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Verfahren zur Gewinnung organspezifischer Fraktionen aus Organgeweben
Das Verfahren dient zur Gewinnung organspezifischer Fraktionen aus Organgeweben.
Als Ausgangsstoff kann jedes Organgewebe, insbesondere auch pathologisches Gewebe,
Verwendung finden. Die daraus isolierten Stoffe lassen sich zur gezielten Organbehandlung
verwenden, ebenso auch als Antigen oder Substrat zu diagnostischen Zwecken, insbesondere
zu serologischen Reaktionen auf cytotoxische Antikörper oder zur Abwehrfermentreaktion.
Aus der Literatur geht hervor, daß die Spezifität einer diagnostischen Reaktion
von der Spezifität des verwendeten Antigens bzw. Substrats abhängt. Eine Methode,
die es erlaubt, diese Spezifität zu erhöhen, muß deshalb die damit angestellten
Reaktionen verbessern. Diese altgemeingültige These trifft auch für die Abwehrfermentreaktion
zu. In jeder Organart sind nicht nur Zellen enthalten, die die besondere Funktion
des Organs ermöglichen, sondern ebenso Zeltarten, die in jedem Gewebe und in jedem
Organ vorkommen können, wie z. B. bindegewebiges Stütz- und Füllgewebe, Lymph- und
Blutgefäße, Nerven u. dgl.
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Bei der Gewinnung von Organsubstraten für die Abwehrfer mentreaktion
nach A b- d e r h a1 d en werden diese Zeltbestandteile soweit wie möglich aus den
vorzerkleinerten und gekochten Gewebepartikeln mit der Pinzette ausgezupft, doch
gelingt dies niemals so vollkommen, wie es wünschenswert wäre.
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Aber auch die organspezifischen Zellen enthalten ubiquitäre Zeltbestandteile,
die in allen Zeltarten ebenfalls vorkommen und den vegetativen Aufgaben zur Erhaltung
des Lebens und der Vermehrung, wie z. B. der Energiegewinnung, der Atmung und dem
intracellulären Stoffwechsel, dienen. Diese funktionsunspezifischen Zeltbestandteile
konnten bisher nicht von den spezifischen abgetrennt werden. Dies ist jedoch wichtig,
weilt nur ein kleiner Teil der Zeltbestandteile für die organspezifischen Funktionen
verantwortlich ist.
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Das Verfahren, mit dem diese Abtrennung möglich wird, hat gewisse
Ähnlichkeiten mit demjenigen,.das zur Isolierung von bestimmten Antikörperfraktionen
aus Antikörperseren verwendet wird.
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Zum Beispiel wird dort aus einem Antikörperserum, das gegen verschiedene
Mikroorganismen gerichtet sein kann, auf Grund einer überkreuzreaktion eine Digerierung
erreicht. Auf diese Weise kann man ein spezifisch gegen Streptokokken-Antigene gerichtetes
Serum zunächst mit Staphylokokken zusammenbringen. Dabei reagieren auf Grund einer
Antigen-Antikörperreaktion alle Antikörper, die auch in Staphylokokken enthalten
sind, mit diesen Bakterien und bilden -in Agglutinat oder Präcipitat, das abgeschleudert
und beseitigt werden kann. Im IM) erstand des Serums sind dann nur die spezifisch
gegen Strepto-1<okken gerichteten Antikörperfraktionen enthalten, nicht aber
solche, die sich auch gegen Staphylokokken richten.
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Bei dem Verfahren handelt es sich jedoch darum, die unspezifischen
Falttoren aus einer Organsubstanz zu beseitigen. Dies geschieht hier in umgekehrter
«'eise mit einem spezifisch auf die unerwünschten Fraktionen des Organhomogenates
gerichteten Serum. das also sowohl gegen die unerwünschten Zeltarten als auch gegen
die ubiquitären Zeltbestandteile gerichtet ist. Da diese ubiquitären Zeltbestandteile
auch in den unerwünschten Begleitzellen enthalten sind, genügt es also, ein Serum
zu verwenden, das spezifisch auf diese Zeltarten gerichtet ist. Man benutzt also
ein Serum gegen Gefäß- und Bindegewebe sowie Nervengewebe, wenn man organspezifische
Stoffe isolieren will. Will man jedoch die für das Nervengewebe spezifischen Stoffe
isolieren, darf man diese selbstverständlich nicht zur Gewinnung des Serums mitverwenden.
Man bringt also hier eine möglichst feine Aufschwemmung bzw. Lösung des zu bearbeitenden
Organhomogenates mit einem antimesenchymalen Serum zusammen und beseitigt das sich
bildende Agglutinat bzw.- Präcipitat durch Schwerkrafttrennung. Voraussetzung dazu
ist eine möglichst feine Homogenisierung des Gewebes, die so weit gehen sollte,
daß auch die Bestandteile des strukturierten Protoplasmas (Zellkerne, Mitochondrien)
mechanisch aufgeschlossen sind. Zum Schutz gegen eine spontane Sedimentation ist
dem Organhomogenat ein Schutzkolloid oder ein Emulgator zuzusetzen (Agar-Agar, Zelluloseester.
Fructose u. dgl.), die selbst nicht an der Reaktion teilnehmen und später möglichst
wieder durch Dialyse gegen Aqua dest. beseitigt werden können.
