DE2034593B2 - Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure - Google Patents

Description

Die FR-PS 15 71 551 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm, der zur Gattung Candida gehört und Zitronensäure anzureichern und Kohlenwasserstoffe zu assimilieren vermag, in einem wäßrigen Kulturmedium, das wenigstens eines der Normalparaffine von C9-30 als Hauptkohlenstoffquelle enthält, inokuliert, das Kulturmedium bei einem pH von etwa 4 bis etwa 7,5 inkubiert, bis Zitronensäure in wesentlicher Menge in der Kulturbrühe angereichert ist, und die so angereicherte Zitronensäure isoliert. Obwohl der pH-Wert in der FR-PS als zwischen etwa 4 und etwa 7,5 liegend angegeben wird, liegt der bevorzugte pH-Bereich zwischen 5 und 6,5 wie aus S. 3, Zeile 7/8 der FR-PS hervorgeht.

Dagegen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Umwandlung von ( + )-Isozitronensäure in Zitronensäure. Dies ist ein ganz andere·; erfinderisches Konzept als das erfinderische Konzept gemäß der genannten FR-PS.

Ferner wird bemerkt, daß der pH-Bereich von 7,0 bis 9,5, bei dem das vorliegende Verfahren durchgeführt wird, außerhalb des bevorzugten Bereichs von pH 5 bis 6,5 liegt, bei dem das Verfahren der FR-PS 15 71 551 vorteilhaft durchgeführt wird. Tatsächlich liegen alle Ausführungsbeispiele der FR-PS 15 71551 außerhalb des pH-Bereichs des vorliegenden Verfahrens. Auch darin unterscheiden sich die beiden Verfahren voneinander.

Für die Großherstellung von Zitronensäure ist jedoch das Verfahren dieser FR-PS nicht immer befriedigend, da die Ausbeute an Zitronensäure auf Basis der verwendeten Kohlenstoffquellen mit zunehmender Menge der gleichzeitig gebildeten (+ )-Isozitronensäure niedriger wird.

Die Bemühungen den Nachteil des obengenannten Verfahrens auszuschalten, hatten folgendes Ergebnis:

1) Die Fermentationsmaische gewisser Hefen, die Zellen dieser Hefen sowie eine aus der Maische oder den Hefezellen stammende verarbeitete Substanz haben die Fähigkeit, ( + )-Isozitronensäure in Zitronensäure umzuwandeln.

2) Diese Hefen gehören zu den Gattungen Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula, Trichosporon, Toruiopsis oder Pichia und vermögen

/ 1 \ I - * 1 »w" · Κ' I I

3) Die Fähigkeit zur Umwandlung ist bei einem pH-Wert von 7,0-9,5 erhöht

4) Es ist möglich, speziell die (H-)-Isozitronensäure in Zitronensäure in hoher Ausbeute umzuwandeln.

indem die Fermentationsmaische, die Hefezellen oder eine daraus stammende verarbeitete Substanz verwendet werden.

Diese Feststellungen sind sehr überraschend, da

in angenommen wurde, daß in der Fermentationsbrühe, in den Hefezellen und in deren verarbeiteten Stoffen verschiedene Arten von enzymatischen Wirkungen vorliegen, durch die die (-i-)-lsozitroner.säure nicht in Zitronensäure, sondern in andere Substanzen umgewandelt wird.

Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zugrunde. Sie ist von praktischem Wert für die Großherstellung von Zitronensäure.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein

2» Verfahren, wie es im Patentanspruch dargelegt ist.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann mit beliebigen Hefen und deren Mutanten durchgeführt werden, die ( + )-Isozitronensäure anzureichern vermögen und zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryo-

2i myces, Hansenula, Toruiopsis, Trichosporon oder Pichia gehören. Von diesen Mikroorganismen sind Hefen der Gattung Candida für die Zwecke der Erfindung an geeignetsten.

Typische Hefen, die für das Verfahren gemäß der

in Erfindung geeignet sind, sind nachstehend als Beispiele genannt. In der folgenden Liste sind die IFO-Nummern die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka.

