrofuran (THF) oder Dioxan; Glykolether wie Ethylenglykolmono methyl- oder -monoethylether (Methylglykol oder Ethylglykol), Ethylen glykoldimethylether (Diglyme); Ketone wie Aceton oder Butanon; Amide wie Acetamid, Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon (NMP) oder Dime thylformamid (DMF); Nitrile wie Acetonitril; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid (DMSO); Schwefelkohlenstoff; Carbonsäuren wie Ameisensäure oder Es sigsäure; Nitroverbindungen wie Nitromethan oder Nitrobenzol; Ester wie Ethylacetat oder Gemische der genannten Lösungsmittel.

Vorzugsweise wird DMF, Wasser oder ein Alkohol verwendet. Ganz besonders bevorzugt wird die Reaktion ohne ein Lösungsmittel, d. h. in der Schmelze, bei Temperaturen zwischen 100 und 200°C durchge führt.

Von Vorteil ist die Anwesenheit eines sauren Katalysators wie AlCl₃, TiCl₄, p-Toluolsulfonsäure, BF₃, Essigsäure, Schwefelsäure, Oxalsäure, POCl₃ oder Phosphorpentoxid.

Eine bevorzugte Variante besteht darin, daß einer der Reaktanden bereits als Salz, z. B. als Hydrochlorid, eingesetzt wird.

Eine weitere wertvolle Methode zur Herstellung der Verbindungen der Formel I besteht darin, daß man anstatt 1-Cyanguanidin eine Verbindung der Formel III

HN = CX-NH-C(=NH)-NH₂ III

worin
X -SA, -SAr, OA oder OAr
und Ar und A beispielsweise die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutun gen haben,
mit einer Verbindung der Formel II umsetzt.

Schließlich können die Verbindungen der Formel I durch Umsetzung von 2-Chlor-4-arylchinazolinen der Formel IV

worin Ar, R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben,
mit Guanidin hergestellt werden.

Eine Base der Formel I kann mit einer Säure in das zugehörige Säure additionssalz übergeführt werden, beispielsweise durch Umsetzung äqui valenter Mengen der Base und der Säure in einem inerten Lösungsmittel wie Ethanol und anschließendes Eindampfen. Für diese Umsetzung kom men insbesondere Säuren in Frage, die physiologisch unbedenkliche Sal ze liefern. So können anorganische Säuren verwendet werden, z. B. Schwefelsäure, Salpetersäure, Halogenwasserstoffsäuren wie Chlorwas serstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäuren wie Ortho phosphorsäure, Sulfaminsäure, ferner organische Säuren, insbesondere aliphatische, alicyclische, araliphatische, aromatische oder heterocyclische ein- oder mehrbasige Carbon-, Sulfon- oder Schwefelsäuren, z. B. Amei sensäure, Essigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, Diethylessigsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Ascor binsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure, Methan- oder Ethansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p- Toluolsulfonsäure, Naphthalin-mono- und -disulfonsäuren, Laurylschwefel säure. Salze mit physiologisch nicht unbedenklichen Säuren, z. B. Pikrate, können zur Isolierung und/oder Aufreinigung der Verbindungen der For mel I verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der Verbindungen der Formel I als NHE-3-Inhibitoren und/oder ihrer physiologisch unbedenk lichen Salze zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen, insbeson dere auf nicht-chemischem Wege. Hierbei können sie zusammen mit min destens einem festen, flüssigen und/oder halbflüssigen Träger- oder Hilfs stoff und gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren weite ren Wirkstoffen in eine geeignete Dosierungsform gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend mindestens einen NHE-3-Inhibitor der Formel I und/oder eines seiner physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

Diese Zubereitungen können als Arzneimittel in der Human- oder Veteri närmedizin verwendet werden. Als Trägerstoffe kommen organische oder anorganische Substanzen in Frage, die sich für die enterale (z. B. orale), parenterale oder topische Applikation eignen und mit den neuen Verbin dungen nicht reagieren, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Benzyl alkohole, Alkylenglykole, Polyethylenglykole, Glycerintriacetat, Gelatine, Kohlehydrate wie Lactose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline. Zur oralen Anwendung dienen insbesondere Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Pulver, Granulate, Sirupe, Säfte oder Tropfen, zur rektalen An wendung Suppositorien, zur parenteralen Anwendung Lösungen, vorzugs weise ölige oder wässrige Lösungen, ferner Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, für die topische Anwendung Salben, Cremes oder Puder, oder transdermal in Patches.

