DE1040748B

DE1040748B - Process for obtaining organ-specific fractions from organ tissues

Info

Publication number: DE1040748B
Application number: DET13615A
Authority: DE
Inventors: Dr Med Karl Theurer
Original assignee: DR MED KARL THEURER
Current assignee: DR MED KARL THEURER
Priority date: 1957-05-20
Filing date: 1957-05-20
Publication date: 1958-10-09

Description

Verfahren zur Gewinnung organspezifischer Fraktionen aus Organgeweben Das Verfahren dient zur Gewinnung organspezifischer Fraktionen aus Organgeweben. Als Ausgangsstoff kann jedes Organgewebe, insbesondere auch pathologisches Gewebe, Verwendung finden. Die daraus isolierten Stoffe lassen sich zur gezielten Organbehandlung verwenden, ebenso auch als Antigen oder Substrat zu diagnostischen Zwecken, insbesondere zu serologischen Reaktionen auf cytotoxische Antikörper oder zur Abwehrfermentreaktion. Aus der Literatur geht hervor, daß die Spezifität einer diagnostischen Reaktion von der Spezifität des verwendeten Antigens bzw. Substrats abhängt. Eine Methode, die es erlaubt, diese Spezifität zu erhöhen, muß deshalb die damit angestellten Reaktionen verbessern. Diese altgemeingültige These trifft auch für die Abwehrfermentreaktion zu. In jeder Organart sind nicht nur Zellen enthalten, die die besondere Funktion des Organs ermöglichen, sondern ebenso Zeltarten, die in jedem Gewebe und in jedem Organ vorkommen können, wie z. B. bindegewebiges Stütz- und Füllgewebe, Lymph- und Blutgefäße, Nerven u. dgl.Process for obtaining organ-specific fractions from organ tissues The method is used to obtain organ-specific fractions from organ tissues. Any organ tissue, especially pathological tissue, can be used as the starting material. Find use. The substances isolated from it can be used for targeted organ treatment use, as well as antigen or substrate for diagnostic purposes, in particular for serological reactions to cytotoxic antibodies or for defense fermentation reactions. The literature shows that the specificity of a diagnostic response depends on the specificity of the antigen or substrate used. A method, those who make it possible to increase this specificity must therefore be employed by it Improve reactions. This generally accepted thesis also applies to the defense fermentation reaction to. Every type of organ does not only contain cells that perform a particular function of the organ, but also types of tent that exist in every tissue and in every Organ can occur, such as B. connective tissue supporting and filling tissue, lymph and Blood vessels, nerves, etc.

Bei der Gewinnung von Organsubstraten für die Abwehrfer mentreaktion nach A b- d e r h a1 d en werden diese Zeltbestandteile soweit wie möglich aus den vorzerkleinerten und gekochten Gewebepartikeln mit der Pinzette ausgezupft, doch gelingt dies niemals so vollkommen, wie es wünschenswert wäre.When obtaining organ substrates for the defense fermentation reaction after the end of the day, these tent components are removed as far as possible from the pre-shredded and cooked tissue particles are plucked with tweezers, yes this never succeeds as perfectly as it would be desirable.

Aber auch die organspezifischen Zellen enthalten ubiquitäre Zeltbestandteile, die in allen Zeltarten ebenfalls vorkommen und den vegetativen Aufgaben zur Erhaltung des Lebens und der Vermehrung, wie z. B. der Energiegewinnung, der Atmung und dem intracellulären Stoffwechsel, dienen. Diese funktionsunspezifischen Zeltbestandteile konnten bisher nicht von den spezifischen abgetrennt werden. Dies ist jedoch wichtig, weilt nur ein kleiner Teil der Zeltbestandteile für die organspezifischen Funktionen verantwortlich ist.But the organ-specific cells also contain ubiquitous tent components, which also occur in all types of tents and the vegetative tasks of conservation of life and multiplication, such as B. energy production, breathing and the intracellular metabolism, serve. These function-unspecific tent components could not be separated from the specific ones so far. However, this is important Only a small part of the tent components are used for organ-specific functions responsible for.

Das Verfahren, mit dem diese Abtrennung möglich wird, hat gewisse Ähnlichkeiten mit demjenigen,.das zur Isolierung von bestimmten Antikörperfraktionen aus Antikörperseren verwendet wird.The process by which this separation is made possible has certain features Similarities to that used to isolate certain antibody fractions from antibody sera is used.