,-, Candida guilliermondii, IFO064 3

Candida parapsilosis, IFO 0708

Candida tropicalis, IFO 0589

Candida mycoderma, IFO 0842

Candida intermedia, IFO 0761
₄₍₎ Candida lipolytica, IFO 14 Ώ, ATCC 20114

Candida nielibiosa, IFO 0961

Candida brumptii, IFO 0744

Candida sp. IFO 1455

Debaryomyces kloeckeri, IFO 0019
Debaryomyces subglobosus, IFO 0794
Debaryomyces hansenii, IFO 0564 und andere

Hansenula silvicolü, IFO 0807
Hansenula subpelliculosa, IFO 1458
Hansenula swa veolens, IFO 0992
Hansenula miso, IFO 0146

Kloeckera apiculata, IFO 0865

Toruiopsis famata, IFO 0856
Toruiopsis Candida, IFO 0380
Toruiopsis ernobii, IFO 0654

Pichia polymorpha, IFO 0195
Pichia halophila, IFO 0947
Pichia farinosa, IFO 0465

Saccharomyces acidifaciens, IFO 0468
Saccharomyces willianus, IFO 0248

Trichosporon behrendii, IFO 0844
Trichosporon capitatum, IFO0743

Brettanomyces clausscnii, IFO 1506
Brettanomyces lambicus, IFO 0797

Diese Hefe;) werden aus einem

ausgewählten

Medium gezüchtet, das den Eigenschaften der Hefe angepaßt ist Als assimilierbare Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlehydrate wie Glucose und Saccharose, Abfallmelasse, Stärkehydrolysat, Holzhydrolysat, verschiedene Alkohole wie Äthanol und Glycerin, Fettsäuren, wie Essigsäure und Oleinsäure, öle und Fette wie Sojabohnenöl und Fischöl, Kohlenwasserstoffe, z. B. Tetradctan, Hexadecan, Leuchtpetroleum und Gasöl rohe Fraktionen dieser Kohlenwasserstoffe und die verschiedensten anderen organischen Verbindungen und Stoffe, die von der Hefe assimiliert werden Können, allein oder in Kombination. Von diesen Kohlenstoffquellen sind paraffinische Kohlenwasserstoffe für die Großherstellung am vorteilhaftesten.

Als Stickstoffquellen können anorganische Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Amr.ioniumsulfat und Ammoniumphosphat sowie organische Ammoniumsalze wie Arnmoniumacetat und andere organische Stickstoffquellen wie Harnstoff, Hefeextrakt, Maisquellwasser und die Hydrolysate verschiedener Proteine vorteilhaft allein oder als Gemisch von 2 oder mehreren verwendet werden.

Es ist zweckmäßig, außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verschiedene anorganische Nährstoffe dem Medium zuzusetzen. Wenn beispielsweise die verwendete Hefe Vitamine zum Wachstum erfordert, müssen vorher ausreichende Mengen dieser Vitamine (z. B. Biotin, Pantothenat, Inosit) oder ein Material, das diese Vitamine enthält, z. B. Hefeextrakt, dem Medium zugesetzt werden.

Der pH-Wert während der Kultivierung liegt gewöhnlich zwischen etwa 3 und 7, vorzugsweise zwischen etwa 4 und 6,5.

Der pH-Wert des Mediums sinkt mit fortschreitender Fermentation. Gute Ergebnisse werden in vielen Fällen erzielt, wenn ein neutrales Salz, z. B. Calciumcarbonat, Calciumacetat oder Natriumacetat, dem Medium vorher als neutralisierendes Mittel zugesetzt wird. Dieses neutralisierende Mittel kann mehrmals während der Kultivierungsdauer zugesetzt werden. Natürlich können in Fällen, in denen ein neutralisierendes Mittel während der Kultivierung zugesetzt wird, auch andere neutralisierende Verbindungen wie Natriumhydroxyd, Calciumhydroxyd und wäßriges Ammoniak als Teilneutralisatoren verwendet werden.