Die neuen Verbindungen können auch lyophilisiert und die erhaltenen Lyo philisate z. B. zur Herstellung von Injektionspräparaten verwendet werden. Die angegebenen Zubereitungen können sterilisiert sein und/oder Hilfs stoffe wie Gleit-, Konservierungs-, Stabilisierungs- und/oder Netzmittel, Emulgatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffer substanzen, Farb-, Geschmacks- und/oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten, z. B. ein oder mehrere Vitamine.

Als pharmazeutische Zubereitung für die Verabreichung in Form von Aero solen oder Sprays sind geeignet z. B. Lösungen, Suspensionen oder Emul sionen des Wirkstoffs der Formel I in einem pharmazeutisch unbedenkli chen Lösungsmittel.

Die Verbindungen der Formel I und ihre physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate können zur Behandlung und/oder Prophylaxe der oben beschrieben Krankheiten oder Krankheitszuständen verwendet werden.

Dabei werden die erfindungsgemäßen Substanzen in der Regel vorzugs weise in Dosierungen zwischen etwa 0,1 und 100 mg, insbesondere zwi schen 1 und 10 mg pro Dosierungseinheit verabreicht. Die tägliche Dosie rung liegt vorzugsweise zwischen etwa 0,001 und 10 mg/kg Körpergewicht. Die spezielle Dosis für jeden Patienten hängt jedoch von den verschieden sten Faktoren ab, beispielsweise von der Wirksamkeit der eingesetzten speziellen Verbindung, vom Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesund heitszustand, Geschlecht, von der Kost, vom Verabreichungszeitpunkt und weg, von der Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneistoffkombination und Schwere der jeweiligen Erkrankung, welcher die Therapie gilt. Die orale Applikation ist bevorzugt.

Beispiele

Bevorzugt als NHE-3-Inhibitoren sind die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe
4-Phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Fp. 247-250°C (Zersetzung;
4-Phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 236-238°C;
6-Chlor-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin,
6-Chlor-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 309-310°C;
4-(4-Bromphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 185-189°C;
4-(4-Chlorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 296-297°C.
4-(4-Methoxyphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 275-277 °C;
4-(4-Methylphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 300-301°C;
6-Chlor-4-(2-fluorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 275- 276°;
7-Methyl-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 300-301°C;
6-Brom-4-(2-fluorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 294- 295°;
7-Chlor-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 288-290°C;
7-Methoxy-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 280-282°C;
5-Methoxy-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 272-273°C;
6,7-Dimethoxy-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 220-222 °C;
6-Methoxy-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 278-279°C.
8-Chlor-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 309-310°C;
5-Chlor-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 300°C;
7-Chlor-4-(2-fluorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 281- 283°C;
6-Chlor-4-(4-chlorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 261- 262°C;
6-Brom-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Zers. 291-293°C;
6-Methyl-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 295-296°C;
6-Fluor-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin, Hydrochlorid, Fp. 283-285°C.

Pharmakologische Tests

Im folgenden ist die Methodik dargestellt, die zur Charakterisierung der Verbindungen der Formel I als NHE-3-Inhibitoren verwendet wurde.

Die Verbindungen der Formel I wurden in bezug auf ihre Selektivität ge genüber den Isoformen NHE-1 bis NHE-3 charakterisiert. Die drei Isofor men wurden in Maus-Fibroblastenzellinien stabil exprimiert. Die Hemmwir kung der Verbindungen wurde durch Bestimmung der EIPA-empfindlichen ²²Na⁺-Aufnahme in die Zellen nach intrazellulärer Acidose beurteilt. Zur Charakterisierung der Na⁺/H⁺-Austauschhemmstoffe in bezug auf ihre Isoformselektivität untersuchten wir die Verbindungen auf ihre Hemmung der NHE-Isoformen NHE-1, -2 und -3, die in einer Maus- Fibroblastenzellinie stabil exprimiert wurden (siehe Verfahrensteil), da durch, daß die EIPA-empfindliche ²²Na⁺-Aufnahme in die Zellen nach in trazellulärer Acidose bestimmt wurde.

