DE1069333B - - Google Patents

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung antibiotischer Faktoren, die unter anderem in einem als--E 12^9 bezeichneten antibiotischen Stoff enthalten sind, wobei bestimmte Faktoren daraus in gereinigter Form erhalten werden.

Im Patent 1 037 069 wird die Erzeugung des neuen Antibiotikums E 129 beschrieben, das durch Züchtung von Streptomyces ostreogriseus (NCIB 8792, NRRL 2558) auf oder in einem geeigneten Medium gebildet wird.

Es besteht offenbar aus einer Reihe von Faktoren, von denen einige auch in früher isolierten anderen Antibiotika vorkommen. E 129 enthält in der Hauptsache drei Faktoren, nämlich die Faktoren A, B und Z. Hiervon sind die Faktoren A und Z identisch mit den von W.D. Celmer undB. A. Sobinals PA114Aund PA 114 B bezeichneten Faktoren (Antibiotics Annual, 1955-56, S.437). Der Faktor B ist jedoch eine neue Verbindung und in Patent 1 037 070 beschrieben.

In der Literatur ist angegeben, daß die Faktoren PA 114 A und PA 114 B (Faktor A bzw. Z) gegen verschiedene pathogene Bakterien synergistisch wirken. In Patent 1 049 542 wurde gezeigt, daß der neue FaktorB ebenfalls synergistisch mit PA114B (Z) wirkt, da Gemische der Faktoren B und Z eine größere antibiotische Wirkung zeigen als entsprechende Gemische aus den Faktoren A und Z, was sich beispielsweise bei Schutztesten an der Maus ergab.

Die Darstellung der Faktoren A, B und Z in reiner Form aus rohem E 129 ist in hohem Grade erstrebenswert, um die Zubereitung von Gemischen der reinen Faktoren mit einstellbarer antibiotischer Aktivität zu ermöglichen und synergistische Gemische mit optimaler Aktivität herzustellen. Die Durchführung der Trennung der verschiedenen Faktoren hat sich jedoch bisher als schwierig erwiesen. Es wurden für die technische Durchführung wenig geeignete Arbeitsweisen angewandt.

Es wurde nun gefunden, daß die verschiedenen, in rohem E 129 vorhandenen Faktoren und insbesondere die E 129-Faktoren A, B und Z leicht voneinander getrennt und in wenigstens teilweise gereinigter Form erhalten werden können, wenn man zwei ader mehrere dieser Faktoren enthaltende Gemische unter bestimmten, im folgenden beschriebenen Bedingungen der Verteilungschromatographie unterwirft.

Bei der praktischen Durchführung der Verteilungschromatographie wird eine als statische Phase bezeichnete flüssige Phase an einem Adsorptionsmittel adsorbiert, wonach das die statische Phase enthaltende Adsorbens mit einer weiteren flüssigen, als mobile Phase bezeichneten Phase eluiert wird, die im allgemeinen wenigstens teilweise mit der statischen Phase nicht mischbar ist. Das Adsorptionsmittel adsorbiert im all-

Verfahren zur Abtrennung
der antibiotisch wirksamen Faktoren A, B und bzw. oder Z aus rohem E 129

Anmelder:
Glaxo Laboratories Limited,
Greenford, Middlesex (Großbritannien)

Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. Ε. Assmann und Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte, München 2, Bräuhausstr. 4

Beanspruchte Priorität:
Großbritannien vom 20. September 1957

Ernest Lester Smith, North Harrow, Middlesex,
Harold Cullen Shaw, Penn, Buckinghamshire,
und Karl Heinz Fantes, Bushey, Hertfordshire,
(Großbritannien),
sind als Erfinder genannt worden

gemeinen die zu trennenden Substanzen nicht, wie dies bei der Adsorptionschromatographie der Fall ist, sondern wirkt als Träger für die statische flüssige Phase Tatsächlich soll das Adsorbens vorzugsweise nur gelinge oder gar keine adsorptiven Eigenschaften für die Komponenten des zu trennenden Gemisches aufweisen. Die Trennung der Bestandteile des Gemisches erfolgt daher durch Austausch zwischen den zwei flüssigen Phasen.