Die Kultivierung der Hefen wird gewöhnlich unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Wenn die Bestandteile des Mediums in Wasser unlöslich oder schwerlöslich sind, sind ausreichendes Rühren und Vermengen wesentlich. Die übliche Schüttelkultur und die Rührkultur unter Belüftung genügen im wesentlichen diesen Bedingungen. Hierbei werden zuweilen gute Ergebnisse erzielt, wenn dem Medium vorher ein Antischaummittel oder eine oberflächenaktive Verbindung zugesetzt wird. Die Bebrütungstemperatur ist bei den verschiedenen Hefespezies unterschiedlich, jedoch wird gewöhnlich ein Bereich von 25 bis 35° C bevorzugt.

Die auf diese Weise erha'tene Fermentationsbrühe kann als solche für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Wenn die Abtrennung der Hefezellen erwünscht ist, kann dies nach beliebigen üblichen Verfahren, z. B. durch Filtration, Zentrifugierung, Sedimentation und Dekantierung, erfolgen.

Die Fermentationsbrühe oder die Zellen können einer mechanischen oder chemischen Behandlung zur Dehydratisierung, Reinigung oder Extraktion von aktiven Fraktionen und Stabilisierung der Aktivität uciiänOCit wcmcn, Süiüilgc ifife üi'SprüMgiiCilc Fälligkeit, (+)-Isozitronensäure in Zitronensäure umzuwandeln, nicht beeinträchtigt wird.

Der hier gebrauchte Ausdruck »verarbeitetes Material« umfaßt alle Präparate in Form von flüssigen Pasten ϊ und Pulvern, die beispielsweise durch Behandlung oder Extraktion mit Lösungsmitteln (z. B. Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Alkohole, Aceton), durch Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln, chemische Behandlung (z. B. Aussalzen), durch physikalisch-chemisehe Behandlungen (z.B. verschiedene Arten der Chromatographie, z. B. mit Ionenaustauschercellulose, Ionenaustauscherharzen und Aktivkohle), durch mechanische Behandlung (z. B. Gefriertrocknung, Mahlen, Konzentrierung, Trocknen, Ultraschallbehandlung) der r. Brühe oder Hefezellen herstellbar sind.

Als ( + )-Isozitronensäure, die in Zitronensäure umzuwandeln ist, kann die freie Säure, ein Salz dieser Säure oder ein Material, das eine oder beide dieser Verbindungen enthält, verwendet werden, gleichgültig, ob es sich um ein gereinigtes Präparat oder ein rohes Produkt handelt Wenn beispielsweise die (+)-Isozitronensäure in der in der beschriebenen Weise hergestellten Kultjrbrühe angereichert worden ist, kann die Brühe als solche verwendet werden. Es ist auch möglich, >·-> eine Lösung, eine Aufschlämmung oder eine getrocknete Masse der ( + )-Isozitronensäure, eines Salzes dieser Säure oder eines Gemisches dieser Verbindungen zu verwenden, die aus dieser Brühe nach üblichen, allein oder in Kombination angewandten Verfahren wie ι» Filtration, Zentrifugalabscheidung, Erhitzen, Ausfällung, Säulenchromatographie, Behandlung mit Aktivkohle, Konzentrierung und Dehydratisierung erhalten werden können.

Gemäß der Erfindung wird die Umwandlung von !> ( + )-Isozitronensäure in Zitronensäure in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Die Anteile an ( + )-Isozhronensäure und aktiven Materialien, d. h. Fermentationsbrühe, Hefezellen und verarbeiteten Stoffen, sollten so gewählt werden, daß die Ausbeute an Zitronensäure to maximal ist. Im allgemeinen genügen etwa 10 bis 100 Gew.-Teile des aktiven Materials, gerechnet auf Trockenbasis der Hefezellen, pro 100 Gew.-Teile (+)-lsozitronensäure.

Die erforderliche Umwandlungszeit beträgt etwa 0,5 ■t5 bis 10 Stunden. Der pi I-Wert des Umwandlungssystems kann von neutral bis alkalisch reichen und liegt insbesondere zwischen etwa 7,0 und 9,5.

