DE1069329B - Verfahren zur Herstellung eines injizier'baren beständigen proteolytischen Enzympräparates - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren beständigen proteolytischen Enzympräparates Die Erfindung bezieht sich auf die Stabilisierung proteolytischer Enzyme.
• In neuerer Zeit hat man die Verwendung von Trypsin in Fällen akuter Thrombophlebitis und Phlebothrombose empfohlen. Bei der parenteralen Verabreichung von Trypsin-Präparaten traten jedoch Schwierigkeiten auf.
• Trypsin ist in wäßriger Lösung verhältnismäßig unbeständig und infolgedessen müssen Lösungen unmittelbar vor Gebrauch frisch hergestellt werden. Es wurde ferner festgestellt, daß die intramuskuläre Verabreichung von Trypsin in wäßriger Lösung, wäßriger isotonischer Lösung oder öliger Suspension häufig zu beträchtlichen Schmerzen an der Injektionsstelle führt.
• Es wurde nun gefunden, daß Trypsin-Präparate, die wäßrige Gelatine enthalten, bedeutend stabiler sind und außerdem den erwähnten, an der Injektionsstelle auftretenden Schmerz weitgehend verringern. Es gibt zwar noch keine verbindliche Theorie für die Erklärung dieser Tatsache; man kann aber annehmen, daß die Schmerzverringerung darauf zurückzuführen ist, daß das Trypsin eher die Gelatine verdaut, als das Gewebe, das bei der Injektion verletzt wird, und dadurch den Schmerzfaktor beträchtlich herabsetzt. Es wird ferner angenommen, daß die Anwesenheit von Polypeptiden zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen wirksamen und unwirksamen Trypsin führt, und daß dadurch eine verbesserte Beständigkeit erzielt wird. Die letztere ist äußerst wichtig, da die Wirksamkeit des Trypsins bekanntlich in wäßrigen Medien rasch abnimmt.
• Es wurde ferner gefunden, daß proteolytische Enzyme im allgemeinen durch eine solche Kombination mit wäßriger Gelatine stabilisiert werden. Der hier gebrauchte Ausdruck »proteolytisches Enzym« umfaßt das Trypsin selbst, wie auch die verwandten proteolytischen Enzyme wie Chymotrypsin, Pepsin und Bromelin sowie auch Streptokinase. Als proteolytisches Enzym verwendet man vorzugsweise Trypsin oder Chymotrysin, vor allem jedoch Trypsin.
• Die bei der Ausführung der Erfindung verwendete Gelatine soll steril, frei von Fiebererregern und ohne antigene Wirkung sein. Diese Gelatine ist üblich und bekannt (z. B. Knox 250 A oder Pharmagel A). Sie wird normalerweise aus gereinigtem Rindsknochen- oder Schweinehaut-Kollagen hergestellt und ist im Handel als trockener Feststoff erhältlich. Die Gelatine kann in wäßriger Lösung verwendet werden und sollte teilweise (z. B. durch Erhitzen in verdünnter Säure) hydrolysiert werden. So kann man eine wäßrige Lösung von teilweise hydrolysierter Gelatine (Polypeptidhydrolysat) dadurch herstellen, daß man 22 Gewichtsprozent Gelatine (z. B.
• Knox 250 A oder Pharmagel A) in warmer 0,001 n-Salzsäurelösung, die 0,01 Volumprozent para-Oxybenzoesäurepropylester und 0,09 Volumprozent para-Oxybenzoesäuremethylester enthält, löst, das Gemisch 2 bis 5 Stunden lang bei 100"C oder 1 bis 3 Stunden lang bei 1200 C in einem Autoklav erhitzt, anschließend filtriert und mit destilliertem Wasser, das die para-Oxybenzoesäureester in den oben angegebenen Konzentrationen enthält, auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
• Der pE-Wert wird mittels zusätzlicher Salzsäure auf einen Wert von 3,2 bis 4,8, vorzugsweise von etwa 3,6, eingestellt. Im allgemeinen ist eine 50/,ige wäßrige Lösung brauchbar. Man kann aber auch mehr oder weniger konzentrierte Lösungen venvenden. Die Gelatinelösung kann auch in der Weise hergestellt werden, daß man 10 Gewichtsprozent Gelatine in warmer 0,01 n-Salzsäurelösung löst, die 0,01 Volumprozent para-Oxybenzoesäurepropylester und 0,09 Volumprozent para-Oxybenzoesäuremethylester enthält. Die so erhaltene Lösung erhitzt man auf 80 bis 100"C und hält sie 1 Stunde lang auf dieser Temperatur. Anschließend wird sie filtriert und das erhaltene Filtrat mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,2 bis 4,8 eingestellt. Hiernach verdünnt man das Filtrat mit Wasser, das 0,01 0!o para-Oxybenzoesäurepropylester und 0,09 ovo para-Oxybenzoesäuremethylester enthält, zu einer 50!0eigen Lösung.