Material und Methoden LAP1-Zellinien, die die unterschiedlichen NHE-Isoformen exprimieren

Die LAP1-Zellinien, die die Isoformen NHE-1, -2 und -3 exprimieren (eine Maus-Fibroblastenzellinie), wurden von Prof. J. Pouysségur (Nice, Frank reich) erhalten. Die Transfektionen wurden nach dem Verfahren von Fran chi et al. (1986) durchgeführt. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifizier tem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% inaktiviertem fötalem Kälberserum (FKS) kultiviert. Zur Selektion der NHE-exprimierenden Zellen wurde das sogenannte "Säureabtötungsverfahren" von Sardet et al. (1989) verwen det. Die Zellen wurden zuerst 30 Minuten in einem NH₄Cl-haltigen bicar bonat- und natriumfreien Puffer durch Waschen mit einem bicarbonat-, NH₄Cl- und natriumfreien Puffer entfernt und es wurde mit einem bicarbo natfreien NaCl-haltigen Puffer inkubiert. Nur diejenigen zellen, die NHE funktionell exprimieren, konnten in der intrazellulären Ansäuerung, der sie ausgesetzt wurden, überleben.

Charakterisierung von NHE-Hemmstoffen in bezug auf ihre Isoformselekti vität

Mit den obengenannten Maus-Fibroblastenzellinien, die die Isoformen NHE-1, NHE-2 und NHE-3 exprimieren, wurden Verbindungen nach der von Counillon et al. (1993) und Scholz et al. (1995) beschriebenen Vorge hensweise auf Selektivität gegnüber den Isoformen geprüft. Die Zellen wurden intrazellulär nach dem NH₄Cl-Prepulse-Verfahren und anschlie ßend durch Inkubation in einem bicarbonatfreien ²²Na⁺-haltigen Puffer an gesäuert. Aufgrund der intrazellulären Ansäuerung wurde NHE aktiviert und Natrium wurde in die Zellen aufgenommen. Die Auswirkung der Prüfverbindung wurde als Hemmung der EIPA (Ethyl-isopropylamilorid)- empfindlichen ²²Na⁺-Aufnahme ausgedrückt.

Die Zellen, die NHE-1, NHE-2 und NHE-3 exprimierten, wurden in einer Dichte von 5-7,5 × 10⁴ Zellen/Näpfchen in Mikrotiterplatten mit 24 Näpf chen überimpft und 24 bis 48 Stunden bis zur Konfluenz gezüchtet. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen wurden 60 Minuten bei 37°C im NH₄Cl-Puffer (50 mM NH₄Cl, 70 mM Cholinchlorid, 15 mM MOPS, pH 7,0) inkubiert. Anschließend wurde der Puffer entfernt und die Zellen wurden rasch zweimal mit dem Cholinchlorid-Waschpuffer (120 mM Cholinchlorid, 15 mM PIPES/Tris, 0,1 mM Ouabain, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, pH 7,4) überschichtet; in diesem Puffer wurden die Zellen 6 Minuten inkubiert. Nach Ablaufen der Inkubationszeit wurde der Inkubationspuffer abgesaugt. Zwecks Entfernung extrazellulärer Radioaktivität wurden die Zellen viermal rasch mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Danach wurden die Zellen durch Zusatz von 0,3 ml 0,1 N NaOH pro Näpf chen solubilisiert. Die zellfragmenthaltigen Lösungen wurden in Szintillati onsröhrchen überführt. Jedes Näpfchen wurde noch zweimal mit 0,3 ml 0,1 N NaOH gewaschen und die Waschlösungen wurden ebenfalls in die entsprechenden Szintillationsröhrchen gegeben. Die das Zellysat enthal tenden Röhrchen wurden mit Szintillationscocktail versetzt und die in die Zellen aufgenommene Radioaktivität wurde durch Bestimmung der β- Strahlung bestimmt.