Die Temperatur liegt zwischen etwa 25 und 45° C. Das Umwandlungssystem kann gegebenenfalls gerührt werden.

Um den pH-Wert des Systems während der gesamten Umwandlungsdauer innerhalb eines geeigneten Bereichs zu halten, kann eine Pufferlösung verwendet werden, die Phosphate, Tris(hydroxymethyl)aminome-■35 than, Glycin, Borate, Salzsäure und Natriumhydroxyd in geeigneter Kombination enthält. Es ist auch möglich, den pH-Wert des Systems während der Umwandlung von Zeit zu Zeit durch Zusatz einer Säure oder eines alkalischen Reagens während der Reaktion zu korrigie-W) ren.

Die Zitronensäure und (-l-)-Isozitronensäure im

System werden nach der Pentabromaceton-Methode von Kuratomi (Biochem. 27, 72 [1955]) und nach der enzymatischen Methode (Methoden der enzymatischen

t>5 Analyse, Seite 318 [Verlag Chemie]) bestimmt.

Die Umwandlung ist beendet, wenn die Anreicherung der Zitronensäure eine vorbestimmte Höhe erreicht hat.

AUS uicSciTi System kaiüi uie ZiüuncttSäürC üfiiViiiiel-

bar oder nach vorheriger, beispielsweise durch Zentrifugierung oder Filtration vorgenommener Entfernung der Feststoffe des Systems isoliert werden.

Die Zitronensäure kann beispielsweise durch Filtration, Zentrifugicrung, Erhitzen, Tällung, Säulenchromatographie, Behandlung mit Aktivkohle und Konzentrierung isoliert und gewonnen werden. Zur Erleichterung der Isolierung kann der pH-Wert der Brihe nach Belieben eingestellt werden. Wenn beispielsweise das unlösliche Calciumsalz im System vorhanden ist, ist es zweckmäßig, das System anzusäuern, um das Salz löslich zu machen, und dann die Zellen beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtration abzutrennen. Die auf diese Weise von Feststoffen befreite Lösung kann gegebenenfalls durch Zusatz von Natriumhydroxyd, Calciumcaibonat oder Kalkmilch neutralisiert werden. Aus dem so erhaltenen Gemisch wird die Zitronensäure und, falls vorhanden, auch die nicht umgesetzte ( + )-Isozitronensäure in Form von Calciumsalzen ausgefällt, die dann beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren und anschließendes Trocknen isoliert werden. Hierbei wird ein weißes Pulver von Calciumzitrat oder ein weißes Pulvergemisch von Calciumzitrat und Calcium-( + )-isozitrat erhalten. Aus diesem Produkt kann beispielsweise durch Neutralisation, Ionenaus· tauschbehandlung, Säulenchromatographie. Entfärbung, Filtration und Kondensation reine Zitronensäure erhalten werden.

Durch Wiederholung dieses Zyklus kann schließlich die gesamte (-l-)-Isozitronensäure in Zitronensäure umgewandelt werden.

In den folgenden Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1

150 Raumleile einer Lösung von 14% Glucose, 0,1% NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,3% Maisquellwasser (|.M 5,8) werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat. Nach der Sterilisation des Fermenters werden 2,5 Gew.-Teile steriles Calciumcarbonat zugesetzt. Das Medium wird dann mit Candida parapsilosis var. tokyoensis (IFO 1453) geimpft und 5 Tage bei 28°C bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,5. Bei dieser Fermentation werden 4,1% (+ )-Isozitronensäure, bezogen auf die Kulturbrühe, und gleichzeitig 1,3% Zitronensäure auf der gleichen Basis gebildet. IGO Raumteile der Kulturbrühe werden mit 3 η-Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und dann zentrifugiert.

Die Zellenfraktion wird in 100 Raumteilen Wasser suspendiert und zentrifugiert. Die Zellen werden abschließend in 50 Raumteilen Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer bei pH 8,5 suspendiert.