In
dem verwendeten antimesenchymalen Serum sind aber auch Abwehrfermente enthalten,
die in der Lage sind, selektiv die organunspezifischen Fraktionen des Homogenates
abzubauen.-Man kann diese Methode deshalb zusätzlich oder allein benutzen und sie
beträchtlich verstärken durch Zusatz des Acetonharnniederschlages der Antikörperbildner,
von denen man durch wiederholte Immunisierung das antimesenchymale Serum gewonnen
hat. Durch Ausschütteln des Harnes in Aceton sind die Abwehrfermente in diesem angereichert
enthalten. Die Einheitlichkeit des Verfahrens an der Digerierung mit Antikörpern
und einer solchen durch fermentativ en Abbau mit Abwehrfermenten ist gewährleistet,
weil es sich bei den verwendeten Antikörpern und Abwehrfermenten um Stoffe aus denselben
Körperflüssigkeiten von besonders vorbehandelten Individuen handelt und weil eine
gleichzeitige Einwirkung dieser Stoffe, ganz abgesehen von einer kombinierten Anwendung,
möglich ist.
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Man kann aber auch allein durch Abwehrfermente die unerwünschten unspezifischen
Organbestandteile beseitigen, indem man sie durch die Fermentwirkung bis zu dialysablen
Stoffen abbaut und dann durch Dialyse beseitigt. Das Gemisch aus Antikörperserum
und Organhomogenat kann aber nur nach einer zeitlich ausreichenden Einwirkung der
Abwehrfermente ton solchen Abbauprodukten dialysiert werden. Für die Digerierung
durch Antikörper darf jedoch nicht solange zugewartet werden, weil bei dem Homogenat
trotz zugesetzter Emulgatoren die Gefahr der spontanen Sedimentierung besteht. Man
muß also schon nach relativ kurzer Einwirkungszeit des Serums, wo noch kein wesentlicher
fernientiver Abbau stattgefunden hat, das Agglutinat bzw. Präcipitat durch besonders
vorsichtige Schwerkrafttrennung bei niederer Tourenzahl in der Zentrifuge trennen
und beseitigen. Danach kann man aber im Brutschrank das Serum weiter einwirken lassen
und zusätzlich Abwehrfermente, die aus dem Acetonharnniederschlag der Serumspender
gewonnen werden, hinzufügen. Es können dadurch etwaige Reste der unerwünschten Organbestandteile,
die durch die Agglutination oder Präcipitation nicht erfaßt wurden, noch fermentativ
gespalten werden. Auf diese Weise ist eine kombinierte Reinigung bzw. Einengung
des Organhomogenates auf die organspezifische Fraktion möglich, nach der durch Dialyse
sowohl die Abbauprodukte als auch das Schutzkolloid bzw. das Emulgiermittel beseitigt
wird und durch Gefriertrocknung sich eine Konservierung ohne fremde Zusätze erreichen
läßt. . Ausführungsbeispiel Von Schweineleber sollen aus einem Homogenat die organspezifischen
Fraktionen isoliert werden. Dazu ist vorher die Gewinnung eines antimesenchymalen
antinervalen Serums bzw. des Acetonharnniederschlages aus dem Harn der Serumlieferanten
erforderlich. Das Serum -wird nach bekannten Methoden der Gewinnung cytotoxischer
Seren durch wiederholte Injektion von Milz, subcutanem Bindegewebe, Blut- und Lymphgefäßen
(Aorta; Ductus thoracicus) und Nervengewebe (N. brachialis oder N. femoralis), alle
vom Schwein, die insammen als Homogenat mit dem Freundschen Adjuvans vermischt sind,
hergestellt, indem man diese Kombination einem Hammel viermal im -Abstand von etwa
einer Woche injiziert. Nach 6 Wochen wird dann aus dem Blut des Tieres das erforderliche
Antikörperserum gewonnen und durch fraktioniertes Aussalzen auf die Antikörperfraktion
eingeengt.
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Während der aktiven Immunisierung wird von dein Hammel jeweils 1 bis
2 Tage nach der Impfung mittels Dauerkatheter der Harn gesammelt und dieser in gleicher
Weise wie bei der Abderhaldenschen Reaktion in Aceton ausgeschüttelt. Der Acetonharnniederschlag
wird danach getrocknet-und vor der Verwendung im Verhältnis 1 : 10- in Kochsalzlösung
gelöst.
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Es werden nun 100 g schlachtfrisch entnommene Schweineleber finit
dem Messer zunächst vorzerkleinert, dann in flüssigem Stickstoff tiefgekühlt und
in einer ebenfalls tiefgekühlten Mühle fein gemahlen. dann in 50 ccm einer 40o/oigen
Fructoselösung auf 0° C erwärmt und zusammen mit der gleichen Volumenmenge Glassplitter
in einer Mörsermühle weiterzerkleinert. Nun -,verden weitere 50 ccm der Fructoselösung
zugegeben und die zur Mahlung verwendeten Glassplitter, nachdem sich diese abgesetzt
haben, beseitigt und finit der Fructoselösung, die für die weiteren Aufarbeitungen
derselben Organart benötigt wird, von den noch etwa darin enthaltenen Organbestandteilen
freigespült.
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je 10g der überstehenden Organemulsion bzw. Lösung werden nun mit
der zur Ausspülung der Glassplitter verwendeten Fructoselösung auf 100 ccm verdünnt
und 5 ccm des Anti-Schweinemesenchym-Serums dazugegeben. Nach einer halben Stunde
bei Temperaturen um 37° C wird nun das entstehende Agglutinat bzw. Präcipitat vorsichtig
zentrifugiert bei 500 bis 1000 Umdrehungen und danach beseitigt. Der Überstand wird
nun erneut, eventuell unter Zugabe einer weiteren Serummenge, auf 1 Stunde bei 37°
C belassen und danach in gleicher Weise erneut zentrifugiert und das Sediment beseitigt.
Danach werden 10 ccm der Lösung des Acetönharnniederschlages zu dem Überstand zugesetzt
und auf weitere 12 Stunden wieder bei 37° C bebrütet, danach gegen Aqua dest. ausgiebig
dialysiert und gefriergetrocknet.