Zum Beispiel wird dort aus einem Antikörperserum, das gegen verschiedene Mikroorganismen gerichtet sein kann, auf Grund einer überkreuzreaktion eine Digerierung erreicht. Auf diese Weise kann man ein spezifisch gegen Streptokokken-Antigene gerichtetes Serum zunächst mit Staphylokokken zusammenbringen. Dabei reagieren auf Grund einer Antigen-Antikörperreaktion alle Antikörper, die auch in Staphylokokken enthalten sind, mit diesen Bakterien und bilden -in Agglutinat oder Präcipitat, das abgeschleudert und beseitigt werden kann. Im IM) erstand des Serums sind dann nur die spezifisch gegen Strepto-1<okken gerichteten Antikörperfraktionen enthalten, nicht aber solche, die sich auch gegen Staphylokokken richten.For example, there is an antibody serum that is against various Microorganisms can be directed, due to a cross-reaction a digestion achieved. In this way you can have a specifically directed against streptococcal antigens First bring the serum together with the staphylococci. Thereby react on the basis of a Antigen-antibody reaction all antibodies that are also contained in staphylococci are with these bacteria and form -in agglutinate or Precipitat, which is thrown off and can be eliminated. In the IM) purchase of the serum, only those are specific contain antibody fractions directed against Strepto-1 <okken, but not those that are also directed against staphylococci.

Bei dem Verfahren handelt es sich jedoch darum, die unspezifischen Falttoren aus einer Organsubstanz zu beseitigen. Dies geschieht hier in umgekehrter «'eise mit einem spezifisch auf die unerwünschten Fraktionen des Organhomogenates gerichteten Serum. das also sowohl gegen die unerwünschten Zeltarten als auch gegen die ubiquitären Zeltbestandteile gerichtet ist. Da diese ubiquitären Zeltbestandteile auch in den unerwünschten Begleitzellen enthalten sind, genügt es also, ein Serum zu verwenden, das spezifisch auf diese Zeltarten gerichtet ist. Man benutzt also ein Serum gegen Gefäß- und Bindegewebe sowie Nervengewebe, wenn man organspezifische Stoffe isolieren will. Will man jedoch die für das Nervengewebe spezifischen Stoffe isolieren, darf man diese selbstverständlich nicht zur Gewinnung des Serums mitverwenden. Man bringt also hier eine möglichst feine Aufschwemmung bzw. Lösung des zu bearbeitenden Organhomogenates mit einem antimesenchymalen Serum zusammen und beseitigt das sich bildende Agglutinat bzw.- Präcipitat durch Schwerkrafttrennung. Voraussetzung dazu ist eine möglichst feine Homogenisierung des Gewebes, die so weit gehen sollte, daß auch die Bestandteile des strukturierten Protoplasmas (Zellkerne, Mitochondrien) mechanisch aufgeschlossen sind. Zum Schutz gegen eine spontane Sedimentation ist dem Organhomogenat ein Schutzkolloid oder ein Emulgator zuzusetzen (Agar-Agar, Zelluloseester. Fructose u. dgl.), die selbst nicht an der Reaktion teilnehmen und später möglichst wieder durch Dialyse gegen Aqua dest. beseitigt werden können. In dem verwendeten antimesenchymalen Serum sind aber auch Abwehrfermente enthalten, die in der Lage sind, selektiv die organunspezifischen Fraktionen des Homogenates abzubauen.-Man kann diese Methode deshalb zusätzlich oder allein benutzen und sie beträchtlich verstärken durch Zusatz des Acetonharnniederschlages der Antikörperbildner, von denen man durch wiederholte Immunisierung das antimesenchymale Serum gewonnen hat. Durch Ausschütteln des Harnes in Aceton sind die Abwehrfermente in diesem angereichert enthalten. Die Einheitlichkeit des Verfahrens an der Digerierung mit Antikörpern und einer solchen durch fermentativ en Abbau mit Abwehrfermenten ist gewährleistet, weil es sich bei den verwendeten Antikörpern und Abwehrfermenten um Stoffe aus denselben Körperflüssigkeiten von besonders vorbehandelten Individuen handelt und weil eine gleichzeitige Einwirkung dieser Stoffe, ganz abgesehen von einer kombinierten Anwendung, möglich ist.The procedure is, however, the unspecific To eliminate folding gates from an organ substance. This is done in reverse here «'With a specific focus on the undesired fractions of the organ homogenate directed serum. So that against the undesirable types of tent as well as against the ubiquitous tent components is addressed. Because these ubiquitous tent components are also contained in the unwanted accompanying cells, it is sufficient to use a serum specifically aimed at these types of tents. So you use a serum against vascular and connective tissue as well as nerve tissue, if you are organ-specific Wants to isolate substances. However, one wants the substances specific for the nerve tissue isolate, you must of course not use them to obtain the serum. So here you bring the finest possible suspension or solution of the material to be processed Organ homogenates together with an antimesenchymal serum and eliminates that itself forming agglutinate or precipitate by gravity separation. Prerequisite for this is the finest possible homogenization of the tissue, which should go as far as that the components of the structured protoplasm (cell nuclei, mitochondria) are mechanically open. To protect against spontaneous sedimentation is add a protective colloid or an emulsifier to the organ homogenate (agar-agar, cellulose ester. Fructose and the like), which themselves do not participate in the reaction and later if possible again by dialysis against distilled water. can be eliminated. In the antimesenchymal serum used also contains defense ferments, which are able to selectively remove the organ-unspecific fractions of the homogenate - One can therefore use this method in addition or alone and they considerably increase the antibody builder by adding the acetone urine precipitate, from which the antimesenchymal serum is obtained by repeated immunization Has. By shaking out the urine in acetone, the defensive ferments are enriched in it contain. The uniformity of the process at the digestion with antibodies and this through fermentative degradation with defensive ferments is guaranteed, because the antibodies and defense ferments used are substances from the same Body fluids from specially pretreated individuals and because a simultaneous exposure to these substances, not to mention combined use, is possible.

Man kann aber auch allein durch Abwehrfermente die unerwünschten unspezifischen Organbestandteile beseitigen, indem man sie durch die Fermentwirkung bis zu dialysablen Stoffen abbaut und dann durch Dialyse beseitigt. Das Gemisch aus Antikörperserum und Organhomogenat kann aber nur nach einer zeitlich ausreichenden Einwirkung der Abwehrfermente ton solchen Abbauprodukten dialysiert werden. Für die Digerierung durch Antikörper darf jedoch nicht solange zugewartet werden, weil bei dem Homogenat trotz zugesetzter Emulgatoren die Gefahr der spontanen Sedimentierung besteht. Man muß also schon nach relativ kurzer Einwirkungszeit des Serums, wo noch kein wesentlicher fernientiver Abbau stattgefunden hat, das Agglutinat bzw. Präcipitat durch besonders vorsichtige Schwerkrafttrennung bei niederer Tourenzahl in der Zentrifuge trennen und beseitigen. Danach kann man aber im Brutschrank das Serum weiter einwirken lassen und zusätzlich Abwehrfermente, die aus dem Acetonharnniederschlag der Serumspender gewonnen werden, hinzufügen. Es können dadurch etwaige Reste der unerwünschten Organbestandteile, die durch die Agglutination oder Präcipitation nicht erfaßt wurden, noch fermentativ gespalten werden. Auf diese Weise ist eine kombinierte Reinigung bzw. Einengung des Organhomogenates auf die organspezifische Fraktion möglich, nach der durch Dialyse sowohl die Abbauprodukte als auch das Schutzkolloid bzw. das Emulgiermittel beseitigt wird und durch Gefriertrocknung sich eine Konservierung ohne fremde Zusätze erreichen läßt. . Ausführungsbeispiel Von Schweineleber sollen aus einem Homogenat die organspezifischen Fraktionen isoliert werden. Dazu ist vorher die Gewinnung eines antimesenchymalen antinervalen Serums bzw. des Acetonharnniederschlages aus dem Harn der Serumlieferanten erforderlich. Das Serum -wird nach bekannten Methoden der Gewinnung cytotoxischer Seren durch wiederholte Injektion von Milz, subcutanem Bindegewebe, Blut- und Lymphgefäßen (Aorta; Ductus thoracicus) und Nervengewebe (N. brachialis oder N. femoralis), alle vom Schwein, die insammen als Homogenat mit dem Freundschen Adjuvans vermischt sind, hergestellt, indem man diese Kombination einem Hammel viermal im -Abstand von etwa einer Woche injiziert. Nach 6 Wochen wird dann aus dem Blut des Tieres das erforderliche Antikörperserum gewonnen und durch fraktioniertes Aussalzen auf die Antikörperfraktion eingeengt.But you can also use defense ferments alone to remove the unwanted unspecific ones Eliminate organ components by making them dialysable through the fermentation effect Degrades substances and then eliminated through dialysis. The mixture of antibody serum and organ homogenate can, however, only after sufficient exposure to the Defense ferments can be dialyzed by such degradation products. For digestion due to antibodies, however, one must not wait as long because the homogenate Despite added emulsifiers, there is a risk of spontaneous sedimentation. Man So it has to take effect after a relatively short period of time for the serum to take effect, where not yet a significant one distant degradation has taken place, the agglutinate or Precipitat by particularly Carefully separate the centrifuge by gravity if the number of revolutions is low and eliminate. After that, however, you can let the serum take effect in the incubator and defensive ferments from the acetone urine precipitate of the serum donors be obtained, add. Any residues of the unwanted organ components, which were not detected by agglutination or precipitation, nor fermentatively be split. In this way there is a combined cleaning or narrowing of the organ homogenate on the organ-specific fraction possible after dialysis both the degradation products and the protective colloid or emulsifying agent are eliminated and freeze-drying can be used to preserve it without any external additives leaves. . Exemplary embodiment of pork liver, the organ-specific Fractions are isolated. To do this, an antimesenchymal must first be obtained antinerval serum or the acetone urine precipitate from the urine of the serum suppliers necessary. The serum becomes more cytotoxic by known methods of recovery Sera obtained from repeated injections of the spleen, subcutaneous connective tissue, blood and lymph vessels (Aorta; thoracic duct) and nerve tissue (brachial or femoral nerve), all from pork, which are mixed together as a homogenate with Freund's adjuvant, made by giving this combination a mutton four times at a distance of about injected a week. After 6 weeks, the blood of the animal becomes the required Antibody serum obtained and by fractional salting out to the antibody fraction constricted.

Während der aktiven Immunisierung wird von dein Hammel jeweils 1 bis 2 Tage nach der Impfung mittels Dauerkatheter der Harn gesammelt und dieser in gleicher Weise wie bei der Abderhaldenschen Reaktion in Aceton ausgeschüttelt. Der Acetonharnniederschlag wird danach getrocknet-und vor der Verwendung im Verhältnis 1 : 10- in Kochsalzlösung gelöst.During active immunization, your mutton will receive 1 to 2 days after the vaccination, the urine was collected by means of an indwelling catheter and this was done in the same way Shaken like in the Abderhalden reaction in acetone. The acetone urine precipitate is then dried - and before use in a ratio of 1:10 - in saline solution solved.

Es werden nun 100 g schlachtfrisch entnommene Schweineleber finit dem Messer zunächst vorzerkleinert, dann in flüssigem Stickstoff tiefgekühlt und in einer ebenfalls tiefgekühlten Mühle fein gemahlen. dann in 50 ccm einer 40o/oigen Fructoselösung auf 0° C erwärmt und zusammen mit der gleichen Volumenmenge Glassplitter in einer Mörsermühle weiterzerkleinert. Nun -,verden weitere 50 ccm der Fructoselösung zugegeben und die zur Mahlung verwendeten Glassplitter, nachdem sich diese abgesetzt haben, beseitigt und finit der Fructoselösung, die für die weiteren Aufarbeitungen derselben Organart benötigt wird, von den noch etwa darin enthaltenen Organbestandteilen freigespült.100 g of pork liver removed from the slaughterhouse are now finite first pre-shredded with the knife, then deep-frozen in liquid nitrogen and finely ground in a also frozen grinder. then in 50 cc of a 40o / oigen Fructose solution warmed to 0 ° C and together with the same volume of glass splinters further crushed in a mortar grinder. Well - add another 50 cc of the fructose solution added and the glass splinters used for grinding after they have settled have eliminated and finite the fructose solution, which is necessary for further work-up the same type of organ is required, of the organ components still contained therein flushed free.

je 10g der überstehenden Organemulsion bzw. Lösung werden nun mit der zur Ausspülung der Glassplitter verwendeten Fructoselösung auf 100 ccm verdünnt und 5 ccm des Anti-Schweinemesenchym-Serums dazugegeben. Nach einer halben Stunde bei Temperaturen um 37° C wird nun das entstehende Agglutinat bzw. Präcipitat vorsichtig zentrifugiert bei 500 bis 1000 Umdrehungen und danach beseitigt. Der Überstand wird nun erneut, eventuell unter Zugabe einer weiteren Serummenge, auf 1 Stunde bei 37° C belassen und danach in gleicher Weise erneut zentrifugiert und das Sediment beseitigt. Danach werden 10 ccm der Lösung des Acetönharnniederschlages zu dem Überstand zugesetzt und auf weitere 12 Stunden wieder bei 37° C bebrütet, danach gegen Aqua dest. ausgiebig dialysiert und gefriergetrocknet.10g each of the supernatant organ emulsion or solution are now with the fructose solution used to rinse the broken glass is diluted to 100 ccm and 5 cc of the anti-pig mesenchyme serum was added. After half an hour at temperatures around 37 ° C. the agglutinate or precipitate formed is now cautious centrifuged at 500 to 1000 revolutions and then eliminated. The supernatant will now again, possibly with the addition of a further amount of serum, for 1 hour at 37 ° Leave at C and then centrifuged again in the same way and the sediment removed. Then 10 cc of the solution of the acetone urine precipitate is added to the supernatant and incubated again at 37 ° C for a further 12 hours, then against distilled water. extensively dialyzed and freeze-dried.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Method for obtaining organ-specific fractions from organ tissues, characterized in that organ tissue is gently homogenized in an aqueous medium with antimesenchyrnalem obtained in a known manner and or or antineural antibody serum, the resulting agglutinate or precipitate removed by centrifugation, the resulting emulsion, optionally after addition the corresponding defense ferments, incubated at 37 "C, then dialyzed and Gefrierlrocküet. 2: - Method according to claim 1, characterized in that the Organ homogenates dialyzable protective colloids or emulsifiers are added.