Die überstehende Flüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit zusammengegeben und durch Zusatz einer wäßrigen 5 n-Natriumhydroxydlösung auf pH 7,0 eingestellt. Das System wird 30 Minuten bei 100° C gehalten, wobei sich eine Fällung bildet. Die Fällung wird heiß abgenutscht. Hierbei wird ein Gemisch von Calciumisozitrat und Calciumzitrat in fast quantitativer Ausbeute erhalten.

Dieses Gemisch wird in etwa 10 Raumteilen Wasser suspendiert. Zur Suspension wird tropfenweise 50%ige Schwefelsäure unter Rühren gegeben, bis das Filtrat bei Zusatz von Bariumchloridlösung leichte Anzeichen von Sulfatradikalen zeigt. M.in erhitzt dann etwa 30 Minuten in siedendem Wasser, entfärbt nach dieser Zeit und filtriert heiß. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Während eine gebildete Calciumsulfatfällung entfernt wird, wird weiter eingeengt, bis ein Sirup von niedriger Konsistenz erhalten wird. In einer Glaskolonne wird ein Gemisch von 350 Gew.-Teilen Kieselgel von Chromatographiereinheit in 250 Raurnteilen 0,5 n-H₂SO₄ und etwa 2500 Raumteilen Chloroform, das 15% n-Butanol enthält, gegeben. Auf die Säule wird ein Gemisch einer Lösung des obengenannten Konzen-

Ki trats in etwa 20 Raumteilen 0,5 n-H₂SO₄ und 30 Gew.-Teilen des gleichen Kieselgels von Chromatographiereinheit zusammen mit einer geringen Chloroformmenge gegeben. Das Chlororform läßt man durch seine Schwere nach unten ablaufen.

Ii Nach diesem Durchgang läßt man durch die Kieselgelschicht von oben 2 Elutionsmittel (verschiedene Mischungen von n-Butanol und Chloroform), von denen das eine 25% n-Butanol und das andere 35% n-ButanoS enthält, mit 0,5 n-H₂SO₄ in dieser Reihenfolge.

2(i falls notwendig unter Druck, durchlaufen. Mit dem zweiten Elutionsmittel, das 35% n-Butanol enthält, werden zwei saure Fraktionen eluiert.

Von den beiden Fraktionen wird die zweite Fraktion in eine wäßrige Phase überführt, die dann unter

2^r> vermindertem Druck eingeengt wird, wobei 2,5 Gew.-Teile Isozitronensäure in Form eines Sirups erhalten werden. Aus der vorhergehenden sauren Fraktion werden etwa 0,7 Gew.-Teile Zitronensäure isoliert.

jo Die erhaltene Isozitronensäure wird in 25 Raumteilen Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer bei pH 8,5 gelöst. Die Lösung wird mit der vorher abgetrennten Zellensuspension vereinigt. Das Gemisch wird mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt

i) und 6 Stunden bei 32° C stehengelassen. Dieses Reaktionsgemisch enthält 1,96 Gew.-Teile Zitronensäure. Die Zellen werden abfiltriert, und das Filirat wird in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei 1,05 Gew.-Teile Zitronensäure erhalten werden.

■4(1 Diese Ausbeute zusammen mit der vorher erhaltenen Ausbeute von 0,7 Gew.-Teilen ergibt eine Gesamtausbeute von 1,75 Gew.-Teilen Zitronensäure.

Beispiel 2

4> In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat, werden 150 Raumteile eines Mediums, das aus 8% eines C|₂-Cie-n-Paraffingemisches (Reinheit 92%). 0,3% NH₄CI, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂0,0,05% FeSO₄ · 7 H₂O und 0,5%

« CaCO₁ besteht (pH 6,5) und mit 0,00004 Gew.-Teilen Bromkresolgrün sterilisiert worden ist, mit Candida lipolytica (IFO 1437) geimpft. Das Medium wird 3 Tage bebrütet und während der Bebrütung mil NH₄OH bei einer gelblichgrünen Farbe (entsprechend pH 4 — 5)