Hemmung der ²²Na⁺-Aufnahme in Kaninchen-Erythrozyten

Die Na⁺/H⁺-Austauschaktivität wurde auch durch Beobachtung der Auf nahme von ²²Na⁺-Ionen in sauergestellte Kaninchen-Erythrozyten be stimmt. Kaninchen-Erythrozyten haben bei Untersuchungen zur Na⁺/H⁺- Austauschaktivität breite Anwendung gefunden (Escobales & Fugueroa, 1991; Morgan & Canessa, 1990). Der EIPA-empfindliche Anteil der ²²Na⁺- Aufnahme in sauergestellte Erythrozyten wurde als Na⁺/H⁺-abhängige ²²Na⁺-Aufnahme angesehen.

Zellpräparation

Die Präparation der roten Blutkörperchen sowie die interne Ansäuerung der roten Blutkörperchen wurden in starker Anlehnung an die Verfahren von Morgan und Canessa (1990) durchgeführt.

Das Blut wurde von Kaninchen erhalten (z. B. New Zealand White). Es wurde in 50-ml-Falcon-Zentrifugenröhrchen aufgefangen, die 5 ml Natri umheparinlösung (250 U/ml) enthielten. Das Blut und die Heparinlösung wurden gut vermischt. Die roten Blutkörperchen wurden durch Zentrifugation bei 2000 × g bei 4°C gewonnen; Plasma und Leukozytenmanschette wurden entfernt. Die verbleibende Lösung wurde durch 200-µm-Gaze fil triert. Das Filtrat wurde mit Waschpuffer wieder auf das ursprüngliche Vo lumen suspendiert (140 mM KCl, 0,15 mM MgCl₂, 10 mM TRIS/MOPS, pH 7,4). Die roten Blutkörperchen wurden wiederum durch Zentrifugation ge wonnen (2000 × g, 4°C). Der Waschvorgang wurde zweimal wiederholt.

Intrazelluläre Ansäuerung

Zur intrazellulären Ansäuerung wurden 5 ml der abgesetzten gesammelten roten Blutkörperchen wiederum mit 45 ml Ansäuerungspuffer suspendiert (170 mM KCl, 0,15 mM MgCl₂, 0,1 mM Ouabain, 10 mM Glucose, 10 mM Saccharose, 20 mM Tris/Mes, pH 6,2). Die Suspension der roten Blutkör perchen wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert (unter gelegentlichem Mi schen). Um den internen pH zu fixieren, versetzt man mit bis zu 200 µM und 1 mM DIDS bzw. DIAMOX (acetazolamid). Man inkubierte noch 30 Mi nuten bei 37°C.

Die roten Blutkörperchen wurden anschließend durch Zentrifugation ge wonnen (4 Minuten bei 2000 × g, 4°C); sie wurden wiederum mit eiskalter ungepufferter Waschlösung (170 mM KCl, 40 mM Saccharose, 0,15 mM MgCl₂) suspendiert und damit viermal gewaschen.

Inkubation sowie Messung der ²²Na⁺-Aufnahme

Die Inkubation wurde in Macrowell-Tube-Streifen in einem Format von 8 × 12 durchgeführt. Mit der Inkubation wurde dadurch begonnen, daß man 200 µl Inkubationspuffer (160 mM KCl, ²²NaCl (37 MBq/Näpfchen), 10 mM NaCl, 0,15 mM MgCl₂, 0,1 mM Ouabain, 10 mM Glucose, 40 mM Saccha rose, 10 mM Tris/MOPS, ph 8,0, 0,5 mM Diamox, 1% DMSO) mit 20 µl der (vorgewärmten) angesäuerten Lösung der roten Blutkörperchen versetzte. Die Prüfsubstanzen wurden zuerst mit 100% DMSO gelöst und die Lösung wurde anschließend mit Inkubationspuffer auf die entsprechenden Kon zentrationen verdünnt. Man inkubierte 5 Minuten bei 37°C. (In Vorversu chen wurde gezeigt, daß unter diesen Inkubationsbedingungen die ²²Na- Aufnahmerate während der 5-minütigen Inkubationsdauer linear war).