Bei der Verteilungschromatographie verwendet man als statische flüssige Phase ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren, im wesentlichen polaren, organichen Lösungsmittel und als mobile Phase ein praktisch unpolares, mit Wasser nicht mischbares, organisches Lösungsmittel, um einen oder mehrere dieser Faktoren aus diesem Gemisch abzutrennen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach in der Durchführung und kann leicht in technischem Maßstab angewandt werden.

Als das zu trennende antibiotische Gemisch kann zweckmäßigerweise rohes E 129 verwendet werden, wie es direkt bei der Züchtung eines E 129 erzeugenden Stamms von Streptomyces ostreogriseus, wie sie beispielsweise in Patent 1037 069 beschrieben ist, erhalten wird.

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Es kann jedoch vorteilhaft sein, das antibiotische Gemisch einer Vorbehandlung zu unterwerfen, um wenigstens einen Teil des gegebenenfalls darin enthaltenen Faktors A zu entfernen. Diese Vorbehandlung läßt sich leicht durch Auflösen des antibiotischen Gemisches in einem Lösungsmittel erzielen, worin der Faktor A weniger löslich ist als die anderen Faktoren, so daß er bevorzugt auskristallisiert. Ein geeignetes Lösungsmittel ist Essigsäureäthylester, weshalb gemäß einer Ausführungsform der Erfindung als Ausgangsmaterial für die Verteilungschromatographie rohes E 129 verwendet wird, das einer Behandlung zum Entfernen wenigstens eines Teils des Faktors A unterworfen worden ist.

Ferner kann das erfindungsgemäß zu trennende antibiotische Gemisch einer Vorbehandlung zur Entfernung wenigstens eines Teils des Faktors Z unterworfen werden. Dies kann man beispielsweise durch Säureextraktion des Essigsäureäthylesterfiltrats erzielen, das man nach Entfernung von wenigstens einem Teil des Faktors A in der oben 'beschriebenen Weise erhalten hat. Das Verfahren der Säureextraktion des FaktorsZ ist in-der Patentanmeldung G 24565 IVa/30h beschrieben.

Durch Vorbehandlung des antibiotischen Gemisches zur Entfernung wenigstens eines Teils des Faktors A und/oder des Faktors Z wird die Abtrennung des.'Faktors B durch anschließende Verteilungschromatographie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erleichtert. Es wird daher als Ausgangsmaterial rohes E 129 bevorzugt verwendet, das entweder einer oder vorzugsweise beiden der oben beschriebenen Vorbehandlungen zur Entfernung des Faktors A und/oder des Faktors Z unterworfen worden ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendete Lösungsmittel für die mobile Phase sind aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol oder ein Gemisch dieser Lösungsmittel. Derartige Lösungsmittel können mit einem oder mehreren Lösungsmitteln verdünnt werden, die ein geringes Lösungsvermögen für die E 129-Faktoren aufweisen, z. B. Cyclahexan, Tetrachlorkohlenstoff oder ein höherer Äther, wie Isopropyläther. Als mobile Phase eignen sich ferner Chloroform oder Easigsäureäthylester, die mit einem Lösungsmittel mit geringem Lösungsvermögen, wie oben erwähnt, verdünnt sind. Bei der praktischen Durchführung wird die mobile Phase vorzugsweise mit einem Lösungsmittel von niedrigem Lösungsvermögen verdünnt, bis die Faktoren Z und A aus der Säule eluiert sind. Anschließend wird der Faktor B mit unverdünntem Lösungsmittel eluiert.

Die statische Phase besteht vorzugsweise aus einem Gemisch ausWasser und einem niederen 1- oder 2wertigen Alkohol, z. B. Methylalkohol, Äthylalkohol, Äthylenglykol oder Propylenglykol. Hiervon sind Methyl- und Äthylalkohol bevorzugt. Ein als statische Phase besonders geeignetes Lösungsmittel besteht aus Methanol und Wasser in den Verhältnissen von 2:1 bis 1:2, vorzugsweise etwa 3 Teile Methylalkohol auf 2 Teile Wasser. Im allgemeinen hat sich gezeigt, daß die Trennung der E 129-Faktoren bei den niederen Methylalkoholkonzentrationen besser verläuft, jedoch ist die Kapazität der chromatographischen Säule dann geringer als bei höheren Methylalkoholkonzentrationen. 6g