« gehalten. Nach dieser Bebrütungszeit enthält die Kulturbrühe 49 mg Zitronensäure/ml und 52 mg Isozitronensäure/ml. Die Kulturbrühe hat einen pH-Wert von 4,5. 100 Raumteile der Kulturbrühe werden zur Entfernung der Zellen durch Filterpapier abgenutscht.

w) Das Filtrat wird durch Zusatz von Ca(OH)₂ auf pH 7,5 eingestellt. Es wird dann unter leicht vermindertem Druck zum Sieden erhitzt. Nach 30 Minuten wird das System gekühlt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und in einem Luftstrom getrocknet. Hierbei wird

μ Calciumzitrat erhalten, das 4,7 Gew.-Teile Zitronensäure enthält. Das Salz wird in 40 Raumtcilen Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 5 n-H₂SO₄ neutralisiert. Nach Zusatz von 1 Gew.-Teil Aktivkohle

zur überstehenden Flüssigkeit wird filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf einen Sirup von niedriger Konsistenz eingeengt (wobei eine etwa gebildete Fällung aus Calciumsulfat von Zeit zu Zeit abfiltriert wird). Das Konzentrat wird in einem Kühlschrank stehengelassen, worauf 4,05 Gew.-Teile kristalline Zitronensäure (ohne Kristallwasser) erhalten werden.

Das Filtrat, aus dem das Caldciumzitrat entfernt worden ist, enthält 4,8 Gew.-Teile Isozitronensäure. Zu diesem Filtrat wird die gesamte Zellenmenge gegeben, die aus der obengenannten Kulturbrühe abgetrennt worden ist (100 Raumteile), worauf mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt wird. Nach Zusatz von 1% Chloroform (Volumen/Volumen) wird das Gemisch 4 Stunden bei 32°C stehengelassen. Nach dieser Zeit werden die Zeilen abfiltriert. Das Filtrat wird in der gleichen Weise, wie vorstehend für die Isolierung der Zitronensäure beschrieben, aufgearbeitet. Hierbei werden 3,9 Gew.-Teile kristalline Zitronensäure (ohne Kristallwasser) erhalten.

Beispiel 3

100 Raumteile der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kulturbrühe werden mit 5 n-NaOh auf pH 8,5 eingestellt, worauf 1 Volum-% Benzol zugesetzt wird. Das System wird in einem Fermenter 4 Stunden stehengelassen. Nach dieser Zeit enthält es 83 mg Zitronensäure/ml und 17 mg Isozitronensäure/ml. Diese Werte stellen erhebliche Verbesserungen dar.

Die Gesamtmenge der Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei Zitronensäure in einer Ausbeute, die 6,9 Gew.-Teilen wasserfreien Kristallen entspricht, erhalten wird.

Beispiel 4

In einen Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, werden 100 Raumteile einer Lösung gegeben, die 0,3% NH₄Cl, 0,1% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,1% Hefeextrakt in Leitungswasser enthält. Nach der Sterilisation werden 100 Raumteile einer 25%igen sterilen Lösung von Calciumacetatmonohydrat in jeden Kolben gegeben. Alle Kolben werden mit Candida lFO-1455 geimpft. Der geimpfte Fermenter wird 7 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Fermentationsbrühe einen pH-Wert von 5,5. Bei dieser Fermentation werden 2,8% Isozitronensäure, bezogen auf die Kulturbrühe, erhalten.

Bei diesem Versuch wird keine Zitronensäure festgestellt. 100 Raumteile der Kulturbrühe werden 30 Minuten einer Ultraschallbehandlung bei 19 kHz unterworfen. Nach dieser Zeit wird die Kulturbrühe auf pH 85 eingestellt Sie wird 4 Stunden bei 32° C stehengelassen, worauf die Ausbeute an Zitronensäure mit 2,4% ermittelt wird. Die Zitronensäure wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aus der Kulturbrühe isoliert Hierbei werden 823% der in der Probe der Kulturbrühe enthaltenen Zitronensäure in Form von Kristallen erhalten.

Beispiel 5

Eine Lösung, die 0,1% NH₄NO₃, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O und 03% Maisquellwasser in Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,8 eingestellt 150 Raumteile der Lösung werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, worauf 9 Gew.-Teile Glycerin oder 9 Raumteile Äthanol zugesetzt werden. Nach der Sterilisation werden 4,5 Gew.-Teile steriles Calciumcarbonat in den Fermenter gegeben. Der Fermenter wird mit Hansenula subpelliculosa (IFO 1458) geimpft Das geimpfte Medium wird 5 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,5.

Bei diesem Fermentationsversuch werden bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle 1,5% Isozitronensäure und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle 1,4% Isozitronensäure erhalten. Zi-

ID tronensäure wird gleichzeitig gebildet, aber ihre Menge beträgt bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle 0,9% der Kulturbrühe und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle 0,5%. Die Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei stets reine Zitronensäure in einer Ausbeute von 83 bis 85% erhalten wird. Die überstehenden Flüssigkeiten, die nach der Ausfüllung des Calciumzitrats bei dem vorstehend beschriebenen Versuch erhalten werden, werden für jede Probe der Kulturbrühe zusammengegeben. Zu 100 Raumteilen der vereinigten überstehenden Flüssigkeit werden 3 Teile (auf nasser Basis) der Zellen von Pichia potymorpha IFO 0195 gegeben, die 3 Tage bei 28⁰C auf einem Medium (pH 6) kultiviert worden sind, das aus einer Lösung von 6% Glucose, 6% Calciumacetatmonohydrat, 0,05% NH₄CI, 0,05% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄ ■ 7 H₂O und 0,2% Maisquellwasser besteht. Die Flüssigkeit wird dann mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt.

Die Gemische werden 5 Stunden bei 34⁰C stehenge-

3(i lassen. Nach dieser Zeit beträgt die Ausbeute an Zitronensäure 1,2% bzw. 0,69%. Diese Reaktionsgemische werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Ausbeuten an Zitronensäure betragen 86% bzw. 83%, bezogen auf die Gemische.

Beispiel 6

Eine Lösung, die 12% Glucose, 0,1% NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,2% Maisquellwasser in Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,8 eingestellt. Je 150 Raumteile der Lösungen werden in Fermenter gegeben, die ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen haben, worauf sterilisiert wird. In jeden Fermenter werden 6 Gew.-Teile steriles Calciumcarbonat gegeben, worauf die Medien mit Debaryomyces kloeckeri IFO 0015, Trichosporon behrendii IFO 0844 bzw. Brettanomyces claussenii IFO 1506 geimpft werden. Jeder geimpfte Fermenter wird 5 Tage bebrütet.

Die Bildung an (+)-Isozitronensäure beträgt 0,6% bei Debaryomyces kloeckeri, 1,0% für Trichosporon behrendii und 1,0% bei Brettanomyces claussenii. Gleichzeitig wird Zitronensäure in einer Ausbeute von 0,5% bei Debaryomyces, 0,6% bei Trichosporon und 1% bei Brettanomyces claussenii gebildet Die Fermentationsbrühen werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei Zitronensäure in fast quantitativer Ausbeute bei den Mikroorganismen erhalten wird. Wenn die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Isozitronensäurefraktionen (d.h. nach Ausfüllung von

bo Calciumzitrat erhaltene überstehende Flüssigkeiten und die Mutterlaugen nach der Kristallisation der Zitronensäure) für jeden Mikroorganismus vereinigt werden, wird festgestellt, daß 97% der in jeder Kulturbrühe gebildeten Isozitronensäure darin enthalten sind.

Zu jedem der vorstehenden Produkte wird die Gesamtmenge der nassen Zellen gegeben, die durch Zentrifugieren jeder Kulturbrühe für 20 Minuten bei 5000 UpM erhalten werden, so daß die Produkte in der

gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, reagieren können. Es wird festgestellt, daß bei den Mikroorganismen die Isozitronensäure mit einem Umsatz von etwa 83% in Zitronensäure umgewandelt wird. Jedes der Reaktionsprodukte wird einer Behandlung in der oben beschriebenen Weise zur Isolierung der Zitronensäure unterworfen. Hierbei wird Zitronensäure in einer Ausbeute von 85% erhalten.

Beispiel 7

Eine Lösung, die 20% Melasseabfälle von Rohrzucker (12% reduzierender Zucker als Glucose), 0,10% NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ in Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,5 eingestellt. 200 Raumteile der Lösung werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteiler! hat, worauf sterilisiert wird.

In den Fermenter werden dann 6,0 Gew.-Teile steriles Calciumcarbonat gegeben. Zum Impfen des Mediums wird Candida guilliermondii var. membranaefaciens IFO 1454 verwendet. Der Fermenter wird auf die oben beschriebene Weise mechanisch geschüttelt. Nach beendeter Kultivierung hat die Kulturbrühe einen pH-Wertvon5,5.

Bei dieser Fermentation werden 3,75% Zitronensäure (gerechnet als Zitronensäure ohne Kristallwasser), bezogen auf die Kulturbrühe, erhalten. Auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise werden aus dieser Kulturbrühe 9,4 Gew.-Teile (Trochengewicht) Calciumzitrat pro 200 Raumteile Kulturbrühe isoliert. Diese Menge entspricht 7,2 Gew.-Teilen Zitronensäure (ohne Kristallwasser).

Die abgetrennten nassen Zellen werden gefrierge

trocknet und gelagert. In 100 Raumteilen Dinatriumphosphat-Monokaliumphosphat-Puffer, der einen pH-Wert von 8,5 hat, werden 5 Gew.-Teile Monocaliumisozitrat gelöst. Zur Lösung werden 5 Gew.-Teile der aufbewahrten trockenen Zellen gegeben. Das Gemisch wird gut gerührt und mit Natriumhydroxydlösung genau auf pH 8,5 eingestellt.

Das Gemisch wird 5 Stunden bei 32° C stehengelassen, worauf der Mikroorganismus abfiltriert wird. Die ίο überstehende Flüssigkeit wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise behandelt, wobei 3,55 Gew.-Teile Zitronensäure erhalten werden.

Beispiel 8

In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 2ÖÖ Raumteiien hat, werden 150 Raumteiie eines Mediums, das 8% eines Cii-Cie-n-Paraffingemisches (Reinheit 92%), 0,3% NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,05% FeSO₄ · 7 H₂O und 0,5% CaCO₃ enthält (pH 6,5), mit Torulopsis Candida IFO 0380 geimpft, worauf 3 Tage auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise bebrütet wird. Nach der Bebrütungszeit enthält die Kulturbrühe 21 mg Zitronensäure/ml und 28 mg( + )-Isozitronensäure/mI. 100 Raumtei- Ie der Kulturbrühe werden mit 5 n-NaOH auf pH 8,5 eingestellt, worauf 1 Raumteil Xylol zugesetzt wird. Das Gemisch wird unter Rühren bei 35° C stehengelassen. Hierbei werden 41 mg Zitronensäure/ml und 8 mg (+ )-Isozitronensäure/ml erhalten.

jo Durch Aufarbeitung des Reaktionsgsgemisches auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise werden 3,4 Gew.-Teile Zitronensäure (ohne Kristallwasser) erhalten.

Claims (1)

1. Palentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man 100 Gew.-Teile (+)-Isozitronensäure mit einer Fermentationsbrühe einer Hefe, die zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula, Trichosporon, Toruiopsis oder Pichia gehört und die 10 bis 100 Gew.-Teile Hefezellen (auf Trockenbasis) oder ein verarbeitetes Material, das aus dieser Menge der Kulturbrühe oder der Zellen erhalten worden ist, enthält, bei einem pH-Wert von 7,0 bis 9,5 in Berührung bringt und bei einer Temperatur zwischen 25 und 45° C behandelt und anschließend die so aus ( + )-lsozitronensäure gebildete und angereicherte Zitronensäure isoliert.