Die Inkubation wurde durch Zugabe von 800 µl eiskalter Stopplösung (112 mM MgCl₂, 0,1 mM Ouabain) gestoppt. Die Röhrchen wurden kurzfristig auf Eis aufbewahrt. Anschließend wurden die Röhrchen mit Parafilm ab gedeckt und die roten Blutkörperchen wurden durch 7-minütige Zentrifuga tion bei 2000 × g und 4°C gewonnen. Der Überstand wurde mit einem selbstgemachten Absaugegerät abgesaugt, mit dem man 4 nebeneinan derliegende Röhrchen gleichzeitig absaugen konnte; Abstandhalterringe an den weiteren Enden der Spitzen verhinderten, daß die Spitzen zu tief in die Röhrchen eintauchten und man das Pellet der roten Blutkörperchen absaugte. Alle ²²Na-haltigen Überstände sowie Waschlösungen wurden aufbewahrt und als radioaktiver Abfall entsorgt.

Die roten Blutkörperchen wurden dreimal mit 900 µl eiskalter Stopplösung gewaschen, und zwar dadurch, daß man den oben beschriebenen Sus pendierungs-/Zentrifugationsschritt wiederholte. Nach dem letzten Wa schen wurde das Pellet der roten Blutkörperchen mit 200 µl Wasser ver setzt. Anschließend wurden die Röhrchen 2 × 30 Minuten mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurden die Macrowell-Tube-Streifen auseinan dergenommen und jedes Röhrchen wurde kopfüber in ein eigenes Szintil lationsröhrchen gegeben; durch leichtes Schütteln entleerte sich die hä molysierte Lösung der roten Blutkörperchen in das Szintillationsgläschen. Jedes Gläschen wurde mit 3 ml der Szintillationsflüssigkeit Aquasafe 300 PS versetzt, und die Gläschen wurden mit Verschlüssen versehen und gut gemischt.

Die in die roten Blutkörperchen aufgenommene Radioaktivität wurde in ei nem Szintillationszähler durch Verfolgen des β-Zerfalls bestimmt. Pro Substanzkonzentration wurde die bestimmung in dreifacher Wieder holung durchgeführt. Von jedem Wert wurde das Mittel der Zählungsbe stimmung in gegenwart von 10 µM EIPA subtrahiert, um die nicht-Na⁺/H⁺- abhängige ²²Na⁺-Aufnahme in die Erythrozyten einzubeziehen. Das Mittel der verbleibenden Zählungen in Abwesenheit einer Substanz wurde als 100-%-Kontrolle verwendet; die Mittelwerte in Gegenwart der Prüfverbin dungen wurden als Prozentsatz dieses Kontrollwerts ausgedrückt. Die pro zentmäßigen Aufnahmedaten wurden semilogarithmisch aufgetragen; IC50-Werte wurden dadurch erzielt, daß man unter Verwendung der Glei chung f(x) = 100/(1 + (IC50/x)**n) die Werte an eine nichtlineare Kurve an passte.

Literatur

Counillon et al. (1993) Mol. Pharmacol. 44: 1041-1045
Escobales und Figueroa (1991) J. Membrane Biol. 120, 41-49
Franchi et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9388-9392
Morgan und Canessa (1990) J. Membrane Biol. 118, 193-214
Sardet et al. (1989) Cell 56: 271-280
Scholz et al. (1995) Cardiovasc. Res. 29: 260-268

Die nachfolgenden Beispiele betreffen pharmazeutische Zubereitungen:

Beispiel A Injektionsgläser

Eine Lösung von 100 g eines NHE-3-Inhibitors der Formel I und 5 g Dina triumhydrogenphosphat wird in 3 l zweifach destilliertem Wasser mit 2 n Salzsäure auf pH 6,5 eingestellt, steril filtriert, in Injektionsgläser abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jedes In jektionsglas enthält 5 mg Wirkstoff.