• Bei der Herstellung der Gelatinelösung kann man an Stelle der oben verwendeten Salzsäure auch andere geeignete, nicht reaktionsfähige starke Säuren, wie Phosphor- oder Milchsäure, verwenden. Es ist jedoch wichtig, daß der pE-Wert der fertigen Gelatinelösung 3,2 bis 4,8, vorzugsweise etwa 3,6, beträgt. Die para-Oxybenzoesäureester werden als Schutzmittel verwendet, und an Stelle der genannten Methyl- und Propyl-Ester kann man auch andere Parabene oder andere Schutzmittel wie z. B. Phenol, ein Kresol, p-Chlorkresol oder Thimerosal verwenden.
• Injizierbare Präparate kann man in der Weise herstellen, daß man kristallines Trypsin, z. B. in destilliertem Wasser oder vorzugsweise in einer kleinen Menge von 0,01 n-Salzsäure löst und anschließend einer wäßrigen, teilweise hydrolysierten, sterilen, fiebererregerfreien, nicht antigenischen Gelatinelösung einverleibt, die beispielsweise wie oben beschrieben hergestellt wurde. Lyophilisiertes Trypsin, das durch Lösen des Trypsins in Wasser oder 0,01 n-Salzsäure, Gefrierenlassen und Gefriertrocknen hergestellt wird, kann man leicht unmittelbar in einer 5%igen wäßrigen, teilweise hydrolysierten, sterilen, fiebererregerfreien, nicht antigenischen Gelatinelösung unter Bildung einer zum Injizieren geeigneten Zusammensetzung lösen. Die erhaltene Zusammensetzung wird durch weitere Zugabe von Säure oder Alkali auf einen pE-Wert von etwa 4 gebracht, und sie kann zwecks Aufrechterhaltung dieses pE-Wertes durch die Zugabe von Säure oder Alkali gepuffert werden. Zur Einstellung des pE-Wertes verwendet man im allgemeinen Salzsäure oder Natriumhydroxyd. Man kann jedoch auch andere Säuren, z. B. Phosphor- oder Milchsäure und andere Alkalien, z. B. Kaliumhydroxyd, verwenden. Die Zusammensetzung wird in einem sauren pE-Wertbereich von 3,2 bis 4,8, vorzugsweise von 3,6, gehalten. Schutzmittel wie para-Oxybenzoesäurepropylester (etwa 0,01 bis 0,02 Gewichtsprozent) und para-Oxybenzoesäuremethylester (etwa 0,09 bis 0,18 Gewichtsprozent) können ebenfalls zugegeben werden.
• Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann man Trypsin- und Gelatine-Bestandteile getrennt herstellen und beide unmittelbar vor Gebrauch vereinigen. Hier kann das Trypsin als solches verwendet werden. Vorzugsweise gibt man jedoch genügend nicht reaktionsfähige, starke Säure zu dem Trypsin (z. B.
• Q,01 n-Salzsäure), um eine Lösung mit einem pE-Wert von etwa 2 bis 3 herzustellen. Die erhaltene Lösung führt man dann durch Gefriertrocknen in ein leicht lösliches und zum Vermischen mit der Gelatine-Lösung fertiges Produkt über. Die Gelatine-Komponente wird in der -oben beschriebenen Weise (d. h. durch Lösen der teilweise hydrolysierten Gelatine, -Polypeptidhydrolysat -), in verdünnter Säure, Zugabe von Schutzmitteln, Erwärmen, Filtrieren, Verdünnen und anschließende p-Einstellung auf 3,2 bis 4,8 hergestellt.
• Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann man eine lyophylisierte Kombination von Trypsin und Gelatine zur unmittelbar vor Gebrauch erfolgenden Vermischung mit einem wäßrigen Lösemittel herstellen.
• Dies kann in der Weise geschehen, daß man eine Lösung von Trypsin in Gelatine gefriertrocknet, wobei in dem wäßrigen Lösemittel ein Schutzmittel (z. B. 0,1 01o para-Oxybenzoesäureester) oder Säure (z. B. Salzsäure) enthalten sein kann, es kann aber auch isotonische Kochsalzlösung sein. Es ist auf jeden Fall wichtig, daß die fertige Zusammensetzung, die durch Vermischen der Trypsin-Gelatine-Komponente mit dem wäßrigen Lösemittel gebildet wird, vor Gebrauch einen pH-Wert von 3,2 bis 4,8, vorzugsweise von 3,6, besitzt.
• Die Verabreichung durch Injektion wird vorzugsweise intramuskulär unter Verwendung von 21/2 bis 5,0 mg Trypsin oder eines anderen proteolytischen Enzyms (wobei 1/2 oder 1,0 ccm der Zusammensetzung eine Konzentration von 5 mg Trypsin/ccm besitzt), je nach Bedarf, 1 bis 4 mal oder mehr täglich durchgeführt.
• Die Erfindung wird nun an Hand von Beispielen näher erläutert. Alle darin angegebenen Teile beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf Gewichtsteile.
• Beispiel 1 Zu einer 5%igen wäßrigen Lösung von nicht antigener, fiebererregerfreier, teilweise hydrolysierter Gelatine (Knox 250 A), die man durch 3stündiges Erhitzen der Gelatine in 0,001 n-Salzsäure bei 100°C herstellt, werden unter Rühren etwa 5 mg kristallines Trypsin pro ccm Lösung gegeben. Zu dem erhaltenen Gemisch gibt man dann etwa 0,09 01o para-Oxybenzoesäuremethylester und 0,01 °lo para-Oxybenzoesäurepropylester. Nachdem durch Rühren die Gleichmäßigkeit des Gemischs erreicht worden ist, stellt man den p,-Wert durch Zugabe von Salzsäure oder Natriumhydroxyd auf einen Wert von 3,6 ein. Man kann selbstverständlich auch einen pE-Wert von 3,2, 3,5 oder 4,5 erzielen, indem man die Säure- oder Alkalimenge entsprechend verändert. Die Trypsin-Konzentration kann man dadurch verändern, daß man die Menge des zu der Gelatinelösung gegebenen Enzyms variiert. Das auf einen pE-Wert von 3,2 bis 4,8 eingestellte Produkt kann als solches für Injektionen üblicher Art verwandt werden.
• Beispiel 2 a) Gelatine-Lösemittel Gelatine (Knox 250 A) 3000 g Propyl-Paraben .................. 6,0 g Methyl-Paraben .................. 54,0 g Konzentrierte Salzsäure (36,5 bis 38%) ................ 90 ccm Destilliertes Wasser, für Gesamtmenge der Lösung von ................. 60 Litern Man bringt 551 Wasser zum Kochen und gibt Propyl-Paraben und Methyl-Paraben zu. Danach gibt man die Salzsäure zu der wäßrigen Lösung und mischt so lange, bis ein gleichmäßiges Gemisch erzielt ist. Dann wird die Gelatine zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf 80 bis 100O G erhitzt und 1 Stunde lang auf dieser Temperatur gehalten.
• Danach bringt man den Wert mittels zusätzlicher Salzsäure auf 3,5 und verdünnt die Lösung mit destilliertem Wasser auf das entsprechende Volumen.
• Man gibt nun 30 g eines sterilen, gewaschenen Filtrier-Hilfsmittels (Hi-Flo) zu und filtriert die Lösung durch Whatman-Papier Nr. 52.
• Hiernach füllt man die Lösung in Mengen von 5,8 ccm in Ampullen und sterilisiert sie 1/2 Stunde lang bei 100O C. b) Lyophylisiertes Trypsin Kristallines Trypsin .............. 125 g 0,01 N Salzsäure, für Gesamtmenge der Lösung von ................ 5000 ccm Das Trypsin wird in der Salzsäure gelöst und durch Whatman-Papier Nr. 52 filtriert. Danach filtriert man es durch einen Selas 02-Filter in einen sterilen Behälter.
• In die Ampullen werden jeweils 1 ccm unter aseptischen Bedingungen eingefüllt, worauf die Lyophylisierung folgt.
• Für die Zwecke der Injektion werden 5 ccm Gelatine-Lösemittel a) mit 25 mg lyophylisiertem Trypsin b) vermischt.
• Beispiel 3 a) wäßriges Lösemittel para-Oxybenzoesäurepropylester.... 6,0 g para-Oxybenzoesäuremethylester.... 54,0 g Destilliertes Wasser, für Gesamtmenge der Lösung von ................ 60 Liter Die para-Oxybenzoesäureester werden in dem destillierten Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wird durch ein mittleres Sinterglas-Filter filtriert, anschließend in Mengen von je 5,8 ccm in Ampullen gefüllt und 20 Minuten lang bei 120"C sterilisiert. b) Trypsin-Gelatine, lyophylisiert Man stellt eine Gelatine-Lösung, wie im Beispiel 2 beschrieben, her, nur daß die Gelatine-Konzentration auf 25°/o erhöht wird.
• Dann stellt man eineTrypsin-Lösung, wie im Beispiel2 beschrieben, her und filtriert sie durch einen Bakterienfilter (Selas 02) in einen sterilen Behälter.
• Unter sterilen Bedingungen werden 5 1 der oben beschriebenen sterilen Gelatine-Lösung zu der Trypsin-Lösung gegeben und der p-'Vert wird auf 3,6 eingestellt.
• 2,0 ccm der erhaltenen Lösung, die 25 mg Trypsin und 0,5 g Gelatine enthält, werden in Ampullen gefüllt, und der Inhalt wird in der üblichen Weise lyophylisiert.
• Für Injektionszwecke werden 5 ccm des wäßrigen Lösemittels a) mit der lyophylisierten Trypsin-Gelatine vermischt.
• Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können besonders zur Linderung entzündlicher und ödematöser Erscheinungen, insbesondere von Thrombophlebitis und Phlebothrombose, verwendet werden. Sie können ferner bei der Behandlung anderer Entzündungskrankheiten angewandt werden. So erwiesen sie sich bei der Behandlung von Iritis und anderen Augenentzündungen sowie diabetischen- und sonstigen Beingeschwüren als brauchbar. Bei intramuskulärer Anwendung wird eine tiefe Injektion bevorzugt. Die hierzu verwendeten Spritzen sind vorzugsweise solche mit Nadeln Nr. 20.
• Die Injektion erfolgt normalerweise langsam in den Gesäßmuskel. Die Zusammensetzungen können in der gleichen Weise auch zum Verdünnen schleimiger Sekretionen in den oberen Luftwegen, wie sie beispielsweise bei Bronchialasthma auftreten, verwendet werden.
• Bezüglich der Prüfung auf Haltbarkeit wurde eine Lösung von 3 mglccm kristallinem Trypsin in 50/0aber Gelatine mit einem pE-Wert von 4,1 nach dem üblichen Hämoglobin-Verdauungsverfahren (insbesondere dem von Northrop, Kunitz und Herriot, »Crystalline Enzymes, Columbia UniversityPress, 1948, S.107) untersucht. DieVersuchergebnisse zeigten, daß nach 2 Wochen bei Raumtemperatur keine Veränderung derTrypsin-Wirksamkeit eingetreten war. Ferner wurden Untersuchungen nach einem Verfahren, das im wesentlichen dem von Fabinyi-Szebehelz, Brit. J. Pharmacol, Bd. 8, [1953] S. 30, entspricht, ebenfalls unter Verwendung der oben erwähnten Lösung, durchgeführt und die erhaltenen Daten zeigten, daß die Wirksamkeit des Trypsins in Gelatine mit der von Trypsin in Ö1 (Parenzyme) vergleichbar war.
• PATENTANSPRUCEE 1. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren, beständigen proteolytischen Enzympräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man eine teilweise hydrolysierte, sterile, fiebererregerfreie, nicht antigene Gelatine und ein proteolytisches Enzym einem wäßrigen Medium einverleibt und den pE-Wert so einstellt, daß die erhaltene wäßrige Lösung einen Wert von 3,2 bis 4,8 besitzt.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym als solches oder eine wäßrige Lösung des Enzyms mit einer wäßrigen Lösung der Gelatine vereinigt.

   3. Verfahren nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym in lyophylisierter Form einer wäßrigen Lösung der Gelatine zugibt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch des Enzyms und der Gelatine in lyophylisierter Form zu dem wäßrigen Medium gibt.

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym Trypsin ist. ~~~~~ In Betracht gezogene Druckschriften: Schweizerische Patentschrift Nr. 90 689.