Als festen adsorbierenden Träger für die statische Phase kann man jede geeignete poröse Festsubstanz verwenden, die keine wesentlichen adsorptiven Eigenschaften für die antibiotischen Faktoren aufweist. Zur Zeit wird Kieselgur bevorzugt, doch stellen auch ge-

pulverte Cellulose, Stärke und Siliciumdioxyd sehr befriedigende Adsorpentien dar.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die statische Phase mit dem Trägerfeststoff vermischt und die mobile Phase zur Trennung der vorhandenen Faktoren verwendet. Das Mengenverhältnis von statischer Phase zu Trägerfeststoff hängt von der Menge an statischer Phase ab, die die Festsubstanz aufnehmen kann. Kieselgur beispielsweise nimmt im allgemeinen etwa das Doppelte seines eigenen Gewichtes an statischer Phase auf. Es hat sich gezeigt, daß ein Verhältnis von statischer Phase zu Kieselgur von 6 bis 3 Teilen, vorzugsweise 5 Teilen der ersteren zu 4 Teilen des letzteren, bezogen auf das Gewicht, zweckmäßig ist.

Nach dem Vermischen der statischen Phase mit der Trägerfestsubstanz wird in der Praxis meistens eine Säule hergestellt, durch die die mobile Phase geleitet werden kann. Das zu behandelnde Ausgangsmaterial kann entweder in der mobilen oder der statischen Phase gelöst werden, vorzugsweise wird es jedoch in der statischen Phase gelöst, da diese ein besseres Lösungsmittel für E 129 darstellt. So hat es sich als zweckmäßig erwiesen, eine gesättigte Lösung von E 129 in der statischen Phase zuzubereiten, die dann mit der Trägerfestsubstanz vermischt wird. Dieses Gemisch wird dann auf das obere Ende der Säule aufgebracht und die mobile Phase wird hindurchgeleitet. Die Höhe dieses E 129 enthaltenden Teils der Säule soll vorzugsweise die Hälfte der Gesamtlänge der Säule nicht übersteigen und vorzugsweise nicht mehr als das 0,8fache der Länge des Restes der Säule betragen.

Mit fortschreitender Entwicklung der Säule erfolgt die Trennung der verschiedenen Faktoren. Es sei darauf hingewiesen, daß die Reihenfolge, in der die drei E 129-Faktoren A, B und Z wandern, folgende ist: Z, A, B, wobei der Faktor Z am schnellsten wandert. Die Faktoren können getrennt aus verschiedenen Fraktionen des Eluats oder etwas weniger gut durch Ausschneiden der Säulenabschnitte, die die jeweiligen Faktoren enthalten und Extraktion dieser Abschnitte gewonnen werden.

Das nacheinander erfolgende Austreten der Faktoren kann verfolgt werden, indem man jeweils das Gewicht des beim Verdampfen gleicher Anteile des Eluats erhaltenen Rückstands bestimmt oder, zweckmäßiger, durch Tüpfelversuche mit Ferrichloridlösung, die nahezu augenblicklich eine rotbraune Färbung mit Faktor Z und eine Grünfärbung mit den Faktoren A und B ergibt.

Bei der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugten Arbeitsmethode wird die Säule zunächst mit einem Cyclohexan-Benzol-Gemisch (z. B. 3 :5) zur Entfernung des Faktors Z, dem der Faktor A folgt und dann mit Benzol allein zur Entfernung des Faktors B entwickelt.

Die Faktor-A-Fraktion kann, falls erwünscht, weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Kristallisation, vorzugsweise aus Essigsäureäthylester.

Die Faktor-Z-Fraktion kann, falls erwünscht, durch Kristallisation aus Methanol oder Äthanol entweder direkt oder nach einer wie in der Patentanmeldung G 24565 IVa/30h beschriebenen Extraktion mit Säure gereinigt werden.

Die Faktor-B-Fraktion kann, falls erwünscht, durch Wiederholung der Verteilungschromatognaphie weiter gereinigt werden.

Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die erwähnten antibiotischen Fak-

toren in weitgehend reiner Form und praktisch vollständig voneinander getrennt zu erhalten. Das Verfahren eignet sich besonders zur Erzielung von praktisch reinem Faktor B, der bisher nicht in einfacher Weise rein erhalten werden konnte.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Das Lösungsmittelsystem wurde in folgendem Verhältnis angesetzt: Benzol 12,5 — Cyclohexan 7,5 (mobile Phase) — Methanol 12 — Wasser 8 (statische Phase). 40g säuregewaschenes Kieselgur als Träger mit einem Gehalt von 60 ml der statischen Phase wurden in eine Säule von 3,0 cm Durchmesser eingefüllt und ergaben eine Höhe von 27 cm.

3 g rohes E 129 wurden in 21 ml warmer wäßriger Phase (40° C) gelöst und auf 15 g Kieselgur als Träger aufgebracht, die eingefüllt wurden und eine Höhe von 10 cm ergaben.

Die obere Phase des oben angegebenen Systems wurde durch die Säule geleitet, bis der Ferrichlorid-Tüpfeltest keine rotbraune Farbe mehr ergab. Dieser Teil des Eluats enthielt den Faktor Z. Gewicht dieser Fraktion = 662 mg.

Die spektroskopische Analyse ergab, daß hiervon 270 mg reiner Faktor Z waren.

Die Entwicklung mit der Lösungsmittelphase wurde fortgesetzt, und die Gegenwart von Faktor A in dem Eluat wurde durch die sich mit Ferrichloridlösurug ergebende grüne Farbe verfolgt. Sobald diese Probe negativ war, enthielt das durchgegangene Eluatvolumen den gesamten vorhandenen Faktor A und das Gewicht dieser Fraktion betrug 1,43 g. Eine quantitative Ferrdchloridbestimmung ergab ein Gewicht von 1,18 g Faktor A.

Dann wurde mit wäßriger Phase gesättigtes Benzol zur Entwicklung der Säule verwendet, bis mit Ferrichloridlösung keine Grünfärbung mehr auftrat. Diese Fraktion wog 806 mg, wovon 720 mg reiner Faktor B waren.

Das vollständige Auswaschen der Säule mit Methanol ergab einen Rückstand von 80 mg.

Beispiel 2

Es wurde das gleiche Lösungsmittelsystem verwendet, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde. 21 g rohes E 129 wurden in 270 ml heißem Essigsäureäthylester gelöst. Beim Abkühlen kristallisierten 4,7 g Faktor A aus, die entfernt wurden; die Mutterlauge wurde zur 5" Trookne eingedampft. Es wurde eine Säule aus 380 g Kieselgur als Träger mit einem Gehalt von 475 ml wäßriger Phase hergestellt, deren Durchmesser 7,6 cm und deren Höhe 38 cm betrug.

16 g Festsubstanz aus der Essigsäureäthylesterlösung wurden erneut in 150 ml wäßriger Phase gelöst und auf 100 g Kieselgur aufgebracht. Dieses Material wurde auf das obere Ende der vorher hergestellten Säule gegeben und ergab eine Höhe von 9 cm.

Die Lösungsmittelphase wurde durch die Säule geleitet, bis mit Fernichlorid keine Rotfärbung mehr auftrat.

Gewicht der Fraktion = 4,06 g, wovon. 2,5 g durch speiktroskopische Analyse als reiner FaktorZ nachgewiesen wurden.

Dann wurde mit Lösungsmittelphase weiterentwikkelt, bis mit Ferrichlorid keine Grünfärbung mehr auftrat.

Gewicht der Fraktion = 4,96 g, wovon 3,0 g aus Faktor A bestanden, ro

Zur Elution der B-Fraktion der Säule wurde Benzol verwendet, wobei man 5,8 g Substanz erhielt. Der Faktor-B-Gehalt dieser Fraktion wurde quantitativ zu 4,1 g ermittelt.

Beispiel 3

Als Lösungsmiittelsystem wurde Benzol 20 (mobile Phase) — Methanol 12 — Wasser 8 (statische Phase) verwendet.

500 g rohe E 129 wurden in 4000 ml heißem Essigsäureäthylester gelöst und ergaben nach Abkühlen und Filtrieren 125 g rohen Faktor A. Die Mutterlaugen wurden dreimal mit je 1000 ml n/2-Salzsäure extrahiert, wobei man 79 g Faktor Z als Ausbeute erhielt. Die Rückstände der Essigsäureäthylesterlösungen wogen 240 g und wurden in 1000 ml wäßriger Phase gelöst, die von 800 g Kieselgur adsorbiert wurden. Dieses Präparat wurde auf eine vorher zubereitete Säule von etwa 15,2 cm Durchmesser aufgebracht, die aus 2 kg Kieselgur als Träger und 2,5 1 wäßriger Phase bestand.

Die Säule wurde mit Benzol allein entwickelt.

Die Gegenwart von FaktorA in dem ersten Eluat ergab sich aus Tüpfelproben mit Ferrichlorid, und sobald die Intensität der Grünfärbung geringer wurde, wurde angenommen, daß die folgenden Eluate den Faktor B enthielten.

Einzelne Volumina des Benzoleluats wurden entnommen und einzeln behandelt. Jedes Volumen wurde weitgehend eingeengt und mit Petroläther (Siedebereich 40 bis 60° C) gefällt. Nach dem Abfiltrieren, Trocknen und Wiegen wurden in aliquoten Anteilen Bestimmungen mit Ferrichlorid durchgeführt.

	Volumen	Gewicht	Reinheit
1.	81	49 g	60%
2.	71	30 g	75%
3.	91	36 g	85%
4.	91	20 g	85%
5.	35 1	34 g	73%

Beispiel 4

Als Lösungsmittelsystem wurde verwendet: Toluol 12,5 — Cyclohexan 7,5 (mobile Phase) — Äthanol 12 —· Wasser 8 (statische Phase). 20 g Kieselgur als Träger für 25 ml wäßrige Phase wurden in eine Säule von 2,4 cm Durchmesser zu einer Höhe von 19 cm gepackt.

lOö mg rohes E 129 wurden in 5 ml wäßriger Phase gelöst und zu 4 g Kieselgur als Träger gegeben. Dieses Präparat wurde auf die Säule aufgebracht und ergab eine Höhe von 4 cm.

Es wurde mit Lösungsmittelphase entwickelt, wobei man annahm, daß die ersten 150 ml den Faktor Z enthielten.

Gewicht der Fraktion — 19 mg. Die spektroskopische Analyse ergab die Gegenwart von 9 mg Faktor Z.

Die weitere Entwicklung mit mobiler Phase wurde fortgesetzt, bis mit Ferrichloridlosung keine Grünfärbting mehr auftrat. Dieses Eluat ergab 49 mg_r wovon 38,5 mg Faktor A waren. Dann wurde mit wäßriger Phase gesättigtes Toluol zur Elution des Faktors B aus der Säule verwendet. Diese 33 mg wiegende Fraktion enthielt nach der Berechnung 22 mg reinen Faktor B.

Beispiel 5

28 g CelMösepttlver (Standardsorte) als Träger für 35 ml wäßrige Phase (12 CH₃OH : 8 H₂O) wurden

Claims (18)

in eine Säule von 2,1 cm Durchmesser gepackt. Die Höhe der Cellulosesäuie betrug 17 cm. 100 mg rohes E 129 wurden in 5 ml wäßriger Phase gelöst und zu 4 g Cellulose als Träger gegeben. Die Höhe der Beschickung betrug 3 cm. Durch die ersten 200 ml der mobilen Phase (12,5 Benzol : 7,5 Cyclohexan) wurde der Faktor Z eluiert, Gewicht der Z-Fraktion = 19 mg. Die nächsten 500 ml der mobilen Phase führten zur Elution von Faktor A, die durch die sich mit l°/oiger Ferrichloridlösung in C2H5OH ergebende Grünfärbung verfolgt wurde. Gewicht der A-Fraktion = 41,2 mg. Die Säule wurde dann mit 100°/oigem Benzol eluiert, um den Faktor B zu entfernen (erkennbar durch die 1S Grünfärbung mit FeCl3). Gewicht der Fraktion = 32 mg. Die Analyse der Fraktionen ergab folgende Konzentrationen der Faktoren: Faktor Z 17 Vo Faktor A 34% Faktor B 28% Beispiel 6 a5 Das verwendete Lösungsmittelsystem bestand aus Benzol 12,5 — Cyclohexan 7,5 (mobile Phase) ■— Methanol 14 — Wasser 6 (statische Phase). 6 g rohes E 129 wurden in 30 ml wäßriger Phase gelöst, für die 15 g säuregewaschenes Kieselgur als Träger dienten. Dieses Präparat wurde auf eine vorher zubereitete Säule von 40 g säuregewaschenem Kieselgur als Träger für 50 ml wäßriger Phase gepackt. Die Höhe -der Säule und der Beschickung betrug bei einem Durchmesser von 3 cm 28 bzw. 7 cm. Die Säule wurde mit Lösungsmittelphase entwickelt, bis mit Ferrichloridlösung keine Rotfärbung mehr auftrat. Die erhaltene Fraktion wog 1,20 g, wovon 1,0 g durch spektroskopische Analyse als reiner Faktor Z festgestellt wurde. Dann wurde mit dem gleichen Elutionsmittel weiter entwickelt, bis mit Ferrichloridlösung keine Grünfärbung mehr auftrat. Diese Fraktion enthielt Faktor A und wog 2,32 g, wovon 1,55 g aus dem reinen Faktor bestanden. Dann wurde das Entwicklungslösungsmittel gewechselt und mit wäßriger Phase gesättigtes Benzol zur Entfernung des Faktors B verwendet. Die B-Fraktion wog 1.64 g und eine quantitative Ferrichloridbestimmung ergab 1,51 g reinen Faktor. Beispiel 7 Als Lösungsmittelsystem wurde verwendet: Benzol 12,5 — Cyclohexan 7,5 (mobile Phase) — Äthylenglykol 15 — WasserS (statische Phase). Aus 20 g säuregewaschenem Kieselgur als Träger für 25 ml wäßrige Phase wurde eine Säule von 2,3 cm Durchmesser und 17 cm Höhe hergestellt. 100 mg rohes E 129 wurden in 5 ml wäßriger Phase gelöst und mit 4 g Kieselgur als Träger auf die Säule aufgebracht. Mit den ersten 150 ml Elutionsmittel erhielt man eine 21 mg wiegende Fraktion, die 17 mg reinen Faktor Z enthielt. Die Säule wurde dann mit Benzol entwickelt und das Eluat in Anteilen von jeweils 50 ml mit Ferrichloridlösung geprüft. Xach 200 ml Eluat nahm plötzlich die Ferrichloridfärbung ab und nahm dann mit fortschreitender Entwicklung langsam wieder zu. Die ersten 200 ml Benzol ergaben eine Fraktion von 50 mg Gewicht, wovon 32 mg reiner Faktor A waren. Weitere 400 ml Eluat ergaben 32 mg Festsubstanz, wovon 24 mg reiner Faktor B waren. Beispiel 8 Als Lösungsmittelsystem diente Chloroform 10 ■— Tetrachlorkohlenstoff 90 (mobile Phase) — Methanol 3 — Wasser 2 (statische Phase). 20 g säuregewaschenes Kieselgur, die 25 ml wäßrige Phase enthielten, wurden in eine Glassäule von 2,1 cm Durchmesser gepackt und ergaben eine Höhe von 20 cm. 100 mg rohes E 129 wurden in 5 ml wäßriger Phase gelöst, für die 4 g Kieselgur als Träger dienten. Dieses Präparat wurde auf die vorher bereitete Säule aufgebracht, wobei sich eine Höhe von 4,5 cm ergab und mit dem mit der wäßrigen Phase gesättigten Chloroform, Tetrachlorkohlenstofflösungsmittel entwickelt. Der Faktor Z befand sich in den ersten 50 ml des Eluats. Die Fraktion wog 21 mg, wovon sich 17 mg als reiner Faktor Z erwiesen. Bei der weiteren Entwicklung mit dem gleichen Lösungsmittel wurden Anteile von jeweils 50 ml aufgefangen. Eine Abnahme in der Farbreaktion mit Ferrichlorid nach Auffangen von 200 ml Eluat ließ erkennen, daß der gesamte Faktor A aus der Säule ausgetreten war. Diese Fraktion wog 45 mg, wovon 36 mg reiner Faktor A waren. Man wechselte dann das Elutionsmittel und verwendete Chloroform 20 ■— Tetrachlorkohlenstoff 80. Damit wurde die Säule entwickelt, bis mit Ferrichloridlösung keine weitere Färbung mehr auftrat. Diese Fraktion "wog 30 mg und enthielt 24,5 mg reinen Faktor B. Beispiel 9 Als Lösungsmittelsystem verwendete man Toluol 20 (mobile Phase) — Methanol 12 — Wasser 8 (statische Phase). Wie im Beispiel 8 beschrieben, wurde eine Kieselgursäule hergestellt und die 100 gm E 129 enthaltende Beschickung in der ebenfalls dort beschriebenen Weise auf die Säule aufgebracht. Der Faktor Z befand sich in den ersten 100 ml des ausgetretenen Toluols. Diese 21 mg wiegende Fraktion enthielt 17 mg reinen Faktor Z. Zur Entfernung des Faktors A, der durch die Färbung mit Ferrichloridlösung festgestellt wurde, wurde eine weitere Entwicklung mit 300 ml Toluol durchgeführt. Die 48 mg wiegende Fraktion enthielt 36 mg reinen Faktor A. Das Entwicklungsmittel wurde dann gewechselt und Toluol mit einem Gehalt von 20% Chloroform verwendet, um den Faktor B zu entfernen. 300 ml dieses Eluats enthielten 29 mg Substanz, wovon 24 mg Faktor B waren. Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung der antibiotisch ■ wirksamen Faktoren A, B und/oder Z aus rohem E 129, das zwei oder mehrere dieser Faktoren enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das rohe E 129 der Verteilungschromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren, im wesentlichen polaren organischen Lösungsmittel als statischer flüssiger Phase und einem praktisch unpolaren, mit Wasser

nicht mischbaren organischen Lösungsmittel als mobiler Phase unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff ein bei der Züchtung eines E 129 erzeugenden Stamms von Streptomyces ostreogriseus erhaltenes rohes E 129 verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff rohes E 129 verwendet, aus dem wenigstens ein Teil des vorhandenen Faktors A entfernt worden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Faktor A durch Behandlung des rohen E 129 mit einem Faktor A bevorzugt lösenden Lösungsmittel entfernt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als den Faktor A bevorzugt lösendes Lösungsmittel Essigsäureäthylester verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff rohes E 129 verwendet, aus dem wenigstens 1 Teil des vorhandenen Faktors Z entfernt worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Faktor Z durch Säureextraktion entfernt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man rohes E 129, aus dem wenigstens ein Teil des Faktors A durch Behandlung mit Essigsäureäthylester entfernt worden ist, zur Entfernung des Faktors Z der Säureextraktion unterwirft.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete mobile Phase eines oder mehrere aromatische Kohlenwasserstoff lösungsmittel, Chloroform oder Essigsäureäthylester enthält. ₍

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als KohlenwasserstofElösungsmittel Benzol oder Toluol verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 9 ader 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die mobile Phase mit einem Lösungsmittel mit geringem Lösungsvermögen für die E 129-Faktoren verdünnt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel mit geringem Lösungsvermögen Cyclohexan, Tetrachlorkohlenstoff oder einen höheren Äther verwendet.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete statische Phase ein Gemisch aus Wasser und einem oder mehreren niederen 1- oder 2wertigen Alkoholen enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete statische Phase aus Methylalkohol und Wasser in einem Verhältnis von 2 :1 bis 1 :2 besteht.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger für die statische Phase ein Adsorptionsmittel verwendet, das praktisch kein Adsorptionsvermögen für die Faktoren A, B oder Z aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Kieselgur, gepulverte Cellulose, Stärke oder Siliciumdioxyd verwendet.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das rohe E 129 in der statischen Phase löst.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung in einer Chromatographiersäule durchführt und zunächst mit einer mobilen Phase aus Cyclohexan und Benzol und dann mit Benzol allein entwickelt.

©. 909 649/395 11.59