Beispiel B Suppositorien

Man schmilzt ein Gemisch von 20 g eines NHE-3-Inhibitors der Formel I mit 100 g Sojalecithin und 1400 g Kakaobutter, gießt in Formen und läßt erkalten. Jedes Suppositorium enthält 20 mg Wirkstoff.

Beispiel C Lösung

Man bereitet eine Lösung aus 1 g eines NHE-3-Inhibitors der Formel I, 9,38 g NaH₂PO₄ . 2H₂O, 28,48 g Na₂HPO₄ . 12H₂O und 0,1 g Benzalko niumchlorid in 940 ml zweifach destilliertem Wasser. Man stellt auf pH 6,8 ein, füllt auf 1 l auf und sterilisiert durch Bestrahlung. Diese Lösung kann in Form von Augentropfen verwendet werden.

Beispiel D Salbe

Man mischt 500 mg eines NHE-3-Inhibitors der Formel I mit 99,5 g Vaseli ne unter aseptischen Bedingungen.

Beispiel E Tabletten

Ein Gemisch von 1 kg eines NHE-3-Inhibitors der Formel I, 4 kg Lactose, 1,2 kg Kartoffelstärke, 0,2 kg Talk und 0,1 kg Magnesiumstearat wird in üblicher Weise zu Tabletten verpreßt, derart, daß jede Tablette 10 mg Wirkstoff enthält.

Beispiel F Dragees

Analog Beispiel E werden Tabletten gepreßt, die anschließend in üblicher Weise mit einem Überzug aus Saccharose, Kartoffelstärke, Talk, Tragant und Farbstoff überzogen werden.

Beispiel G Kapseln

2 kg eines NHE-3-Inhibitors der Formel I werden in üblicher Weise in Hart gelatinekapseln gefüllt, so daß jede Kapsel 20 mg des Wirkstoffs enthält.

Beispiel H Ampullen

Eine Lösung von 1 kg NHE-3-Inhibitor der Formel I in 60 l zweifach destil liertem Wasser wird steril filtriert, in Ampullen abgefüllt, unter sterilen Be dingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jede Ampulle enthält 10 mg Wirkstoff.

Claims

1. Verbindungen der Formel I
worin
Ar unsubstituiertes oder einfach durch R³ substituiertes Phenyl oder Naphthyl,
R¹, R² jeweils unabhängig voneinander H, A, OA, Hal oder CF₃,
R³ A, OA, Hal oder CF₃,
A Alkyl mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atomen,
Hal F, Cl, Br oder I
bedeutet,
sowie deren Salze und Solvate als NHE-3-Inhibitoren.

2. Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ih re physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Her stellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypertonie, von Thrombosen, ischämischen Zuständen des Herzens, des peripheren und zentralen Nervensystems und des Schlaganfalls, ischämischen Zuständen peripherer Organe und Gliedmaßen und zur Behandlung von Schockzuständen.

3. Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ih re physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Her stellung eines Arzneimittels zum Einsatz bei chirurgischen Operatio nen und Organtransplantationen und zur Konservierung und Lage rung von Transplantaten für chirurgische Maßnahmen.

4. Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ih re physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Her stellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, bei de nen die Zellproliferation eine primäre oder sekundäre Ursache dar stellt, zur Behandlung oder Prophylaxe von Störungen des Fettstoff wechsels oder gestörtem Atemantrieb.

5. Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ih re physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Her stellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischer Niere, ischämischen Darmerkrankungen oder zur Prophylaxe von akutem oder chronischen Nierenerkrankungen.

6. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt mindestens eines NHE-3-Inhibitors nach Anspruch 1 und/oder einem shrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate.

7. Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe
6-Chlor-4-(2-fluorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin;
6-Brom-4-(2-fluorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin;
6,7-Dimethoxy-4-phenyl-2-chinazolinyl-guanidin;
7-Chlor-4-(2-fluorphenyl)-2-chinazolinyl-guanidin;
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze.